Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
i
OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU
DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION
(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN
DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Adi Wirasaputra
NIM : 088114059
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
Persetujuan Pembimbing
OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU
DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION
(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN
DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI
Skripsi yang diajukan oleh:
Adi Wirasaputra
NIM : 088114059
telah disetujui oleh :
Pembimbing Utama
Prof. Dr. Sri Noegrohati Apt. tanggal...................................................
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
Pengesahan Skripsi Berjudul
OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU
DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION
(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN
DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI
oleh:
Adi Wirasaputra
NIM : 088114059
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Pada tanggal:............................
Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
Ipang Djunarko, M. Sc., Apt.
Panitia Penguji Tanda tangan :
1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. ...............
2. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. ...............
3. Jeffry Julianus, M. Si. ..............
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
“Ketika jiwaku letih lesu di dalam aku, teringatlah aku
kepada TUHAN, dan sampailah doaku kepada-Mu, ke
dalam bait-Mu yang kudus.”
(Yunus 2:7)
“Usaha yang sedang – sedang saja membuahkan hasil yang sedang
– sedang saja. Tetapi usaha yang luar biasa membuahkan hasil
yang luar biasa pula.”
(Toyotomi Hideyoshi)
“Terbayangkan berarti terjangkau.”
(Toyotomi Hideyoshi)
Skripsi ini aku persembahkan kepada :
Bapak, Mama, Bagus, dan Candra,
yang selalu mendukungku dan menerimaku apa adanya
semua sahabat, teman, dan almamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Penulis menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang ditulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Apabila dikemudian hari ditemukan indikasi plagiarisme dalam naskah
ini, maka penulis bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-
undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 8 Juli 2012
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
(Adi Wirasaputra)
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH UNTUK
KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertandatangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata
Dharma:
Nama : Adi Wirasaputra
No Mahasiswa : 088114059
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
OPTIMASI CLEAN UP EKSTRAK METANOL AIR TEH HIJAU
DENGAN MENGGUNAKAN METODE SOLID PHASE EXTRACTION
(SPE) UNTUK MENDUKUNG PENETAPAN KADAR KUERSETIN
DALAM TEH HIJAU DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA
TINGGI
Beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,
mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan
data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikan di Internet atau
media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya
maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya
sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Segala pujian dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan karena hanya
dengan anugerah, berkat, cinta, kasih, dan pertolongan-Nya, penulis dapat
menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi yang berjudul ”Optimasi Clean
Up Ekstrak Metanol Air Teh Hijau dengan Menggunakan Metode Solid
Phase Extraction (SPE) untuk Mendukung Penetapan Kadar Kuersetin
dalam Teh Hijau dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi”. Skripsi ini
disusun guna memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Strata
Satu Program Studi Farmasi (S.Farm).
Terselesaikannya penulisan laporan akhir ini tidak lepas dari bantuan
berbagai pihak, karena itu penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan dan segenap staf serta
karyawan Laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
2. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah
memberikan petunjuk, saran, arahan, dan bimbingan kepada penulis dalam
proses penyusunan skripsi ini.
3. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. dan Bapak Jeffry Julianus, M. Si. selaku
Dosen Penguji skripsi yang telah memberikan saran dan masukan demi
kesempurnaan skripsi ini.
4. Seluruh staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
: Mas Bimo, Mas Kunto, Pak Parlan, dan Pak Kethul yang telah banyak
membantu selama penelitian di laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
5. Pak Sanjaya dan Pak Acang atas bantuan selama menghadapi masalah dalam
penelitian dan mau membagi ilmu yang tidak didapatkan selama kuliah.
6. Keluarga Wirasaputra tercinta Bapak, Mama, Bagus, dan Candra terima kasih
atas dukungan doa yang selalu membanjir tulus untukku yang membuatku
berani bangkit lagi di kala terpuruk.
7. Keluarga Mbah Putri yang selalu mendoakan segala perjuanganku Mbah
Putri, Bulik Etik, Mas Hagai, Heraldi, Kezia, dan Brian.
8. Alfonsus Rosario Heppy Dwiyoga, Paulus Setya Dharma dan Anastasia
Filipa Veritas da Silva teman seperjuangkanku yang telah dengan sabar
menghadapi semua kemalasanku, mendukung dan menyemangati aku selama
masa-masa terpuruk di lab.
9. Kawan-kawan seperjuangan di lab dan grup antistress: Eka Riusinta Wati,
Melisa Dharmawan, Vinsensia Vica, M.G. Rosita Secoadi, Dhimas B.K.,
Novi Imoliana, Meiske Munda, Wilfrida Maria Dua, Margaretha Efa Putri,
Yuni Rogan, dan Elisa atas kerja sama dan kebersamaan, dukungan dan
keceriaan di lab selama penelitian ini.
10. Monica Satya Resmi Yunita untuk momen – momen kebersamaan kita dulu
dan terima kasih atas dukungan doa selama ini.
11. Teman – teman FST 2008 yang selalu memberi bantuan, dukungan, dan
berbagi keceriaan : Theresia Wijayanti, Anastasia Mardilla, Helena Angelina
Kurniawan, Margareth Henrika Silow, Elya Findawati, Laurensius Widi
Andhika Putra, Sari Tambunan, Aldo Sahala, Valentinus Widyawan, Edward
Wijaya Setyawan, dan Fajar Dwi Riyanto.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
12. Antonius Pandu W., Albertus Djanu Rombang, Alexius Ario P.W., dan Yosef
Himawan Yudha terima kasih atas keluangan waktu untuk bersama pergi
sejenak dari penatnya skripsi.
13. Teman – teman FKK 2008 yang mau membantu dan selalu memberi
dukungan untuk selesainya skripsi ini : Adityawarman, Perthy Melati Kasih,
Ellen Sinaga, Paulina Marcellina, Pratiwi Setyaningsih, Gina Vinrensia,
Marsyani, dan Tia.
14. Serta semua pihak yang telah banyak membantu penyusunan skripsi ini yang
tidak dapat disebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih banyak kekurangan
dan kelemahan karena keterbatasan pikiran, tenaga, dan waktu penulis. Untuk itu
penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir
kata semoga skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca semua.
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL .......................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ............................................................. iii
HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................. v
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................................... vi
PRAKATA ......................................................................................... vii
DAFTAR ISI ...................................................................................... x
DAFTAR TABEL .............................................................................. xiii
DAFTAR GAMBAR .......................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................... xvi
INTISARI ........................................................................................... xvii
ABSTRACT ......................................................................................... xviii
BAB I PENGANTAR ......................................................................... 1
A. Latar Belakang .............................................................................. 1
1. Permasalahan .......................................................................... 3
2. Keaslian penelitian .................................................................. 4
3. Manfaat penelitian ................................................................... 4
B. Tujuan Penelitian .......................................................................... 4
BAB II PENELAHAAN PUSTAKA .................................................. 5
A. Kandungan daun teh hijau (Camelia sinensis L.) .......................... 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
B. Flavonoid ..................................................................................... 5
C. Kuersetin ..................................................................................... 6
D. Ekstraksi ...................................................................................... 7
E. Soxhlet.............................................................................................. 7
F. Solid Phase Extraction (SPE) ....................................................... 7
1. Prosedur SPE ........................................................................... 7
2. Fase SPE...................................................................................... 9
G. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) .................................. 10
1. Definisi dan instrumentasi KCKT................................................ 10
2. Kromatografi partisi fase terbalik................................................. 12
H. Landasan Teori ............................................................................ 12
I. Hipotesis.......................................................................................... 13
BAB III METODE PENELITIAN ...................................................... 14
A. Jenis dan Rancangan Penelitian .................................................... 14
B. Variabel Penelitian............................................................................ 14
C. Definisi Operasional.......................................................................... 15
D. Bahan Penelitian .......................................................................... 15
E. Alat Penelitian ............................................................................. 16
F. Tata Cara Penelitian ..................................................................... 17
1. Pembuatan serbuk daun teh ..................................................... 17
2. Ekstraksi denga menggunakan metode sokhlet sekaligus hidrolisis 17
3. Skrining metode clean up ........................................................ 17
4. Optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE ........................... 18
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
5. Optimasi volume fase gerak (eluen) ......................................... 20
6. Penentuan kapasitas kolom SPE .............................................. 21
G. Analisis Hasil Optimasi ................................................................ 22
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................. 24
A. Pembuatan Serbuk Daun Teh ....................................................... 24
B. Ekstraksi denga menggunakan metode sokhlet sekaligus hidrolisis 24
C. Skrining metode clean up ............................................................. 27
D. Optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE................................ 29
E. Optimasi volume fase gerak (eluen) ............................................. 44
F. Penentuan kapasitas kolom SPE ................................................... 46
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN............................................... 49
A. Kesimpulan .................................................................................. 49
B. Saran ............................................................................................ 49
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................... 50
LAMPIRAN ....................................................................................... 52
BIOGRAFI PENULIS ........................................................................ 72
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Indeks polaritas larutan kimia .................................... ..... 10
Tabel II. SPE – KLT densitometri.................................................... 28
Tabel III. Ekstraksi cair – cair............................................................ 28
Tabel IV. Rata – rata resolusi............................................................. 42
Tabel V. Optimasi volume eluen........................................................ 44
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Kuersetin ........................................................................ 1
Gambar 2. Sisi aktif kuersetin .......................................................... 6
Gambar 3. Interaksi antara kuersetin dengan pelarut
metanol-air(90:10) .......................................................... 26
Gambar 4. Reaksi hidrolisis pada suatu kuersetin glikon .................. 27
Gambar 5. Kromatogram baku kuersetin 65 ppm ............................. 32
Gambar 6. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (silika)........... 32
Gambar 7. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (silika)........... 33
Gambar 8. Kromatogram hasil elusi dengan metanol......................... 33
Gambar 9. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (diol) ........... 36
Gambar 10. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (diol) ............ 36
Gambar 11. Kromatogram hasil elusi dengan metanol (diol) .............. 37
Gambar 12. Kromatogram baku kuersetin 14 ppm (C18) ................... 39
Gambar 13. Kromatogram hasil elusi dengan HCl 0,002 N (C18) ...... 39
Gambar 14. Kromatogram hasil elusi dengan metanol ....................... 40
Gambar 15. Kromatogram baku kuersetin 10 ppm ............................. 41
Gambar 16. Kromatogram fraksi metanol .......................................... 41
Gambar 17. Kromatogram sampel sebelum SPE ................................ 43
Gambar 18. Kurva volume eluen vs AUC .......................................... 45
Gambar 19. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,05 ml
sampel ............................................................................ 46
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
Gambar 20. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,1 ml
sampel.................................................... .......................... 47
Gambar 21. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,2 ml
sampel ............................................................................ 47
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam
C18 .............................................................................. 53
Lampiran 2. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam
diol............................................................................... 55
Lampiran 3. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam
silika ............................................................................ 58
Lampiran 4. Kromatogram optimasi volume .................................... 61
Lampiran 5. Kromatogram kapsitas .................................................. 64
Lampiran 6. Contoh cara perhitungan resolusi .................................. 70
Lampiran 7. Contoh cara perhitungan efisiensi clean up ................... 70
Lampiran 8 Contoh cara perhitungan t-test ...................................... 70
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
INTISARI
Kuersetin merupakan senyawa berkhasiat yang terdapat dalam daun teh
(Camelia sinensis). Senyawa flavonoid golongan flavonol ini dikenal memilki
khasiat sebagai antioksidan kuat. Di dalam daun teh terdapat bermacam – macam
senyawa dari golongan fenolik, tanin, pektin, katekin, dan vitamin. Tentunya
ekstrak metanol air dari teh hijau mengandung senyawa – senyawa lain yang bisa
mengganggu determinasi kuersetin dalam teh hijau. Oleh karena itu dalam
penelitian ini digunakan metode Solid Phase Extraction (SPE) untuk mengurangi
berbagai senyawa yang ikut terekstraksi agar kuersetin dapat dideterminasi tanpa
adanya gangguan dari senyawa – senyawa tersebut.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan sistem SPE optimal yang
bisa mengurangi berbagai senyawa yang ikut terekstraksi sehingga dapat
digunakan untuk determinasi kuersetin dalam ekstrak teh hijau. Optimasi
dilakukan dengan pemilihan jenis fase diam (diol, silika, dan C18) dan fase gerak
(aquabidest, metanol, etil asetat, n-heksana) serta volume fase gerak untuk
mengelusi kuersetin.
Sistem SPE terpilih adalah SPE kolom C18 dengan larutan pencuci 6 ml
HCl 0,002 N dan larutan pengelusi 5 – 10 ml metanol. Kondisi tersebut cukup
efisien dalam memisahkan kuersetin dari koekstraktan dengan nilai resolusi 2,994
dan nilai efisiensi clean up 37,5 – 43,75%.
Kata kunci : kuersetin, teh hijau, clean up, SPE
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
ABSTRACT
Quercetin is a pharmacologic component in green tea (Camelia sinensis).
This flavonol flavonoid has a potential antioxidant effect. There are many
components in green tea leaves such as phenolic components, tannin, pectin,
cathecin, and vitamin. Aqueous methanolic green tea extract has many other
components which can disturb the determination of quercetin in green tea sampel.
Therefore Solid Phase Extraction is used in this study to reduce the number of co-
extractants so it can support the determination of quercetin.
This study is to determine the optimum conditions of Solid Phase
Extraction system that fit for purpose. Optimation could be done by choosing the
type of stationary phase (diol, silica, and C18) and the mobile phase (aquabidest,
methanol, aethyl acetic, n-hexane) and the volume of mobile phase to eluting
quercetin.
The chosen SPE system is SPE C18 coloumn with 6 ml HCl 0,002 N as
the washing solvent and 5 – 10 ml methanol as the eluting solvent. That condition
is enough efficient to separate quercetin from co-extractants which resolution
value 2,994 and clean up efficiency value 37,5 – 43,75%.
Keywords : quercetin, green tea, clean up, SPE
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Teh sudah tak asing lagi bagi masyarakat Indonesia. Menikmati teh bisa
dengan dijadikan teh seduh, teh celup, hingga teh siap saji dalam kemasan. Teh
hijau memiliki banyak kandungan di dalamnya, di antaranya adalah pektin, tanin,
vitamin, dan termasuk di dalamnya adalah flavonoid.
OHO
OH O
OH
OH
OH
Gambar 1. Kuersetin
Kuersetin merupakan salah satu turunan flavonoid golongan flavonol.
Kuersetin memiliki khasiat sebagai antioksidan yang poten (Phani, Vinaykumar,
Rao, and Sindhuja, 2010). Kuersetin sebagai senyawa antioksidan diperlukan oleh
tubuh untuk menetralkan radikal bebas dan mencegah kerusakan sel normal oleh
adanya radikal bebas. Senyawa antioksidan menstabilkan radikal bebas dengan
mendonorkan protonnya untuk berpasangan dengan elektron yang dimiliki radikal
bebas sehingga reaksi berantai dari pembentukan radikal bebas dapat dihambat.
Kandungan flavonoid golongan lain dalam daun teh hijau (Camellia
sinensis L.) adalah katekin. Katekin tidak berwarna, larut dalam air, dan memberi
rasa pahit pada teh. Katekin utama dalam daun teh hijau (Camellia sinensis L.)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
adalah epigalokatekin galat (log P = 2,38), epigalokatekin (log P = 1,2), epikatein
galat, epikatekin (log P = 1,02), dan katekin (log P = 1,02). Epigalokatekin galat
juga mempunyai aktivitas antioksidan (Kodama, Goncalves, Lajolo, and
Genovese, 2010).
Upaya mendapatkan fraksi analit yang bersih dari senyawa lain (clean
up) bisa ditempuh dengan cara Liquid – Liquid Extraction (LLE) maupun Solid
Phase Extraction (SPE). LLE berdasarkan pada koefisien distribusi analit pada
suatu pelarut dengan prinsip partisi. Pelarut yang digunakan untuk menghilangkan
senyawa lain selain analit tidak boleh bercampur. SPE merupakan kromatografi
kolom, dimana senyawa yang memiliki kepolaran mirip dengan fase diam atau
dapat berinteraksi dengan fase diam akan tertahan sedangkan senyawa yang lain
akan ikut terelusi. Dengan mempertimbangkan log P dari senyawa – senyawa
selain kuersetin dan log P kuersetin sendiri (log P = 1,82), maka fase gerak SPE
yang dipilih juga diharapkan mampu mengelusi kuersetin dengan sedikit
mengelusi senyawa – senyawa lain.
Adapun langkah dalam metode SPE adalah dengan pemilihan pelarut
yang mampu menahan semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan,
sementara senyawa – senyawa penganggu akan terelusi. Analit yang dituju (yang
tertahan pada penjerap ini) selanjutnya dielusi dengan sejumlah kecil pelarut
organik yang akan mengambil analit yang tertahan ini. Langkah lain adalah
dengan mengusahakan supaya analit yang tertuju keluar (terelusi), sementara
senyawa penganggu tertahan pada penjerap (Rohman, 2009). Selanjutnya analit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
diinjeksikan pada alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik
yang metodenya telah dioptimasi oleh Dwiyoga (2012).
Pemilihan fase diam (C18, diol, dan silika) dan komposisi pelarut dalam
metode SPE perlu dioptimasi untuk mendapatkan hasil yang optimum. Kondisi
metode SPE dikatakan optimum jika memenuhi parameter – parameter berikut
yaitu berkurangnya jumlah peak senyawa – senyawa lain yang terikut dalam
ekstraksi yang dinyatakan dengan nilai efisiensi clean up, Area Under Curve
(AUC) kuersetin terbesar dan didapatkan nilai Rs ≥ 1,5.
Telah dilakukan penelitian tentang pemisahan kuersetin menggunakan
metode SPE fase terbalik dalam tablet Ginkgo biloba (Mokgadi, Mmualefe, and
Torto, 2009), namun bukan dalam teh hijau. Dengan tetap mengacu pada
penelitian tersebut, optimasi dilakukan dengan mengubah – ubah komposisi atau
jenis pelarut dan pemilihan fase diam (C18, diol, dan silika) serta menentukan
volume pengelusi. Ketiga faktor tersebut dapat mempengaruhi parameter –
parameter clean up yang optimum.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang di atas, permasalahan yang dapat diuraikan
sebagai berikut: bagaimanakah jenis fase diam dan fase gerak serta volume eluen
yang sesuai supaya diperoleh efisiensi clean up yang baik, nilai resolusi ≥ 1,5 dan
Area Under Curve (AUC) kuersetin terbesar untuk mendukung penetapan kadar
kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau?
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
2. Keaslian penelitian
Penelitian terhadap kuersetin dengan metode SPE telah dilakukan dalam
suatu sediaan obat. Penelitian dengan judul “SampliQ OPT Solid Phase
Extraction Sorbent in the Cleanup of Flavonoids in Ginkgo Biloba by HPLC-
DAD” dilakukan dengan menggunakan fase diam C18 dan larutan pengelusi
metanol:air (5:95 v/v) serta metanol:amonium asetat (30:70 v/v) untuk
memisahkan kuersetin dalam tablet Ginkgo Biloba (Mokgadi, Mmualefe, and
Torto, 2009). Demikian, maka dapat dipastikan bahwa optimasi metode SPE
kuersetin dalam teh hijau ini belum pernah dilakukan sebelumnya.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
informasi mengenai penggunaan metode SPE pada proses ekstraksi kuersetin
untuk penetapan kadar kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau.
b. Manfaat praktis. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan
informasi terkait dengan pemilihan jenis fase diam, jenis fase gerak, dan volume
eluen SPE yang terbaik untuk proses ekstraksi kuersetin untuk penetapan kadar
kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau.
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan jenis fase diam dan fase
gerak serta volume eluen yang sesuai supaya diperoleh efisiensi clean up yang
baik, nilai resolusi ≥ 1,5 dan Area Under Curve (AUC) kuersetin terbesar untuk
penetapan kadar kuersetin dalam ekstrak metanol air teh hijau.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Kandungan Daun Teh Hijau (Camellia sinensis L.)
Daun teh hijau (Camellia sinensis L.) mengandung substansi fenol dan
substansi bukan fenol. Substansi fenol terdiri dari katekin yang punya empat
turunan, yaitu epikatekin (EC), epikatekin galat (ECG), epigalokatekin (EGC) dan
epigalokatekin galat (EGCG) serta flavonol terdiri dari kaempferol, kuersetin, dan
mirisetin. Subtansi bukan fenol terdiri dari pektin, alkaloid, karbohidrat, klorofil,
mineral, protein, dan asam amino (Soraya, 2007).
Flavonol utama yang ada di dalam daun teh adalah kuersetin, kaempferol
dan myrycetin. Flavonol ini, terutama terdapat dalam bentuk glikosidanya
(berikatan dengan molekul gula) dan sedikit dalam bentuk aglikonnya (Hartoyo,
2003).
B. Flavonoid
Aglikon flavonoid adalah polifenol dan karena itu mempunyai sifat kimia
senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi
bila dibiarkan dalam larutan basa, dan di samping itu terdapat oksigen, banyak
yang akan terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil yang tak tersulih,
atau suatu gula, flavonoid merupakan senyawa polar, maka umunya flavonoid
cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetil
sulfoksida, dimetilformamida, air, dan lain – lain (Markham, 1988).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
Adanya gula yang terikat pada flavonoid, cenderung menyebabkan
falvonoid mudah larut dalam air dan dengan demikian campuran pelarut di atas
dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya,
aglikon yang kurang polar seperti flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih
mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).
C. Kuersetin
Kuersetin merupakan senyawa berwarna kuning dan menjadi anhidrat
pada suhu 95 - 97° C. Kelarutan : larut dalam asam asetat glasial, dalam larutan
aqueous alkaline dan praktis tidak larut dalam air (The Merck Index, 1989).
Kuersetin memiliki gugus fungsi karbonil dan hidroksil sehingga dapat
membentuk kompleks dengan beberapa ion logam (Makasheva, 2005).
Kuersetin memiliki aktivitas antioksidan yang kuat karena memiliki tiga
ciri pada strukturnya, yaitu 3’,4’-dihidroksi pada cincin B; 2,3-ikatan rangkap
pada cincin C dan sebuah gugus 5-hidroksil pada cincin A. Ketiga ciri ini secara
umum ditunjukkan pada gambar di bawah ini (Sibuea, 2006).
O
OOH
OH
HO
OH
OH
OH
A
B
C
2
3
456
7
8
2
3
4
5
Gambar 2. Sisi aktif kuersetin yang potensial sebagai antioksidan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
D. Ekstraksi
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat
aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai,
kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang
tersisa diperlakukan sedemikian sehingga memenuhi baku yang telah ditetapkan
(DirJen POM, 1995).
Ekstraksi adalah proses pemisahan satu atau lebih komponen dari suatu
campuran homogen menggunakan pelarut cair (solven) sebagai separating agent
(Harborne, 1987). Pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat dapat
dipermudah dengan mengetahui terlebih dahulu zat aktif yang dikandung
simplisia (DirJen POM, 1986).
E. Soxhlet
Soxhlet adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang
dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah
pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Penyarian dengan alat
soxhlet menggunakan larutan yang dipanaskan terus menerus sehingga zat aktif
yang tidak tahan pemanasan kurang cocok (DirJen POM, 2010).
F. Solid-Phase Extraction (SPE)
1. Prosedur SPE
Ada dua strategi untuk melakukan penyiapan sampel menggunakan SPE
ini. Strategi pertama adalah dengan pemilihan pelarut yang mampu menahan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
semua analit yang dituju pada penjerap yang digunakan, sementara senyawa –
senyawa penganggu akan terelusi. Analit yang dituju (yang tertahan pada penjerap
ini) selanjutnya dielusi dengan sejumlah kecil pelarut organik yang akan
mengambil analit yang tertahan ini. Strategi ini beramanfaat jika analit yang dituju
berkadar rendah. Strategi lain adalah dengan mengusahakan supaya analit yang
tertuju keluar (terelusi), sementara senyawa penganggu tertahan pada penjerap
(Rohman, 2009).
Tahap pertama menggunakan SPE adalah dengan mengkondisikan
penjerap dengan pelarut yang sesuai. Penjerapa nonpolar seperti C18 dan penjerap
penukar ion dikondisikan dengan mengalirinya menggunakan metanol lalu dengan
akuades. Pencucian yang berlebihan dengan air akan mengurangi recovery analit.
Penjerap – penjerap polar seperti diol, siano, amino, dan silika harus dibilas
dengan pelarut nonpolar seperti metilen klorida (Rohman, 2009).
Ada empat tahap dalam prosedur SPE, yaitu:
a. Pengkondisian
Cartridge (penjerap) dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi
permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga
perubahan – perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan
dapat dihindari.
b. Retensi (tertahannya) sampel
Larutan sampel dilewatkan ke cartridge baik untuk menahan analit yang
dituju, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen yang
tidak diharapkan sementara analit yang dituju terelusi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
c. Pembilasan
Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak
tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.
d. Elusi
Tahap ini merupakan tahap terakhir untuk mengambil analit yang dituju
jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).
2. Fase SPE
Suatu penjerap SPE harus dipilih sedemikian rupa sehingga mampu
menahan analit secara kuat selama pemasukan sampel ke dalam cartridge. Untuk
sampel – sampel yang bersifat ionik atau yang dapat terionisasi, digunakan
penjerap penukar ion. Fraksi analit yang keluar dari SPE dapat langsung
diinjeksikan ke sistem kromatografi atau dilakukan pengaturan pH untuk
meminimalkan ionisasi sehingga dapat dipisahkan dengan kolom fase terbalik
pada KCKT (Rohman, 2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Tabel I. Indeks polaritas larutan kimia (Snyder, 1978)
Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa
pelarut. Fase gerak bergerak di dalam fase diam, yaitu lapisan berpori karena ada
gaya kapiler (Stahl, 1985).
G. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Definisi dan instrumentasi KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah teknik pemisahan
campuran senyawa berdasarkan interaksi dengan fase diam di bawah aliran fase
gerak, dimana fase gerak dialirkan dengan bantuan tekanan menuju kolom secara
cepat dan dideteksi dengan detektor yang sesuai (Hendayana, 2006). Ada dua fase
dalam kromatografi, yaitu fase normal dan fase terbalik. Fase normal apabila fase
diam lebih polar dari fase gerak, sedangkan fase terbalik, yaitu apabila fase diam
lebih non polar dari fase geraknya (Munson, 1991).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
Kromatografi merupakan teknik yang mana solut terpisah oleh
perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut – solut ini melewati suatu kolom
kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2009).
a. Fase diam
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yan paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa – senyawa dengan kepolaran
yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi
lebih sesuai untuk solut yang polar (Gandjar dan Rohman, 2009).
b. Fase gerak
Kemampuan KCKT dalam memisahkan banyak senyawa terutama
tergantung pada jenis fase gerak. Fase gerak dapat mempengaruhi pemisahan
komponen dalam campuran (Munson, 1991).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan
asetonitril (Gandjar dan Rohman, 2009).
c. Detektor
Detektor UV-Vis didasarkan pada adanya penyerapan ultraviolet (UV)
dan sinar tampak (Vis) pada kisaran panjang gelombang 190 – 800 nm oleh
spesies oleh spesies solut yang mempunyai struktur – struktur atau gugus – gugus
kromoforik (Gandjar dan Rohman, 2009).
Detektor spektrofotometri UV dapat berupa detektor dengan panjang
gelombang tetap (merupakan detektor yang paling sederhana) serta detektor
dengan panjang gelombang bervariasi (Gandjar dan Rohman, 2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
2. Kromatografi partisi fase terbalik
Konsep dasar kromatografi partisi, yaitu perlakuan sampel dalam kondisi
cair-cair tergantung pada kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat (Gritter
et al., 1991). Partisi analit di antara dua fase yang tidak saling campur, karena
adanya perbedaan koefisien distribusi dari masing-masing senyawa (Munson,
1991).
H. Landasan Teori
Kuersetin merupakan turunan flavonoid golongan flavonol. Kuersetin
adalah aglikon yang terlepas dari gugus glikosidanya sehingga kepolarannya
menurun namun larut dalam pelarut metanol.
Salah satu kandungan ekstrak teh hijau adalah flavonoid. Kandungan
flavonoid dalam ekstrak teh hijau tidak hanya kuersetin, namun masih ada turunan
flavonoid golongan lain ataupun polifenol lain yang larut dalam pelarut ekstrak
yang sama. Oleh karena itu, diperlukan Solid Phase Extraction (SPE) dengan
harapan didapatkan ekstrak teh hijau yang bersih dari turunan flavonoid lain
ataupun polifenol lain.
Solid Phase Extraction merupakan teknik pemisahan analit dari
koekstraktan. Proses pemisahannya, yaitu kuersetin diikatkan pada fase diam C18
dan pengotornya dipisahkan dengan dialiri larutan pengelusi yang lebih polar dari
fase diam. Lalu hasilnya dibandingkan dengan langkah yang berbeda yaitu
koekstrakstan diikatkan pada fase diam diol dan kuersetin dipisahkan dengan
dialiri larutan pengelusi yang lebih nonpolar dari fase diam. Optimasi clean up
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
dengan SPE dilakukan untuk memperoleh ekstrak yang bersih dari senyawa
lainnya (selain kuersetin) dan didaptkan kandungan kuersetin terbanyak. Hasil
ekstraksi diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik yang sudah teroptimasi dan
dilihat kromatogramnya. Parameter pemisahan dengan SPE yang menunjukkan
hasil optimum yaitu berkurangnya puncak – puncak senyawa selain kuersetin,
Area Under Curve (AUC) kuersetin yang terbesar, dan resolusi tercapai ≥ 1,5
pada kromatogram.
I. Hipotesis
Dengan menggunakan jenis fase diam C18 dan fase gerak HCl 0,002 N
dan metanol serta menggunakan jenis fase diam diol dan silika dan fase gerak n-
heksana, etil asetat, dan metanol akan menghasilkan kromatogram yang baik,
yakni efisiensi clean up yang baik dengan berkurangnya puncak – puncak
senyawa selain kuersetin, Area Under Curve (AUC) yang terbesar, dan nilai
resolusi tercapai ≥ 1,5.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis dan rancangan penelitian ini adalah eksperimental karena terdapat
perlakuan terhadap subjek uji.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah :
a. Fase diam C18 dengan fase gerak HCl 0,002 N dan metanol.
b. Fase diam diol dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol.
c. Fase diam silika dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol.
d. Volume eluen yang digunakan
2. Variabel tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah nilai efisiensi clean up,
nilai resolusi, dan AUC kuersetin.
3. Variabel pengacau terkendali
Kemurnian pelarut yang digunakan, dapat diatasi dengan menggunakan
pelarut pro analysis yang memiliki kemurnian tinggi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
C. Definisi Operasional
1. Kuersetin yang dianalisis merupakan senyawa aktif yang berada dalam sampel
ekstrak teh hijau.
2. Sistem SPE yang digunakan adalah seperangkat alat SPE menggunakan fase
diam C18 dengan fase gerak aquabidest HCl 0,002 N, dan metanol; fase diam
diol dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol; serta fase diam
silika dengan fase gerak n-heksana, etil asetat, dan metanol.
3. Optimasi jenis fase diam dan fesa gerak dilakukan dengan menggunakan fase
diam yang berbeda dan fase gerak yang berbeda pada tiap fase diam, optimasi
volume fase gerak dilakukan dengan mengubah volume fase gerak, dan
optimasi kapasitas kolom dilakukan dengan mengubah volume sampel yang
masuk pada kolom SPE.
4. Parameter pemisahan komponen dengan metode SPE dilanjutkan dengan
KCKT fase terbalik adalah kromatogram dengan jumlah impurities yang
sedikit dan AUC kuersetin terbesar.
D. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah baku kuersetin
(Pcode:100910390), metanol p.a. (E, Merck), aquabidest, etil asetat p.a. (E,
Merck), n-heksana p.a. (E, Merck), akuades yang disaring yang diperoleh dari
Laboratorium Farmasi USD, metanol teknis (PT.Brataco), BHT (PT.Brataco),
asam klorida yang telah dibakukan dengan natrium karbonat dan diperoleh
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
konsentrasinya adalah 11,32 M, teh hijau dengan merk ”Sigma” yang diperoleh
dari PT. Pagilaran Samigaluh, Kulon Progo.
E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat soxhlet
100 ml dan refluks, waterbath (merk “Marius” dan “Hedolph), termometer,
kantong sokhlet, rotary evaporator, neraca analitik (OHAUS Carat Series PAJ
1003, max 60/120 g, min 0,001 g, d = 0,01/0,1 mg, e = 1 mg), densitometer
(CAMAG TLC Scanner 3 CAT. No. 027.6485 SER. No. 160602), autosampler
(Linomat 5 No. 170610), perangkat lunak WinCats (V.1.4.4), bejana
kromatografi, seperangkat alat KCKT fase terbalik dengan sistem gradien dan
isokratik dengan detektor ultraviolet, Shimadzu LC-2010C, kolom C-18 merek
KNAUER C-18 (No. 25EE181KS (B115Y620), Dimensi 250 x 4,6 mm),
seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S Connexant Sistem RD01-D850 A03-
0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625730), alat
ultrasonikasi (Retsch tipe T640 No.935922013), kertas saring Whatman 0,45 μm,
alat vacuum, hair dryer “Q2 External Beauty”, milipore, seperangkat cartridge
Solid Phase Extraction (SPE) dengan fase diam C18, diol, silika merek E-Merck,
dan alat-alat gelas yang biasa digunakan dalam laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan serbuk daun teh
Sejumlah tujuh bungkus kemasan teh hijau yang diambil dari PT
Pagilaran dengan nomor batch yang sama dicampur menjadi satu kemudian
dihomogenkan, lalu diserbuk dan disaring. Hasil serbuk kemudian disimpan
dalam wadah yang kering, kemudian diberi silika gel.
2. Ekstraksi dengan menggunakan metode Soxhlet sekaligus hidrolisis
Serbuk daun teh ditimbang 8 gram kemudian dimasukkan ke dalam tea
bag. Tea bag dimasukkan ke dalam tabung soxhlet kemudian disoxhlet dengan
240 ml larutan metanol : aquabidest (90:10) yang mengandung HCl 1,85 M dan
Butyl Hidroxy Toluene (BHT) 0,1% b/v pada suhu 90OC. Proses soxhletasi
dihentikan setelah mencapai 18 kali sirkulasi larutan penyari. Hasil soxhlet atau
ekstrak didiamkan selama beberapa saat pada suhu kamar hingga suhunya kurang
lebih sama dengan suhu kamar. Ekstrak dipindahkan ke dalam labu takar 250 ml
lalu diencerkan dengan ditambahkan larutan metanol : aquabides (90:10) hingga
tanda. Sejumlah 25 ml ekstrak diuapkan dengan rotary evaporator hingga 5 ml.
3. Skrining metode clean up
Dilakukan skrining metode clean up dengan SPE cartridge diol, silika,
dan C18 dengan fase gerak metanol, etil asetat, toluen, n-heksana, kloroform,
etanol, aseton. Kemudian fraksi – fraksi tersebut ditotolkan pada KLT-
densitometri yang telah dioptimasi oleh Dharma (2012).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Dilakukan metode clean up dengan cara partisi, yaitu ekstraksi cair – cair
antara larutan metanol:air (90:10) dengan n-heksana, air dengan etil asetat. Fraksi
– fraksi tersebut ditotolkan pada KLT-densitometri yang telah dioptimasi.
4. Optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE
a. Pembuatan HCl 0,002 N. Sejumlah 2,21 ml HCl 32% dimikropipet
dan dipindahkan pada labu takar 25 ml, diencerkan dengan aquabidest hingga
batas tanda menjadi HCl 1 N. Sejumlah 200 µl larutan HCl 1 N dimikropipet dan
dipindahkan ke labu takar 100 ml, diencerkan dengan aquabidest hingga batas
tanda menjadi HCl 0,002 N.
b. Fase diam diol
1) Pengkondisian (conditioning). Sejumlah 2 ml metanol p.a.
dialirkan pada kolom SPE diol kemudian tetesan ditampung pada tabung reaksi.
Selanjutnya dialirkan berturut – turut 2 ml etil asetat p.a. dan 2 ml n-heksana p.a.
ke dalam kolom SPE diol.
2) Pengisian (loading) sampel. Sejumlah 0,3 ml sampel pekat
dimasukkan ke dalam kolom SPE diol.
3) Pengelusian (eluting). Sejumlah 4 ml n-heksana p.a.
dialirkan melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Berturut –
turut 4 ml etil asetat p.a. dan metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen
ditampung pada tabung reaksi.
4) Preparasi sampel. Fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol
diuapkan dengan rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a. Sejumlah
tertentu metanol p.a. dari fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol dipindahkan ke
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
dalam labu takar 5 ml dan diencerkan hingga batas tanda. Fraksi – fraksi tersebut
di-milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.
c. Fase diam silika
1) Pengkondisian (conditioning). Sejumlah 2 ml metanol p.a.
dialirkan pada kolom SPE silika kemudian tetesan ditampung pada tabung reaksi.
Selanjutnya dialirkan berturut – turut 2 ml etil asetat p.a. dan 2 ml n-heksana p.a.
ke dalam kolom SPE silika.
2) Pengisian (loading). Sejumlah 0,3 ml sampel pekat
dimasukkan ke dalam kolom SPE.
3) Pengelusian (eluting). Sejumlah 4 ml n-heksana p.a.
dialirkan melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Berturut –
turut 4 ml etil asetat p.a. dan metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen
ditampung pada tabung reaksi.
4) Preparasi sampel. Fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol
diuapkan dengan rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a. Sejumlah
tertentu metanol p.a. dari fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol dipindahkan ke
dalam labu takar 5 ml dan diencerkan hingga batas tanda. Fraksi – fraksi tersebut
di-milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.
d. Fase diam C18
1) Pengkondisian (conditioning). Berturut – turut 2 ml
metanol p.a. dan 2 ml HCl 0,002 N dialirkan pada kolom SPE C18 kemudian
tetesan ditampung pada tabung reaksi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
2) Pengisian (loading). Sejumlah 0,2 ml sampel pekat
dimasukkan ke dalam kolom SPE C18.
3) Pengelusian (eluting). Sejumlah 6 ml HCl 0,002 N dialirkan
melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Sejumlah 5 ml
metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.
4) Preparasi sampel. Fraksi HCl 0,002 N diuapkan dengan
rotary evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a., dipindahkan pada labu takar
5 ml dan ditmbahkan metanol hingga batas tanda. Sejumlah 5 ml fraksi metanol
diencerkan dengan labu takar 10 ml hingga batas tanda. Fraksi – fraksi tersebut di-
milipore dan di-ultrasonikasi selama 10 menit.
5. Optimasi volume fase gerak (eluen)
a. Pengkondisian (conditioning). Berturut – turut 2 ml metanol p.a.
dan 2 ml HCl 0,002 N dialirkan pada kolom SPE C18 kemudian tetesan
ditampung pada tabung reaksi.
b. Pengisian (loading). Sejumlah 0,1 ml sampel pekat dimasukkan ke
dalam kolom SPE C18.
c. Pencucian (washing). Sejumlah 6 ml HCl 0,002 N dialirkan
melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi.
d. Pengelusian (eluting).
1) Sejumlah 5 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan
eluen ditampung pada tabung reaksi.
2) Sejumlah 7,5 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan
eluen ditampung pada tabung reaksi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
3) Sejumlah 10 ml metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan
eluen ditampung pada tabung reaksi.
e. Preparasi sampel. Fraksi metanol sejumlah 7,5 ml dan 10 ml
diuapkan dengan rotary evaporator. Setelah teruapkan diencerkan dengan
metanol p.a. di dalam labu takar 5 ml hingga tanda batas, lalu di-milipore dan di-
ultrasonikasi selama 10 menit.
6. Penentuan kapasitas kolom SPE
a. Pengkondisian (conditioning). Berturut – turut 2 ml metanol p.a.
dan 2 ml HCl 0,002 N dialirkan pada kolom SPE C18 kemudian tetesan
ditampung pada tabung reaksi.
b. Pengisian (loading).
1) Sejumlah 0,05 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam
kolom SPE C18.
2) Sejumlah 0,1 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom
SPE C18.
3) Sejumlah 0,2 ml sampel pekat dimasukkan ke dalam kolom
SPE C18.
c. Pengelusian (eluting). Sejumlah 6 ml HCl 0,002 N dialirkan
melalui kolom, tetesan eluen ditampung pada tabung reaksi. Sejumlah 6 ml
metanol p.a. dialirkan ke dalam kolom dan eluen ditampung pada tabung reaksi.
d. Preparasi sampel. Fraksi HCl 0,002 N diuapkan dengan rotary
evaporator lalu dilarutkan pada metanol p.a., dipindahkan pada labu takar 5 ml
dan ditambahkan metanol hingga batas tanda. Fraksi metanol sejumlah 6 ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
diuapkan dengan rotary evaporator. Setelah teruapkan, diencerkan dengan
metanol p.a. di dalam labu takar 5 ml hingga tanda batas, lalu di-milipore dan di-
ultrasonikasi selama 10 menit.
7. Identifikasi kuersetin
Analit yang diperoleh dari hasil SPE kemudian diinjeksikan pada sistem
KCKT fase terbalik yang sudah teroptimasi dengan kolom C18 detektor UV pada
panjang gelombang 370 nm, flow rate 1 mL, komposisi fase gerak aquabidest-
metanol-asam fosfat 1% (55:45:1).
G. Analisis Hasil Optimasi
Data kromatogram yang diperoleh pada baku diamati sehingga dapat
diketahui sistem SPE yang memberikan hasil optimal, yaitu dengan menghitung
nilai resolusi dan menghitung nilai efisiensi clean up.
1. Analisis kualitatif
Analisis kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi
antara kromatogram baku kuersetin dengan kromatogram fraksi hasil elusi SPE.
2. Nilai resolusi
Nilai resolusi pemisahan peak dihitung terhadap peak terdekat dengan
rumus: Rs = 𝑡𝑅1 − 𝑡𝑅2
(𝑤2+𝑤1)/2
Keterangan : tR1 dan tR2 = waktu retensi komponen
W1 dan W2 = lebar alas puncak
Pemisahan yang baik menghasilkan nilai Rs > 1,5 (Pescok et al., 1976).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
3. Nilai efisiensi clean up
Nilai efisiensi clean up dihitung dengan membandingkan jumlah peak
sebelum SPE dengan jumlah peak sesudah SPE dengan rumus:
Efisiensi clean up= 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸−𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑠𝑢𝑑𝑎 ℎ 𝑆𝑃𝐸
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎 𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸 𝑥 100%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Serbuk Daun Teh
Sebelum dilakukan ekstraksi dengan metode sokhletasi, sampel daun teh
kering yang diperoleh dari PT. Pagilaran diserbuk dahulu. Tujuan dari proses
penyerbukan ini adalah untuk memperluas area kontak antara pelarut dengan
sampel sehingga ketika proses ekstraksi, pelarut akan lebih banyak berinteraksi
dengan sel tanaman. Dengan proses penyerbukan sampel ini diharapkan proses
ekstraksi bisa berlangsung maksimal.
Setelah diperoleh serbuk daun teh, dilakukan penyaringan dan
pencampuran serbuk daun teh. Dalam proses penyaringan ini serbuk akan terpisah
berdasarkan ukuran partikelnya. Ukuran partikel serbuk yang diambil adalah
serbuk yang berukuran partikel kecil karena memiliki luas area kontak dengan
pelarut yang lebih besar. Tujuan pencampuran serbuk daun teh adalah untuk
menghomogenkan sampel.
B. Ekstraksi dengan Menggunakan Metode Soxhlet Sekaligus Hidrolisis
Proses ekstraksi ini berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh
Dharma (2012) dimana diperoleh kondisi ekstraksi optimal yaitu proses sokhletasi
disertai dengan hidrolisis menggunakan larutan penyari metanol-air (90:10) yang
mengandung HCl 1,85 M pada suhu 90°C. Proses soxhletasi ini dilakukan hingga
tercapai 18 sirkulasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Metode ekstraksi yang digunakan adalah soxhletasi. Soxhletasi adalah
ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru umumnya dilakukan dengan alat
khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinyu dengan jumlah pelarut yang relatif
konstan dengan adanya pendingin balik (DirJen POM, 2010). Dikatakan “pelarut
selalu baru” karena pelarut yang berada di dalam labu akan menguap dan
terkondensasi oleh adanya pendingin balik sehingga menetes mengisi tabung sifon
dan membasahi tea bag di dalamnya. Pelarut yang membawa ekstrak, akan
memenuhi tabung sifon dan kembali ke dalam labu yang nantinya akan menguap
dan terkondensasi lagi sehingga bisa dikatakan terjadi ekstaksi secara kontinyu
(berkesinamungan).
Kuersetin merupakan flavonoid golongan flavonol yang umumnya
terdapat di alam dalam bentuk glikosida. Adanya glikosida menyebabkan
flavonoid memiliki kelarutan di dalam air. Bentuk glikosida kuersetin salah
satunya adalah rutin (kuersetin-3-rutinoside). Dalam penelitian ini kuersetin yang
akan dianalisis adalah kuersetin dalam bentuk aglikon, oleh karena itu diperlukan
proses hidrolisis untuk mengubah kuersetin glikon menjadi kuersetin aglikon.
O
OH
OH
O
OH
HO
OH
Gambar 1. Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Pada proses ekstraksi yang disertai hidrolisis ini digunakan larutan
penyari metanol:air (90:10) yang mengandung HCl 1,85 M. Pelarut yang dipilih
adalah metanol:air (90:10) karena adanya gugus - gugus hidroksil pada kuersetin
menyebabkan larutan metanol-air mampu berinteraksi secara hidrogen bonding
sehingga kuersetin dapat larut dalam pelarut tersebut.
OO
O
O
O
O
O
H
H
HH
H
H
H
H
O
O
O
O
CH3
H
H3C H
CH3
H
O
O
O
HO
H3C
H
H
OH
H
metanol
air
air
metanol
metanol
metanol
Keterangan : merupakan ikatan hidrogen
H3C
H
H3C
H
O H
H
air
metanol
Gambar 3. Interaksi antara kuersetin dengan pelarut metanol-air(90:10).
Adanya HCL 1,85 M digunakan untuk memberikan suasana asam dan
sebagai katalisator proses hidrolisis. Suasana asam dapat mempercepat proses
hidrolisis dan tetap menjaga kuersetin dalam bentuk molekul. Adapun reaksi
hidrolisis yang terjadi :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
Gambar 4. Reaksi hidrolisis pada suatu kuersetin glikon
Suhu yang digunakan dalam proses sokhletasi sekaligus hidrolisis ini
adalah 90°C. Pada suhu tersebut metanol akan menguap dan mengalami
kondensasi sehingga menetes dan membasahi tea bag mengisi ruang sifon.
C. Skrining Metode Clean Up
Tujuan dilakukan clean up yaitu untuk mengurangi senyawa – senyawa
selain analit yang ikut terekstraksi (ko-ekstraktan) selama proses ekstraksi
berlangsung. Alasan pentingnya dilakukan clean up karena ko-ekstraktan bisa
mengganggu proses determinasi analit, dalam hal ini adalah kuersetin. Gangguan
tersebut bisa menyebabkan tidak tercapainya parameter optimal yang salah
satunya adalah resolusi. Jika parameter resolusi tidak tercapai maka metode tidak
akan valid untuk dapat dilakukan determinasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Tabel II. SPE – KLT densitometri
SPE pengelusi hasil keterangan
diol &
silika
toluen tidak ada kuersetin
toluen:metanol (2:1)
ada kuersetin
karena terelusi oleh metanol
metanol ada
kuersetin
mengelusi hampir semua senyawa selain kuersetin, masih ada kuersetin yang terjerap kuat pada diol
aseton ada
kuersetin
etanol ada
kuersetin
etil asetat ada
kuersetin
kloroform tidak ada kuersetin
n-heksana tidak ada kuersetin
C18
campuran air &
metanol
ada kuersetin
karena terelusi oleh metanol
metanol ada
kuersetin
Tabel III. Ekstraksi cair – cair
Ekstraksi Cair – Cair Hasil
Sampel dalam pelarut metanol-air (90:10) diuapkan metanolnya dan ditambahkan aquabidest. Paritsi antara aquabidest dengan etil asetat analit larut dalam etil
asetat. Etil asetat diuapkan dan pelarutnya diganti dengan metanol.
Beberapa senyawa yang polar (larut dalam air)
berkurang
Sampel dalam pelarut metanol-air (90:10) dipartisi dengan n-heksana analit berada dalam fraksi metanol-
aquabidest(90:10). Metanol diuapkan dan ditambahkan aquabidest. Paritsi antara aquabidest dengan etil asetat
analit larut dalam etil asetat. Etil asetat diuapkan dan pelarutnya diganti dengan metanol.
Diperoleh fraksi dengan profil kromatogram terdiri
dari 3 puncak
Namun langkah ini tidak reprodusibel
Banyak kuersetin yang
hilang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Optimasi metode SPE dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT) akhirnya dipilih karena KCKT lebih sensitif dalam mendeteksi
analit dibadingkan dengan Kromatografi Lapid Tipis Densitometri (KLT-
Densitometri). Selain itu, ekstraksi cair – cair secara partisi tidak lagi dipilih
karena tidak efektif dan tidak efisien dalam mendapatkan analit. Hal ini terkait
dengan banyaknya pelarut yang digunakan dan koefisien distribusi kuersetin pada
dua pelarut yang digunakan saat proses partisi.
Metode KLT Densitometri yang digunakan untuk skrining metode clean
up berdasarkan penelitian Dharma (2012) dimana menggunakan fase diam silika,
fase gerak toluen-etil asetat-asam format (14:5:1). Sedangkan metode KCKT yang
digunakan untuk optimasi jenis fase diam dan fase gerak SPE yang akan dibahas
pada subbab selanjutnya adalah metode KCKT optimal dari penelitian Dwiyoga
(2012), yaitu dengan menggunakan fase diam C8, fase gerak aquabidest-metanol
(52,5:47,5) suhu kolom 30°C, dan flow rate 1,2 ml/menit.
D. Optimasi Jenis Fase Diam dan Fase Gerak SPE
Pemilihan jenis fase diam dan fase gerak SPE dilakukan untuk
mendapatkan sistem SPE yang mampu memenuhi parameter resolusi, selektivitas,
dan efisiensi clean up. Fase diam (cartridge) SPE yang digunakan adalah diol,
silika, dan C18, sedangkan fase gerak yang digunakan juga berbeda karena
perbedaan fase diamnya. Diol dan silika merupakan sistem kromatografi dengan
fase normal, sedangkan C18 merupakan sistem kromatografi fase terbalik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Adapun tahap – tahap yang dilakukan dalam SPE adalah sebagai berikut :
a. Pengkondisian
Cartridge (penjerap) dialiri dengan pelarut sampel untuk membasahi
permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama, sehingga
perubahan – perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan
dapat dihindari.
b. Retensi (tertahannya) sampel
Larutan sampel dilewatkan ke cartridge baik untuk menahan analit yang
dituju, sementara komponen lain terelusi atau untuk menahan komponen yang
tidak diharapkan sementara analit yang dituju terelusi.
c. Pembilasan
Tahap ini penting untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak
tertahan oleh penjerap selama tahap retensi.
d. Elusi
Tahap ini merupakan tahap terakhir untuk mengambil analit yang dituju
jika analit tersebut tertahan pada penjerap (Rohman, 2009).
1. Fase diam (cartridge) silika. Fase diam silika merupakan sistem
kromatografi fase normal. Dikatakan demikian karena fase diam yang digunakan
lebih polar daripada fase geraknya.
Pada langkah awal dilakukan aktivasi fase diam silika dengan metanol.
Langkah ini bertujuan untuk menghilangkan sisa – sisa air yang mungkin
tertinggal di fase diam silika sehingga nantinya analit mampu berinteraksi dengan
fase diam secara maksimal karena sudah tidak ada lagi halangan oleh molekul air.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
Pengkondisian dilakukan dengan mengalirkan metanol, etil asetat, dan n-
heksana secara berturut – turut. Digunakan etil asetat sebelum dialirkan n-heksana
karena metanol dan n-heksana tidak saling bercampur dalam volume yang sama
karena tidak terjadi interaksi antara n-heksana dengan metanol, serta adanya
perbedaan indeks polaritas yang jauh antara metanol (5,1) dan n-heksana (0,1).
Oleh karena itu, dibutuhkan fase gerak yang tingkat kepolarannya menengah yang
mampu berinteraksi dengan dua fase gerak tadi yaitu etil asetat dimana memiliki
nilai indeks polaritas 4,4. Dengan demikian tidak ada molekul metanol yang
tertinggal di cartridge saat dialiri n-heksana karena sudah terelusi oleh adanya etil
asetat.
Sejumlah 0,3 ml sampel dimasukkan ke dalam cartridge SPE silika
kemudian berturut – turut dielusi dengan 4 ml n-heksana, 4 ml etil asetat, dan 4 ml
metanol. Kuersetin larut dalam etil asetat dan metanol, namun tidak dalam n-
heksana. Dengan demikian fase gerak yang digunakan sebagai pembilas adalah n-
heksana. Fraksi – fraksi tersebut kemudian diinjeksikan pada KCKT yang telah
dioptimasi oleh Dwiyoga (2012) yaitu dengan menggunakan fase diam C8, fase
gerak aquabidest-metanol (52,5:47,5) suhu kolom 30°C, dan flow rate 1,2
ml/menit.
Analisis kualitatif yang dilakukan adalah dengan membandingkan waktu
retensi (tR) baku kuersetin dengan puncak kromatogram fraksi n-heksana, fraksi
etil asetat, dan fraksi metanol yang memiliki tR yang mirip dengan kuersetin.
Waktu retensi adalah waktu yang dibutuhkan suatu senyawa untuk terelusi keluar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
dari kolom hingga sampai ke detektor. Adapun kromatogram yang didapatkan
sebagai berikut.
Gambar 5. Kromatogram baku kuersetin 65 ppm
Gambar 6. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (silika)
Berdasarkan hasil kromatogram di atas menunjukkan bahwa fraksi hasil
elusi dengan n-heksana tidak menunjukkan adanya kuersetin. Hal ini ditunjukkan
dengan tidak munculnya puncak kuersetin pada sekitar menit 10. N-heksana tidak
melarutkan kuersetin sehingga n-heksana tidak mampu mengelusi kuersetin dari
fase diam, kuersetin lebih teradsorpsi pada fase diam silika.
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
Gambar 7. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (silika)
Pada kromatogram fraksi etil asetat terdapat puncak dengan tR 10,428
menit. Puncak tersebut adalah puncak kuersetin karena memiliki tR yang mirip
dengan tR baku kuersetin. Etil asetat mampu mengelusi kuersetin karena kuersetin
larut dalam etil asetat dan juga etil asetat mampu berinteraksi dengan kuersetin.
Gambar 8. Kromatogram hasil elusi dengan metanol
Pada kromatogram fraksi metanol terdapat puncak dengan tR 10,429
menit yang merupakan puncak kuersetin karena kemiripan tR-nya dengan baku
Kuersetin
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
kuersetin. Metanol mampu mengelusi kuersetin karena kuersetin larut dalam
metanol dan metanol mampu berinteraksi dengan kuersetin.
Dari kromatogram di atas tampak bahwa etil asetat dan metanol mampu
mengelusi kuersetin. Area Under Curve kuersetin pada fraksi metanol lebih kecil
daripada AUC kuersertin pada fraksi etil asetat karena kuersetin yang tersisa
dalam cartridge tinggal sedikit, sebagian besar terlusi oleh etil asetat. Jumlah
puncak yang ada dalam kromatogram fraksi etil asetat dan metanol sama, yaitu 14
puncak.
Etil asetat mampu mengelusi kuersetin dengan jumlah besar, namun
demikian juga koekstraktan yang terikut juga banyak. Nilai resolusi kuersetin
dengan puncak di sebelah kirinya sebesar 0,5666 dan nilai resolusi kuersetin
dengan puncak di sebelah kanannya sebesar 1,3716. Hal ini menunjukkan bahwa
etil asetat tetap mengelusi koekstraktan yang memiliki kepolaran yang mirip
dengan kuersetin. Dengan sistem SPE ini nilai resolusi yang baik tidak tercapai,
nilai resolusi yang baik adalah RS ≥ 1,5.
2. Fase diam (cartridge) diol. Fase diam diol yang dipakai dalam
sistem ini merupakan sistem kromatografi fase normal. Dikatakan demikian
karena fase diam yang digunakan lebih polar daripada fase geraknya.
Pengkondisian dilakukan dengan mengalirkan metanol, etil asetat, dan n-
heksana secara berturut – turut. Digunakan etil asetat sebelum dialirkan n-heksana
karena metanol dan n-heksana tidak saling bercampur dalam volume yang sama
karena tidak terjadi interaksi antara n-heksana dengan metanol, serta adanya
perbedaan indeks polaritas yang jauh antara metanol (5,1) dan n-heksana (0,1).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
Oleh karena itu, dibutuhkan fase gerak yang semi polar yang mampu berinteraksi
dengan dua fase gerak tadi yaitu etil asetat dimana memiliki nilai indeks polaritas
4,4. Dengan demikian tidak ada molekul metanol yang tertinggal di cartridge saat
dialiri n-heksana karena sudah terelusi oleh adanya etil asetat.
Sejumlah 0,3 ml sampel dimasukkan ke dalam cartridge SPE silika
kemudian berturut – turut dielusi dengan 4 ml n-heksana, 4 ml etil asetat, dan 4 ml
metanol. Kuersetin larut dalam etil asetat dan metanol, namun tidak dalam n-
heksana. Dengan demikian fase gerak yang digunakan sebagai pembilas adalah n-
heksana.
Analisis kualitatif yang dilakukan adalah dengan membandingkan waktu
retensi (tR) baku kuersetin dengan puncak kromatogram fraksi n-heksana, fraksi
etil asetat, dan fraksi metanol yang memiliki tR yang mirip dengan kuersetin.
Adapun kromatogram yang didapatkan sebagai berikut.
Gambar 5. Kromatogram baku kuersetin 65 ppm
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Gambar 9. Kromatogram hasil elusi dengan n-heksana (diol)
Gambar 10. Kromatogram hasil elusi dengan etil asetat (diol)
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Gambar 11. Kromatogram hasil elusi dengan metanol (diol)
Dilihat dari kromatogram fraksi n-heksana, etil asetat, dan metanol
memiliki kemiripan profil kromatogram dengan kromatogram hasil SPE
menggunakan cartridge silika. Hal ini karena diol memiliki sistem kromatogrfi
fase normal seperti pada penggunaan cartridge silika.
Nilai resolusi puncak kuersetin yang didapatkan pada kromatogram
fraksi etil asetat juga tidak memenuhi parameter resolusi yang baik. Nilai resolusi
puncak kuersetin dengan puncak di sebelah kirinya adalah 0,4796, sedangkan nilai
resolusi puncak kuersetin dengan puncak di sebelah kanannya adalah 1,4549. Hal
ini menunjukkan bahwa etil asetat mengelusi senyawa lain yang memiliki
kepolaran yang mirip dengan kuersetin, yaitu senyawa yang memiliki tR yang
berdekatan dengan kuersetin.
3. Fase diam (cartridge) C18. Fase diam kolom SPE C18 merupakan
sistem kromatografi fase terbalik. Hal ini karena fase gerak yang digunakan lebih
polar daripada fase diamnya.
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Pengkondisian dilakukan dengan mengalirkan metanol kemudian
dialirkan HCl 0,002 N. Digunakan metanol karena metanol memiliki viskositas
yang rendah sehingga bisa membasahi seluruh partikel C18 pada kolom.
Kemudian HCl 0,002 N dialirkan agar suasana kolom menjadi asam. Digunakan
HCl 0,002 N karena pH-nya 3 sehingga masih masuk dalam range pH yang aman
untuk fase diam C18. Karena suasana asam maka kuersetin yang berada dalam
kolom akan berubah menjadi bentuk molekul sehingga kuersetin akan mengalami
retensi pada kolom C18.
Setelah dilakukan pengkondisian, sejumlah 0,2 ml sampel dimasukkan ke
dalam kolom SPE lalu dielusi menggunakan HCl 0,002 N. Pengelusian
menggunakan HCl 0,002 N berfungsi sebagai langkah washing (pembilasan)
untuk mengelusi koekstraktan yang larut dalam air. Kemudian dialirkan metanol
untuk mengelusi analit (kuersetin) beserta senyawa lain yang tidak larut dalam air
namun larut dalam metanol. Interaksi yang terjadi antara kuersetin dengan fase
diam C18 adalah interaksi van der Waals, sedangkan interaksi yang terjadi antara
kuersetin dengan metanol adalah interaksi hidrogen.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
Gambar 12. Kromatogram baku kuersetin 14 ppm
Gambar 13. Kromatogram hasil elusi dengan HCl 0,002 N
Pada kromatogram di atas tampak bahwa senyawa kuersetin masih ada
yang ikut terelusi oleh fase gerak HCl 0,002 N. Hal ini karena kuersetin memang
memiliki kelarutan pada aquabidest. Jumlah kuersetin yang terelusi tidak
sebanyak pada fase gerak metanol.
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
Gambar 14. Kromatogram hasil elusi dengan metanol
Pada fraksi ini tampak bahwa terdapat puncak kuersetin dilihat dari tR
puncak yang muncul pada menit 10,418. Kuersetin larut dalam metanol sehingga
kuersetin bisa terelusi oleh metanol. Nilai resolusi puncak kuersetin dengan
puncak di sebelah kirinya adalah 1,6773. Dengan demikian parameter resolusi
tercapai yaitu nilai resolusi lebih besar dari 1,5. Hal ini menunjukkan bahwa
kolom SPE C18 mampu menahan senyawa yang memiliki kepolaran mirip dengan
kuersetin yang ditunjukkan dengan tidak munculnya puncak dengan tR dekat
dengan kuersetin.
Metode SPE dengan larutan pembilas (washing) 0,002 N HCl dan
pengelusi metanol juga diaplikasikan pada sistem KCKT optimum yang
didapatkan oleh Dwiyoga (2012). Sistem KCKT tersebut menggunakan fase diam
oktildesilsilan (C18), campuran fase gerak metanol-aquabidest-asam fosfat 5%
(54:45:1), kecepatan alir 1,0 mL/menit, suhu oven 30° C dengan sistem gradien.
Adapun kromatogram yang didapatkan adalah sebagai berikut.
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
Gambar 15. Kromatogram baku kuersetin 10 ppm
Gambar 16. Kromatogram fraksi metanol
Kromatogram di atas merupakan hasil dari sistem KCKT elusi gradien.
Konsentrasi fase gerak metanol meningkat mulai menit ke-20 sehinga baseline
berubah menjadi naik. Tujuan memakai sistem elusi gradien agar puncak terakhir
cepat terelusi sehingga tidak memakan waktu lama untuk menunggu waktu
retensinya.
Dari kromatogram di atas didapatkan tR baku kuersetin pada menit
15,963 sehingga puncak yang memiliki tR 15,557 pada kromatogram fraksi
Kuersetin
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
metanol dipastikan menjadi puncak kuersetin. Dengan demikian puncak kuersetin
muncul di sekitar menit ke-15.
Resolusi yang didapatkan dari fraksi metanol dengan cartridge SPE C18
sejumlah 3x replikasi yaitu :
Tabel IV. Rata – rata resolusi
replikasi kiri puncak kuersetin
Rs puncak kuersetin
w (menit) tR (menit) w (menit) tR (menit)
1 9,333 7,242 7,824 2,695 16,688 13,801 14,532
2 9,959 7,301 7,948 2,227 17,32 13,91 14,706
3 10,815 10,098 10,261 4,061 16,851 14,96 15,557
rata - rata Rs 2,994
Rata – rata resolusi yang didapatkan dari 3x replikasi adalah 2,994. Dengan
demikian metode SPE cartridge C18 dengan larutan pengelusi metanol memenuhi
parameter resolusi. Dengan tertahannya senyawa yang memiliki tR dekat dengan
kuersetin pada cartridge SPE C18, maka proses clean up ini menunjang
tercapainya resolusi yang baik pada sistem KCKT tersebut.
Efisiensi clean up merupakan kemampuan suatu metode SPE dalam
mengurangi jumlah senyawa selain analit yang ikut terekstraksi. Senyawa –
senyawa selain analit yang ikut terekstraksi tersebut disebut koekstraktan.
Koekstraktan bisa menganggu proses determinasi suatu analit, oleh karena itu
sebisa mungkin jumlah koekstraktan dikurangi.
Cara menghitung efisiensi clean up adalah dengan membandingkan
jumlah senyawa sebelum SPE dan sesudah SPE. Adapun kromatogram sampel
yang sebelum sebagai berikut :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Gambar 17. Kromatogram sampel sebelum SPE
Pada kromatogram fraksi metanol SPE C18 dari kromatogram –
kromatogram sebelumnya didapatkan 9 – 10 puncak dan dari kromatogram
sampel sebelum SPE di atas terdapat 16 puncak. Hal ini menunjukkan bahwa
metode SPE mampu mengurangi jumlah koekstraktan. Adapun perhitungannya
adalah (𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸−𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑠𝑢𝑑𝑎 ℎ 𝑆𝑃𝐸)
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑢𝑛𝑐𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸 𝑥 100% =
(16−9)
16 𝑥 100% = 43,75%. Karena ada puncak kromatogram berjumlah 10
Kuersetin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
puncak maka didapatkan juga hasil perhitungan efisiensi clean up sebesar 37,5%.
Dengan demikian nilai efisiensi clean up metode ini adalah 37,5 – 43,75%. Angka
tersebut menunjukkan bahwa metode ini kurang efisien.
E. Optimasi Volume Fase Gerak (Eluen)
Tujuan dilakukannya optimasi volume fase gerak pengelusi adalah untuk
mendapatkan berapa volume fase gerak pengelusi (metanol) yang dibutuhkan agar
semua analit terelusi dari kolom SPE. Dengan mendapatkan kepastian seberapa
jumlah volume metanol yang dibutuhkan maka diharapkan mampu
mengefisienkan penggunaan sejumlah metanol sebagai eluen. Jika penggunaan
fase gerak efisien maka tidak akan membuang – buang metanol berlebih atau pun
sebaliknya yaitu volume eluen tidak kurang untuk menarik analit.
Tabel V. Optimasi volume eluen
volume eluen (ml) AUC (dalam 100000)
replikasi 1 replikasi 2 rata - rata
5 2,51277 2,4758 2,494285
7,5 2,92801 2,87266 2,900335
10 2,60228 2,62976 2,61602
Volume sampel yang dimasukkan ke dalam kolom SPE C18 adalah 0,1
ml. Kemudian dibilas (washing) menggunakan HCl 0,002 N sejumlah 6 ml yang
selanjutnya dielusi dengan metanol sejumlah 5 ml; 7,5 ml; dan 10 ml. Respon
Area Under Curve (AUC) pada masing – masing volume berbeda – beda dengan
rata – rata 2494285 mV untuk volume metanol 5 ml, 2900335 mV untuk volume
metanol 7,5 ml, dan 2616020 mV untuk volume metanol 10 ml. Peningkatan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
AUC pada volume 7,5 ml disebabkan karena kesalahan pada saat pengisian
sampel yang tidak pas 0,1 ml sehingga terjadi kenaikan AUC.
Gambar 18. Kurva volume eluen vs AUC
Volume eluen dan respon AUC yang didapatkan kemudian diplotkan
untuk mengetahui hubungan antara penambahan volume eluen dengan respon
AUC dan didapatkan persamaan y = 0,024x + 2,487. Dengan menggunakan one
sample t-test, nilai slope 0,024 dibandingkan dengan nilai 0 untuk mengetahui ada
atau tidaknya perbedaan yang bermakna antara kedua nilai tersebut. Didapatkan
bahwa t hitung = 1,0496 < t tabel = 4,30. Dengan demikian tidak ada perbedaan
signifikan antara antara nilai slope dengan 0. Hal ini menunjukkan penambahan
volume eluen tidak akan memberikan perbedaan berarti pada nilai AUC. Oleh
karena itu volume metanol pengelusi yang dipakai adalah 5 – 10 ml. Namun lebih
dipilih volume pengelusi tidak lebih dari 10 ml agar koekstraktan yang terjerap
pada fase diam C18 tidak ikut terelusi.
y = 0,024x + 2,487R² = 0,085
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
0 2 4 6 8 10 12
AU
C
volume metanol (ml)
kurva volume eluen vs AUC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
F. Penentuan Kapasitas Kolom SPE C18
Penentuan kapasitas kolom SPE bertujuan untuk mengetahui kemampuan
cartridge SPE dalam menahan (retensi) sampel dalam jumlah tertentu. Dalam hal
ini bertujuan untuk mencari batasan volume sampel yang boleh dimasukkan ke
dalam kolom SPE agar mampu tertahan di kolom.
Penentuan kapasitas kolom ini dilakukan dengan mengubah volume
sampel yang dimasukkan ke dalam kolom SPE dari 0,05 ml; 0,1 ml; dan 0,2 ml.
Kemudian sampel dielusi pertama dengan HCl 0,002 N lalu dielusi dengan
metanol. Jika ada kuersetin yang terelusi oleh HCl 0,002 N maka hal itu
menunjukkan bahwa cartridge SPE tidak bisa menahan sampel.
Gambar 19. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,05 ml sampel
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Gambar 20. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,1 ml sampel
Gambar 21. Kromatogram fraksi HCl 0,002 N pada pengisian 0,2 ml sampel
Dari 3 kromatogram fraksi HCl 0,002 N di atas menunjukkan tidak
adanya puncak yang terdeteksi pada tR 15 menit dimana pada menit tersebut
muncul puncak kuersetin. Hal ini menunjukkan pada pengisian sampel sejumlah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
0,005 – 0,2 ml pada cartridge SPE C18, kuersetin masih bisa ditahan. Batas
sampai dimana analit tidak tertahan lagi di cartridge SPE tidak diketahui, karena
hanya dilakukan pengisian sampel hingga volume 0,2 ml.
Kinerja proses clean up pada fase diam C18 adalah dengan menjerapkan
analit pada fase diam kemudian dielusi dengan metanol. Adanya HCl 0,002 N
menyebabkan suasana asam sehingga analit berada dalam bentuk molekul dan
terjerap ke fase diam. Koekstraktan yang tidak terjerap pada fase diam akan
terelusi oleh HCl 0,002 N. Kemudian dialiri metanol untuk mengelusi analit
(kuersetin). Namun ada juga koekstraktan yang terjerap pada fase diam, dan tidak
terelusi oleh metanol. Di sinilah peran fase diam C18 dalam proses clean up ini,
yaitu ada koekstraktan yang terelusi oleh HCl 0,002 N dan ada juga yang terjerap
pada fase diam C18 namun tidak terelusi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian, dapat diambil kesimpulan bahwa metode
SPE kolom C18 dapat digunakan untuk mengurangi jumlah senyawa – senyawa
lain (koekstraktan) pada ekstrak teh hijau dengan menggunakan larutan pencuci 6
ml HCl 0,002 N dan larutan pengelusi 5 - 10 ml metanol pada volume pengisian
sampel 0,1 ml dengan parameter optimum resolusi 2,994 namun didapatkan
efisiensi clean up yang kurang baik, yaitu 37,5 – 43,75%.
B. Saran
Perlu dilakukan optimasi clean up kuersetin dengan menggunakan
cartridge SPE lain, yaitu C4 dan C8 untuk fase terbalik, serta NH2 untuk fase
normal dengan jenis dan komposisi fase gerak yang menghasilkan efisiensi clean
up yang lebih baik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
DAFTAR PUSTAKA
Dharma, P.S., 2012, Optimasi Proses Ekstraksi Kuersetin Total pada Teh Hijau
dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri, Skripsi,
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986, Sediaan Galenik,
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, pp. 3-7, 26.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope
Indonesia, edisi IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta,
299, 1009-1010.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 2010, Acuan Sediaan
Herbal, volume kelima, edisi I, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta, 299, 64-65.
Dwiyoga, A.R.H., 2012, Optimasi dan Validasi Penetapan Kadar Kuersetin
Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase Terbalik
dalam Teh Hijau (Camelia sinensis O.K.), Skripsi, Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta.
Gandjar, I.G. dan Rohman, A., 2009, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta, pp. 379.
Hendayana, S., 2006, Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis
Modern, PT. Remaja Rosdakarya, Bandung, 21-25.
Kodama, D.H., Goncalves, A.E.d.S.S., Lajolo, F.M., and Genovese, M.I., 2010, Flavonoids, Total Phenolics and Antioxidant Capacity: Comparison
between Commercial Green Tea Preparations, Ciencia e Technologia de
Alimentos, 1077.
Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh
Kosasih Padmawinata, hal. 15, Penerbit ITB, Bandung.
Mokgadi, J., Mmualefe, L.C., and Torto, N., 2009, SampliQ OPT Solid Phase
Extraction Sorbent in the Cleanup of Flavonoids in Ginkgo Biloba by
HPLC-DAD, Agilent Technologies, 1 – 8.
Munson, J. W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Methods, diterjemahkan
oleh Harjana, Parwa B., Volume II, hal. 13-5, 8Airlangga University
Press, Surabaya.
Paulsen, S., 2003, Quercetin Monograph, diakses tanggal 19 Februari 2012
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Pescok, R. L., Shields, L. D., and Cains, T., 1976, Modern Methods of Chemical
Analysis, 2nd
ed, John Wiley & Sons, Canada, pp. 51.
Phani, Ch. R. S., Vinaykumar, Ch., Rao, K.U., and Sindhuja, G., 2010,
Quantitative Analysis of Quercetin in Natural Sources by RP-HPLC,
IJRPBS, 19.
Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, edisi 1, Graha Ilmu,
Yogyakarta, pp. 36 – 38.
Sibuea, P., 2006, Makan Sehat Hidup Sehat, hal 162-165, diakses tanggal 3 april
2011.
Silva, A. F. V. D., 2012, Validasi Metode dalam Penetapan Kadar Kuersetin Total
dalam Daun Teh Segar (Camellia sinensis O.K.), Teh Hijau, dan Teh
Hitam Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Fase Terbalik, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC Method
Development, 2nd Edition, JohnWiley & Sons, Inc., New York, pp. 690.
Soraya, N., 2007, Sehat dan Cantik Berkat Teh Hijau, diakses tanggal 3 April
2011.
Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy, Penerbit
ITB, Bandung, pp. 1-8.
The Merck Index, 1989, The Merck Index An Encyclopedia Of Chemicals Drugs
and Biological, Eleventh edition, Merck & Co., Inc., USA, pp.1278.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
Lampiran 1. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam C18
1. Kromatogram fase diam C18 dengan fase gerak 0,002 N HCl replikasi 1
2. Kromatogram fase diam C18 dengan fase gerak metanol replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
3. Kromatogram fase diam C18 dengan fase gerak 0,002 N HCl replikasi 2
4. Kromatogram fase diam C18 dengan fase gerak metanol replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
Lampiran 2. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam diol
1. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak n-heksan replikasi 1
2. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak etil asetat replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
3. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak metanol replikasi 1
4. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak n-heksan replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
5. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak etil asetat replikasi 2
6. Kromatogram fase diam diol dengan fase gerak metanol replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
Lampiran 3. Kromatogram optimasi jenis fase gerak pada fase diam silika
1. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak n-heksan replikasi 1
2. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak etil asetat replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
3. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak metanol replikasi 1
4. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak n-heksan replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
5. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak etil asetat replikasi 2
6. Kromatogram fase diam silika dengan fase gerak metanol replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
Lampiran 4. Kromatogram optimasi volume
1. Volume eluen 5 ml metanol replikasi 1
2. Volume eluen 5 ml metanol replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
3. Volume eluen 7,5 ml metanol replikasi 1
4. Volume eluen 7,5 ml metanol replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
5. Volume eluen 10 ml metanol replikasi 1
6. Volume eluen 10 ml metanol replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
Lampiran 5. Kromatogram kapsitas
1. Fraksi air pada 0,05 ml sampel replikasi 1
2. Fraksi metanol pada 0,05 ml sampel replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
3. Fraksi air pada 0,05 ml sampel replikasi 2
4. Fraksi metanol pada 0,05 ml sampel replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
5. Fraksi air pada 0,1 ml sampel replikasi 1
6. Fraksi metanol pada 0,1 ml sampel replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
7. Fraksi air pada 0,1 ml sampel replikasi 2
8. Fraksi metanol pada 0,1 ml sampel replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
9. Fraksi air pada 0,2 ml sampel replikasi 1
10. Fraksi metanol pada 0,2 ml sampel replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
11. Fraksi air pada 0,2 ml sampel replikasi 2
12. Fraksi metanol pada 0,2 ml sampel replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
Lampiran 6. Contoh cara perhitungan resolusi
Rumus: Rs = 2 ( 𝑡𝑅2−𝑡𝑅1 )
( 𝑊2+ 𝑊1 )
Rs = 2 ( 10,422−9,544 )
( 12,603−9,814 + (9,82−8,948))
= 0,479650369
Rs = 2 ( 10,363−8,856 )
( 13,033−9,741 + (9,637−8,637))
= 0,702236719
Lampiran 7. Contoh cara perhitungan efisiensi clean up
Rumus :
efisiensi clean up = (𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑒𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸−𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑒𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑠𝑢𝑑𝑎 ℎ 𝑆𝑃𝐸)
𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎 ℎ 𝑝𝑒𝑎𝑘 𝑠𝑒𝑏𝑒𝑙𝑢𝑚 𝑆𝑃𝐸 𝑥 100%
efisiensi clean up = (16−9)
16 𝑥 100%
= 43,75%
efisiensi clean up = (16−10)
16 𝑥 100%
= 37,5%
Lampiran 8. Contoh cara perhitungan t-test
Rumus : t = (rata – rata – nilai yang diketahui) x √jumlah sampel/standar deviasi
Diketahui persamaan : y = 0,02435x + 2,48761
Standar deviasi yang didapatkan = 0,0401822
t = (0,02435 – 0) x √3/0,0401822 = 1,0496
t hitung = 1,0496
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
derajat kebebasan = n-1 = 3-1 = 2 t tabel untuk tingkat kepercayaan 95% =
4,30
t hitung < t tabel tidak berbeda signifikan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul “Optimasi Clean Up Ekstrak
Metanol Air The Hijau dengan Menggunakan Metode Solid
Phase Extraction (SPE) Untuk Determinasi Kuersetin dalam
Teh Hijau” bernama lengkap Adi Wirasaputra. Penulis lahir
di Klaten pada tanggal 20 Oktober 1989 sebagai anak
pertama dari pasangan Tri Setiyo Widiyanto dan Yuniati
Dewi Dyah Kuswandari. Penulis telah menyelesaikan pendidikannya di SD Maria
Assumpta Klaten (2002), di SMP Pangudi Luhur 1 Klaten (2005), SMA Kolese
De Britto Yogyakarta (2008). Penulis melanjutkan pendidikannya di Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2008. Selama
menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta, penulis aktif dalam kegiatan seperti menjadi panitia Pharmacy
Performances and Event Cup 2008, panitia TITRASI 2009, menjadi panitia
Pharmacy Performances and Event Cup 2010, kegiatan donor darah, dan panitia
pelepasan wisuda.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI