PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk filei optimasi komposisi dan flow rate fase gerak pada penentuan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk dengan menggunakan

i

OPTIMASI KOMPOSISI DAN FLOW RATE FASE GERAK PADAPENENTUAN KADAR TEOBROMIN DAN KAFEIN DALAM COKELATBUBUK DENGAN MENGGUNAKAN METODE KROMATOGRAFI CAIR

KINERJA TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Eka Riusinta Wati088114160

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGTAKARTA2012

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

Persetujuan Pembimbing



Skripsi yang diajukan oleh:Eka Riusinta WatiNIM : 088114160

telah disetujui oleh


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Tuhan selalu mendengar lebih dari apa yang kita katakan, mengerti

lebih dari apa yang kita dapat ungkapkan, memberi lebih dari yang

kita minta dan akan menjawab lebih dari apa yang kita tanya. Hanya

jalan dan caranya yang kita tidak pernah tahu. Tuhan selalu ada

disamping kita kapanpun itu.

Harta yang paling berharga adalah keluarga.

Karya Tulis ini saya persembahkan kepada

Kedua Orang Tua

Adik tercinta

Sahabat tersayang

Keluarga terkasih


v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Apabila di kemudian hari diberlakukan indikasi plagiarism dalam naskah

ini, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-

undangan yang berlaku.

Yogyakarta, Februari 2012

Penulis

(Eka Riusinta Wati)


vi

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAHUNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan dibawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Eka Riusinta WatiNomor Mahasiswa : 088114160

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada PerpustakaanUniversitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:



beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikankepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalandata, mendistribusikan secara terbatas, mempublikasikannya di internet ataumedia lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari sayamaupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama sayasebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : Februari 2012

Yang menyatakan

(Eka Riusinta Wati)


vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas

berkat dan anugerah yang telah diberikan sehingga penelitian dan penyusunan

skripsi dengan judul “Optimasi Komposisi dan Flow Rate Fase Gerak pada

Penentuan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Cokelat Bubuk dengan

Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” dapat

diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu

persyaratan untuk memperoleh gelar Sarjana Strata Satu Prograam Studi Ilmu

Farmasi (S. Farm).

Dalam menyelesaikan skripsi ini, penulis mengalami permasalahan dan

kesulitan. Namun dengan adanya dukungan, bantuan dan semangat dari berbagai

pihak, penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan skripsi ini dengan

baik. Oleh karena itu, dengan segala hormat, penulis ingin mengucapkan terima

kasih atas bantuan yang telah diberikan, kepada:

1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah

membimbing, memberi masukan dan jalan keluar serta saran yang sangat

bermanfaat dalam menyelesaikan penelitian ini hingga penyusunan naskah

skripsi.


viii

3. Jeffry Julianus, M.Si. dan Dra. M.M. Yetty Tjandrawati, M.Si. selaku Dosen

Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membangun dalam

penyusunan skripsi.

4. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah

mendampingi, membagi ilmu dan pengalamannya yang sangat bermanfaat

dalam bidang farmasi.

5. Seluruh Staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

terutama Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto dan Mas Ottok yang telah banyak

membantu dan bersedia untuk direpotkan selama penulis menyelesaikan

penelitian skripsi ini.

6. Kepada adikku tercinta Setyanti Dwi Hartati untuk doa dan dukungannya

selama ini. Keluarga besar ku Pakde, Bude, Om, Bulek, kakak sepupu dan

adik sepupu, terutama Hita yang selalu memberikan semangat dan pengertian

selama penulis menyelesaikan penelitian skripsi ini.

7. Monica Satya Resmi Yunita dan Melisa Darmawan, sahabat dan teman satu

penilitian yang berjuang bersama dalam suka dan duka, saling menyemangati

saat salah satu sedang terpuruk. Terima kasih untuk pengalaman bersama

selama hampir empat tahun kebersamaan kita dan menyelesaikan skripsi

bersama.

8. Mbak Dju, Nyot, Bro Brian, Dhimbek, Kak Cos, Cik Seco, Vica, Abung Aldo,

Cici, Aga, Yuni dan Kimpul untuk persahabatan yang telah terjalin selama

ini, terima kasih untuk doa, saran, suka, duka dan pengalaman bersama.


ix

9. Teman-teman di grup Anti Stres untuk segala canda tawa, lelucon, semangat,

saran dan kesannya selama berjuang bersama di laboratorium.

10. Teman-teman kost yang selalu mau mendengarkan keluh kesahku dan

pengalaman tinggal bersama selama ini.

11. Semua teman-teman FST B dan Farmasi-C 2008 untuk cerita, pengalaman dan

kebersamaannya selama ini. Semua teman-teman angkatan 2008 yang tidak

akan terlupakan.

12. Teman curhat ku yang selalu mau menyediakan waktu untuk mendengarkan

cerita, keluh kesahku, tawa dan tangisku selama ini. Terima kasih untuk mau

menjadi telinga dan mataku juga, terima kasih.

13. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu, namun sudah sangat

membantu selama menyelesaikan penelitian dan penyusunan naskah. Terima

kasih untuk seluruh dukungannya.

Penulis menyadari bahwa didalam skripsi ini masih banyak kekurangan.

Oleh karena itu, segala kritik dan saran yang membangun sangat diharapkan

penulis. Semoga skripsi ini dapat membantu dan bermanfaat bagi pembaca dan

dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis


x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL …………………………………………….……… i

HALAMAN PERSETUJUAN ……………………………………........ ii

HALAMAN PENGESAHAN…………………………………………… iii

HALAMAN PERSEMBAHAN………………………………………… iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA…………………………………. v

LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA……………………. vi

PRAKATA…………………………………………………………….... vii

DAFTAR ISI……………………………………………………………. x

DAFTAR TABEL………………………………………………………. xiii

DAFTAR GAMBAR……………………………………………………. xv

DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………….. xvii

INTISARI……………………………………………………………….. xix

ABSTRACT……………………………………………………………… xx

BAB I PENDAHULUAN……………………………………………... 1

A. Latar Belakang…………………………………………………. 1

1. Permasalahan ………………………………………………. 3

2. Keaslian Penelitian ………………………………………….. 3

3. Manfaat penelitian ………………………………………… 5

B. Tujuan Penelitian ………………………………………………. 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA…………………………………... 6

A. Cokelat …………………………………………………………. 6

B. Kafein ………………………………………………………….. 6


xi

C. Teobromin …………………………….………………………… 8

D. Metode Analisis Teobromin dan Kafein Terdahulu ……….……. 9

E. Spektrofotometer UV………………...………………………….. 10

F. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ...…………………………….. 12

1. Definisi dan instrument .…………………………………….. 12

2. Pemisahan yang optimal dalam kromatografi ………………. 19

G. Landasan teori ………………………………………………..….. 27

H. Hipotesis ………………………………………………………… 28

BAB III METODE PENELITIAN……………………….……….…. 29

A. Jenis dan rancangan penelitian ………………………………….. 29

B. Variabel Penelitian ……………………………………………… 29

C. Definisi Operasional …………………………………………….. 30

D. Bahan-bahan Penelitian ……………………………...………….. 30

E. Alat-alat Penelitian …………………………………….……….. 30

F. Tatacara Penelitian ………………………………..……………..

1. Penyiapan fase gerak metanol : akuabides/TEA3%…….……

2. Pembuatan seri larutan baku kafein dan teobromin …………

3. Optimasi metode KCKT fase terbalik …………...…………..

31

31

32

32

G. Analisis Hasil Optimasi ……………………………….…………

1. Analisis kualitatif ………………………………….…………

2. Analisis pemisahan peak kafein dan teobromin ……………..

a. Bentuk peak ………………………………………..…….

b. Waktu retensi ………………………………….…………

34

34

34

34

34


xii

c. Nilai Resolusi…………………………………………….

d. Nilai HETP ………………………………………………

35

35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN…..……………………..…….

A. Pemilihan Pelarut ………………………………………..……….

B. Pembuatan Fase Gerak …………………………………..………

C. Pembuatan Larutan Baku ……………………………….………..

D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Teobromin dan Kafein

dengan Spektrofotometri UV-Vis ………………..………

E. Kalibrasi Flow rate ………………………………………..…….

F. Optimasi Komposisi dan Flow Rate Fase Gerak pada pemisahan

Teobromin dan Kafein dengan KCKT Fase Terbalik …………...

1. Fase Gerak metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70 dengan flow

rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit …………...…………….


rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit …………...…………….


rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit ………...……………….

36

36

36

39

41

46

47

59

63

66

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN..…………….………………...

A. Kesimpulan ……………………………..………………………..

B. Saran ……………………………………..………………………

75

75

75

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………… 76

LAMPIRAN …………………………………………………………….. 79

BIOGRAFI PENULIS ……………………………………………..……. 101


xiii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I Deret eluotrofik pelarut-pelarut untuk KCKT………………. 15

Tabel II Komposisi fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%.............. 31

Tabel III Indeks polaritas campuran fase gerak metanol :

akuabides/TEA3%.................................................................... 39

Tabel IV Kalibrasi Flow rate pada KCKT……………………………. 47

Tabel V Waktu retensi Baku campuran teobromin dan kafein masing-

masing 100 ppm……………………………………………. 52

Tabel VI Tailing factor pada campuran baku teobromin dan kafein

masing-masing 100 ppm pada fase gerak metanol :

akuabides/TEA 3% 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 pada flow

rate 0,5; 0,8 dan 1 mL/menit ……………………………....... 56

Tabel VII Nilai HETP pada campuran baku teobromin dan kafein



rate 0,5; 0,8 dan 1 mL/menit ………………………………... 57

Tabel VIII Nilai Resolusi pada campuran baku teobromin dan kafein



rate 0,5; 0,8 dan 1 mL/menit ………………………………... 58

Tabel IX Uji Kesesuaian Sistem KCKT untuk pemisahan teobromin

pada campuran larutan baku teobromin dan kafein


xiv

konsentrasi 40, 80 dan 160 ppm pada fase gerak metanol :

akuabides/TEA 3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit ………. 71

Tabel X Uji Kesesuaian Sistem KCKT untuk pemisahan kafein pada

campuran larutan baku teobromin dan kafein konsentrasi 40,

80 dan 160 ppm pada fase gerak metanol : akuabides/TEA

3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit ………………………... 72

Tabel XI Uji Kesesuaian Sistem KCKT untuk resolusi pada campuran

larutan baku teobromin dan kafein konsentrasi 40, 80 dan

160 ppm pada fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%

40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit …………………………….. 73


xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Theobroma cacao………………………………………… 6

Gambar 2. Struktur kafein……………………………………………. 7

Gambar 3. Struktur teobromin………………………………...……... 8

Gambar 4. Diagram KCKT…………………………………….…….. 14

Gambar 5. Skema penyuntikkan keluk………………………….…… 17

Gambar 6. Pengukuran efisiensi Kromatografi puncak Gaussian…… 20

Gambar 7 Difusi Eddy………………………………………………. 23

Gambar 8. Transfer massa pada fase diam …………………………... 23

Gambar 9. Transfer massa pada fase gerak ………………………….. 24

Gambar 10. Ilustrasi waktu dan volume retensi pada kromatografi…... 25

Gambar 11. Pemisahan dua senyawa………………………………….. 25

Gambar 12. Menghitung besarnya tailing factor pada kromatogram…. 26

Gambar 13. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam……….... 27

Gambar 14. Struktur TEA……………………………………………... 37

Gambar 15. Interaksi TEA dengan residu silanol …………………….. 38

Gambar 16. Gugus kromofor pada teobromin dan

kafein………………………………………………………. 42

Gambar 17. Spektra serapan kafein dengan maks= 275 nm……………. 42

Gambar 18. Spektra serapan teobromin dengan maks= 275 nm ……… 44

Gambar 19. Bagian nonpolar teobromin dan kafein………………….… 47

Gambar 20. Interaksi kafein dengan fase diam C18 melalui interaksi


xvi

van Der Waals ………………………………………….. 48

Gambar 21. Interaksi teobromin dengan fase diam C18 melalui

interaksi van Der Waals …………………………………. 48

Gambar 22. Interaksi kafein dengan fase gerak metanol :

akuabides/TEA 3% melalui ikatan hidrogen…………...… 49

Gambar 23. Interaksi teobromin dengan fase gerak metanol :

akuabides/TEA 3% melalui ikatan hidrogen…………...… 49

Gambar 24. Kromatogram baku tunggal teobromin (A.1) dan kafein

(A.2), dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% 40

: 60 dengan flow rate 0,8 mL/menit ………………… 51

Gambar 25. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein

masing-masing 100 ppm, dengan fase gerak metanol :

akuabides/TEA 3% 30 : 70 dengan flow rate 0,5 mL/menit

……………………………………………….. 60




………………………………………………… 60




……………………………………………….. 61



xvii



………………………………………………. 63




………………………………………………… 64




……………………………………………….. 64




……………………………………………….. 67



akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow rate 0,8

mL/menit…………………………………………………. 67



akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow rate 1,0

mL/menit………………………………………………… 68


xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Certificate of Analysis Teobromin ……………………. 80

Lampiran 2. Certificate of Analysis Kafein………………………….. 81

Lampiran 3. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak

metanol : akuabides/TEA 3% (30 : 70) ……………… 82


metanol : akuabides/TEA 3% (35 : 65) ………………. 84


metanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60) ………………. 86

Lampiran 6. Nilai Tailing Factor (TF) peak teobromin dan kafein pada

fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% dan contoh

perhitungan ………………………………………………. 88

Lampiran 7. Nilai HETP dari peak teobromin dan kafein pada fase

gerak metanol : akuabides/TEA 3% dan variasi flow rate

serta contoh perhitungan ………………………………. 89

Lampiran 8. Nilai Resolusi (Rs) peak teobromin dan kafein pada fase

gerak metanol : akuabides/TEA 3% dan variasi flow rate

serta contoh perhitungan ………………………………… 91

Lampiran 9. Uji Kesesuaian Sistem KCKT. Kromatogram teobromin

dan kafein konsentrasi 40 ppm ….……………………….. 92


dan kafein konsentrasi 80 ppm ………………………… 95


xix


dan kafein konsentrasi 160 ppm ………………………… 98


xx

INTISARI

Kafein dan teobromin merupakan kandungan utama dalam cokelat bubuk.Keduanya memiliki efek farmakologi yang dapat memberikan stimulan padatubuh. Dalam produk cokelat bubuk perlu dipastikan bahwa terdapat kafein danteobromin sebagai kandungan utamanya dan seberapa besar kadarnya.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi umum dariKromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik sebagai metode yangdigunakan dalam penetapan kadar kafein dan teobromin dalam cokelat bubuk.Sistem KCKT fase terbalik menggunakan kolom Oktadesilsilan Kromasil 100-5C18 dimensi 250 x 4,6 mm ukuran partikel 5µm dengan fase gerak metanol :akuabides/TEA 3%. Optimasi dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak(30 : 70); (35 : 65) dan (40 : 60) serta flow rate yaitu 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menitdengan detektor ultraviolet 275 nm.

Kondisi optimum sistem KCKT adalah fase gerak metanol :akuabides/TEA3% (40 : 60) pada flow rate 0,8 mL/menit. Kondisi optimum initelah memenuhi parameter pemisahan yang baik yaitu nilai tailing factor 1,67,waktu retensi kurang dari 10 menit, nilai resolusi >1,5 yaitu 2,945 dan nilai HETPyang paling kecil yaitu 0,0362 untuk teobromin dan 0,0143 untuk kafein.

Kata Kunci: Kafein, teobromin, cokelat, optimasi metode, KCKT fase terbalik


xxi

ABSTRACT

Caffeine and theobromine are the main compounds in cocoa powder. Bothof them have pharmacological effect as a stimulant. It is necessary to determinethat caffeine and theobromine are found as the main compound and how much itconsist.

This study aims to determine the optimum conditions for reversed phaseHigh Performance Liquid Chromatography (HPLC) to determine caffeine andtheobromine in cocoa powder. Reversed phase HPLC uses Kromasil 100-5C18,250 x 4,6 mm, particle size 5µm with methanol : aquabidest/TEA 3% as mobilephase. Optimation could be done by changing the composition of the mobilephase (30 : 70); (35 : 65) and (40 : 60) and the flow rate as 0,5; 0,8 and 1 mL/minwith ultraviolet 275 nm.

The optimum condition of HPLC that could be achieved is methanol :aquabidest/TEA 3% (40 : 60) in the flow rate 0,8 mL/min. This optimumcondition has fulfill the good separation parameter which are tailing factor value1,67, retention time < 10 minutes, resolution value is 2,945 and the smallest valueof HETP which is 0,0362 for theobromine and 0,0143 for caffeine.

Keywords: Caffeine, theobromine, cocoa, optimation method, reversed phaseHPLC


xxii


1

BAB I

PEDAHULUAN

A. Latar Belakang

Cokelat merupakan salah satu makanan yang sering dikonsumsi oleh

masyarakat umum, mulai dari anak kecil sampai orang dewasa. Berbagai bentuk

dan sediaan cokelat yang dikonsumsi mulai dari cokelat batangan, cokelat cair dan

cokelat bubuk. Beberapa kandungan yang ada dalam cokelat adalah teobromin

dan kafein. Kedua senyawa ini yang menyebabkan adanya rasa pahit dalam

cokelat (Ramli et al., 2000).

Teobromin dan kafein merupakan golongan metilksantin yang memiliki

efek farmakologis berupa peningkatan kesadaran pada sistem saraf pusat atau

sebagai stimultan (Czech et al., 2011). Mengingat fungsinya sebagai stimulan,

maka seorang yang mengkonsumsi cokelat dapat meningkat aktivitas kerjanya

karena kesadarannya juga meningkat, sedangkan teobromin juga memiliki fungsi

sebagai diuretik (Ramli et al., 2000). Efek stimulant ini lah yang sering menjadi

alasan bagi konsumen untuk mengkonsumsi cokelat.

Dewasa ini, banyak produsen yang melakukan kecurangan dengan

menggunakan pewarna ataupun perasa sintesis untuk menurunkan biaya produksi

sehingga bisa mendapatkan keuntungan yang lebih besar. Dengan demikian perlu

dilakukan penjaminan mutu dari cokelat untuk mengetahui apakah benar

mengandung cokelat. Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan apakah

benar dalam produk cokelat yang akan dianalisis mengandung teobromin dan

kafein sebagai unsur utama yang ada dalam cokelat. Struktur teobromin dan


2

kafein memiliki kemiripan sehingga diperlukan metode yang tepat untuk

memisahkan kedua senyawa tersebut dan melakukan penetapan kadar.

Sebelum dilakukan penetapan kadar teobromin dan kafein dari sampel,

maka perlu dilakukan optimasi pada sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT) untuk mendapatkan kondisi yang optimal. Tujuan dari optimasi ini adalah

agar sistem KCKT dapat memberikan hasil yang optimal yaitu dapat memberikan

pemisahan yang baik pada senyawa teobromin dan kafein yang akan ditetapkan

kadarnya.

Pada penelitian ini, akan dilakukan optimasi sistem KCKT dengan

melakukan perubahan komposisi dan flow rate fase gerak. Optimasi perbandingan

fase gerak yang dimaksudkan adalah optimasi perbandingan komposisi fase gerak

yang paling baik memberikan pemisahan dengan melihat nilai resolusinya (Rs).

Fase gerak yang digunakan dalam sistem KCKT ini adalah campuran metanol dan

akuabides yang mengandung trietilamin (TEA) 3%. Optimasi flow rate yang

dimaksudkan adalah flow rate fase gerak yang digunakan hingga dapat

memisahkan analit dengan baik dilihat dari bentuk kromatogramnya.

Kondisi yang optimal ditentukan berdasarkan nilai resolusi pemisahan

antara teobromin dan kafein serta nilai waktu retensi (tR) yang dihasilkan pada

saat pemisahan dengan KCKT. Nilai resolusi (Rs) yang optimal adalah > 1,5

(Gandjar dan Rohman, 2007). Untuk waktu retensi yang optimal ditunjukkan

dengan nilai (tR) yang tidak terlalu lama. Dengan demikian sistem KCKT yang

optimal didapatkan saat kromatogram tiap analit terpisah dengan baik dan nilai

(tR) tidak terlalu lama sehingga metode yang digunakan lebih efisien.


3

Sistem KCKT fase terbalik yang telah optimal dapat digunakan pada

rangkaian penelitian berikutnya yaitu pada validasi metode KCKT fase terbalik

dan aplikasinya pada penetapan kadar teobromin dan kafein dalam sampel cokelat

bubuk merk “x”.

1. Permasalahan

Bagaimanakah kondisi optimal sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

untuk melakukan penetapan kadar teobromin dan kafein terkait perbandingan

komposisi dan flow rate fase gerak?

2. Keaslian Penelitian

Sepengetahuan peneliti, metode analisis untuk menetapkan kadar

teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk dengan menggunakan fase gerak

metanol : akuabides/TEA 3% dengan metode KCKT fase terbalik belum pernah

dilakukan.

Pada penelitian oleh Ramli et al. (2000), penetapan kadar teobromin dan

kafein dilakukan pada buah cokelat dengan menggunakan fase gerak metanol :

akuabides : asam asetat (20 : 79 : 1), dan menggunakan kolom Bondapak. Pada

penelitian ini kolom yang digunakan adalah kolom Kromasil 100-5C18

Oktadesilsilan merek KNAUER, Dimensi 250 mm x 4,6 mm ukuran partikel 5

µm, selain itu fase gerak yang digunakan juga berbeda. Penelitian lainnya adalah

penetapan kadar teobromin dan kafein yang dilakukan oleh Czech et al. (2011),


4

menggunakan fase gerak metanol : bufer asetat (20 : 80), dengan menggunakan

kolom XB C-18 dan diaplikasikan pada sampel biji kopi.

Pada penelitian Ptolemy et al. (2010), dilakukan penetapan kadar

teobromin dan kafein dalam cairan biologis yaitu dalam saliva, plasma dan urin.

Metode yang digunakan adalah kromatografi cair tandem dengan spektrofotometri

massa, sehingga detektor yang digunakan berbeda dengan yang digunakan dalam

penelitian ini. Selain itu, matriks dimana sampel terkandung juga berbeda. Pada

penelitian tersebut digunakan cairan biologis sedangkan pada penelitian ini

diaplikasikan pada sampel cokelat bubuk.

Pada penelitian Kasabe and Badhe (2010), pernah dilakukan ekstraksi

teobromin dari teh yang beredar dipasaran, namun metode yang digunakan dalam

penetapan kadarnya berbeda karena pada penelitian Kasabe ini menggunakan

High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) dan deteksi sinar UV.

Metode yang digunakan berbeda dengan metode yang digunakan dalam penelitian

ini. Dengan demikian berdasarkan data penelitian terdahulu seperti yang telah

dikemukakan diatas, belum pernah dilakukan penelitian dengan judul “Optimasi

Fase Gerak pada Penentuan Kadar Teobromin dan Kafein dalam Cokelat Bubuk

dengan Menggunakan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik”.


5

3. Manfaat Penelitian

Penelitian ini memberikan manfaat:

1. Manfaat teoritis: diharapkan dengan penelitian ini dapat memberikan informasi

atau sumbangan pada ilmu pengetahuan tentang optimasi metode KCKT fase

terbalik dalam aplikasinya untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein..

2. Manfaat metodologis: diharapkan penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar

untuk melakukan optimasi metode KCKT fase terbalik dalam aplikasinya

untuk menetapkan kadar teobromin dan kafein.

3. Manfaat praktis: diharapkan penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar

penelitian menetapkan kadar teobromin dan kafein dalam suatu bentuk sediaan

farmasi, ataupun makanan dan minuman.

B. Tujuan Penelitian

Tujuan dilakukannya penelitian ini:

Untuk mengetahui kondisi sistem KCKT yang optimal terkait komposisi dan

flow rate fase gerak untuk dapat menetapkan kadar teobromin dan kafein.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. COKELAT

Cokelat atau yang disebut cacao (Theobroma cacao) merupakan tanaman

asli dari Amerika. Theobroma cacao termasuk dalam famili Sterculiaceae. Biji

tanaman ini digunakan untuk membuat cocoa dan produk cokelat (Anonim,

2011).

Gambar 1. Theobroma cacao.

Tumbuhan cokelat (gambar 1) mengandung beberapa senyawa kimia yang

termasuk dalam golongan toksik dan kurang bergizi. Contohnya adalah

teobromin, kafein, teofilin, oksalat, furfural, tannin dan inhibitor tripsin

(Alexander et al., 2008).

B. KAFEIN

Kafein merupakan golongan alkaloid metilksantin yang ditemukan secara

alami dalam daun, biji ataupun buah di lebih dari 63 jenis tanaman di seluruh

dunia, namun paling banyak ditemukan dalam kopi, biji cokelat, kacang kola dan

dalam daun teh. Dalam bentuk murninya, kafein merupakan serbuk putih dan

berasa pahit. Rumus kimianya adalah C8H10N4O2 dengan nama 1,3,5-tri

metilksantin (Wanyika et al., 2010).


7

N

N N

NH3C

O

CH3

OCH3

Gambar 2. Struktur kafein.

Kafein dapat meningkatkan kesadaran pada sistem saraf pusat manusia,

sehingga kafein berfungsi sebagai stimulan. Efek kafein sebagai stimulan ini

mampu memasok energi dalam tubuh, menurunkan rasa letih dan meningkatkan

kerja dari sistem motorik. Efek negatif yang dapat ditimbulkan oleh kafein adalah

efek kecanduan yang dapat ditandai dengan beberapa gejala seperti sakit kepala,

mudah lelah dan menurunnya konsentrasi serta meningkatkan emosi. Menurut

Food and Drug Administration (FDA) Amerika Serikat, batas maksimum

konsumsi kafein adalah 400 mg per hari (Czech et al., 2011).

Sifat fisika kimia kafein (gambar 2) mencakup: pemeriannya berupa

serbuk putih; tidak berbau dan rasanya pahit; pH (1%larutan) 6,9; titik lelehnya

235-237,5oC; pKa sebesar 13,9; kelarutan kafein adalah sebagai berikut: 1 gram

kafein dapat larut dalam 50 mL air. Satu gram kafein dapat larut dalam 6 mL air

panas dengan suhu 80oC. Satu gram kafein dapat larut dalam 75 mL alkohol dan

+25 mL alkohol dengan suhu 60oC. Satu gram kafein dapat larut dalam 6 mL

kloroform dan 1 gram kafein dapat larut dalam 600 mL eter (Gennaro, 2000).


8

C. TEOBROMIN

Teobromin dikenal dengan nama 3,7-dihydro-3,7-dimethyl-1H-purine-2,6-

dione merupakan golongan alkaloid metilksantin yang ditemukan secara alami

dalam berbagai jenis tanaman termasuk pula kafein dan teofilin. Teobromin

merupakan kandungan utama yang ditemukan dalam tanaman cokelat

(Theobroma cacao) (Kasabe and Badhe, 2010).

HN

N N

N

O

CH3

OCH3

Gambar 3. Struktur teobromin

Teobromin memiliki efek farmakologis yang hampir sama dengan kafein

namun efek yang timbul lebih kecil (Kasabe and Badhe, 2010). Teobromin

memiliki efek stimulan dalam tingkat yang lebih rendah dibandingkan kafein

sehingga tidak mempengaruhi sistem saraf pusat (Cezch et al., 2011).

Sifat fisika kimia teobromin (gambar 3) mencakup: merupakan serbuk

putih kristalin; titik sublimasi pada 290-295oC; titik leleh pada 357oC. Kelarutan

teobromin adalah sebagai berikut: 1 gram teobromin dapat larut dalam 2 liter air.

Satu gram teobromin dapat larut dalam 150 mL air mendidih. Satu gram

teobromin dapat larut dalam 250 mL etanol 95 % . Satu gram teobromin larut

dalam 6000 mL kloroform. Teobromin tidak dapat larut dalam eter (Clarke,

1969).


9

D. Metode Analisis Teobromin dan Kafein Terdahulu

Pada penelitian Ramli et al. (2000), dilakukan penetapan kadar teobromin

dan kafein pada buah cokelat dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi

menggunakan fase gerak metanol : akuabides : asam asetat (20 : 79 : 1) flow rate

1 mL/menit dan menggunakan kolom Bondapak dengan ukuran 30 cm x 4,0 mm

dan ukuran partikel 10 µm. Pengamatan dilakukan pada panjang gelombang 280

nm. Pada penelitian ini, didapatkan nilai % recovery 92,58% untuk teobromin dan

91,09 % untuk kafein. Nilai % recovery ini sudah memenuhi persyaratan menurut

Horwitz yaitu 90-110% (Gonzales and Herrador, 2007). Kekurangan dari

penelitian ini adalah belum terpenuhinya nilai linearitas, yang dapat dilihat dari

koefisien korelasi pada persamaan kurva baku yang didapat yaitu 0,98 untuk

teobromin dan 0,9951 untuk kafein. Nilai koefisien korelasi yang didapat pada

penelitian ini tidak memenuhi persyaratan linearitas yaitu > 0,999 (Snyder et al.,

1979).

Penelitian lainnya terkait teobromin dan kafein adalah penelitian yang

dilakukan Czech et al. (2011) yang melakukan determinasi teobromin dan kafein

dalam biji kopi. Metode yang digunakan adalah kromatografi cair kinerja tinggi

dengan menggunakan fase gerak metanol : bufer asetat (20 : 80) flow rate 1

mL/menit, kolom XB C-18 dengan ukuran partikel 2,6 µm. Pengamatan dilakukan

pada panjang gelombang 272 nm. Waktu retensi yang dihasilkan untuk kedua

senyawa ini adalah kurang dari 5 menit. Nilai koefisien korelasi yang didapatkan

juga memenuhi persyaratan yaitu 0,999 untuk teobromin, sedangkan untuk kafein


10

nilai r = 0,9988 sehingga belum memenuhi persyaratan nilai r > 0,999 (Snyder et

al., 1979).

Penelitian Kasabe and Badhe (2010), melakukan penetapan kadar

teobromin dengan menggunakan metode High Performance Thin Layer

Chromatography (HPTLC) fase terbalik. Plat yang digunakan pada penelitian ini

adalah Silika gel 60 F254 sebagai fase diam. Fase gerak yang digunakan adalah etil

asetat : metanol (27 : 3). Determinasi dilakukan dengan densitometer pada

panjang gelombang pengamatan 274 nm. Metode HPTLC ini memberikan presisi,

akurasi, sensitivitas dan ketahanan sistem yang baik.

Penelitian yang dilakukan Ptomely et al. (2010) menetapkan kadar

teobromin dan kafein dalam cairan biologis manusia yaitu pada saliva, plasma dan

urin. Metode yang digunakan adalah kromatografi cair tandem dengan

spektrofometri massa. Fase diam yang digunakan adalah kolom C-18 BEH 50 mm

x 2,1 mm dan ukuran partikel 1,7 µm. Fase gerak yang digunakan adalah asam

format 0,1% (v/v) dalam akuabidestilata sebagai fase gerak A dan asetonitril

sebagai fase gerak B. Dengan demikian, sistem yang digunakan adalah sistem

gradien. Pengamatan ini dilakukan pada panjang gelombang 280 nm. Kelebihan

metode pada penelitian ini adalah dapat diaplikasikan pada sampel dengan

konsentrasi yang sangat kecil, yaitu sampai pada 10-300 µmol/Liter.

E. Spektrofotometer UV

Spektroskopi adalah salah satu teknik analisis fsiko-kimia yang mengamati

tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik (REM).


11

Spektrofotometri ultraviolet adalah salah satu teknik analisis spektroskopi yang

menggunakan sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm)

dengan instrumen spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995).

Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan atas interaksi yang terjadi

antara radiasi elektromagnetik dengan atom atau molekul. Adanya interaksi tadi

menyebabkan terjadinya perpindahan energi dari sinar radiasi ke molekul yang

disebut absorpsi. Akibat absorpsi radiasi elektromagnetik oleh molekul tersebut

maka akan terjadi eksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi yang dikenal sebagai

orbital elektron antibonding. Ada empat tipe transisi elektronik yang mungkin

terjadi yaitu *, n*, nπ* dan ππ* (Mulja dan Suharman, 1995). Pada

transisi * elektron pada suatu orbital tereksitasi ke orbital *, dengan

mengabsorpsi radiasi. Pada transisi n* terjadi pada senyawa-senyawa jenuh

dengan elektron tidak berpasangan. Transisi tersebut memerlukan energi yang

lebih besar dan terjadi pada daerah 150-250 nm dengan ϵ = 100-3000 M-1cm-1.

Transisi nπ* dan ππ* mencakup sebagian besar senyawa organik. Energi

yang diperlukan untuk transisi menghasilkan absorbsi maksimum pada daerah

200-700 nm. Dengan adanya orbital π berarti terdapat gugus fungsi yang tidak

jenuh. Transisi nπ* memiliki ϵ = 10-100 M-1cm-1 sedangkan transisi ππ*

memiliki ϵ = 1000-10.000 M-1cm-1 (Khopkar, 1990).

Transisi elektronik yang berguna dalam penelitian adalah transisi nπ*

dan ππ* karena memberikan spektra pada 200-700 nm. Kedua transisi ini

membutuhkan adanya kromofor dalam struktur molekul suatu senyawa, yaitu

suatu gugus fungsional tidak jenuh yang menyediakan orbital π yang dapat


12

menyerap pada daerah ultraviolet (Skoog, 1985). Selain gugus kromofor, dikenal

juga gugus auksokrom yaitu gugus jenuh yang apabila terikat pada kromofor

secara langsung dapat menggeser panjang gelombang dan mengubah intensitas

serapan maksimum, cirinya adalah heteroatom yang langsung terikat pada

kromofor (Sastrohamidjojo, 2001). Gugus auksokrom paling sedikit memiliki

sepasang elektron bebas yang dapat berinteraksi dengan elektron π, misalnya -OH,

-NH2 (Skoog, 1985).

Spektrofotometer menghasilkan spektrum pada panjang gelombang

tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan

atau diabsorbsi. Dengan demikian, spektrofotometer digunakan untuk mengukur

energi yang ditansmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari

panjang gelombang (Khopkar, 1990).

F. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

1. Definisi dan instrument

Kromatografi merupakan teknik dimana solut atau zat-zat terlarut terpisah

oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom

kromatografi (Ganjar dan Rohman, 2007). Definisi tersebut menggambarkan

bahwa dalam sistem kromatografi terjadi pemisahan zat-zat terlarut atau analit

akibat adanya interaksi dengan fase diam yang ada dalam kolom kromatografi.

Pemisahan ini terjadi karena adanya interaksi antara zat analit dengan fase gerak

dan fase diam yang digunakan.


13

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan metode yang paling

banyak dipilih untuk melakukan analisis. KCKT sudah banyak dikembangkan

untuk penelitian bahan-bahan obat, bahan kimia, makanan dan obat. Hal ini sesuai

dengan pendapat Chan et al. (2004), dimana KCKT banyak dipilih sebagai

metode analisis karena memiliki kemampuan pemisahan zat analit serta

kuantifikasinya atau penentuan jumlah zat analit tersebut berdasarkan respon Area

Under Curve (AUC). KCKT sering digunakan untuk menganalisis ketidak

murnian senyawa karena KCKT dapat juga digunakan untuk kuantifikasi senyawa

(Rohman, 2009). Kelebihan lain yang didapatkan dengan menggunakan KCKT

adalah dapat digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa yang memiliki

struktur yang hampir sama, analisis molekul non-volatil (sulit menguap) yang

tidak dapat dideteksi dengan kromatografi gas, analisis senyawa dengan jumlah

yang sangat kecil (Rohman, 2009).

Sistem KCKT merupakan gabungan dari berbagai macam alat yang

dirangkaikan untuk dapat menghasilkan suatu pemisahan, pendeteksian dan

kuantifikasi zat analit. Rangkaian alat ini dikenal dengan instrument kromatografi.

Menurut Rohman (2009), Instrumen KCKT pada dasarnya terdiri atas: wadah fase

gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,

wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau

perekam. Rangkaian sistem KCKT dapat dilihat pada gambar 4.


14

Gambar 4. Diagram KCKT ( Rohman, 2009)

a. Fase gerak

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam elusi dan resolusi. Kedua hal

ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat

komponen-komponen sampel. Terdapat dua fase yang biasanya digunakan dalam

sistem KCKT yaitu fase normal dan fase diam. Penentuan kedua fase ini

tergantung pada tingkat kepolaran dari masing-masing fase gerak dan fase diam

yang digunakan. Apabila fase diam yang digunakan lebih polar dibandingkan fase

geraknya maka fase tersebut adalah fase normal, sedangkan untuk fase terbalik

fase diam yang digunakan lebih nonpolar dibandingkan fase geraknya. Hal ini

sesuai dengan pendapat Rohman (2009) dimana untuk fase normal (fase diam

lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi senyawa non polar meningkat

dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam

kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi senyawa non polar menurun

dengan meningkatnya polaritas pelarut.


15

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap

selama elusi) atau dengan cara gradien (komposisi fase gerak berubah-ubah

selama elusi). Elusi gradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran

yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas

(Gandjar dan Rohman, 2007).

Fase gerak berperan untuk melewatkan sampel pada fase diam, namun

juga harus dilihat pemilihannya berdasarkan interaksinya dengan fase diam. Fase

gerak yang dipilih mungkin juga mengalami interaksi dengan fase diam. Kekuatan

dan tipe interaksi yang terjadi akan mempengaruhi resolusi dan efisiensi

pemisahan tersebut (Kuwana, 1980).

Deret eluotropik yang disusun berdasarkan polaritas pelarut merupakan

panduan yang berguna dalam pemilihan fase gerak yang akan digunakan dalam

KCKT. Deret eluotropik dapat dilihat pada tabel I.

Tabel I. Deret eluotropik pelarut-pelarut untuk KCKT

Pelarut Parameter kekuatanpelarut , έ (adsorpsi)

Parameter kekuatanpelarut, έ (partisi)

UV cut off (nm)

n- heksansikloheksantetraklorometanmetilbenzentriklorometandiklorometantetrahidrofuranpropanonasetonitrilisopropanoletanolmetanolair

0,010,040,180,290,400,420,560,560,650,820,880,95>1

0,1-0,21,62,44,13,14,03,95,83,94,35,1

10,2

195200265285245230212330190205205205170



16

b. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk KCKT adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yaitu pompa harus inert

terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas , baja

tahan karat, teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu

memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan

kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus

mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit (Rohman, 2009).

Pompa yang digunakan harus dapat menjamin akurasi dan konsistensi

kecepatan alir dari fase gerak, hal ini diperlukan untuk menjaga stabilitas dan

ripitabilitas interaksi antara zat analit dengan fase diam. Flow rate yang buruk

dapat mempengaruhi waktu retensi dan resolusi pemisahan analit (Chan et al.,

2004)

c. Tempat penyuntikaan sampel

Larutan yang mengandung analit dimasukkan ke dalam lubang kolom

dimana sudah ada fase gerak yang mengalir. Dengan demikian, sampel yang

disuntikan dapat terbawa oleh fase gerak menuju fase diam (kolom). Tempat

penyuntikan sampel ini biasanya terbuat dari tembaga agar tahan terhadap karat

sedangkan katupnya terbuat dari teflon.


17

Gambar 5. Skema penyuntikkan keluk (a) posisi saat memuat sampel;(b) posisi pada saat menyuntikkan sampel (Gandjar dan Rohman, 2007)

Pada saat pengisian sampel, sampel melewati keluk sampel dan

kelebihannya dikeluarkan ke pembuangan. Pada saat penyuntikkan, katup diputar

sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan mengalirkan sampel ke

kolom (Gandjar dan Rohman, 2007).

d. Kolom

Kolom merupakan bagian terpenting dalam rangkaian KCKT karena fase

diam dalam KCKT terdapat dalam kolom. Dengan demikian, pemisahan analit

dari komponen lainnya terjadi pada kolom. Keberhasilan pemisahan analit

tergantung pada keadaan kolom, sehingga pemilihan kolom sangatlah penting

(Mulja dan Suharman, 1995).

Kebanyakan fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi atau

polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan

sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat

dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti

klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan

menggantinya dengan gugus fungsional yang lain (Rohman, 2009). Oktadesilsilan


18

(ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena

mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang,

dan tinggi.

e. Detektor

Terdapat dua golongan detektor pada KCKT yaitu detektor umum dan

spesifik. Detektor umum merupakan detektor yang dapat mendeteksi zat secara

umum, tidak bersifat spesifik dan selektif. Contoh dari detektor yang umum

adalah detektor indeks dan detektor massa. Detektor spesifik merupakan detektor

yang hanya dapat mendeteksi suatu analit sesuai dengan spesifikasi tertentu,

misalnya digunakan detektor UV-Vis maka analit yang digunakan harus memiliki

persyaratan yang sesuai untuk dapat dideteksi dengan detektor UV-Vis. Contoh

lainnya adalah detektor fluoresensi dan elekrokimia (Rohman, 2009).

Detektor Spektrofotometri UV-Vis

Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak digunakan dan

sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi karena kebanyakkan senyawa

obat mempunyai struktur yang dapat menyerap sinar UV-Vis. Sel detektor

umumnya berupa tabung dengan diameter 1 mm dan panjang celah optiknya 10

mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan pengaruh

indeks bias yang dapat megubah absorbansi yang terukur (Gandjar dan Rohman,

2007). Senyawa yang dapat dideteksi dengan menggunakan detektor UV-Vis ini

adalah senyawa yang memiliki gugus kromofor dan auksokrom dan memiliki

serapan pada panjang gelombang UV dan Vis.


19

2. Pemisahan yang optimal dalam kromatografi

a. Efisiensi kolom.

Tujuan umum pada kromatografi adalah pemisahan suatu campuran yang

akan dianalisis. Kualitas pemisahan dengan kromatografi ini dapat dilihat dari 2

parameter. Parameter pertama adalah resolusi yaitu tingkat pemisahan puncak-

puncak analit yang saling berdekatan. Parameter yang kedua adalah efisiensi yaitu

ukuran banyaknya pelebaran puncak dari masing-masing puncak zat analit.

Efisiensi pemisahan suatu kolom terdiri dari dua teori yaitu teori lempeng, teori

laju.

i. Teori Lempeng

Salah satu yang menjadi ukuran efisiensi dari suatu kolom adalah jumlah

lempeng atau plate number (N) yang didasarkan pada konsep lempeng teoritis.

Efisiensi kolom dalam kromatografi secara umum juga berkaitan dengan waktu

retensi, yakni lamanya waktu komponen atau molekul yang akan dianalisis berada

di dalam kolom (Ganjar dan Rohman, 2007).

Dalam teori lempeng dinyatakan bahwa kolom kromatografi digambarkan

sebagai seri lapisan tipis horizontal yang disebut lempeng teoritis. Zat analit akan

mengalami distribusi pada fase diam dan fase gerak. Pemisahan akan semakin

baik jika terjadi distribusi yang merata dan berkali-kali dalam jumlah tinggi, jika

ini terjadi maka jumlah lempeng teoritis juga semakin tinggi (Noegrohati,1994).

Dengan begitu, jumlah lempeng teoritis juga menjadi ukuran efisiensi pemisahan

pada kolom. Semakin tinggi jumlah lempeng teoritis pada suatu pemisahan,


20

semakin baik pula efisiensi kolom, dan sebaliknya jika nilai lempeng teoritis yang

didapatkan kecil, maka efisiensi kolom juga menurun.

Dengan menganggap profil puncak kromatogram (gambar 6) adalah

sesuai kurva Gaussian, maka N didefinisikan:= () (1)

Keterangan:

tR : waktu retensi solut

t : standar deviasi lebar puncak

Dalam prakteknya, lebih mudah untuk mengukur baik lebar puncak (Wb)

atau tinggi puncak (W h/2) dan 2 persamaan berikut diturunkan dari persamaan (1):N = 16 () (2)N = 5,54() (3)

Gambar 6. Pengukuran efeisiensi Kromatografi dari puncak Gaussian (Gandjar danRohman, 2007)

Satuan ukuran alternatif (yang tergantung pada panjang kolom

kromatografi) adalah tinggi lempeng (H) atau juga biasa disebut dengan tinggi

pelat teori (HETP= Height Equivalent Theoretical Plate). Tinggi setara pelat teori

atau HETP dalam kolom kromatogafi yang menggunakan kolom (KCKT dan

Kromatografi Gas) merupakan panjang kolom kromatografi (dalam mm) yang


21

diperlukan sampai terjadinya satu kali keseimbangan molekul solut dalam fase

gerak dan fase diam. Hubungan antara HETP dan jumlah lempeng (N) serta

panjang kolom (L) dirumuskan dengan:H = (4)

(Ganjar dan Rohman, 2007)

HETP dapat digunakan untuk membandingkan efisiensi kolom dengan

panjang kolom yang berbeda, karena pada pengukuran HETP ini, panjang kolom

yang bervariasi dibandingkan dengan jumlah lempeng teoritis masing-masing

kolom sehingga perbandingannya tidak berdasarkan masing-masing panjang

kolom.

Nilai HETP berbanding terbalik dengan jumlah lempeng teoritis (N).

Dengan begitu, semakin tinggi nilai N, semakin kecil nilai HETP dan semakin

efisien kolom yang digunakan (Ganjar dan Rohman, 2007).

ii. Teori Laju

Teori lempeng hanya menggambarkan laju migrasi secara kuantitatif,

tetapi tidak dapat menggambarkan pengaruh variabel-variabel lain yang

menyebabkan terjadinya pelebaran peak, oleh karena itu perlu diketahui teori laju.

Pada waktu migrasi, zat analit mengalami transfer dalam fase diam dan fase gerak

berkali-kali. Zat analit hanya dapat bergerak jika berada dalam fase gerak

sehingga migrasi di dalam kolom juga tidak teratur dan mengakibatkan laju rata-

rata analit relatif terhadap fase gerak juga sangat bervariasi, sehingga terjadi

pelebaran peak analit (Noegrohati, 1994).


22

Menurut teori laju ini, efisiensi kolom dinyatakan dengan persamaan Van

Deemter yang dapat dinyatakan sebagai berikut (Rohman, 2009):= +µ+ .µ + .µ atau (5)

= / / + µ+ .µ + .µ / (6)

Dimana : H = ukuran efisiensi kolom

µ = kecepatan alir

A = difusi Eddy

B = difusi longitudinal

Cs = resistensi terhadap perpindahan atau transfer massa molekul dalam fase diam

Cm = resistensi terhadap transfer massa yang disebabkan oleh diameter dan bentuk

partikel fase diam dan kecepatan difusi molekul dalam fase gerak.

Berdasarkan persamaan di atas dapat dilihat terdapat tiga variabel yang

mempengaruhi efisiensi kolom, yaitu:

1) Difusi Eddy, yang dinyatakan sebagai A pada persamaan (5). Difusi Eddy

menggambarkan ketidakhomogenan kecepatan alir dan panjang lintasan di

sekitar partikel yang terpack-ing (Gambar 7). Lintasan alir yang tidak sama

pasti ditemukan dalam kolom dimana kerapatan kolom rendah dengan cepat

mencapai akhir kolom, khususnya pada kolom dengan diameter kecil.

Molekul solut yang melewati bagian tengah kolom akan mencapai akhir

kolom lebih lambat. Hal ini menyebabkan perbedaan laju tiap molekul melalui

kolom berbeda-beda. Unutk meminimalkan difusi Eddy ini, maka diameter

rata-rata partikel dalam kolom harus sekecil mungkin dan seseragam mungkin


23

(Willard et al., 1988). Difusi Eddy yang terjadi di dalam kolom dapat

digambarkan sebagai berikut:

Gambar 7. Difusi Eddy (Noegrohati,1994)

2) Difusi longitudinal, Nilai B pada persamaan (5), menyatakan efek difusi

longitudinal, pergerakan acak molekul dalam fase gerak. Pengaruh difusi

longitudinal terhadap ketinggian lempeng menjadi signifikan hanya pada

kecepatan fase gerak yang rendah/lambat. Kecepatan difusi solut yang tinggi

pada fase gerak dapat menyebabkan molekul solut terdispersi secara aksial

sementara dengan lambat bermigrasi melalui kolom.

3) Transfer massa, Transfer massa dinyatakan dengan Cstasionary dan Cmobile.

Cstasionary merupakan hasil ditahannya analit karena adanya fase diam. Suatu

molekul bergerak lambat dalam fase diam, sementara molekul lainnya melaju

melalui kolom bersama dengan fase gerak. Untuk mengatasi hal ini

diperlukan fase diam yang lebih encer (tidak terlalu kental). Peristiwa ini

dapat digambarkan sebagai berikut (Gambar 8):

Gambar 8. Transfer massa pada fase diam (Willard et al., 1988)


24

Cmobile menggambarkan adanya peristiwa dimana zat analit dalam fase diam

bertemu dengan fase gerak yang masih baru. Hal ini dapat digambarkan

sebagai berikut (Gambar 9):

Gambar 9. Transfer massa pada fase gerak (Willard et al., 1988)

b. Waktu retensi

Pada pemisahan campuran-campuran dalam kolom, solut-solut dicirikan

dengan waktu retensi (tR) dan faktor retensi (k`) yang berbanding lurus dengan

nilai perbandingan distribusi (D). Waktu retensi merupakan lamanya waktu yang

dibutuhkan solut untuk melewati kolom. Waktu retensi (tR) dan faktor retensi (k`)

dihubungkan dengan persamaan:

tR = tm (1 + k`) (7)

tm merupakan waktu yang dibutuhkan solut yang tidak tertahan untuk

melewati kolom. Solut yang tidak tertahan akan bermigrasi dengan kecepatan

yang sama dengan fase gerak karena perbandingan distribusi (D) dan faktor

retensinya adalah 0; jadi tR – tm = 0 (Gandjar dan Rohman, 2007). Ilutrasi waktu

retensi analit pada kromatografi dapat dilihat pada gambar 10.


25

Gambar 10. Ilustrasi waktu dan volume retensi pada kromatografi (Kuwana, 1980)

c. Resolusi

Faktor resolusi (Rs) adalah ukuran pemisahan dua puncak yang berdekatan

(Johnson and Setevenson, 1978). Resolusi menjadi indikator pemisahan pada

kromatogram yang dihasilkan dari analit (Kuwana, 1980). Nilai Rs harus

mendekati atau lebih dari 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak yang

baik (Gandjar dan Rohman, 2007). Pemisahan yang baik menghasilkan nilai Rs >

1,5 (Pescok et al., 1976). Ilustrasi pemisahan puncak yang baik dapat dilihat pada

gambar 11. Hubungan waktu retensi (tR) dengan lebar puncak (W) dinyatakan

dalam persamaan sebagai berikut:= ( )/ = ∆ (8)

Gambar 11. Pemisahan dua semyawa (Johnson dan Stevenson, 1978)

d. Tailing factor

Analisis KCKT mencari kondisi yang menghasilkan puncak yang simetris

karena puncak yang asimetris dapat menghasilkan bilangan lempeng teoritik dan


26

faktor resolusi yang tidak akurat, perhitungan yang tidak teliti, penurunan derajat

resolusi dan puncak-puncak minor yang tidak terdeteksi pada ekor puncak, serta

waktu retensi yang tidak reprodusibel. Parameter yang digunakan untuk menilai

bentuk puncak adalah peak asymmetry factor (As), yang diukur pada 10 % tinggi

puncak (Snyder et al., 1997).

Faktor asimetri juga disebut dengan tailing factor (Tf) yang dinyatakan

dengan rasio antara lebar setengah tinggi puncak kromatogram yang

menghasilkan nilai Tf = 1 menunjukkan bahwa kromatogram tersebut bersifat

setangkup atau simetris. Nilai Tf > 1 menunjukkan bahwa kromatogram

mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar harga Tf maka kolom yang

digunakan semakin kurang efisien, dengan begitu nilai Tf dapat digunakan untuk

melihat efisiensi kolom kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007).

Jika nilai Tf dan As sama dengan 1, artinya sudah terjadi pemisahan yang

baik pada kromatogram. Semakin meningkatnya nilai Tf dan As maka makin

buruk pemisahan yang terjadi pada kolom. Nilai Tf yang lebih dari 2 dapat

mengganggu analisis analit, sehingga untuk analisis di persyaratkan nilai tailing

factor adalah kurang dari 2 (Snyder et al., 2010). Nilai As dan Tf dapat diperoleh

menggunakan persamaan seperti pada gambar 12.

Gambar 12. Menghitung besarnya TF pada kromatogram (Snyder et al., 2010).

26




















26





















27

Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam pada saat terjadi tailing

dapat dilihat pada gambar 13.

Gambar 13. Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam ( Kuwana, 1980)

G. Landasan Teori

Kafein dan teobromin merupakan dua senyawa yang terkandung dalam

cokelat. Kedua senyawa ini memiliki struktur yang mirip sehingga memerlukan

metode yang tepat untuk dapat memisahkan keduanya dan dapat mengukur

kadarnya secara maksimal. Dalam kasus ini kafein dan teobromin yang akan

diteliti berada dalam sampel cokelat bubuk. Tujuan penelitian ini adalah untuk

mendapatkan kondisi yang optimal dalam memisahkan dan menentukan kadar

kafein dan teobromin. Metode yang dapat digunakan untuk melakukan pemisahan

ini adalah Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ( KCKT ) fase terbalik.

KCKT dapat digunakan untuk melakukan pemisahan kafein dan teobromin

dari sampel cokelat bubuk. Pemisahan yang dilakukan dengan KCKT merupakan

pemisahan yang berdasarkan tingkat kepolaran dan interaksi analit dengan fase

gerak dan fase diam pada metode KCKT ini. Analit yang sudah dipisahkan

dengan KCKT akan dideteksi oleh detektor UV karena kedua senyawa ini

memiliki serapan pada panjang gelombang UV. Teobromin dan kafein memiliki


28

kromofor dan auksokrom sebagai syarat senyawa yang dapat dideteksi dengan

detektor UV. Nilai ϵ untuk teobromin adalah 10.144,14 M-1cm-1 dan kafein adalah

9.786,41 M-1cm-1. Selanjutnya menghasilkan suatu kromatogram yang harus

memiliki pemisahan yang baik antara analit dengan zat lain maupun dengan

pelarut.

Metode yang akan digunakan harus dioptimasi terlebih dahulu agar

mendapatkan kondisi optimum. Dengan kondisi optimum, diharapkan pemisahan

yang dihasilkan juga akan baik. Parameter yang akan dioptimasi adalah laju alir

dan perbandingan fase geraknya. Perubahan perbandingan fase gerak dilakukan

untuk melihat perbandingan berapa yang akan menghasilkan pemisahan yang

paling baik. Kondisi optimum akan dicapai jika hasil yang didapat sudah

memenuhi parameter yang harus dipenuhi yaitu efisiensi kolom yang akan

memberi gambaran tingkat efisiensi kolom untuk dapat memisahkan sampel

dengan baik; waktu retensi yang akan menggambarkan pemisahan tiap zat karena

analit akan terelusi pada waktu yang berbeda, resolusi, faktor asimetris dan nilai

HETP. Jika metode yang digunakan sudah dapat memenuhi kondisi optimal dan

dapat diterapkan selanjutnya untuk validasi metode analisis dan penetapan kadar.

H. HIPOTESIS

Metode KCKT fase terbalik dengan komposisi dan flow rate yang optimum

dapat menghasilkan kromatogram dengan bentuk peak yang memenuhi

persyaratan tailing factor kurang dari 2, tR < 10 menit, resolusi pemisahan > 1,5,

dan nilai HETP yang semakin kecil sehingga dapat digunakan untuk melakukan

penetapan kadar kafein dan teobromin.


29

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis rancangan penelitian deskriptif

eksperimental karena diberikan perlakuan pada subjek uji.

B. Varibel Penelitian

1. Variabel utama

a. Variabel bebas

1) Perbandingan komposisi fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%.

2) Flow rate yang digunakan.

b. Variabel tergantung

1) Pemisahan peak masing-masing komponen yaitu kafein dan teobromin

yang dapat dilihat dari waktu retensi masing-masing senyawa.

2) Bentuk peak masing-masing komponen teobromin dan kafein serta tailing

factor untuk melihat seberapa besar pengekoran yang terjadi pada

kromatogram.

3) Nilai resolusi dan nilai HETP.

2. Variabel pengacau terkendali

Variabel pengacau terkendali pada percobaan adalah kemurniaan pelarut

yang digunakan. Untuk mengatasinya maka digunakan pelarut yang memiliki

tingkat pro analysis sehingga memiliki kemurnian yang tinggi.


30

C. Definisi Operasional

1. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan dalam penelitian adalah fase gerak

berupa campuran metanol dan akuabides dan fase diam berupa kolom

oktadesilsilan (C18).

2. Kadar kafein dan teobromin dinyatakan dengan satuan part per million (ppm).

3. Parameter pemisahan komponen dengan metode KCKT adalah bentuk peak,

waktu retensi, nilai resolusi dan HETP.

D. Bahan-bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku teobromin dengan

kemurnian > 99% (Sigma Aldrich) dengan Certificate of Analysis (CoA) yang

terlampir, kafein kualitas farmasetis dengan Certificate of Analysis (CoA) yang

terlampir, metanol (p.a., E. Merck), trietilamin (p.a., E. Merck) dan akuabides

hasil penyulingan di laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma.

E. Alat-Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah: Spektrofotometer

UV/Vis SP-3000plus merk OPTIMA, kuvet, seperangkat alat KCKT fase terbalik

dengan sistem gradien dengan detektor UV, Shimadzu LC-2010C, kolom C-18

merek KNAUER C-18 (No. 25EE181KSJ (B115Y620), Dimensi 250 x 4,6 mm, 5

µm), seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S Connexant System RD01-D850

A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000 625 730), alat


31

degassing ultrasonic merek Retsch tipe T640, penyaring Whatmann anorganik

dan organik, neraca analitik merek Ohaus Carat Series PAJ 1003 (max 60/120g,

min 0,0001 g, d = 0,01/0,1 mg), Millipore ukuran pori 0,45 µm, mikropipet 100 -

1000µL dan 1000 - 10000µL merek Socorex . Gelas Beaker , pipet tetes, flakon,

labu takar, pengaduk, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium

analisis.

F. Tatacara Penelitian

1. Penyiapan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3%

Memipet trietilamin (TEA) 15 mL selanjutnya diencerkan dengan

akuabides dalam labu takar 500 mL hingga tanda batas dan didapatkan akuabides

yang mengandung TEA sebesar 3%.

Metanol dan akuabides/TEA 3% yang akan digunakan sebagai fase gerak

disaring menggunakan kertas Whatmann dengan menggunakan kertas yang

berbeda untuk pelarut organik dan anorganik.

Campuran yang digunakan untuk optimasi dalam penelitian ini dapat

dilihat pada tabel II:

Tabel II. Komposisi fase gerak metanol:akuabides/TEA 3%

No Komposisi fase gerakMetanol Akuabides/TEA 3%

1 30 602 35 653 40 70


32

2. Pembuatan seri larutan baku kafein dan teobromin.

a. Pembuatan larutan stok 1000 ppm. Kafein dan teobromin baku ditimbang

lebih kurang 25 mg secara seksama dan dilarutkan dalam akuabides panas dalam

labu takar 25 mL hingga tanda.

b. Pembuatan larutan baku intermediet 500 ppm. Memipet 5 mL larutan 1000

ppm kafein dan teobromin kemudian masing-masing diencerkan dengan

akuabides dalam labu takar 10 mL hingga tanda.

c. Pembuatan larutan kerja. Dilakukan pemipetan masing-masing larutan

baku intermediet (500 ppm) kafein dan teobromin sebanyak 0,8; 1,6; 2 dan 3,2

mL dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL yang sama. Selanjutnya diencerkan

dengan akuabides hingga tanda, sehingga didapatkan seri larutan kerja 40, 80 ,

100 dan 160 ppm selanjutnya larutan disaring dengan milipore dan di-degassing

menggunakan ultrasonicator selama 15 menit.

d. Pembuatan larutan kerja 5, 10 dan 15 ppm. Dilakukan pemipetan masing-

masing larutan baku intermediet (500 ppm) kafein dan teobromin sebanyak 0,1;

0,2 dan 0,3 mL lalu masing-masing dimasukkan ke dalam labu takar 10 mL yang

berbeda. Selanjutnya diencerkan dengan akuabides hingga tanda, sehingga

didapatkan larutan baku tunggal kafein dan teobromin 5, 10 dan 15 ppm.

3. Optimasi metode KCKT fase terbalik

a. Penentuan panjang gelombang maksimum kafein dan teobromin.

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan cara merekam


33

spektra larutan baku kafein dan teobromin masing-masing dengan konsentrasi 5;

10 dan 15 ppm dengan pelarut akuabides pada rentang 200-300 nm terhadap

blanko akuabides. Berdasarkan spektra dapat diketahui panjang gelombang yang

menghasilkan serapan yang maksimum pada masing-masing konsentrasi,

kemudian ditentukan panjang gelombang yang akan digunakan dalam optimasi.

b. Optimasi pemisahan. Detektor pada alat KCKT diatur pada panjang

gelombang maksimum. Sejumlah 20 µL larutan baku campuran kafein dan

teobromin 100 ppm yang sudah disaring dengan millipore dan di-degassing

selama 15 menit, diinjeksikan pada sistem KCKT fase terbalik menggunakan fase

gerak yang telah dibuat seperti pada langkah F.1 di atas. Sistem operasi KCKT

fase terbalik dilakukan dengan mengubah-ubah komposisi fase gerak metanol dan

akuabides/TEA 3% dengan perbandingan (40 : 60), (35 : 65) dan (30 : 70) serta

mengubah-ubah flow rate 0,5; 0,8; dan 1 mL/menit untuk masing-masing fase

gerak.

c. Verifikasi akurasi Pompa. Alirkan fase gerak 1mL/menit ke labu 5 mL

dengan merk yang sama, replikasi sebanyak 5 kali. Mencatat waktu yang

dibutuhkan untuk mencapai tanda batas pada labu takar dan hitung % perbedaan

flow rate hasil pengukuran dengan flow rate yang diatur dari alat.

d. Reprodusibilitas metode KCKT yang optimal. Seri larutan kerja campuran

baku kafein dan teobromin dengan konsentrasi masing-masing 40, 80 dan 160

ppm, kemudian di injeksikan sebanyak 20 µL ke dalam sistem KCKT

menggunakan perbandingan fase gerak dan flow rate hasil optimasi. Penginjekan

larutan ini dilakukan sampai 5 kali. Setelah mendapatkan kromatogram


34

dilanjutkan dengan menghitung %CV untuk parameter tailing factor (Tf), waktu

retensi, HETP, resolusi dan Area Under Curve (AUC) dari pemisahan campuran

kafein dan teobromin.

G. Analisis Hasil Optimasi

Data kromatogram yang diperoleh pada baku diamati sehingga dapat

diketahui sistem KCKT fase terbalik yang memberikan pemisahan teobromin dan

kafein yang paling baik yaitu dengan mengamati bentuk peak yang dihasilkan,

waktu yang dibutuhkan untuk elusi, tailing factor, menghitung nilai resolusi dan

HETP.

1. Analisis kualitatif

Analisis kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi

antara baku kafein dengan baku teobromin.

2. Analisis pemisahan peak kafein dan teobromin

a. Bentuk peak pemisahan kafein dan teobromin

Bentuk peak yang diharapkan adalah simetris. Sebagai parameter yaitu

tailing factor (Tf). Pada penelitian ini, digunakan parameter tailing factor yang

diukur 5 % dari tinggi peak. Perhitungan Tf melalui persamaan: Tf = (a+b)/2a.

Persyaratan umum untuk parameter tailing factor adalah nilai Tf kurang dari 2

(Synder et al., 2010).

b. Waktu retensi (tR)

Amati waktu yang dibutuhkan untuk pemisahan senyawa. Apabila kurang

dari 10 menit, maka pemisahan dikatakan efisien.


35

c. Nilai resolusi

Nilai resolusi pemisahan peak dihitung terhadap peak terdekat dengan

rumus: = ( )/Keterangan : tR1 dan tR2 = waktu retensi komponen

W1 dan W2 = lebar alas puncak

Pemisahan yang baik menghasilkan nilai Rs > 1,5 (Pescok et al., 1976).

d. Nilai HETP

Nilai HETP dihitung dengan rumus HETP: = . Makin besar nilai N/L atau

makin kecil HETP maka kolom yang dipakai untuk pemisahan semakin efisien



36

BAB VI

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pemilihan Pelarut

Pemilihan pelarut sangatlah penting, dengan menggunakan pelarut yang

sesuai maka dapat melarutkan analit yang akan dianalisis. Pelarut yang digunakan

untuk melarutkan teobromin dan kafein adalah akuabides hangat dengan suhu

+80oC karena dengan suhu tinggi dapat membantu kelarutan baku teobromin dan

kafein. Pemilihan pelarut ini juga berdasarkan teori kelarutan teobromin dan kafein

yaitu berdasarkan Gennaro (2000) dimana 1 gram kafein larut dalam 6 mL air

panas 80oC. Kelarutan teobromin yang paling baik adalah dalam air mendidih

dengan kelarutan 1 gram dalam 150 mL (Clarke, 1969). Air yang digunakan

sebagai pelarut adalah akuabides yang telah mengalami proses pemurnian. Syarat

pelarut yang baik untuk digunakan dalam metode KCKT adalah murni, inert, dapat

melarutkan analit dan dapat bercampur dengan fase gerak.

B. Pembuatan Fase Gerak

Metode KCKT yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode KCKT

dengan fase terbalik, sehingga fase diam yang digunakan lebih nonpolar

dibandingkan dengan fase geraknya. Fase diam yang digunakan adalah

oktadesilsilan (C18) yang bersifat nonpolar dan fase geraknya adalah campuran

metanol dan akuabides yang mengandung 3% trietilamin (TEA) bersifat lebih

polar dibandingkan fase diamnya. Sistem yang digunakan adalah sistem isokratik


37

dimana tidak ada perubahan komposisi fase gerak selama proses elusi.

Pencampuran kedua kompisisi fase gerak dilakukan di dalam alat KCKT. Untuk

mendapatkan kepolaran fase gerak yang sesuai, dilakukan dengan mengubah-ubah

komposisi fase gerak. Metanol digunakan sebagai fase gerak dengan pertimbangan

bahwa metanol merupakan pelarut organik yang umum dan sering digunakan pada

sistem KCKT fase terbalik. Penggunaan TEA ini berfungsi untuk menutup residu

silanol yang ada dalam kolom C18. Penutupan menggunakan TEA ini diperlukan

karena teobromin dan kafein merupakan senyawa yang bersifat basa, jika tidak

dilakukan penutupan dengan TEA zat analit akan berikatan dengan residu silanol

pada kolom sehingga kromatogram yang dihasilkan akan mengalami tailing.

Trietilamin (TEA) digunakan sebagai campuran dalam fase gerak untuk

dapat menurunkan tailing factor yang dialami oleh senyawa-senyawa yang bersifat

basa (Choo et al., 1996). Penambahan TEA pada fase gerak berperan sebagai

kompetitor senyawa basa, sehingga dapat menurunkan kemampuan interaksi

antara residu silanol dengan senyawa analit yang bersifat basa. Dengan begitu,

dapat menurunkan tailing yang terjadi. Efisiensi kolom juga akan meningkat

dengan semakin kecilnya tailing yang terjadi (Long et al., 2007).

N

CH 2

H 3C

H 2C CH 3

H 2C

H 3C

Gambar 14. Struktur Trietilamin


38

N

H2C

CH3

CH2H3C

CH2

CH3

Si

O

O

OH

Si O

Si O

(CH2)17 CH3

(CH2)17 CH3

Gambar 15. Interaksi Trietilamin dengan residu silanol dalam kolom C18

Pada gambar 15, terlihat interaksi antara residu silanol pada kolom dengan

TEA. Interaksi yang terjadi ini merupakan mekanisme penutupan dari TEA,

dengan begitu TEA yang digunakan bertindak sebagai kompetitor senyawa basa.

Analit yang bersifat basa akan berkurang interaksinya dengan residu silanol pada

kolom dan akan mengurangi tailing yang terjadi.

Perbandingan komposisi fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini

untuk mendapatkan hasil yang optimal dari metanol : akuabides/TEA 3% adalah

40 : 60 ; 35 : 65 dan 30 : 70. Pada penelitian ini dilakukan peningkatan jumlah

metanol secara bertahap. Menurut Snyder et al. (1997), dengan meningkatnya

jumlah metanol dalam sistem KCKT fase terbalik maka analit akan terelusi lebih

mudah.

Pada proses pembuatan fase gerak ini, disiapkan metanol dan

akubides/TEA 3% secara terpisah. Fase gerak yang sudah dibuat terlebih dahulu


39

disaring menggunakan penyaring Whatmann untuk menyaring partikel yang dapat

menyumbat kolom. Kemudian dihilangkan gelembung-gelembung udara yang

mungkin terjebak dalam fase gerak dengan menggunakan ultrasonicator, karena

udara dapat mengganggu pengukuran teobromin dan kafein dalam sistem KCKT.

Tabel III. Indeks polaritas campuran fase gerak metanol : akuabides/TEA3%

No

Komposisi Fase GerakIndeks

PolaritasMetanol Akuabides/TEA3%

1 30 70 8,67

2 35 65 8,415

3 40 60 8,16

Menurut Mulja dan Suharman (1995), dalam sistem KCKT fase terbalik,

kemampuan elusi akan semakin meningkat dengan menurunkan indeks polaritas

fase gerak. Semakin kecil nilai indeks polaritas fase gerak, maka semakin nonpolar

fase gerak tersebut. Pada tabel III, dapat diketahui urutan kepolaran dari polar ke

nonpolar adalah 30 : 70 , 35 : 65 dan 40 : 60. Untuk mendapatkan parameter yang

diinginkan dari pemisahan teobromin dan kafein, dilakukan dengan mengubah-

ubah komposisi fase gerak tersebut sampai didapatkan peak yang runcing,

memenuhi persyaratan tailing factor, resolusi dan HETP yang kecil.

C. Pembuatan Larutan Baku

Baku kafein yang digunakan dengan kualitas farmasetis dengan kemurnian

99,58% dan memiliki Certificate of Analysis (CoA) untuk menjamin

kemurniannya. Baku teobromin yang digunakan dari Sigma-Aldrich dengan

kemurnian > 99,0% dan memiliki CoA juga untuk menjamin kemurnian

teobromin. Pelarut yang digunakan adalah akuabides. Tujuan pembuatan larutan


40

baku ini adalah untuk memastikan bahwa di dalam sampel benar-benar terdapat

analit yang dimaksud, sehingga pembuatan larutan baku ini sebagai pembanding

atau reference standard.

Sebelum dilakukan optimasi komposisi fase gerak dan flow ratenya,

dibutuhkan penentuan panjang gelombang maksimum masing-masing analit.

Untuk melakukan penentuan panjang gelombang ini, dibuat larutan baku dengan

tiga konsentrasi rendah, tengah dan tinggi yaitu 5, 10 dan 15 ppm untuk masing-

masing larutan baku teobromin dan kafein. Konsentrasi ini dipilih untuk

memenuhi nilai absorbansi yang baik yaitu antara 0,2-0,8.

Dalam optimasi ini digunakan tiga larutan baku yaitu larutan baku

teobromin 500 ppm, larutan baku kafein 500 ppm serta larutan campuran

teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm. Larutan baku teobromin dan kafein

500 ppm dibuat terpisah untuk mengetahui tR masing masing zat analit. Untuk

mengetahui pemisahan antara kedua analit digunakan larutan baku campuran

teobromin dan kafein. Larutan baku 100 ppm akan digunakan dalam optimasi

komposisi fase gerak 30 : 70, 35 : 65 dan 40 : 60 serta flow rate 0,5; 0,8 dan 1

mL/menit.

Selanjutnya dibuat tiga konsentrasi larutan baku campuran teobromin dan

kafein masing-masing adalah 40, 80 dan 160 ppm. Larutan baku ini digunakan

untuk Uji Kesesuaian Sistem (UKS), dengan tujuan untuk melihat reprodusibilitas

metode yang digunakan pada konsentrasi rendah, sedang dan tinggi. Uji

Kesesuaian Sistem ini dilakukan dengan menggunakan komposisi fase gerak serta

flow rate yang sudah optimal.


41

D. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Teobromin dan kafein

menggunakan Spektrofotometer UV-Vis

Penentuan panjang gelombang pengamatan dilakukan dengan mengukur

panjang gelombang kedua analit terlebih dahulu secara terpisah. Pengukuran

panjang gelombang maksimum ini dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-

Vis karena secara teoritis, kedua senyawa ini memiliki panjang gelombang

maksimum antara 200-300 nm. Setelah mendapatkan spektra panjang gelombang

masing-masing zat analit, selanjutnya dilakukan overlapping untuk mengetahui

panjang gelombang dimana teobromin dan kafein memberikan serapan secara

bersamaan dan maksimal pada detektor KCKT yaitu detektor ultraviolet.

Pada penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan

mengamati panjang gelombang pada rentang tersebut menggunakan tiga tingkat

konsentrasi untuk masing-masing analit. Konsentrasi yang digunakan adalah 5, 10

dan 15 ppm. Penggunaan tiga tingkat konsentrasi ini adalah untuk meyakinkan

bahwa panjang gelombang yang digunakan dalam pengamatan benar-benar berasal

dari panjang gelombang maksimum teobromin dan kafein. Selain itu, juga

bertujuan untuk melihat bahwa bentuk spektra dan panjang gelombang maksimum

yang didapatkan adalah sama. Panjang gelombang maksimum yang didapatkan

akan digunakan sebagai panjang gelombang pengamatan pada penelitian ini.

Teobromin dan kafein memiliki gugus kromofor, oleh karena itu dapat

memberikan serapan pada panjang gelombang ultraviolet. Gugus kromofor yang

ada pada suatu senyawa akan bertanggung jawab pada penyerapan cahaya

ultraviolet. Gugus kromofor memiliki ikatan rangkap yang mengandung elektron π


42

yang bila terkena radiasi elektromagnetik akan tereksitasi ke tingkat energi yang

lebih tinggi (orbital π*). Teobromin dan kafein memiliki atom N yang terikat pada

kromofor. Atom N ini memiliki pasangan elektron bebas yang dapat

memperpanjang gugus kromofor sehingga bertanggung jawab pada pergeseran

panjang gelombang dan intensitas serapan teobromin dan kafein. Gugus kromofor

dari teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar 16.

Gambar 16. Gugus kromofor pada teobromin (A) dan kafein (B)= gugus kromofor

Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum di ketiga tingkat

konsentrasi teobromin dan kafein dapat dilihat pada gambar berikut:

A

(nm)

A

B

42










A

(nm)

A

B

42










A

(nm)

A

B


43

Gambar 17. Spektra serapan kafein dengan maks= 275 nmKeterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm

(konsentrasi tengah); C = Konsentrasi 15 ppm (konsentrasi tinggi) dalam pelarut akuabides

Pada gambar 17, dapat dilihat bahwa ketiga seri kadar kafein dalam pelarut

akuabides memiliki serapan maksimum pada 275 nm. Kafein dalam larutan pH 9,4

memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 273 nm (Clarke, 1969).

Pergeseran panjang gelombang maksimum yang terjadi pada pengamatan panjang

gelombang kafein ini mungkin terjadi karena pelarut yang digunakan berbeda

dengan pelarut yang digunakan secara teoritis. Pada pengamatan ini digunakan

pelarut akuabides.

(nm)(nm)(nm)

(nm)

(nm)

B

C

43









pelarut akuabides.

(nm)(nm)(nm)

(nm)

(nm)

B

C

43









pelarut akuabides.

(nm)(nm)(nm)

(nm)

(nm)

B

C


44

Gambar 18. Spektra serapan teobromin dengan maks= 275 nmKeterangan : A = Konsentrasi 5 ppm (konsentrasi rendah); B = Konsentrasi 10 ppm


A

B

C

(nm)

(nm)

(nm)

44



A

B

C

(nm)

(nm)

(nm)

44



A

B

C

(nm)

(nm)

(nm)


45

Pada gambar 18, dapat dilihat bahwa ketiga seri kadar teobromin dalam

pelarut akuabides memiliki serapan maksimum pada 275 nm. Teobromin dalam

pelarut etanol memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 273 nm

(Clarke, 1969). Pergeseran panjang gelombang maksimum yang terjadi pada

pengamatan panjang gelombang teobromin ini mungkin terjadi karena pelarut

yang digunakan berbeda dengan pelarut yang digunakan secara teoritis. Pada

pengamatan ini digunakan pelarut akuabides.

Dalam sistem KCKT untuk melakukan pengukuran diperlukan suatu

panjang gelombang dimana senyawa analit memberikan serapan yang optimal

untuk dapat diukur pada detektor dalam sistem KCKT. Panjang gelombang inilah

yang disebut sebagai panjang gelombang pengamatan. Untuk campuran dua

senyawa menggunakan panjang gelombang overlapping. Spektra yang diperoleh

dari teobromin dan kafein memiliki bentuk yang hampir sama dan panjang

gelombang maksimumnya sama yaitu 275 maka digunakan panjang gelombang

pengamatan pada 275 nm.

Pada gambar 17 dan gambar 18 terlihat bahwa teobromin dan kafein

memiliki spektra yang hampir mirip, karena keduanya memiliki gugus kromofor

yang sama namun memiliki intensitas penyerapan yang berbeda. Menurut Moffat

et.al. (2004) kafein memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet (E % ) yaitu

504 pada panjang gelombang 273 nm dalam larutan asam, sedangkan teobromin

memiliki nilai spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet (E % ) sebesar 563 pada

panjang gelombang 273 nm dalam larutan asam. Dengan demikian, panjang

gelombang pengamatan yang digunakan adalah 275 nm. Pada panjang gelombang


46

pengamatan ini, baik teobromin dan kafein memiliki serapan yang optimum pada

detektor UV yang digunakan dalam sistem KCKT.

E. Kalibrasi Flow rate

Tahapan ini bertujuan untuk melakukan kalibrasi alat yang digunakan.

Kalibrasi dilakukan pada flow rate alat KCKT yang akan digunakan. Kalibrasi ini

dilakukan dengan menampung fase gerak yang keluar dari konektor KCKT

sebelum masuk ke kolom pada labu takar 5 mL. Dilakukan perhitungan waktu

sejak fase gerak mulai keluar dari konektor sampai pada saat fase gerak yang

ditampung tepat pada garis batas labu takar 5 mL, setelah itu waktu dihentikan dan

dicatat. Tahapan ini dilakukan sebanyak 5 kali untuk dapat menjamin

reprodusibilitas flow rate pada metode KCKT. Flow rate yang digunakan adalah 1

mL/menit, sehingga secara teoritis labu takar akan terisi penuh tepat 5 menit.

Berikut adalah data yang didapatkan dari kalibrasi flow rate:

Tabel IV. Kalibrasi Flow Rate pada KCKT

Flow rate Volume Replikasi Waktu (menit)1mL/menit 5 mL 1 4’ 59”

2 5’ 01”3 4’ 59”4 5’5 5’

Rata-rata 4,9967SD 0,0139%CV 0,2796

Pada tabel IV, diketahui bahwa flow rate pada KCKT ini memiliki

reprodusibilitas yang baik. Hal ini dapat disimpulkan dengan melihat nilai %CV

yang diperoleh yaitu 0,28%, nilai ini sudah memenuhi persyaratan %CV yang


47

dapat diterima yaitu < 2%. Nilai %CV yang kurang dari 2 % menggambarkan

presisi yang baik atau keterulangan yang baik (Horwitz dalam Gonzales and

Herrador, 2007). Dengan begitu, flow rate yang digunakan reprodusibel.

F. Optimasi Komposisi dan Flow Rate Fase Gerak dalam pemisahan

Teobromin dan Kafein dengan Metode KCKT Fase Terbalik

Pemisahan senyawa analit teobromin dan kafein menggunakan KCKT fase

terbalik, dimana fase diam yang digunakan bersifat lebih nonpolar dibandingkan

dengan fase geraknya. Fase diam yang digunakan adalah oktadesilsilan (C18) dan

fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol : akuabides/TEA 3%. Pada

sistem KCKT ini, senyawa yang lebih polar akan terelusi terlebih dahulu

dibandingkan dengan senyawa yang lebih nonpolar. Hal ini terjadi karena senyawa

yang lebih polar akan lebih kuat berinteraksi dengan fase gerak dibandingkan

dengan fase diam, sehingga akan lebih mudah terelusi melewati fase diamnya.

Senyawa yang lebih nonpolar akan cenderung berinteraksi lebih kuat pada fase

diamnya maka akan tertinggal di kolom lebih lama. Berikut adalah gambar bagian

nonpolar dari teobromin dan kafein:

Gambar 19. Bagian nonpolar teobromin (A) dan kafein (B)= Bagian Nonpolar

BA


48

N

N N

NH3C

O

CH3

O CH3

Si

CH3O

H3C O

H3C

Gambar 20. Interaksi kafein dengan fase diam C18 melalui interaksi van Der Waals= interaksi van Der Waals

Si

CH3O

H3C O

H3C

HN

N N

N

O

CH3

O

CH3

Gambar 21. Interaksi teobromin dengan fase diam C18 melalui interaksi van Der Waals= interaksi van Der Waals

Pada gambar 20 dan 21 menunjukan interaksi yang terjadi antara kafein

dan teobromin dengan fase gerak adalah dengan interaksi van Der Waals. Interaksi

kafein pada fase diam lebih banyak dibandingkan interaksi teobromin dengan fase

diam. Oleh karena itu, kafein akan lebih lama tertinggal pada kolom dibandingkan

dengan teobromin. Hal ini dapat teramati pada waktu retensi kedua senyawa analit


49

(gambar 24). Senyawa yang memiliki interaksi lebih banyak pada fase diam akan

memiliki waktu retensi yang lebih lama, sedangkan yang memiliki interaksi lebih

sedikit akan terelusi lebih cepat dan waktu retensi yang cepat.

N

N

H3C

O

CH3

O

HOHH3C O

H

N

N

CH3

H O H

H O H

H

O CH3

H

O CH3

Gambar 22. Interaksi kafein dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% melaluiinteraksi hidrogen.= interaksi hidrogen

N

N

H

O

CH3

O

HOHH3C O

H

N

N

CH3

H O H

H O H

H

O CH3

H O

H

H

O CH3

OH3C

H

Gambar 23. Interaksi teobromin dengan fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% melaluiinteraksi hidrogen.= interaksi hidrogen

Pada gambar 22 dan 23 dapat dilihat bahwa teobromin dan kafein

berinteraksi hidrogen dengan fase gerak metanol dan akuabides. Interaksi hidrogen

pada teobromin lebih banyak dibandingkan pada kafein, dengan begitu interaksi

teobromin terhadap fase gerak akan lebih besar dibandingkan interaksi kafein

dengan fase gerak. Semakin banyak interaksi yang terjadi antara analit dengan fase


50

gerak, maka akan mudah untuk terelusi, sehingga secara teoritis teobromin akan

lebih cepat terelusi dibandingkan kafein.

Optimasi yang dilakukan dengan menggunakan metode KCKT ini adalah

dengan mengubah komposisi fase gerak dan flow rate untuk mendapatkan

pemisahan yang baik antara teobromin dan kafein. Komposisi fase gerak yang

akan dilakukan adalah 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 (metanol : akuabisdes/TEA 3%)

dengan flow rate 0,5; 0,6 dan 0,8 mL/menit.

Sebelum dilakukan optimasi komposisi dan flow rate pada fase gerak,

dilakukan terlebih dahulu orientasi untuk mengetahui letak peak tunggal masing-

masing senyawa analit. Hal ini untuk memastikan bahwa peak yang nantinya

muncul pada larutan campuran baku adalah milik teobromin dan kafein. Data yang

diperoleh dilakukan pada salah satu komposisi dan flow rate fase gerak yaitu pada

perbandingan metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit. Pada

pengamatan waktu retensi masing-masing analit ini, dilakukan dengan

menggunakan larutan baku tunggal teobromin dan kafein masing-masing 500 ppm.

Pada gambar 24. dapat diketahui bahwa waktu retensi untuk teobromin

lebih pendek dibandingkan waktu retensi kafein. Hal ini sesuai dengan teori bahwa

kafein lebih nonpolar dibandingkan teobromin sehingga memiliki interaksi dengan

fase diam lebih kuat dibandingkan pada fase diam dengan begitu kafein akan lebih

lama terelusi dibandingkan teobromin. Waktu retensi yang didapatkan untuk

teobromin adalah 2,239 menit, sedangkan untuk kafein adalah 3,600 menit.

Berikut adalah gambar kromatogram untuk masing-masing baku teobromin dan

kafein:


51

Gambar 24. Kromatogram baku tunggal teobromin (A.1) dan kafein (A.2), denganparameter KCKT sebagai berikut:

Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nm

A.1

A.2

51



A.1

A.2

51



A.1

A.2


52

Pengamatan waktu retensi merupakan salah satu parameter analisis

kualitatif senyawa pada penelitian ini. Masing-masing senyawa analit memiliki

waktu retensi yang berbeda. Pada saat senyawa analit berada dalam campuran,

dapat dibedakan berdasarkan waktu retensi masing-masing senyawa. Berikut

merupakan pengamatan waktu retensi campuran baku teobromin dan kafein pada

masing-masing komposisi dan flow rate fase gerak yang dioptimasi.

Tabel V. Waktu retensi baku campuran teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm

Komposisi FaseGerak Analit Waktu Retensi (tR) (menit)

Metanol :Akuabides/TEA3%

0,5(mL/menit)

0,8(mL/menit)

1(mL/menit)

30 : 70 Teobromin 3,549 2,23 1,788

Kafein 5,784 3,629 2,908

35 : 65 Teobromin 3,551 2,232 1,79

Kafein 5,705 3,593 2,878

40 : 60 Teobromin 3,567 2,233 2,277

Kafein 5,652 3,557 2,852

Pada data yang diperoleh seperti pada tabel V, dari masing-masing

komposisi fase gerak tersebut, semakin tinggi jumlah metanol yang digunakan

maka waktu retensinya semakin cepat dan sebaliknya semakin kecil jumlah

metanol yang digunakan semakin lama waktu retensi baik untuk teobromin

maupun kafein. Pada perubahan flow rate fase gerak, semakin meningkatnya flow

rate yang digunakan semakin kecil waktu retensi teobromin dan kafein. Dengan

demikian, semakin banyak jumlah metanol yang digunakan dan semakin

meningkatnya flow rate fase gerak maka waktu retensi teobromin dan kafein

semakin kecil atau cepat terelusi.

Pada pengamatan waktu retensi, didapatkan waktu retensi untuk teobromin

lebih kecil dibandingkan waktu retensi kafein. Hal ini sesuai dengan banyaknya


53

interaksi yang terjadi antara senyawa analit dengan fase diam dan fase gerak yang

digunakan. Teobromin memiliki interaksi yang lebih sedikit dengan fase diam dan

punya interaksi lebih banyak dengan fase gerak sehingga lebih cepat terelusi dan

waktu retensinya lebih pendek. Hal sebaliknya terjadi pada kafein sehingga waktu

retensi pada kafein lebih panjang.

Pada tabel V. dapat diamati bahwa pada komposisi fase gerak metanol :

akuabides dengan perbandingan 30 : 70, waktu retensi yang dihasilkan paling lama

dibandingkan dengan komposisi 35 : 65 dan 40 : 60. Hal ini terjadi karena pada

komposisi 30 : 70, jumlah metanol yang digunakan lebih sedikit sehingga

kemampuan fase gerak untuk mengelusi teobromin dan kafein dari kolom lebih

kecil dibandingkan dengan komposisi yang lain. Pada komposisi fase gerak 35 :

65, waktu retensinya lebih cepat karena metanol yang digunakan lebih banyak

sehingga kemampuan elusi dari fase geraknya meningkat. Pada komposisi 40 : 60,

waktu retensinya paling singkat. Terjadi penyimpangan waktu retensi milik

teobromin, waktu retensi yang paling pendek adalah pada komposisi 35 : 65.

Penyimpangan yang terjadi ini menyebabkan belum dapat ditentukannya

komposisi fase gerak yang optimal, tetapi penentuan komposisi fase gerak yang

paling optimal juga dipengaruhi oleh parameter lainnya yaitu tailing factor, HETP

dan resolusi. Pada pengamatan waktu retensi ini, didapatkan hasil bahwa pada

setiap komposisi fase gerak didapatkan waktu retensi yang kurang dari 10 menit,

sehingga dapat disimpulkan bahwa ketiga komposisi fase gerak yang digunakan

menghasilkan waktu retensi kurang dari 10 menit, sudah memenuhi syarat yang

berlaku untuk waktu retensi yang baik.


54

Selain melakukan peningkatan jumlah metanol pada komposisi fase gerak,

optimasi juga dilakukan dengan mengubah flow rate dari fase gerak yang

digunakan. Flow rate yang digunakan adalah 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit. Semakin

meningkatnya flow rate pada tiap komposisi fase gerak waktu retensi yang

dihasilkan untuk teobromin dan kafein semakin pendek. Waktu retensi yang paling

pendek dihasilkan pada flow rate 1,0 mL/menit sedangkan waktu retensi yang

paling panjang ada pada flow rate 0,5 mL/menit. Data waktu retensi dapat dilihat

pada tabel V. Flow rate yang digunakan tidak lebih dari 1,0 mL/menit untuk

menjaga tekanan pada kolom. Semakin tinggi flow rate yang digunakan, semakin

tinggi pula tekanan pada kolom. Batas tekanan pada sistem KCKT yang digunakan

adalah 0 kgf/cm2 sampai 380 kgf/cm2. Tekanan yang digunakan harus dijaga untuk

agar kolom tidak rusak. Tekanan yang tinggi dapat merusak kolom.

Parameter lain yang harus dipenuhi untuk menentukan komposisi dan flow

rate fase gerak yang optimum selain waktu retensi adalah nilai tailing factor.

Parameter ini dapat menunjukan bentuk peak yang dihasilkan pada kromatogram,

dimana peak berbentuk simetris atau mengalami pengekoran. Tailing factor yang

mendekati nilai 1, semakin memperlihatkan bahwa peak kromatogram yang

dihasilkan berbentuk simetris, namun nilai tailing factor lebih besar dari 1

menunjukan bahwa peak yang dihasilkan mengalami pengekoran. Semakin besar

nilai tailing factor yang dihasilkan maka semakin besar maka semakin kurang

efisien kolom yang digunakan, maka besarnya nilai tailing factor dapat digunakan

untuk melihat efisiensi kolom kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007).


55

Tailing factor yang masih dapat diterima adalah kurang dari 2 (Snyder et

al., 2010). Jika tailing factor yang dihasilkan lebih dari 2 dimungkinkan terjadi

permasalahan yang mengakibatkan peak mengalami tailing (pengekoran).

Permasalahan yang mungkin terjadi seperti kolom yang sudah mengalami

overload karena jumlah sampel yang terlalu besar, pelarut sampel yang digunakan

terlalu kuat berinteraksi dengan fase diam pada kolom dan terjadinya interaksi

senyawa dengan residu silanol pada fase diam (Snyder et al., 2010). Hal yang

dapat menyebabkan teobromin dan kafein mengalami tailing adalah adanya

interaksi dengan sisa silanol pada kolom. Teobromin dan kafein bersifat basa

sehingga akan berinteraksi dengan residu silanol yang bersifat asam, namun tailing

ini dikurangi dengan penggunaan trietilamin (TEA) pada fase gerak sehingga TEA

akan berinteraksi dengan residu silanol pada kolom dan mengurangi interaksi

senyawa analit dengan residu silanol, dengan begitu tailing pada senyawa dapat

berkurang.

Nilai tailing factor yang diperoleh pada pengamatan ini digunakan sebagai

pertimbangan untuk memilih komposisi dan flow rate fase gerak yang paling

optimal. Hasil pengamatan tailing factor pada campuran baku teobromin dan

kafein konsentrasi 100 ppm dari pengamatan ini dapat dilihat pada tabel VI

sebagai berikut:


56

Tabel VI. Tailing factor pada campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm

pada fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 pada flow rate 0,5;

0,8 dan 1 mL/menit

Komposisi Fase Gerak Analit Flow rate(mL/menit) tR (menit) Tailing

factorMetanol : Akuabides/TEA 3%

30 : 70

Teobromin 0,5 3,549 1,750,8 2,230 2,251 1,788 1,75

Kafein 0,5 5,784 1,50,8 3,629 1,671 2,908 1,125

35 : 65

Teobromin 0,5 3,551 1,50,8 2,232 2,251 1,790 1,125

Kafein 0,5 5,705 1,50,8 3,593 1,671 2,878 1,5

40 : 60

Teobromin 0,5 3,567 1,750,8 2,233 1,671 2,277 1,67

Kafein 0,5 5,652 20,8 3,557 1,671 2,852 1,375

Parameter lain yang juga menjadi pertimbangan dalam menentukan

komposisi dan flow rate yang digunakan adalah efisiensi kolom yang dilihat dari

nilai HETP yang didapatkan. HETP merupakan satuan ukuran alternatif yang

digunakan untuk menilai efisiensi kolom. Menurut Gandjar dan Rohman (2007),

makin kecil nilai HETP yang didapatkan maka makin efisien kolom yang

digunakan untuk pemisahan. Berikut adalah data pengamatan nilai HETP pada

setiap komposisi dan flow rate fase gerak yang digunakan:


57

Tabel VII. Nilai HETP pada campuran baku teobromin dan kafein masing-masing

100 ppm pada fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 pada flow

rate 0,5; 0,8 dan 1 mL/menit

Komposisi Fase Gerak

AnalitFlow rate

(mL/menit)

N (JumlahLempeng) HETPMetanol :

Akuabides/TEA3%

30 : 70

Teobromin 0,5 109,0289 0,22930,8 110,1995 0,22681 70,8443 0,3528

Kafein 0,5 289,5919 0,08630,8 291,8392 0,08571 130,1356 0,1921

35 : 65

Teobromin 0,5 194,0477 0,12880,8 172,4957 0,14491 71,0029 0,3521

Kafein 0,5 500,8626 0,04990,8 277,5434 0,09011 127,4644 0,1961

40 : 60

Teobromin 0,5 783,2014 0,03190,8 690,6010 0,03621 94,9534 0,2633

Kafein 0,5 1.9663,986 0,01270,8 1.752,3365 0,01431 125,1717 0,1997

Pada hasil pengamatan tersebut, dapat dilihat bahwa pada komposisi fase

gerak yang sama dengan semakin meningkatnya flow rate maka semakin besar

nilai HETP yang dihasilkan. Jika dilihat dari tiap komposisi fase gerak yang

digunakan, semakin banyak jumlah metanol yang digunakan maka nilai HETP

yang dihasilkan lebih kecil. Semakin banyak jumlah metanol yang digunakan,

maka akan semakin efisien pemisahan yang dihasilkan oleh kolom.

Optimasi komposisi dan flow rate fase gerak ini akan digunakan atau

diaplikasikan pada penetapan kadar teobromin dan kafein dalam matriks cokelat


58

bubuk sebagai sampelnya, sehingga teobromin dan kafein harus dapat terpisah

secara sempurna dengan begitu peak teobromin tidak akan mengganggu peak

kafein, begitu pula sebaliknya. Pemisahan antara kedua peak ini dapat diamati dari

nilai resolusi (RS). Rs menjadi indikator pemisahan kromatogram yang akan

dihasilkan dari senyawa analit. Nilai Rs harus mendekati atau lebih dari 1,5 karena

akan memberikan pemisahan puncak yang baik (Gandjar dan Rohman, 2007).

Data hasil pengamatan nilai resolusi dari kromatogram yang dihasilkan oleh

campuran baku teobromin dan kafein dapat dilihat pada tabel VII.

Tabel VIII. Nilai Resolusi pada campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100

ppm pada fase gerak metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70; 35 : 65 dan 40 : 60 pada flow rate

0,5; 0,8 dan 1 mL/menit

Komposisi Fase Gerak Flow rate(mL/menit) Resolusi

Metanol Akuabides/TEA3%30 70 0,5 2,79

0,8 3,261 1,723

35 65 0,5 3,590,8 3,0241 1,98

40 60 0,5 30,8 2,9421 1

Nilai resolusi yang didapatkan ini menggambarkan pemisahan yang terjadi

pada kromatogram dua senyawa analit yaitu teobromin dan kafein dalam larutan

baku campuran masing-masing 100 ppm. Tujuan pengamatan nilai resolusi ini

adalah untuk mengetahui komposisi serta flow rate fase gerak yang dapat

menghasilkan pemisahan kromatogram dengan nilai lebih dari 1,5. Pada data yang

diperoleh, dapat diketahui bahwa dengan semakin meningkatnya jumlah metanol,


59

nilai resolusinya semakin kecil, artinya kedua kromatogram semakin mendekat.

Selain dengan meningkatnya jumlah metanol yang digunakan, semakin tinggi flow

rate yang digunakan juga menghasilkan nilai resolusi yang semakin kecil. Dengan

demikian, dapat disimpulkan dengan peningkatan jumlah metanol dan flow rate

maka resolusi yang dihasilkan semakin kecil.

1. Fase Gerak metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70 dengan flow rate 0,5; 0,8

dan 1,0 mL/menit

Penentuan komposisi dan flow rate fase gerak yang optimal dilakukan

dengan mengubah komposisi fase gerak dan flow ratenya. Komposisi pertama

yang digunakan adalah komposisi metanol : akuabides/TEA3% dengan

perbandingan 30 : 70 menggunakan flow rate yang bervariasi yaitu 0,5; 0,8 dan

1,0 mL/menit. Pada optimasi ini, digunakan larutan yang mengandung baku

teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm.

Pada komposisi 30 : 70 ini, didapatkan peak yang runcing namun masih

mengalami tailing. Peak yang dihasilkan pada flow rate 0,5 mL/menit lebih lebar

dibandingkan 0,8 mL/menit dan 1 mL/menit, dan peak yang paling ramping

dihasilkan pada flow rate 1mL/menit. Semakin tinggi flow rate yang digunakan,

maka peak yang dihasilkan semakin kecil dan runcing. Permasalahan yang

ditemukan pada pemisahan dengan menggunakan komposisi ini adalah tailing

yang masih terjadi pada kromatogram. Berikut adalah hasil kromatogram larutan

baku campuran teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm pada komposisi

fase gerak 30 : 70 dengan flow rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit:


60

Gambar 25. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,dengan parameter KCKT sebagai berikut:


Gambar 26. Kromatogram campuran baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm,parameter KCKT seperti pada gambar 25 dengan flow rate 0,8 mL/menit

Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin

60




Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin

60




Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


61


Tailing yang terjadi pada kromatogram ini karena teobromin dan kafein

yang dianalisis merupakan senyawa basa yang cenderung akan mengalami

pengekoran karena berinteraksi dengan residu silanol pada kolom. Penggunaan

akuabides/TEA 3% pada komposisi ini adalah 70 bagian, dan metanol 30 bagian,

komposisi ini masih belum maksimal untuk mengelusi teobromin dan kafein dari

kolom. Pada tabel VI, dapat diketahui bahwa nilai tailing factor pada 0,5

mL/menit baik untuk teobromin dan kafein sudah kurang dari 2, begitu pula pada

flow rate 1 mL/menit, tetapi pada flow rate 0,8 mL/menit peak teobromin

mengalami tailing yang melebihi syarat karena nilai tailing factor yang dihasilkan

2,25.

Selain nilai tailing factor parameter HETP dan resolusi juga menjadi

pertimbangan, karena dari bentuk peak yang dihasilkan, sudah memberikan bentuk

yang ramping dan runcing, namun mengalami tailing. Maka pemilihan juga dilihat

dari HETP dan resolusi keduanya. Resolusi yang diperoleh seperti pada tabel VII,

Kafein

Teobromin

61











2,25.





Kafein

Teobromin

61











2,25.





Kafein

Teobromin


62

pemisahan paling besar terlihat pada flow rate 0,8 mL/menit dimana Rs yang

dihasilkan adalah 3,26 sedangkan untuk flow rate 0,5 mL/menit adalah 2,79 dan

flow rate 1 mL/menit adalah 1,723. Resolusi yang didapatkan pada komposisi ini

sudah memenuhi persyaratan resolusi yang baik, karena resolusi yang diperoleh

sudah lebih dari 1,5 sehingga dapat dipastikan bahwa peak teobromin dan kafein

sudah terpisah dan tidak saling mengganggu pengukuran satu sama lain. Semakin

meningkatnya flow rate yang digunakan, semakin kecil resolusi yang diperoleh,

tetapi terjadi penyimpangan karena resolusi terbesar didapatkan pada flow rate 0,8

mL/menit. Secara keseluruhan, semakin meningkatnya flow rate, semakin kecil

resolusi yang didapatkan.

Nilai HETP yang diperoleh pada komposisi fase gerak ini adalah yang

paling besar dibandingkan komposisi fase gerak lain, hal ini dapat dilihat pada

tabel VII. Semakin tinggi flow rate yang digunakan, semakin besar nilai HETP

yang didapatkan. Namun pada flow rate 0,8 mL/menit tidak sesuai karena nilai

HETP yang didapatkan justru lebih kecil dibandingkan flow rate 0,5 mL/menit.

Pada komposisi fase gerak 30 : 70 ini, flow rate yang menghasilkan

pemisahan yang paling baik adalah pada 1 mL/menit karena tailing factor yang

dihasilkan 1,75 dan 1,5 untuk teobromin dan kafein, resolusi yang dihasilkan

sudah mencapai 2,79 sehingga kedua peak sudah terpisah dengan baik serta nilai

HETP yang paling kecil baik untuk teobromin maupun kafein.


63


dan 1,0 mL/menit

Komposisi kedua yang digunakan adalah komposisi metanol :

akuabides/TEA 3% dengan perbandingan 35 : 65 dengan menggunakan flow rate

yang bervariasi yaitu 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit. Pada optimasi ini, digunakan

larutan yang mengandung baku teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm.

Berikut adalah hasil kromatogram yang diperoleh dari larutan baku campuran

teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm pada komposisi fase gerak 35 : 65

dengan flow rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit:



Kafein

Teobromin

63


dan 1,0 mL/menit










Kafein

Teobromin

63


dan 1,0 mL/menit










Kafein

Teobromin


64



Pada komposisi 35 : 65 ini, didapatkan peak yang lebih runcing

dibandingkan pada komposisi 30 : 70 untuk flow rate yang sama, selain itu waktu

retensi yang dihasilkan juga lebih pendek sehingga mempersingkat waktu analisis.

Peak yang dihasilkan lebih runcing, namun masih mengalami tailing. Tetapi nilai

tailing factor yang dihasilkan lebih kecil dibanding pada komposisi sebelumnya.

Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin

64








Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin

64








Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


65

Hal ini terjadi karena jumlah metanol yang digunakan semakin banyak, dengan

begitu kemampuan fase gerak untuk mengelusi senyawa analit dari fase diamnya

lebih besar. Tailing factor yang paling kecil dihasilkan pada flow rate 1 mL/menit

untuk teobromin dan kafein. Pada komposisi ini, peak yang dihasilkan memenuhi

parameter tailing factor, dimana nilainya kurang dari 2, tetapi peak teobromin

pada flow rate 0,8 mL/menit mengalami penyimpangan karena nilainya lebih dari

2 yaitu 2,25.

Parameter lain yaitu nilai resolusi juga menjadi pertimbangan, karena dari

bentuk peak yang dihasilkan, sudah memberikan bentuk yang ramping dan

runcing, namun mengalami tailing. Resolusi yang diperoleh seperti pada tabel

VIII, pemisahan paling besar terlihat pada flow rate 0,5 mL/menit dimana Rs nya

3,59 sedangkan untuk flow rate 0,8 mL/menit adalah 3,024 dan flow rate 1

mL/menit adalah 1,98. Resolusi yang didapatkan pada komposisi ini sudah

memenuhi persyaratan resolusi yang baik, karena resolusi yang diperoleh sudah

lebih dari 1,5 sehingga dapat dipastikan bahwa peak teobromin dan kafein sudah

terpisah dan tidak saling mengganggu pengukuran satu sama lain. Semakin

meningkatnya flow rate yang digunakan, semakin kecil resolusi yang diperoleh.

Nilai HETP yang diperoleh pada komposisi fase gerak ini lebih kecil

dibandingkan komposisi 30 : 70, dapat dilihat pada tabel VII. Nilai HETP yang

makin kecil dapat menggambarkan bahwa kolom yang digunakan semakin efisien

dalam pemisahan senyawa analit. Semakin tinggi flow rate yang digunakan,

semakin besar nilai HETP yang digunakan. Pada komposisi fase gerak ini, HETP

yang paling kecil didapatkan pada flow rate 0,5 mL/menit.


66

Pada komposisi fase gerak 35 : 65 ini, flow rate yang paling optimal untuk

memisahkan tebromin dan kafein adalah 1 mL/menit. Nilai HETP yang dihasilkan

memang lebih besar dibandingkan pada flow rate lainnya tetapi untuk nilai tailing

factor yang dihasilkan paling kecil yaitu 1,125 dan 1,5 untuk teobromin dan kafein

serta resolusi yang dihasilkan lebih besar dari 2.


dan 1,0 mL/menit

Komposisi ketiga yang digunakan adalah komposisi metanol :




Pada komposisi 40 : 60 ini, didapatkan peak yang ramping namun tetap

mengalami tailing. Seperti yang sudah dijelaskan sebelumnya, kromatogram

cenderung untuk mengalami tailing karena analit merupakan senyawa basa dan

akan berinteraksi dengan residu silanol yang ada di dalam kolom C18. Meskipun

mengalami tailing, namun kromatogram yang dihasilkan masih memenuhi

parameter tailing factor yang baik karena nilai Tf masih lebih kecil dari 2, seperti

pada tabel VI. Berikut adalah hasil kromatogram yang diperoleh larutan baku

campuran teobromin dan kafein masing-masing 100 ppm pada komposisi fase

gerak 40 : 60 dengan flow rate 0,5; 0,8 dan 1,0 mL/menit:


67




Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin

67




Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin

67




Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


68


Waktu retensi yang dihasilkan pada komposisi fase gerak perbandingan 40

: 60 ini lebih pendek dibandingkan pada komposisi fase gerak 30 : 70 dan 35 : 65.

Hal ini terjadi karena jumlah metanol yang digunakan semakin banyak dan

kemampuan fase gerak dalam mengelusi senyawa analit menjadi lebih besar,

sehingga senyawa analit juga lebih cepat terelusi dari kolom. Dengan waktu

retensi yang lebih pendek, maka akan meningkatkan efisiensi waktu analisis.

Semakin meningkatnya flow rate yang digunakan, waktu retensi dari kedua analit

juga semakin pendek.

Resolusi yang didapatkan pada komposisi ini juga memenuhi persyaratan

yaitu lebih dari 1,5. Penyimpangan terjadi pada flow rate 1 mL/menit dimana

resolusi yang dihasilkan adalah 1. Hal ini menggambarkan bahwa peak teobromin

dan kafein tidak terpisah secara sempurna atau tidak mengalami baseline, sehingga

pengukuran peak teobromin dan kafein dapat saling mengganggu. Hal ini terjadi

karena senyawa analit mengalami elusi yang lebih cepat akibat fase gerak yang

Kafein

Teobromin

68
















Kafein

Teobromin

68
















Kafein

Teobromin


69

mengalir mengalami peningkatan kecepatan alir, tidak memberikan kesempatan

pada analit untuk berinteraksi lebih lama. Pada flow rate 0,5 dan 0,8 mL/menit

tidak mengalami masalah karena resolusi yang dihasilkan adalah 3 dan 2,942.

Semakin meningkatnya flow rate yang digunakan, semakin kecil nilai resolusi

yang dihasilkan.

Nilai HETP yang diperoleh pada komposisi 40 : 60 ini adalah yang paling

kecil dibandingkan pada komposisi 30 : 70 dan 35 : 65, dapat dilihat pada tabel

VII. Semakin tinggi flow rate yang digunakan, semakin besar nilai HETP yang

didapatkan. Nilai HETP diharapkan dapat sekecil-kecilnya, karena semakin kecil

nilai HETP, makin efisien pemisahan pada kolom semakin baik. Pada komposisi

ini efisiensi kolom paling baik dibandingkan 2 komposisi lain dilihat dari nilai

HETP yang dihasilkan paling kecil dibandingkan komposisi lainnya. Nilai HETP

yang paling kecil didapat pada flow rate 0,5 mL/menit yaitu 0,0319 untuk

teobromin dan 0,0127 untuk kafein.

Pada komposisi 40 : 60 ini, didapatkan pemisahan yang paling baik jika

dilihat dari nilai tailing factor, HETP dan resolusi adalah pada flow rate 0,8

mL/menit. Tailing factor yang paling baik adalah pada flow rate 1 mL/menit,

tetapi resolusi yang dihasilkan adalah 1, sehingga pemisahannya belum baik. Pada

flow rate 0,5 mL/menit, resolusi yang dihasilkan bagus karena nilainya mencapai

3 namun tailing factor pada peak kafein tidak memenuhi persyaratan. Dapat

disimpulkan bahwa pada flow rate 0,8 mL/menit didapat pemisahan yang baik

dengan nilai resolusi 2,945, tailing factor 1,67 untuk masing-masing analit dan

HETP 0,0362 untuk teobromin dan 0,0143 untuk kafein.


70

Dengan demikian, dari seluruh parameter yang digunakan untuk dapat

menentukan komposisi dan flow rate fase gerak yang paling optimal untuk

menghasilkan pemisahan yang baik antara teobromin dan kafein adalah komposisi

metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow rate 0,8 mL/menit. Pada

komposisi dan flow rate ini, Tf yang dihasilkan adalah 1,67 untuk teobromin dan

kafein, HETP yang dihasilkan adalah 0,0362 untuk teobromin dan 0,0143 untuk

kafein serta resolusi 2,945. Selain parameter yang telah disebutkan, pemilihan juga

berdasarkan waktu retensi yang dihasilkan pada komposisi dan flow rate ini cukup

singkat dimana tR untuk teobromin adalah 2,233 menit, sedangkan kafein adalah

3,557 menit.

Komposisi dan flow rate fase gerak yang dapat memberikan pemisahan

yang optimal sudah didapatkan, selanjutnya adalah melakukan pengujian

reprodusibilitas sistem (UKS/Uji Kesesuaian Sistem). Uji ini bertujuan untuk

mengetahui reprodusibilitas sistem yang dapat diamati dari nilai %CV harus < 2%

(Anonim, 2005). Dengan nilai %CV < 2% maka suatu sistem dikatakan memiliki

presisi yang baik, dengan begitu sistem yang digunakan bisa dikatakan “ajeg”,

karena dengan melakukan penginjekan berkali-kali hasil yang diperoleh tetap baik.

Uji Kesesuaian Sistem ini dilakukan dengan menggunakan larutan baku campuran

teobromin dan kafein pada 3 tingkat konsentrasi yaitu 40, 80 dan 160 ppm. Tiga

konsentrasi yang digunakan untuk memastikan bahwa reprodusibilitas sistem ini

dapat dijamin baik pada konsentrasi rendah, sedang dan tinggi. Parameter yang

digunakan pada UKS ini adalah waktu retensi, tailing factor, HETP, nilai Area


71

Under Curve (AUC) dan resolusi. Berikut adalah hasil pengamatan pada Uji

Kesesuaian Sistem ini:

Tabel IX. Uji Kesesuaian Sistem KCKT pada pemisahan teobromin pada campuran

larutan baku teobromin dan kafein konsentrasi 40, 80 dan 160 ppm pada fase gerak metanol

: akuabides/TEA 3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit

KonsentrasiBaku

Teobromindan

Kafein

Ripitasi

Teobromin

tR(menit) Tailing factor HETP AUC

40 ppm 1 2,236 1,6500 0,0817 33689602 2,254 1,6875 0,0809 33700083 2,254 1,6250 0,0799 33677324 2,254 1,6250 0,0799 33695195 2,255 1,6250 0,0798 3372030

rata-rata 2,2478 1,6425 0,0805 3369646,8SD 9,0664x10-3 0,0274 8,0558x 10-4 15783,3770CV (%) 0,4033 1,6673 1,001 0,0468

80 ppm 1 2,239 1,5 0,068 60908112 2,245 1,5 0,0677 60864003 2,246 1,5625 0,0676 60929384 2,244 1,5 0,0677 60867025 2,245 1,5 0,0677 6087957

rata-rata 2,2438 1,5125 0,0678 6088961,6SD 2,7748X10-3 0,0279 1,6649X10-4 2824,4336CV (%) 0,1237 1,8477 0,2456 0,0464

160 ppm 1 2,24 1,57 0,0455 121603082 2,233 1,5625 0,0458 121624073 2,24 1,571 0,0455 121531414 2,241 1,571 0,0454 121583545 2,239 1,571 0,0455 12165580

rata-rata 2,2386 1,67 0,0455 12159958SD 3,2093X10-3 0 1,5166X10-4 4657,553CV (%) 0,1434 0 0,333 0,0383


72

Tabel X. Uji Kesesuaian Sistem KCKT pada pemisahan kafein pada campuran

larutan baku teobromin dan kafein konsentrasi 40, 80 dan 160 ppm pada fase gerak metanol

: akuabides/TEA 3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit

KonsentrasiBaku

Teobromindan

Kafein

Ripitasi

Kafein

tR(menit) Tailing factor HETP AUC

40 ppm 1 3,608 1,500 0,0366 30503242 3,607 1,545 0,0366 30638933 3,619 1,500 0,0364 30852684 3,617 1,500 0,0364 30838485 3,617 1,500 0,0364 3059155

rata-rata 3,6136 1,509 0,0365 3068497,6SD 5,639x10-3 0,0201 1,0954 x 10-4 15.456,7726CV (%) 0,0156 1,334 0,3003 0.5037

80 ppm 1 3,598 1,625 0,0264 56219052 3,609 1,625 0,0262 56173393 3,611 1,611 0,0261 56266394 3,611 1,625 0,0261 56098445 3,615 1,625 0,0261 5617836

rata-rata 3,588 1,6222 0,0262 5618712,6SD 1x10-3 6,2609X10-3 9,1104X10-5 6.211,4229CV (%) 0,0278 0,3859 0,3474 1,105

160 ppm 1 3,6 1,69 0,0263 111590112 3,583 1,6875 0,0266 111606933 3,602 1,750 0,0263 111549574 3,604 1,688 0,0263 111595435 3,6 1,688 0,0263 11186139

rata-rata 3,5978 1,7 0,02363 11164068SD 8,4380X10-3 0,02795 1,3416X10-4 12.525,7594CV (%) 0,2345 1,64416 0,5589 0,1122


73

Tabel XI. Uji Kesesuaian Sistem KCKT resolusi pada campuran larutan baku

teobromin dan kafein konsentrasi 40, 80 dan 160 ppm pada fase gerak metanol :

akuabides/TEA 3% 40 : 60 flow rate 0,8 mL/menit

KonsentrasiBaku

Teobromindan

Kafein

Ripitasi Resolusi

40 ppm 1 1,82932 1,82273 1,88274 1,885 1,8467

rata-rata 1,8523SD 0,0279CV (%) 1,5097

80 ppm 1 2,17442 2,18243 2,14 2,18725 2,1192

rata-rata 2,1672SD 0,0381CV (%) 1,7591

160 ppm 1 2,1762 2,1253 2,1794 2,1815 2,168

rata-rata 2,1658SD 0,0233CV (%) 1,0776

Semua parameter yang harus dipenuhi yaitu tailing factor, waktu retensi,

HETP, AUC serta resolusi pada kromatogram yang dihasilkan, diperoleh nilai

%CV kurang dari 2% baik pada konsentrasi rendah, tengah maupun tinggi, data


74

yang diperoleh dapat dilihat pada tabel IX, X dan XI. Dengan demikian, dapat

disimpulkan bahwa sistem yang digunakan pada optimasi metode KCKT ini

memiliki reprodusibilitas yang baik.

Berdasarkan hasil optimasi serta Uji Kesesuaian Sistem yang dilakukan

pada penelitian ini, didapatkan kesimpulan bahwa komposisi fase gerak metanol :

akuabides/TEA 3% 40 : 60 dengan flow rate 0,8 mL/menit adalah yang paling baik

menghasilkan pemisahan teobromin dan kafein dengan menggunakan metode

KCKT fase terbalik. Metode ini juga memiliki reprodusibilitas yang baik, dengan

demikian dapat digunakan dalam tahapan validasi metode analisis serta penetapan

kadar teobromin serta kafein.


75

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Kondisi optimum yang didapatkan pada pemisahan teobromin dan kafein

untuk aplikasi dalam sampel serbuk cokelat dengan metode KCKT fase

terbalik adalah menggunakan komposisi fase gerak metanol : akuabides/TEA

3% (40 : 60) pada flow rate 0,8 mL/menit, dengan spesifikasi sebagai berikut:

Kolom : Kromasil Oktadesilsilan C-18 (100-5C18) merek KNAUER dimensi

250 mm x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm

Detektor : Ultraviolet pada 275 nm

B. Saran

1. Perlu dilakukan validasi metode KCKT fase terbalik pada penetapan kadar

teobromin dan kafein.

2. Perlu dilakukan penetapan kadar teobromin dan kafein dalam sampel serbuk

cokelat merek ‘x’.


77

Daftar Pustaka

Alexander, J., Benford, D., Cockburn, A., Cravedi, J.P., Dogliotti, E., andDomenico, A.D., 2008, Theobromine as undesirable substances inanimal feed, The Eur. Food Safety Authority J., 725, pp. 1-66.

Anonim, 2005, The United States Pharmacopeia The National Formulary,Volume II, United States Pharmacopeial Convention, INC, Rockville,pp. 2389.

Anonim, 2011, Theobroma cacao, http://en.wikipedia.org/wiki/Theobroma_cacao, diakses tanggal 21 Oktober 2011.

Chan, C. C., Lam, H., Lee, Y.C., and Zhang, X.M., 2004, Analytical MethodValidation and Instrument Performance Verification, John Wiley &Sons, Canada, pp. 173-184.

Choo, Khor Swan and Tee E-Siong, 1996, Development of a HPLC method forthe simultaneous determination of several B-vitamins and ascorbic acid,Malay. J. Nutrition., 2, pp. 49-65.

Czech, K., Johnson, A., and Rodeberg, N., 2011, Simultaneous determination ofcaffeine and theobromine in local area coffee brews, Con. Coll. J. Anal.Chem., 2, pp. 17-22.

Clarke, E.G.C., 1969, Isolation and Identification of Drugs in Pharmaceuticals,Body Fluids and Post-mortem material, Pharmaceutical Press, London,pp. 234, 567.

Gandjar, I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,Yogyakarta, pp. 323-346.

Gennaro, A.R., 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th

Edition, Lippincott William & Wilkins, Philadephia, pp. 1472.

Gonzales, A.Gustavo., and Herrador, M.A., 2007, A Practical Guide to AnalyticalMethod Validation, including Measurement Uncertainty and AccuracyProfile, Trends in Anal. Chem., 26, pp. 232, 234.

Johnson, E. L. and Stevenson, R., 1978, Dasar Kromatografi Cair, diterjemahkanoleh Kosasih Padmawinata, Penerbit ITB, Bandung, pp. 17-22.

Kasabe, A. J. and Badhe, G. B., 2010, Extraction and Estimation of Theobrominein Marketed Tea by HPTLC and UV Method, Int. J. App. Biol. andPharm. Tech., 1, pp. 367-373.


http://en.wikipedia.org/wiki/Theobroma_

78

Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, diterjemahkan oleh A.Saptohardjo, Pendamping Agus Nurhadi, UI Press, Jakarta, pp. 194, 202.

Kuwana, T., 1980, Physical Methods In Modern Chemical Analysis, Vol II,Academic Press, London, pp. 12, 29.

Long, William J. and Henderson, Jhon W. Jr., 2007 Chromatography of Nitrogen-Containing Compounds Without Triethylamine, Agilent Technology.

Moffat, A.C., Osselton, M.D. and Widdop B., 2004, Clarke’s: Analysis of drugand poisons, Pharmaceutical Press, USA

Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, Universitas Airlangga,Surabaya, pp. 6-11, 26, 31, 34.

Noegrohati, S., 1994, Pengantar Kromatografi, UGM, Yogyakarta, pp. 16, 17.

Pescok, R. L., Shields, L. D., and Cains, T., 1976, Modern Methods of ChemicalAnalysis, 2nd ed, John Wiley & Sons, Canada, pp. 51.

Ptolemy, Adam S., Tziousmis, E., Thomke, A., Rifai, S., and Kellogg, M., 2010,Quantification of Theobromine and Caffeine in Saliva, Plasma andUrine via Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry: ASingle Analytical Protocol Applicable to Cocoa Intervention Studies, J.Chrom. B., 878, pp. 409-416.

Ramli, N., Yatim, A. M., Said, M., and Hok, H. C., 2000, HPLC Determination ofMethylxanthines and Polyphenols Levels In Cocoa and ChocolateProducts, Malay. J. Anal. Sci., 7, pp. 377-386.

Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta,pp. 13, 11, 117.

Sastrohamidjojo, H., 2001, Spektroskopi, Penerbit Liberty, Yogyakarta, pp. 8-12,17-19.

Skoog, D.A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, 3rd, Saunders CollegePublishing, USA, pp. 185-188.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 1997, Practical HPLC MethodDevelopment, 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp. 208,209,710-723.

Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L., 2010, Introduction to ModernLiquid Chromatography, 3rd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, pp.20-57.


79

Wanyika, H. N., Gatebe, E. G., Gitu, L. M., Ngumba, E.K., and Maritim, C.W.,2010, Determination of Caffein Content of Tea and Instant CoffeeBrands Found in Kenyan Market, Af. J. Sci., 4, pp. 353-358.

Willard, H. H., Merrit, Jr., Dean, J.A., and Settle Jr, F.A., 1988, InstrumentalMethods of Analysis, 7th ed., Wadsworth Publishing Company,California, pp. 525-529.


80

LAMPIRAN


81

Lampiran 1. COA

TEOBROMIN


82

Lampiran 2. COA KAFEIN


83

Lampiran 3. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerakmethanol : akuabides/TEA 3% (30 : 70)

a. Flow rate 0,5 mL/menit

Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2

b. Flow rate 0,8 mL/menit

Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µL

Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


84

Detektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2

c. Flow rate 1 mL/menit

Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 30 : 70Flow rate : 1 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2

Teobromin

Kafein


85

Lampiran 4. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerakmethanol : Akuabides/TEA 3% (35 : 65)

a. Flow rate 0,5 mL/menit

Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2


Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µL

Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


86



Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 35 : 65Flow rate : 1mL/menitVolume injeks : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2

Kafein

Teobromin


87

Lampiran 5. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerakmethanol : akuabides/TEA 3% (40 : 60)a. Flow rate 0,5 mL/menit

Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,5 mL/menitVolume injeks : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2


Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeks : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2

Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


88


Nama Sampel : Campuran baku teobromin 100 ppm dan kafein 100 ppmFase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 1 mL/menitVolume injeks : 20 µLDetektor UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2

Kafein

Teobromin


89

Lampiran 6. Nilai Tailing Factor (Tf) peak teobromin dan kafein pada fasegerak metanol : akuabides/TEA 3% dan contoh perhitungan.

Komposisi fase gerakMetanol :

akuabides (TEA 3%)

Flow rate(mL/menit)

Teobromin Kafein

a b T.f a b T.f

40 : 60 0,5 0,2 0,5 1,75 0,2 0,6 20,8 0,2 0,3 1,67 0,15 0,35 1,67

1 0,15 0,35 1,67 0,2 0,35 1,375

35 : 65 0,5 0,25 0,5 1,5 0,2 0,55 1,50,8 0,1 0,35 2,25 0,2 0,35 1,67

1 0,2 0,25 1,125 0,15 0,3 1,5

30 : 70 0,5 0,2 0,5 1,75 0,25 0,5 1,50,8 0,1 0,35 2,25 0,15 0,35 1,67

1 0,1 0,25 1,75 0,2 0,25 1,125

Contoh perhitungan :

Tailing factor (T.f) = = = 1,75

b =

a =


90

Lampiran 7. Nilai HETP dari peak teobromin dan kafein pada fase gerakmetanol : akuabides/TEA 3% dan variasi flow rate serta contoh perhitungan.

Komposisi fase gerakMetanol : akuabides/TEA 3% Flow rate

(mL/menit)

TeobromintR

(menit) w1/2 h N HETP

40 : 60 0,5 3,5670 0,3 783,2014 0,03190,8 2,2330 0,2 690,6010 0,0362

1 2,277 0,55 94,9534 0,263335 : 65 0,5 3,551 0,6 194,0477 0,1288

0,8 2,232 0,4 172,4957 0,14491 1,790 0,5 71,0029 0,3521

30 : 70 0,5 3,549 0,8 109,0289 0,22930,8 2,230 0,5 110,1995 0,2268

1 1,788 0,5 70,8443 0,3528

Komposisi fase gerakMetanol : akuabides/TEA 3%

Flow rate(mL/menit)

KafeintR

(menit) w1/2 h N HETP

40 : 60 0,5 5,6520 0,3 19663,986 0,01270,8 3,5570 0,2 1752,3365 0,0143

1 2,852 0,6 125,1717 0,199735 : 65 0,5 5,705 0,6 500,8626 0,0499

0,8 3,593 0,5 277,5434 0,09011 2,878 0,6 127,4644 0,1961

30 : 70 0,5 5,784 0,8 289,5919 0,08630,8 3,629 0,5 291,8392 0,0857

1 2,908 0,6 130,1356 0,1921Contoh perhitungan nilai HETP :

h

½ h


91

N = 5,54 x ( )

N = 5,54 x (

N= 783.2014

HETP =

Panjang Kolom = 25 cm

HETP = = 0.0319


92

Lampiran 8. Nilai Resolusi (Rs) peak teobromin dan kafein pada fase gerakmetanol : akuabides/TEA 3% dan variasi flow rate serta contoh perhitungan.

Komposisi fase gerakMetanol : akuabides/TEA 3%

Flow rate(mL/menit)

Waktu Retensi ResolusitR 1

(menit)tR 2

(menit) w1 w2 Rs

40 : 60 0,5 3,5670 5,6520 0,75 0,6 30,8 2,2330 3,5570 0,5 0,4 2,942

1 2,277 2,852 0,2 0,2 1

35 : 65 0,5 3,551 5,705 0,6 0,6 3,590,8 2,232 3,593 0,4 0,5 3,024

1 1,790 2,878 0,5 0,6 1,98

30 : 70 0,5 3,549 5,784 0,8 0,8 2,790,8 2,230 3,629 0,5 0,5 3,26

1 1,788 2,908 0,5 0,8 1,723

Contoh perhitungan :

Rs =

Rs =

Rs = 3

W1

W2


93

Lampiran 9. Uji Kesesuaian Sistem KCKT. Kromatogram teobromin dan kafeinkonsentrasi 40 ppm

Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 40 ppm replikasi 1Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2

Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 40 ppm replikasi 2Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µL

Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


94




Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


95


Kafein

Teobromin


96



Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 80 ppm replikasi 2Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µL

Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


97




Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


98


Kafein

Teobromin


99




Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


100


Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 160 ppm replikasi 4Fase diam Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gerak : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2

Kafein

Teobromin

Kafein

Teobromin


101

Nama Sampel : Campuran baku teobromin dan kafein 160 ppm replikasi 5Fase diam : Kromasil 100-5 C18 dimensi 250 x 4,6 mm, 5µmFase gera : metanol : akuabides/TEA 3% 40 : 60Flow rate : 0,8 mL/menitVolume injeksi : 20 µLDetektor : UV-275 nmPump Presure : 173 kgf/cm2

Kafein

Teobromin


102

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Optimasi Komposisi danFlow Rate Fase Gerak Pada Penentuan Kadar Teobromindan Kafein dalam Cokelat Bubuk dengan MenggunakanMetode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik”ini memiliki nama lengkap Eka Riusinta Wati. Penulislahir di Medan, pada 27 September 1990. Penulis adalahanak pertama dari dua bersaudara pasangan Budiono danSabariah. Penulis telah menyelesaikan pendidikannya diTK Karya Maju Medan pada 1995-1996, SD AntoniusMedan pada 1996-1997, SD Strada Cakung Bekasi pada

1996-2002, SMP Strada Kampung Sawah Bekasi pada 2002-2005 dan SMAPangudi Luhur II Servasius Bekasi pada 2005-2008. Kemudian penulismelanjutkan studi di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2008.Selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma,pernah menjadi asisten praktikum Farmasi Fisika dan praktikum Formulasi danTeknologi Sediaan Semi-Solid. Selain kegiatan akademik, penulis juga aktifdalam kegiatan organisasi yaitu sebagai sekretaris organisasi DPMF FakultasFarmasi (2011-2012), menjadi anggota sie acara dalam kegiatan Titrasi (2009)dan Donor darah JMKI (2009), anggota kesekretariatan dalam kegiatan SeminarTOI (2010) dan menjadi MC dalam kegiatan Pelepasan Wisuda (2011). Penulisjuga pernah menjadi relawan korban merapi di Hargobinagun dan stadionMaguwoharjo. Penulis pernah mendapatkan beasiswa Peningkatan PrestasiAkademik (PPA) tahun 2010-2011 dan PKA-Rahmat periode 2011-2012.


Documents

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk filei optimasi komposisi dan flow rate fase gerak pada penentuan kadar teobromin dan kafein dalam cokelat bubuk dengan menggunakan