PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk · Pengamatan ekspresi protein dengan metode imunositokimia . 33 ... suatu enzim yang mengatur sintesis prostaglandin dan di

AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN KELADI

TIKUS (Typhonium flagelliforme Lodd. Blume) TERHADAP SEL KANKER

KOLON WiDr MELALUI PENEKANAN EKSPRESI PROTEIN COX-2

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Handika Immanuel

NIM : 118114083

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2015

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN KELADI

TIKUS (Typhonium flagelliforme Lodd. Blume) TERHADAP SEL KANKER

KOLON WiDr MELALUI PENEKANAN EKSPRESI PROTEIN COX-2

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh :

Handika Immanuel

NIM : 118114083

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2015


ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

KOLOSE 3 : 23

“Apapun juga yang kamu perbuat, perbuatlah dengan segenap hatimu

seperti untuk Tuhan dan bukan untuk manusia”

Kupersembahkan Karyaku untuk :

Bapa Di Surga

Papa, Mama, Dede

Para Sahabat

Almamaterku


v


vi


vii

PRAKATA

Syukur bagi Allah Tritunggal karena atas anugrah dan rahmat-Nya Penulis

dapat menyelesakan skripsi ini dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi

salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) program studi

Farmasi.

Penulis telah banyak menerima dukungan selama proses perkuliahan,

penelitian dan penyusunan skripsi. Oleh karena itu, Penulis ingin mengucapkan

terima kasih kepada :

1. Aris Widayati selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta

2. Agustina Setiawati, M.Sc, Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah

memberikan waktu, bimbingan, pengarahan, serta masukan kepada Penulis

dalam penyusunan skripsi.

3. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan waktu, masukan, kritik dan saran kepada Penulis.

4. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan waktu, masukan, kritik dan saran kepada Penulis.

5. Segenap Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma yang telah mengajar, membantu dan membimbing penulis selama

perkuliahan.

6. Gigih Prayoga, Tjok Gede Perdana Wiguna, dan Mery Tri Utami sebagai

rekan satu tim atas kerjasama, persahabatan, bantuan dan kebersamaan

selama proses penyusunan skripsi.


viii

7. Angky Glori, Henra, Canly Hansen Sudirman, Andre Salim, Prasetyo

Handy Kurniawan, Andrian, Surya Adhi Nugraha, Vina Alvionita Susilo,

Ester Rina Dwi Astuti, Laurensia Jessie Loreta, Fransisca Andriani, Verni

Emelia, Greta Paulina, Gabriella Septiana, Giacinta Puspananda, atas

dukungan dan doa dalam skripsi ini.

8. Teman-teman angkatan 2011 terkhusus Kelas FSM B 2011 dan FST A

2011 atas keceriaan dan kebersamaan yang tidak akan terlupakan.

9. Teknisi Laboratotium Parasitologi dan Team CCRC UGM yang telah

membantu dalam penelitian ini.

10. Bagian Instalasi Patologi Anatomi RSUP Dr. Sardjito Yogyakarta yang

telah membantu dalam penelitian ini.

11. Pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu oleh Penulis.

Penulis menyadari bahwa didalam skripsi ini masih ada

kekurangan. Oleh karena itu, Penulis mengharapkan saran dan kritik yang

membangun dari seluruh pihak. Semoga skripsi ini memberikan manfaat

bagi kita semua.

Yogyakarta, 29 Januari 2015

Penulis


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................ i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................ ii

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................ iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................... v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ................................... vi

PRAKATA ............................................................................................... vii

DAFTAR ISI ............................................................................................ ix

DAFTAR TABEL .................................................................................... xiv

DAFTAR GAMBAR ................................................................................ xv

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xvi

INTISARI ................................................................................................. xvii

ABSTRACT ............................................................................................... xviii

BAB I. PENGANTAR .............................................................................. 1


x

A. Latar Belakang ................................................................................ 1

1. Perumusan masalah ................................................................. 5

2. Keaslian penelitian .................................................................. 6

3. Manfaat penelitian ................................................................... 6

B. Tujuan Penelitian ............................................................................. 7

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .............................................................. 8

A. Kanker Kolon. ................................................................................. 8

1. Definisi dan karsinogenesis kanker kolon ................................ 8

2. Jalur APC / -catenin .............................................................. 9

3. Mutasi K-Ras .......................................................................... 9

4. SMAD-4 dan TP53 ................................................................. 10

B. COX-2 dan Kanker Kolon ............................................................... 11

C. WiDr ............................................................................................... 14

D. Tanaman Keladi Tikus ..................................................................... 15

1. Deskripsi tanaman ................................................................... 15

2. Klasifikasi tanaman ................................................................. 16

3. Nama daerah ........................................................................... 16


xi

4. Kandungan fitokimia ............................................................... 16

E. Doksorubisin ................................................................................... 17

F. Apoptosis dan Nekrosis .................................................................... 18

G. Uji sitotoksik dengan metode MTT .................................................. 20

H. Uji Apoptosis Double Staining ........................................................ 22

I. Uji Imunositokimia .......................................................................... 23

J. Landasan Teori ................................................................................ 24

K. Hipotesis ......................................................................................... 25

BAB III. METODE PENELITIAN ........................................................... 26

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ....................................................... 26

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ................................... 26

1. Variabel utama ........................................................................ 26

2. Variabel pengacau ................................................................... 26

3. Definisi operasional................................................................. 27

C. Bahan Penelitian .............................................................................. 27

D. Alat Penelitian ................................................................................. 28

E. Tata Cara Penelitian ......................................................................... 28


xii

1. Determinasi tanaman keladi tikus. .......................................... 28

2. Sterilisasi alat ......................................................................... 29

3. Pembuatan simplisia. .............................................................. 29

4. Ekstraksi daun keladi tikus dengan maserasi. .......................... 29

5. Pembuatan media kultur ......................................................... 29

6. Uji sitotoksisitas daun keladi tikus dengan metode MTT. ....... 30

7. Uji induksi apoptosis dengan metode double staining ............. 32

8. Pengamatan ekspresi protein dengan metode imunositokimia . 33

F. Tata Cara Analisis Hasil ................................................................... 36

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 38

A. Penyiapan Ekstrak Keladi Tikus ...................................................... 38

B. Uji Sitotoksik Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi tikus Terhadap

Sel Kanker Widr…………............................................................... 40

C. Uji Apoptosis Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi Tikus dengan

Metode Double Staining…………………………………………… 45

D. Uji Imunositokimia COX-2 akibat perlakuan ekstrak……………… 48

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ................................................... 52

A. Kesimpulan ..................................................................................... 52


xiii

B. Saran ............................................................................................... 52

DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 53

LAMPIRAN ............................................................................................. 59

BIOGRAFI PENULIS……………………………………………………... 79


xiv

DAFTAR TABEL

Tabel I. Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode

double staining ....................................................................... 48

Tabel II. Jumlah rata-rata sel yang mengekpresikan COX-2

dalam tiap perlakuan ............................................................... 50

Tabel III. Hasil uji statistik kebermaknaan antara perlakuan yang

diberikan dengan kontrol sel……………………………… .... 50


xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Tahapan Karsinogenesis pada Kanker Kolon ........................... 11

Gambar 2. Pengaruh ekspresi COX-2 pada kanker kolorektal ................... 13

Gambar 3. Tanaman Keladi Tikus ............................................................ 15

Gambar 4. Struktur kimia doksorubisin…………………………………... 18

Gambar 5. Reaksi MTT menjadi Formazan .............................................. 22

Gambar 6. Kurva hubungan viabilitas sel vs log konsentrasi ekstrak daun

keladi tikus…………………………………………………… 43

Gambar 7. Efek sitotoksik ekstrak daun keladi tikus terhadap sel kanker

kolon WiDr…………………………………………………... 44

Gambar 8. Hasil Uji double staining ekstrak keladi tikus .......................... 46

Gambar 9.Hasil Imunositokimia sel kanker kolon WiDr ........................... 51


xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode

double staining………………………………………. 60

Lampiran 2. Hasil Perhitungan Uji Ekspresi Protein dengan metode

Imunositokimia………………………………………… 62

Lampiran 3. Pengolahan data uji sitotoksik MTT assay………........ 63

Lampiran 4. Dokumentasi uji sitotoksik MTT assay……………….. 66

Lampiran 5. Dokumentasi uji double staining……………………… 67

Lampiran 6. Dokumentasi uji imunositokimia……………………… 69

Lampiran 7. Hasil analisis statistik pada uji imunositokimia dengan

Program R………………………………………………. 72

Lampiran 8. Perhitungan IC50 Doksorubisin dengan program R…… 76

Lampiran 9. Perhitungan IC50 ekstrak keladi tikus dengan program R 77

Lampiran 10. Surat keterangan determinasi tanaman keladi tikus…. 78


xvii

INTISARI

Obat antikanker yang sudah beredar sekarang ini memiliki efek samping

yang cukup besar bagi konsumen karena rendahnya selektivitas dari obat-obatan

tersebut. Eksplorasi bahan alam yang lebih aman namun tetap memiliki efek

terapi dapat dijadikan alternatif dari kemoterapi. Banyak tanaman khususnya di

Indonesia yang memiliki potensi antikanker, salah satunya adalah keladi tikus

(Typhonium flagelliforme Lodd. Blume).

Tujuan dari penelitian ini adalah menguji aktivitas antikanker ekstrak

etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker kolon WiDr dan mengetahui

potensinya dalam menghambat produksi enzim siklooksigenase 2 (COX-2), enzim

yang meningkatkan kemampuan invasi dari kanker kolon. Penelitian ini

merupakan jenis eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak

lengkap pola searah. Uji aktivitas sitotoksik dilakukan dengan menggunakan

metode in vitro MTT assay dan dihitung inhibitory concentration 50 (IC50) dari

ekstrak uji menggunakan program statistik R-2.14.0. Dilakukan uji double staining

untuk mengetahui penyebab kematian sel dan kemudian dilakukan uji

imunositokimia untuk melihat kemampuan ekstrak dalam menghambat ekspresi

enzim COX-2.

Hasil uji sitotoksik terhadap sel WiDr dengan metode MTT menunjukan

nilai IC50 ekstrak etil asetat daun keladi tikus sebesar 102 g/mL. Hasil uji

apoptosis dengan double staining menunjukan ekstrak etil asetat keladi tikus

menginduksi apoptosis, dan hasil uji imunositokimia menunjukan bahwa ekstrak

etil asetat daun keladi tikus menekan ekspresi protein COX-2.

Kata kunci : daun keladi tikus, sel kanker kolon WiDr, COX-2, apoptosis, Uji

sitotoksik, IC50, Double Staining, Imunositokimia


xviii

ABSTRACT

Anticancer drugs that are marketed today have considerable side effects

for patient because of the low selectivity of these drugs. In terms of reducing these

side effects, exploration of natural materials that are safer but still has a

therapeutic effect can be used as an alternative to chemotherapy. Many plants

especially in Indonesia has the potential anticancer activity, one of which is a

rodent tuber (Typhonium flagelliforme Lodd. Blume).

The purpose of this study was to test the anticancer activity of the ethyl

acetate extract of rodent tuber leaves against WiDr colon cancer cells and to

investigate the potential of the extract in inhibiting the production of the

cyclooxygenase 2 (COX-2), an enzyme that increases the ability of invasion of

colon cancer. This study is a purely experimental design was completely

randomized with a unidirectional pattern. Cytotoxic activity test performed by in

vitro using MTT assay and the IC50 of the extract using the R program. To

investigate the cause of death of the cells, the double staining assay are performed

and then the imunocytochemistry test are performed to investigate whether the

extract has the potential in inhibiting the expression of COX-2 enzyme.

The result of the cytotoxicity MTT assay showed that the value of the

extract is 102 g/mL. The result of double staining assay showed that the exract

of rodent tuber induces apoptosis, and the result of immunocytochemistry assay

showed that the ethyl acetate extract of rodent tuber suppress COX - 2 protein

expression.

Keywords : rodent tuber leaves, WiDr colon cancer, COX-2, apoptosis,

cytotoxicity assay, IC50, double staining, immunocytochemistry


1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kanker kolon merupakan salah satu penyakit yang mematikan. World

Cancer Report WHO melaporkan bahwa sekitar 944.717 kasus ditemukan di

seluruh dunia pada tahun 2000. Insiden yang tinggi pada kasus kanker kolorektal

ditemukan di negara Amerika Serikat, Eropa, Australia, sedangkan insiden yang

rendah ditemukan di negara India dan Aljazair. Diperkirakan sebanyak 153.760

kasus baru yang terdiagnosa kanker kolorektal, yang terdiri dari 112.340 pasien

yang terdiagnosa kanker kolon dan sisanya yaitu 41.420 merupakan pasien

terdiagnosa kanker rektal pada tahun 2007 dan tercatat sekitar 30.000 pasien

meninggal karena kanker kolon pada tahun 2010 (Chang, 2012). American Cancer

Society memperkirakan terdapat 96.830 kasus baru kanker kolon dan 40.000

kasus baru untuk kanker rektal pada tahun 2014 dan diperkirakan menyebabkan

kematian sebanyak 50.310 orang (American Cancer Society, 2014).

Pembentukan dan progresi kanker kolon dipengaruhi oleh enzim

siklooksigenase-2 (COX-2), suatu enzim yang mengatur sintesis prostaglandin

dan di ekspresikan secara berlebih pada daerah inflamasi dan pada beberapa

kanker jaringan epitel (Sinicrope and Gill, 2004). Kakiuchi et al. (2002)

melaporkan bahwa mRNA COX-2 dan tingkat proteinnya meningkat pada

jaringan kolon pasien yang menderita kanker kolon dan penggunaan inhibitor


2

COX-2 dapat mencegah terbentuknya polip baru pada kanker kolon. Hal ini

dibuktikan dalam penelitian yang dilakukan Koehne and Dubois (2004).

Pada umumnya, kanker kolon dapat ditangani dengan pembedahan, dan

harus dilakukan terapi non invasif lainnya. Kemoterapi disertakan apabila

penyakit tersebut telah menyebar ke nodus limfa dan jaringan lain (Yeatman,

2001). Terapi menggunakan sulindac yang merupakan obat golongan Non Steroid

Anti Inflammatory Drug (NSAID) (Waddel and Loughry, 1989) atau inhibitor

COX-2 lainnya menunjukan penurunan jumlah polip sebesar 30% dalam enam

bulan pemakaian (Steinbach et al, 2000).

Kekurangan dalam terapi NSAID untuk pengobatan kanker antara lain

pada penggunaan aspirin dengan dosis relatif yang kecil dapat mengakibatkan

efek samping yang serius pada ginjal dan saluran pencernaan (Ranke et al., 1994).

Efek samping tersebut meningkat pada pasien dengan usia lanjut. Efek samping

yang biasa terjadi adalah dyspepsia, ulkus peptikus, dan perdarahan

gastrointestinal (Scheiman, 1996). Pengobatan kanker merupakan pengobatan

dalam jangka panjang dan oleh sebab itu, terapi dengan NSAID tidak disarankan

dan perlu terus dikembangkan usaha pengembangan obat yang aman dan efektif,

salah satunya melalui eksplorasi bahan alam.

Indonesia memiliki kekayaan bahan alam yang beragam, dan beberapa

diantaranya telah diketahui memiliki aktivitas antikanker, salah satunya tanaman

keladi tikus. Tanaman keladi tikus telah sejak lama digunakan di Malaysia secara

oral dalam bentuk juice atau serbuk untuk mengatasi kanker usus, payudara dan

hati (Chan, 2005). Kemampuan tanaman keladi tikus dalam menyembuhkan


3

beberapa kanker seperti kanker payudara dan kanker rahim telah banyak

dibuktikan secara ilmiah, namun sampai saat ini pengujian yang memberikan

bukti ilmiah mengenai kemampuan tanaman keladi tikus yang dapat

menyembuhkan kanker kolon belum banyak dilakukan.

Farida, Wahyudi, Wahono, dan Hanafi (2012) berhasil mengisolasi

glikosida flavonoid dari ekstrak etil asetat daun keladi tikus. Senyawa glikosida

flavonoid yang didapatkan adalah 6-glucosyl apigenine. Wang et al (2011) dalam

penelitiannya membuktikan bahwa apigenin memiliki aktivitas menginduksi

apoptosis terhadap sel kanker kolon namun besarnya nilai inhibitory

concentration (IC50) tidak disebutkan. Penelitian ini menguji aktivitas antikanker

ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker kolon WiDr (Colorectal

adenocarcinoma cell line).

Sel WiDr dipilih karena memiliki kelebihan yaitu mudah dikulturkan dan

memiliki doubling time yang singkat bila dibandingkan dengan kultur sel kanker

kolon lainnya. Sel ini juga memiliki platting efficiency yang tinggi (Noguchi et

al., 1979) dan mengekspresikan COX-2 dengan jumlah yang tinggi (Palozza et

al., 2005).

Uji thiazoyl blue tetrazolium bromide atau uji MTT yang merupakan uji

sitotoksisitas yang dilakukan secara in vitro dilakukan dalam penelitian ini untuk

mengetahui kemampuan antikanker ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap

sel kanker kolon WiDr. Uji ini dipilih karena memiliki tingkat sensitivitas yang

lebih tinggi dari uji sitotoksik lainnya yaitu lactate dehydrogenase (LDH) assay,

neutral red assay, dan protein assay (Fotakis and Timbrell, 2006). Hasil uji ini


4

berupa data absorbansi yang menggambarkan viabilitas dari sel yang diuji dan

kemudian digunakan untuk menentukan inhibitory concentration 50 (IC50), yang

merupakan konsentrasi minimal ekstrak daun keladi tikus yang dapat

menghambat 50% sel kanker kolon.

Kriteria yang perlu diperhatikan dalam eksplorasi bahan alam tidak

hanya potensinya namun juga selektifitasnya. Suatu agen antikanker dikatakan

selektif apabila dapat menginduksi apoptosis pada sel target (Cui, Wang, Wang,

Zhao, and Peng, 2013) sehingga penelusuran jalur kematian sel perlu dilakukan.

Metode yang dilakukan dalam uji apoptosis dalam penelitian ini adalah double

staining, yaitu dengan menggunakan dua buah reagen pewarna sel yang memiliki

karakteristik pewarnaan yang berbeda (Helberstadt and Emerich, 2007).

Apoptosis dalam suatu sel dapat dihambat oleh beberapa faktor antara

lain mutasi yang berakibat ketidaknormalan jalur pengaturan apoptosis dan

keberadaan protein tertentu yang juga menghambat terjadinya apoptosis,

menyebabkan sel berproliferasi secara terus-menerus. Penghambatan apoptosis

yang terjadi pada kanker kolon diperantarai oleh COX-2 yang banyak terkandung

pada kanker kolon. COX-2 yang berlebih meningkatkan prostaglandin (PGE -2)

yang dapat memicu ekspresi BCl -2 antiapoptosis (Damstrup et al., 1999). COX-2

dalam kanker kolon dapat dijadikan sebagai target terapi antikanker. Jika COX-2

dihambat, maka sel kanker kehilangan kemampuannya untuk terhindar dari

apoptosis dan mengalami kematian. Uji imunositokimia dilakukan untuk

mengetahui kemampuan ekstrak etil asetat daun keladi tikus dalam menghambat

ekspresi protein COX-2.


5

Doksorubisin merupakan agen kemoterapi yang telah banyak dipakai

dalam pengobatan berbagai jenis kanker. Bersifat sitostatik dan menginduksi

apoptosis pada sel kanker kolon melalui fosoforilasi p53, induksi p21,

penghambatan siklus sel pada fase Gap-2 (G2) dan meningkatkan ekspresi protein

proapoptosis yaitu BCl -2 associated X Protein (BAX) (Lupertz, Watjen, Kahl,

and Chovolou, 2010). Hal tersebut mendasari pemilihan doksorubisin sebagai

kontrol positif dalam penelitian ini. Penelitian ini dilakukan untuk menguji

ekstrak etil asetat daun keladi tikus secara in vitro menggunakan metode uji

sitotoksik MTT assay, yang diperkuat oleh uji apoptosis double staining dan uji

immunocytochemistry (ICC) serta membandingkan kemampuannya dengan

doksorubisin.

1. Perumusan masalah

a. Berapa IC50 ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker kolon

WiDr?

b. Apakah ekstrak etil asetat daun keladi tikus menginduksi apoptosis pada sel

kanker kolon WiDr?

c. Apakah aktivitas antikanker ekstrak etil asetat daun keladi tikus diperantarai

oleh penghambatan ekspresi COX-2?

2. Keaslian penelitian

Penelitian terkait daun keladi tikus :

1. Muhammad Da’i (2007) melaporkan bahwa terdapat aktivitas sitotoksik

pada ekstrak etanolik, etil asetat dan kloroform tanaman keladi tikus

terhadap sel kanker HeLa.


6

2. Penelitian yang dilakukan Choo, Chan, Sam, Hitotsunayagi, dan Takeya

(2001) melaporkan bahwa ekstrak kloroform batang dan daun tanaman

keladi tikus menunjukan adanya daya sitotoksisitas dengan IC50 sebesar

15g/mL pada sel kanker leukemia P388.

3. Aksi farmakologis dari keladi tikus telah diteliti oleh Zhong et al (2001).

Semua ekstrak air, alkohol dan ekstrak ester keladi tikus memiliki efek

meredakan batuk, menghilangkan dahak, anti asma, analgesia, anti

peradangan dan obat penenang. Toleransi maksimum untuk toksisitas akut

adalah 720 g/kg (ekstrak etil asetat), 900 g/kg (ekstrak alkohol), dan 3.240

g/kg (ekstrak ester).

Sejauh pengamatan penulis, penelitian mengenai uji aktivitas sitotoksik

ekstrak etil asetat dari tanaman ini terhadap sel kanker kolon WiDr belum pernah

dilakukan.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada para peneliti

khususnya dalam bidang penemuan dan pengembangan obat kanker tentang

potensi daun keladi tikus sebagai salah satu bahan alam yang berpotensi sebagai

pengobatan alternatif kanker kolon.

b. Manfaat praktis

Memberikan bukti ilmiah mengenai kemampuan antikanker daun keladi tikus

berupa nilai IC50, kemampuan menginduksi apoptosis dan kemampuan

menghambat COX-2.


7

B. Tujuan Penelitian

Untuk mengetahui nilai IC50, kemampuan induksi apoptosis dan

penghambatan enzim siklooksigenase-2 (COX-2) ekstrak etil asetat daun keladi

tikus terhadap sel kanker kolon WiDr.


8

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Kanker Kolon

1. Definisi dan karsinogenesis kanker kolon

Kanker kolon adalah suatu kanker yang timbul pada sel epitel usus besar

dan rektum dan disebabkan oleh terjadinya mutasi genetik kumulatif yang

merubah proses dalam sel yang secara normal membatasi pembelahan yang

berlebihan, migrasi, dan diferensiasi yang berakibat terjadinya proliferasi, invasi

dan metastatis suatu sel. Ketidakstabilan genetis terus terjadi dan menyebabkan

perubahan yang lebih lanjut, dan mempengaruhi sensitivitas terhadap terapi pada

tumor yang ganas (Steinberg, 2012).

Perkembangan suatu sel menjadi sel tumor yang ganas merupakan proses

yang memilliki tahapan dari mukosa normal menjadi adenoma dan pada akhirnya

menjadi adenoma invasif. Perkembangan malignan pada kolon dapat diketahui

dengan mempelajari sekuen adenoma-karsinoma. Sebagian besar karsinoma

berkembang dari suatu lesi polip pre-neoplastik adenomatous, kemudian

terakumulasi dan terjadi perubahan di dalam sel epitel usus (Brown, 2007).

Perubahan genetik yang paling sering terjadi dalam karsinogenesis

kanker kolon adalah mutasi Adenomatous Polyposis Coli (APC), Kirsten rat

sarcoma (K-Ras), small ‘mothers against’ decapentaplegic4 (SMAD4), tumor

protein p53 (TP53) dan gen mismatch repair (MMR) yaitu Mutl Homolog 1

(MLH1) dan MutS homologue 2 (MSH2) (Arends, 2013).


9

2. Jalur Adenomatus Polyposis Coli (APC)/-catenin

APC adalah suatu komponen pembentuk sinyal jalur Drosophila

melanogaster wingless gene (WNT). Sinyal ini memiliki fungsi untuk mengkode

sebuah protein yang mengikat berkas mikrotubulus, meningkatkan migrasi dan

perlekatan sel, dan mengatur kadar β-katenin, suatu mediator penting pada jalur

sinyal Drosophila melanogaster wingless gene (WNT)/β-katenin. Pembentukan

sinyal WNT diperlukan bagi sel-sel induk hematopoietik untuk memperbarui diri.

WNT memberi sinyal melalui suatu famili reseptor permukaan sel yang disebut

frizzled (FRZ), dan merangsang beberapa jalur dengan salah satu jalur sentral

yang melibatkan β-katenin dan APC (Markowitz and Bertagnolii, 2009).

Mutasi APC ditemukan pada 80% adenoma dan karsinoma dan terjadi di

awal rantai urutan karsinogenesis. Mutasi pada protein APC mengakibatkan

terjadinya pemotongan protein APC sehingga kemampuannya berubah dan tidak

lagi dapat mendegradasi β-catenin, sehingga terjadi penumpukan β-catenin

didalam sitoplasma dan nukleus yang mengakibatkan terjadinya WNT signaling

pathway secara terus menerus. Inaktifasi APC merupakan jalur utama

terbentuknya adenoma (Arends, 2013).

β-katenin membentuk suatu kompleks dengan T cell transcription factor

(TCF), yang merupakan faktor transkripsi di dalam nukleus yang mengakibatkan

peningkatkan proliferasi sel dengan meningkatkan transkripsi cellular myc (c-

MYC), SIKLIN D1, dan gen lain yang menyebabkan proliferasi pada sel

(Markowitz and Bertagnolli, 2009).


10

3. Mutasi Kirtsten rat sarcoma (K-RAS)

Mutasi yang mengaktivasi kirtsten rat sarcoma (K-Ras) ditemukan pada

40% sampai 45% adenoma dan karsinoma kanker kolon dan diduga muncul pada

tahapan awal pembentukan adenoma. Mutasi biasanya terjadi pada protein kirtsten

rat sarcoma (K-Ras) pada posisi kodon nomor 12, 13 dan 61 dan beberapa bagian

lain. Protein kirtsten rat sarcoma (K-Ras) yang mengalami mutasi memiliki

substitusi asam amino yang asli dengan asam amino yang lain yang berpengaruh

pada fungsi enzimatik protein kirtsten rat sarcoma (K-Ras), yaitu mengurangi

atau mencegah pemotongan enzimatik pada ujung gugus fosfat pada guanosin

trifosfat (GTP), yang secara normal dapat dikonversikan menjadi guanosin

difosfat (GDP) yang merupakan bentuk inaktif.

Gen kirtsten rat sarcoma (K-Ras) mengalami mutasi akan membentuk

protein K-Ras mutan yang teraktivasi secara permanen meskipun tanpa adanya

ikatan antara faktor pertumbuhan dengan reseptor di permukaan membran.

Kirtsten rat sarcoma (K-Ras) mutan menimbulkan pertumbuhan dan penyebaran

tumor yang terus menerus dan tak terkontrol (Sriwidyani, 2013).

4. Gen Small ‘mothers against’ decapentaplegic4 (Smad4) dan Tumor

Supressor Gene 53 (TP 53)

Gen Small ‘mothers against’ decapentaplegic4 (Smad4) mengalami

inaktivasi pada 60% sel kanker oleh adanya mutasi atau delesi dalam jumlah

banyak pada kromosom 18q tempat gen SMAD4 berada. Smad4 berperan dalam

transduksi sinyal pada jalur penghambatan beta-tumor necrosis factor (TNF-),


11

sehingga dengan adanya ketidakmampuan SMAD4 dalam jalur penghambatan

tersebut, sel tumor dapat terus tumbuh (Arends, 2013).

Tumor suppressor gene TP53 mengode protein p53 yang merespon pada

kerusakan DNA dengan upregulation inhibitor Cyclin-Dependent Kinase

Inhibitor (CDK) p21 yang memperbaiki kerusakan DNA atau dengan

upregulation BCl -2 associated X Protein (BAX) dan juga protein apoptosis lain

yang menginduksi kematian sel melalui jalur apoptosis. Mutasi yang

menginaktivasi fungsi protein p53 ditemukan pada lebih dari 60% kanker kolon

dan mutasi ini sering mengakibatkan terjadinya fase akhir yaitu terbentuknya

karsinoma (Arends, 2013). Tahapan karsinogenesis pada kanker kolon secara

ringkas dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1.Tahapan Karsinogenesis pada Kanker Kolon (Arends, 2013).

B. COX-2 dan Kanker Kolon

Prostaglandin merupakan metabolit dari asam arakidonat yang

memainkan peran penting dalam perkembangan kanker kolon. Beberapa

penelitian menunjukan bahwa adanya peningkatan kadar prostaglandin yang

ditemukan dalam kanker kolon. COX-2 merupakan salah satu bentuk enzim yang


12

bertanggung jawab dalam metabolisme asam arakidonat yang ditemukan dalam

inflamasi dan ditemukan dalam sel kanker. Jumlahnya yang meningkat

dipengaruhi oleh adanya paparan dengan mitogen dan faktor pertumbuhan.

Potensi NSAID spesifik COX-2 dalam pencegahan kanker kolon disarankan

dengan adanya distribusi COX-2 pada polip adenomatus dan keefektifan agen

tersebut dalam uji pada hewan model kanker kolon yang diinduksi karsinogen

(Fournier and Gordon, 2000).

Beberapa sitokin yang diproduksi saat inflamasi (TNFα, IL1β, IL6, dan

IL8) dapat juga mengaktifkan beberapa jalur pertahanan sel, yang mengakibatkan

terhindarnya sel dari kematian sel. Sebagai contoh, TNFα yang diproduksi oleh

tumor dan sel imun, dapat membuat suatu sel bertahan dengan upregulation

protein anti-apoptosis yaitu BCl -2 melalui aktivasi Nuclear Factor kappa B

(NFkB) (Cristofanon, et al., 2009; Chen, et al., 2007; D’Alessio, 2004).

Adanya modulasi protein anti apoptosis menyebabkan ekspresi/aktivasi

mediator inflamasi yang merupakan faktor yang menentukan dalam

chemoresistance. Aktivasi yang berkelanjutan dari faktor inflamasi tersebut telah

berhasil ditemukan pada banyak kanker, contohnya kanker hati, kanker prostat,

dan juga leukemia akut. Pada kasus tersebut, peningkatan BCl -2 anti apoptosis

banyak ditemui (Tricot, 2000).

Peningkatan produksi PGE2 yang berfungsi untuk mengatur proliferasi

sel, kematian sel dan invasi tumor pada banyak kanker seperti kanker kolon,

kanker payudara dan kanker paru diinduksi oleh adanya peningkatan COX-2

(Breyer, Bagdassarian and Breyer, 2001). Pembentukan kanker diartikan sebagai


13

ketidakseimbangan antara proliferasi dan kematian sel. PGE2 dapat menghambat

apoptosis pada sel kanker kolon manusia. Telah dibuktikan bahwa PGE2 dapat

meningkatkan kadar protein anti apoptosis BCl -2 pada sel HCA-7, yang

memproduksi PGE2 dalam jumlah yang banyak dalam penelitian yang dilakukan

Sheng, Shao, Morrow, Beauchamp, and DuBois (1998). PGE2 dapat

memperantarai efek ini melalui reseptor Epidermal Growth Factor (EGF), yang

mengaktivasi Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK). PGE2 mengaktivasi

EGFR dengan merangsang ekspresi amphiregulin, suatu substrat Epidermal

Growth Factor Receptor (EGFR). Aktivasi MAPK meningkatkan jumlah BCl -2.

Ekspresi amphiregulin berkorelasi dengan banyaknya COX-2 dalam sel

(Damstrup et al.,1999). Efek COX-2 terhadap proliferasi sel dapat dilihat pada

gambar 2.

Gambar 2. Pengaruh ekspresi COX-2 pada kanker kolorektal

(Ghosh, Chaki, Mandal, and Mandal, 2011)

Asam

arakidonat

COX-2

PGH

2

PGE2 MMP

Invasi

P-Akt Pro-

TGFα

TGFα

Sinyal

EGFR

Penghambatan

Apoptosis

K-Ras

Adhesi

Angiogenesis

Migrasi


14

Prostaglandin juga mengaktivasi phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K)

melalui jalur RAS/MAPK (mitogen- activated protein kinase) dan pengaktifan NF-

кB (Nuclear Factor Kappa B). Aktivasi RAS/MAPK meningkatkan proliferasi sel,

sedangkan aktivasi NF-кB akan menghambat apoptosis dan dapat memicu

ekspresi sitokin inflamasi atau stress oksidatif pada sel inflamatori yang

menyebabkan peningkatan ekspresi COX-2 pada sel epitel. Prostaglandin juga

menginduksi ekspresi matriks metalloproteinase (MMP) yang berperan dalam

proses metastasis. Enzim COX-2 diketahui menstimulasi faktor angiogenik seperti

vascular endothelial growth factor (VEGF) dan basic Fibroblast Growth Factor

(bFGF) yang berperan dalam angiogenesis (pembentukan pembuluh darah baru).

Peningkatan ekspresi COX-2 dapat meningkatkan ekspresi dan aktivasi protein

antiapoptosis serta inaktivasi tumor suppressor factors dan protein proapoptosis.

(Hanahan and Weinberg, 2011; Tenggara and Kurniawati, 2011).

C. WiDr

Colorectal adenocarcinoma cell line (WiDr) merupakan lini sel yang

diderivatisasi dari sel kanker kolon manusia (Chen et al., 1987). Sel ini

mengekspresikan antigen karsinoembrionik dalam kulturnya. Sel ini memiliki

doubling time selama 15 jam dan memiliki efisiensi platting 51% (Noguchi, et al.,

1979) dan berbentuk polygonal (Gander, Gotzos, Fellay and Schwaller, 2013)

WiDr mengekspresikan COX-2 dengan jumlah yang sangat tinggi (Palozza et al.,

2005).

Sel WiDr memiliki sifat resisten terhadap 5-fluorourasil. Usaha

peningkatan sensitivitas dilakukan dengan transfeksi p53 sel normal namun tidak


15

menunjukan adanya peningkatan (Giovanneti, et al., 2007) dengan IC50 sebesar

422 µM (Gilang, Hermawan, Fitriasari, and Jenie, 2012). Hal ini mungkin

disebabkan karena adanya peningkatan thymidyl sinthase dalam sel WiDr

(Sigmond, Backus, Wouters, Temmink, Jansen, Peters, 2003) yang memiliki efek

berkebalikan terhadap efektivitas obat penghambat thymidylate synthase

(Giovanneti et al., 2007).

Sel WiDr memiliki kelebihan yaitu dapat membentuk tumor histologis

mendekati 100% setelah diinokulasikan selama 1-4 minggu pada empat host yang

berbeda. Sel WiDr juga mudah dikulturkan dan memiliki doubling time yang

singkat bila dibandingkan dengan kultur sel kanker kolon lainnya. Sel ini juga

memiliki platting efficiency yang tinggi dan mengekspresikan biomarker yang

berguna yaitu CEA (Noguchi et al., 1979).

D. Tanaman Keladi Tikus

1. Deskripsi tanaman

Gambar 3. Tanaman Keladi Tikus

Tanaman keladi tikus (Gambar 3) tergolong dalam famili Araceae,

Bagian tanaman yang digunakan untuk obat adalah semua bagian tanaman.


16

Termasuk tanaman yang tumbuh menahun, tingginya bisa mencapai 10 – 45 cm,

hidup diatas permukaan tanah. Tumbuh di tempat terbuka yang terdapat sinar

matahari, tetapi memiliki kelembapan. Tumbuh dalam jumlah banyak dan

biasanya sebagai gulma. Tanaman ini berumbi bulat pepat, berwarna putih dan

beracun (Mangan, 2003).

2. Klasifikasi tanaman

Kingdom : Plantae

Filum : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliae

Ordo : Arales

Famili : Araceae

Genus : Typhonium

Species : Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume

(India Biodiversity Portal, 2013).

3. Nama daerah

Tanaman keladi tikus dikenal dengan nama daerah bira kecil, daun panta

susu, kalamoyang, ileus, ki babi, dan trenggiling mentik (Mangan, 2003).

4. Kandungan fitokimia

Kandungan kimia keladi tikus yang telah teridentifikasi adalah ester

metil asam heksa dekanoat, asam oktadekanoat, asam 9-oktadekanoat dan asam

9,12 oktadekadinoat. Selain itu, beberapa senyawa alifatik yang teridentifikasi

adalah dodekan, tridekan tetradekan, pentadekan, heksadekana, heptadekana,

oktadekan, nonadekan dan eikosan. Tidak satu pun dari senyawa yang


17

teridentifikasi menunjukkan atau diketahui memiliki perilaku sitotoksik (Choo et

al., 2001).

Senyawa feoforbid a, feoforbid a’ dan metal feoforbid teridentifikasi

sebagai fraksi dari keladi tikus yang paling aktif. Konstituen ini menunjukan

aktivitas anitiproliferatif yang tinggi terhadap sel kanker dan aktivitasnya

meningkat seiring dengan perlakuan fotoaktivasi. Beberapa senyawa lain yang

teridentifikasi adalah asam heksadekanoat, asam oleat, asam linoleat, asam

linolenat, kampesterol, stigmasterol, dan beta-sitosterol (Lai, Mas, Nair, Mansor,

and Navaratnam, 2010). Senyawa glikosida flavonoid dari daun tanaman ini telah

berhasil dilakukan oleh Farida, Wahyudi, Wahono dan Hanafi (2012) dan

memiliki aktivitas antioksidan yang poten, serta agak toksik dengan nilai lethal

concentration (LC50) sebesar 15.84 g/mL terhadap brine shrimp.

E. Doksorubisin

Doksorubisin (Gambar 4) merupakan antibiotik golongan antrasiklin

yang diisolasi dari kultur Streptomyces peucetius var.caesius (Drugbank, 2005)

dan merupakan agen kemoterapi yang secara luas dipakai untuk berbagai macam

kanker. Doksorubisin menginduksi apoptosis dengan fosforilasi p53 pada asam

amino serin 392, menginduksi p21, penghambatan fase Gap-2 (G2) dan

peningkatan protein proapoptosis, BAX (Lupertz, et al., 2010).

Doksorubisin dapat berikatan dengan DNA-associated enzymes, menyisip

pada pasangan basa DNA. Doksorubisin juga mengaktivasi berbagai sinyal

molekular yaitu AMP-activated protein kinase including apoptosis (AMPK) dan

juga terlibat dalam jalur apoptosis BCl-2/Bax. Doksorubisin mengubah rasio BCl-


18

2/Bax didalam sel yang menyebabkan berlangsungnya jalur kaspase yang

mengakibatkan apoptosis. Doksorubisin memiliki kekurangan yaitu menginduksi

apoptosis dan nekrosis pada sel sehat dan menimbulkan toksisitas pada otak, hati,

ginjal dan jantung (Tacar, Sriamornsak, and Dass, 2013).

Gambar 4. Struktur kimia doksorubisin (Drugbank, 2005)

F. Apoptosis dan Nekrosis

Apoptosis yang juga disebut kematian sel tipe satu, didefinisikan sebagai

perubahan karakteristik pada morfologi nukleus, termasuk kondensasi dan

fragmentasi kromatin, penyusutan sel secara keseluruhan, pembengkakan

membran plasma dan pembentukan badan apoptosis yang mengandung nukleus

atau material sitoplasmik (Osthoff, 2008).

Apoptosis dikendalikan oleh rangsangan internal dan eksternal. Beberapa

macam faktor eksternal untuk aktivasi apoptosis, misalnya oleh TNF (tumor

necrosis factor) melalui reseptornya yang akan memicu apoptosis melalui aktivasi

jalur cascade caspase. Jalur ini menyebabkan dikenalnya reseptor TNF sebagai

reseptor kematian. Faktor eksternal lainnya adalah Transforming Growth Factor β

(TGF-β), neurotransmitter tertentu, radikal bebas, sinar UV dan radiasi ionisasi.


19

Faktor internal antara lain adalah supresor tumor (p53) dan antimetabolit

penghambat nutrien (Subowo, 2011).

Apoptosis dapat dihambat oleh sinyal dari sel lain atau lingkungan

sekitarnya melalui jalur yang disebut survival factors. Hal ini melibatkan faktor

pertumbuhan, hormon seperti estrogen dan androgen, asam amino netral, zink,

dan interaksi dengan matrik protein ekstraseluler. Beberapa sel dan protein virus

dapat beraksi sebagai inhibitor kaspase. Regulator terpenting dalam apoptosis

adalah sinyal internal dari protein BCl -2. Anggota dari keluarga protein ini

memiliki aktivitas antiapoptosis dan proapoptosis yang menentukan kehidupan

dan kematian sebuah sel. Protein-protein ini berinteraksi satu sama lain untuk

menekan atau mempropagasi aktivitasnya sendiri dengan melakukan berbagai aksi

langkah apoptosis. Mereka juga dapat berinteraksi secara independen terhadap

mitokondria untuk mengeluarkan sitokrom c, yang merupakan agen apoptosis

yang paling poten (Ross and Pawlina, 2006).

Nekrosis pada umumnya dianggap sebagai kematian sel yang tidak

terkontrol dan biasanya terjadi karena kecelakaan. Secara biokimiawi, penyebab

yang paling dominan adalah adanya deplesi energi, pembentukan spesies oksigen

reaktif dan aktivasi protease non-apoptosis. Hal-hal tersebut menyebabkan

hilangnya fungsi homeostatis pada pompa ion dan kerusakan pada membrane lipid

serta pembengkakan membran sel dan selanjutnya sel mengalami ruptur (Osthoff,

2008).

Nekrosis merupakan proses kematian sel secara patologik yang dapat

menimbulkan peradangan. Nekrosis dapat disebabkan oleh mikroorganisme,


20

virus, bahan kimia dan agen-agen lain yang dapat merusak jaringan (hipotermia,

hipoksia, radiasi, pH rendah, dan trauma). Terjadi influx air dan ion-ion dari celah

ekstraselular, sebagai akibat kerusakan membran sel. Kejadian ini berlanjut

dengan pelepasan kandungan sitoplasma, termasuk enzim-enzim dalam lisosom

ke dalam celah ekstraselular (Subowo, 2011).

Dalam kondisi fisiologis, kerusakan membran plasma dapat juga

disebabkan oleh virus, substansi seperti komplemen, atau protein yang disebut

perforin. Pembengkakan sel yang cepat dan lisis adalah dua karakteristik dalam

proses ini (Ross, 2006).

G. Uji sitotoksik dengan metode MTT

Uji MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 difenil tertazolium bromide)

didasarkan pada konversi MTT menjadi kristal formazan oleh sel hidup, yang

menggambarkan aktivitas mitokondrial. Karena pada umumnya aktivitas

mitokondrial total dalam suatu populasi sel berhubungan dengan jumlah sel yang

hidup, uji ini dipakai secara luas untuk mengukur efek sitotoksik obat secara in

vitro terhadap suatu sel (Meerlo, Kaspers, and Closs, 2011).

Uji MTT dilakukan untuk melihat kemampuan sel hidup untuk

mengonversi garam tetrazolium yang larut dalam air. [3–(4,5-dimethylthiazol-2-

yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT) diubah menjadi formazan yang tidak

larut dalam air (Gambar 4). Garam tetrazolium menerima elektron dari substrat

yang teroksidasi atau enzim yang sesuai, seperti NADH dan NADPH. MTT

tereduksi pada bagian ubikuinon, sitoktom b dan c pada bagian transpor elektron


21

mitokondria dan merupakan hasil dari aktivitas enzim suksinat dehidrogenase

(Supino, 1995).

Uji sitotoksik selain uji MTT adalah lactate dehydrogenase (LDH) assay.

Uji ini memiliki didasarkan atas deteksi kebocoran lactate dehydrogenase pada

sel yang mati. Uji yang lain adalah neutral red (NR) dengan prinsip pewarnaan

lisosom pada sel hidup, serta uji kandungan protein (protein assay) pada sel

hidup. Diantara keempat uji sitotoksik tersebut, MTT memiliki sensitivitas yang

paling baik (Fotakis and Timbrell, 2006).

Keuntungan penggunaan uji MTT adalah kemampuannya untuk

mengukur dalam waktu yang relatif pendek, bahkan dalam doubling period suatu

sel, dan perbedaan dalam aktivitas metaboliknya (Sieuwerts, Klijin, Peters, and

Foekens, 1995). MTT adalah garam larut dalam air, bermuatan positif bersifat

permeabel terhadap membran sel (Riss et al., 2013) yang dapat diubah menjadi

formazan berwarna ungu yang tidak dapat larut dengan pemotongan cincin

tetrazolium dengan enzim suksinat dehidrogenase didalam mitokondria. Produk

formazan tersebut bersifat impermeabel terhadap membran sel dan juga

terakumulasi dalam sel sehat. Uji MTT telah diuji validitasnya dalam banyak lini /

galur sel (Mossmann, 1983). Beberapa bukti terakhir menyimpulkan bahwa

reduksi MTT juga dapat diperantarai oleh NADH atau NADPH didalam sel dan

diluar mitokondria (Berridge and Tan, 1992).


22

Gambar 5. Reaksi MTT menjadi Formazan

H. Uji apoptosis double staining

Sejak awal kemunculannya, metode uji flow cytometric propidum iodide

(PI) telah digunakan secara luas sebagai uji apoptosis pada banyak model

eksperimental. Metode ini didasarkan pada karakteristik sel yang mengalami

apoptosis yaitu adanya fragmentasi DNA dan hilangnya DNA pada inti sel.

Metode ini menggunakan agen fluorochrome, contohnya PI, yang dapat berikatan

dan melabeli DNA. Metode ini mampu mendapatkan hasil uji DNA sel yang cepat

(selesai dalam 2 jam). Sejak publikasinya uji PI telah digunakan secara luas pada

banyak laboratorium (Riccardi and Niccoleti, 2006).

Agen fluorochrome yang lain adalah Acridine orange (AO), yang dapat

berikatan dengan semua asam nukleat dan dapat menembus membran, bersama

dengan propidium iodide (PI) yang merupakan pewarna yang tidak dapat

menembus membran yang juga mengikat semua asam nukleat merupakan

kombinasi pewarna untuk mengetahui integritas sel. PI berflouresensi merah

apabila berikatan dengan asam nukleat dan AO berflouresensi hijau apabila

berikatan dengan DNA untai ganda dan berflouresensi merah apabila berikatan

dengan RNA atau DNA untai tunggal (Helberstadt and Emerich, 2007).


23

Uji viabilitas sel double-staining dengan komponen yang dapat menyisip

DNA yaitu acridine orange dan ethidium bromide (AO/EB) atau propidium

iodide (PI) didasarkan pada prinsip bahwa acridine orange (AO) dapat masuk ke

dalam sel hidup ataupun sel mati, sedangkan EB dan PI hanya dapat menembus

membran sel yang mengalami disintegrasi. Sel hidup berwarna hijau jika dibaca

dibawah mikrokop floresens dan sel mati berwarna merah (Kavanagh, 2007).

I. Uji Imunositokimia

Imunositokimia merupakan cabang dari penelitian mikroskopik dimana

antibodi digunakan untuk mendeteksi keberadaan suatu molekul pada level

mikroskop cahaya maupun elektron. Imunositokimia adalah perbaikan dari

metode sebelumnya yaitu histokimia dan sitokimia enzim dimana molekul reaktif

atau aktivitas enzim dideteksi sebagai reaksi warna (Vaughn, 2013).

Imunositokimia merupakan identifikasi komponen jaringan secara in situ

dengan interaksi antigen-antibodi spesifik dimana antibodi tersebut telah dilabeli.

Cell staining merupakan metode yang kuat untuk mendemonstrasikan keberadaan

suatu molekul spesifik didalam sel. Dalam metode ini, antibodi spesifik yang

berikatan dengan antigen dideteksi dengan reagen sekunder, biasanya berupa

antibodi lain yang sudah dilabeli fluophore atau enzim (Javois, 1999).

Terdapat beberapa jenis imunositokimia, yaitu langsung (direct) dan

tidak langsung (indirect). Imunositokimia langsung menggunakan antibodi primer

berlabel. Sebagai contoh, untuk mendeteksi suatu antigen didalam sel, antibody

primer yang digunakan adalah adalah rabbit anti-antigen yang dilabeli dengan

fluophore. Prosedur ini hanya menggunakan antibody primer dan tidak


24

menggunakan antibodi tambahan. Imunositokimia langsung merupakan metode

yang paling sederhana dan merupakan metode imunositokimia pertama yang ada.

Imunositokimia tidak langsung menggunakan antibodi sekunder berlabel yang

berikatan dengan antibodi primer. Antibodi sekunder dibuat dengan cara

menginjeksikan IgG yang dimurnikan dari suatu spesies sebagai antigen (Burry,

2011).

J. LANDASAN TEORI

Kanker kolon merupakan kanker yang terjadi di daerah usus besar dan

daerah rektum. Target karsinogensis pada kolon dan rektum adalah kripta sel

epitel kolon dan 98% adenokarsinoma ada di kolon dan rektum. Penyakit ini

marak terjadi pada negara maju dan berkembang. Pengobatan yang sudah ada

memiliki efek samping yang berat sehingga perlu dilakukan eksplorasi bahan

alam yang poten dan lebih aman.

Tanaman keladi tikus yang tergolong dalam famili Araceace, memiliki

kandungan flavonoid yang tinggi pada daunnya dan senyawa glikosida flavonoid

apigenin, yang memiliki aktivitas antikanker terhadap sel kanker kolon SW480,

telah berhasil diidentifikasi dan diisolasi dari ekstrak etil asetatnya. Hal tersebut

mendasari pemilihan ekstrak etil asetat untuk diuji terhadap sel kanker kolon

WiDr.

Uji sitotoksik dilakukan untuk mengetahui kemampuan antikanker dari

ekstrak uji dengan prinsip kolorimetri. Sel yang masih hidup berkemampuan

untuk mereduksi reagen MTT menjadi kristal formazan berwarna biru karena

masih memiliki enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat dalam mitokondria


25

sel hidup, sedangkan enzimnya tidak aktif lagi pada sel yang mati. Hasil yang

diperoleh dari uji ini merupakan absorbansi yang dapat di konversikan menjadi

nilai IC50 yang dapat menggambarkan potensi suatu senyawa antikanker. Hasil

dipertegas dengan uji double staining untuk mengetahui jenis kematian sel secara

apoptosis, atau nekrosis terkait dengan sifat selektifitas ekstrak. COX-2

ditemukan pada sel kanker kolon dan dapat menginduksi apoptosis bila dihambat.

Penghambatan COX-2 ekstrak etil asetat daun keladi tikus pada sel kanker kolon

WiDr dilakukan dengan uji imunositokimia.

HIPOTESIS

Ekstrak etil asetat daun keladi tikus mempunyai aktivitas sitotoksik yang

menginduksi apoptosis diperantarai oleh penekanan ekspresi COX-2 pada sel

kanker kolon WiDr.


26

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian tentang uji aktivitas antikanker ekstrak etil asetat daun keladi

tikus terhadap sel kanker kolon WiDr melalui penekanan ekspresi protein COX-2

ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan

rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel Utama

a. Variabel bebas

Variabel bebas dari penelitian ini adalah besarnya konsentrasi ekstrak etil

asetat daun keladi tikus (Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume pada sel

kanker kolon WiDr.

b. Variabel tergantung

Variabel tergantung dari penelitian ini adalah viabilitas sel WiDr ditandai

dengan nilai IC50 ekstrak etil asetat daun keladi tikus, jumlah sel yang

mengalami apoptosis, dan penekanan ekspresi COX-2.

2. Variabel pengacau

a. Variabel pengacau terkendali :

1) Waktu dan tempat pengambilan tanaman yaitu di Malang, Jawa

Timur pada bulan Agustus 2014

2) Tempat dilakukan percobaan yaitu di Laboratorium Parasitologi

Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.


27

3) Kondisi sel yang digunakan yaitu sel kanker kolon WiDr dalam

keadaan konfluen, tercukupi nutrisinya dan bebas dari kontaminasi.

b. Variabel pengacau tidak terkendali :

Dalam penelitian ini, variable pengacau tak terkendali adalah umur

tanaman yang diambil serta kandungan kimia yang ada di dalam daun

tanaman keladi tikus.

3. Definisi operasional

a. Sitotoksisitas didefinisikan sifat toksik dari ekstrak etil asetat daun keladi

tikus terhadap sel kanker WiDr yang dinyatakan dalam nilai IC50

b. Ekstrak daun keladi tikus didefinisikan ekstrak kental daun keladi tikus

yang diperoleh dengan cara maserasi selama 48 jam menggunakan pelarut

etil asetat.

c. Sel WiDr adalah sel model kanker kolon yang termutasi pada gen p53 dan

mengekspresikan COX-2 dalam jumlah tinggi.

d. IC50 (Inhibition Concentration 50) didefinisikan besarnya konsentrasi

ekstrak daun keladi tikus yang dapat menghambat sejumlah 50%

pertumbuhan sel kanker WiDr.

C. Bahan Penelitian

Pada penelitian ini digunakan daun keladi tikus (diperoleh dari Malang,

Jawa Timur) sel kanker WiDr (diperoleh dari koleksi Laboratorium Parasitologi,

Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada), Pelarut DMSO (Merck), etil

asetat (CV. General Labora) media tumbuh sel kanker WiDr yang terdiri atas

Rosswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 yang mengandung Fetal Bovine


28

Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), dan antibiotik penisilin-streptomisin 1 %(v/v)

(Gibco), medium pencuci sel WiDr yang terdiri atas RPMI 1640, natrium

bikarbonat, dan hepes. Reagen MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 difenil

tertazolium bromide) (50 mg MTT dan 10mL PBS), pelarut phoshat buffer saline

(PBS) 1X pH 7,4 (dibuat dengan melarutkan 8 g NaCl; 0,2 g KCl; 0,2 g KH2PO4;

dan 1,15 g Na2HPO4 dalam 1 liter akuades), reagen stopper yang mengandung

sodium deodesil sulfat (SDS) 10% dalam 0,01 N HCl dan tripsin 0,5 %, tryptan

blue, dan aquabidest, antibodi anti-human COX-2 (Thermo Scientific Lab

Vision), biotinylated universal secondary antibody (Lab Vision), xylol, etilen dan

hematoxylin (Dako).

D. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : alat-alat gelas,

blender, timbangan analitik, ayakan, waterbath, aluminium foil, magnetic stirrer,

tabung conical, autoklaf, tangki nitrogen cair, tissue culture flask, swing rotor

sentrifuge, inkubator, mikropipet, lemari pandingin, cell counter, 96-well plate,

24-well plate, ELISA reader, laminar air flow, mikroskop, mikroskop fluoresensi

haemocytometer, oven, yellow tips, blue tips, effendorf, tabung conical 15 mL,

tissue, glove, masker, kamera DSLR.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman keladi tikus

Determinasi tanaman keladi tikus yang didapatkan di Malang, Jawa

Timur dengan buku acuan menurut Backer, 1963 dilakukan di Fakultas

Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.


29

2. Strerilisasi alat

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilisasikan

terlebih dahulu. Alat-alat dicuci bersih dibawah air mengalir dengan

menggunakan deterjen. Setelah dikeringkan, alat-alat tersebut dibungkus

menggunakan aluminium foil dan disterilisasikan dalam autoclave selama

20 menit pada suhu 121°C.

3. Pembuatan simplisia

Daun keladi tikus yang telah dikumpulkan kemudian dicuci bersih

dibawah air mengalir. Setelah dicuci daun dikeringkan dibawah terik

matahari dan dilanjutkan dengan menggunakan oven pada suhu 50° C. Daun

kemudian diserbukkan di Merapi Farma, Kaliurang, Yogyakarta.

4. Ekstraksi daun keladi tikus dengan metode maserasi

Sebanyak 25 gram serbuk simplisia daun keladi tikus direndam

dalam 250 mL etil asetat dalam erlenmeyer bertutup dan dibiarkan selama

24 jam terlindung dari cahaya matahari sambil diaduk menggunakan shaker.

Setelah 24 jam maserat diambil dan disaring kemudian ditampung dalam

tabung erlenmeyer tertutup dan disimpan terlindung dari cahaya matahari.

Kemudian ditambahkan pelarut baru dan dilakukan remaserasi selama 24

jam. Setelah 24 jam ekstrak disaring dan ditampung. Ekstrak kemudian

dipekatkan dengan rotary evaporator.

5. Pembuatan media kultur

Disiapkan botol Duran volume 100 mL. Sebelum digunakan, FBS

dan penisilin-streptomisin dicairkan terlebih dahulu pada suhu kamar.


30

Setelah itu 10 mL FBS diambil dan dituangkan kedalam botol duran lalu

ditambahkan 1 mL campuran antibiotik-antifungal penisilin-streptomisin.

Kemudian, media RPMI ditambahkan sampai 100 mL (sekitar leher botol).

Diberi penandaan pada botol dengan nama media dan tanggal pembuatan

media kultur.

6. Uji sitotoksisitas ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel

kanker kolon WiDr dengan metode MTT

a. Kultur sel WiDr

Sel WiDr diambil dari tangki nitrogen dan segera dicairkan dalam

penangas air 37° C. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dimasukkan

dalam LAF. Ampul dibuka dan sel WiDr dipindahkan ke dalam conical tube

steril yang telah berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel kemudian

disentrifugasi dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit dan supernatan

yang terbentuk dibuang. Medium RPMI 1640 yang baru ditambahkan

kedalam suspensi sel dan disentrifugasi kembali selama 5 menit hingga

homogen dan dicuci ulang sekali lagi. Setelah suspensi sel WiDr didapatkan,

ditambahkan 1 mL media kultur yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan

kembali secara perlahan hingga homogen. Sel WiDr kemudian ditumbuhkan

dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator CO2

dengan suhu 37° C. Setelah 24 jam, medium kultur WiDr diganti dan sel

WiDr ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.

b. Panen Sel WiDr


31

Setelah sel WiDr konfluen, medium kultur dibuang kemudian sel

WiDr dicuci dengan 3,5 mL PBS sebanyak 2 kali. Tripsin-EDTA sebanyak

300L ditambahkan dalam sel WiDr dan dilakukan inkubasi selama 3 menit

dalam inkubator CO2. Sebanyak ± 5 mL media kultur ditambahkan kembali

dan sel WiDr diresuspensikan hingga terlepas seluruhnya dari dinding flask.

Suspensi sel dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel WiDr

dihitung dengan haemocytometer dan cell counter dan dibuat konsentrasi

suspensi sel yang digunakan untuk penelitian yaitu sebesar 2x104/100 µL.

c. Preparasi larutan uji ekstrak daun keladi tikus

Ekstrak daun keladi tikus ditimbang ± 1 mg dan dimasukkan dalam

tabung effendorf kemudian dilarutkan dalam 1 mL DMSO dan divortex

sampai homogen untuk mendapatkan larutan ekstrak induk dengan

konsentrasi 1 mg/mL. Larutan induk diencerkan dengan media kultur hingga

diperoleh seri konsentrasi 1; 10; 100; 400; 1000; 1200; dan 1500 g/mL.

d. Preparasi larutan kontrol positif doksorubisin

Doksorubisin dengan konsentrasi stok 2000 M dibuat seri

konsentrasi 1; 10; 25; 50; 100; dan 250 M dalam media kultur.

e. Uji sitotoksik dengan MTT assay

Orientasi dilakukan untuk menentukan rentang konsentrasi

yang akan dilakukan dalam uji. Sebanyak 100 µL ekstrak daun keladi

tikus dengan kadar 1; 10; 100; 400; 1000; 1200; dan 1500 g/mL

diteteskan pada suspensi sel WiDr dengan kepadatan 2x104/100 L

dalam sumuran yang berbeda pada well plate. Sebagai kontrol, tiga buah


32

well berisi 100 µL suspensi sel ditambahkan 100 µL media kultur.

Doksorubisin sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 1; 10; 25; 50;

100; 250 ditambahkan ke dalam sumuran.

Sel yang telah diberi perlakuan kemudian diinkubasi

selama semalam didalam inkubator dengan suhu 37C, kemudian

seluruh larutan uji dan media dibuang seluruhnya dan ditambahkan 100

L reagen MTT ke dalam masing-masing sumuran, diinkubasikan

selama 2-4 jam. Reagen stopper ditambahkan dan kemudian sel

didiamkan selama semalam. Absorbansi setiap sumuran dibaca

menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.

7. Uji induksi apoptosis dengan metode Double Staining

a. Penanaman sel kanker WiDr

Sel kanker WiDr diambil dari inkubator CO2 kemudian dipanen.

Sel yang digunakan adalah sel yang sudah dalam kondisi 80% konfluen.

Dilakukan perhitungan sel dan dibuat suspensi sel sebanyak 5x104 sel tiap

200 L untuk tiap sumuran. Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate

menggunakan pinset dengan hati-hati. Dua ratus µL suspensi sel

dimasukkan tepat diatas coverslip secara merata dan perlahan, kemudian

didiamkan selama 3-30 menit dalam inkubator agar sel menempel pada

coverslip. Sebanyak 800 µL media kultur sel WiDr ditambahkan kedalam

sumuran secara perlahan. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat

distribusi sel. Dilakukan inkubasi sel dalam inkubator selama semalam.

Sebanyak satu konsentrasi sampel pada IC50 terhadap sel kanker kolon


33

WiDr dibuat untuk sampel perlakuan dan media kultur untuk kontrol sel,

masing-masing sebanyak 1000 µL.

b. Perlakuan Double Staining Sampel pada Sel

Sel WiDr dalam 24-well plate diambil dari inkubator. seluruh

media kultur dari tiap-tiap sumuran dibuang dengan mikropipet secara

perlahan. Kemudian, kedalam tiap sumuran diteteskan 500 L PBS untuk

mencuci sel WiDr. Kemudian PBS dibuang dari sumuran dan ditambahkan

sebanyak 1000 µL larutan uji ekstrak etil asetat daun keladi tikus atau

doksorubisin dengan konsentrasi sesuai IC50 terhadap sel kanker kolon

WiDr kedalam sumuran. Media kultur dimasukkan diatas kontrol sel dan

kemudian diinkubasikan didalam inkubator selama 24 jam. Setelah

diinkubasi, semua media dari sumuran dibuang dan masing-masing dicuci

dengan 500 µL PBS. PBS kemudian dibuang dan coverslip diambil

menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati.

Letakkan coverslip di atas object glass (kaca obyek) dan diberi label.

Teteskan 10 µL reagen campuran ethidium bromide-akridin oranye di atas

coverslip dan ratakan dengan cara digoyangkan secara perlahan. Preparat

tersebut kemudian diamati di bawah mikroskop fluoresens dan

didokumentasikan.

8. Pengamatan ekpresi protein dengan metode imunositokimia

Sel kanker WiDr diambil dari inkubator CO2 kemudian dipanen.

Sel yang digunakan adalah sel yang sudah dalam kondisi 80% konfluen.

Dilakukan perhitungan sel dan dibuat suspensi sel sebanyak 5x104 sel tiap


34

200 L untuk tiap sumuran. Coverslip dimasukkan kedalam 24-well plate

menggunakan pinset dengan hati-hati. Dua ratus µL suspensi sel

dimasukkan tepat diatas coverslip secara merata dan perlahan, kemudian

didiamkan selama 3-30 menit dalam inkubator agar sel menempel pada

coverslip. Sebanyak 800 µL media kultur sel WiDr ditambahkan kedalam

sumuran secara perlahan. Keadaan sel diamati di mikroskop untuk melihat

distribusi sel. Inkubasi sel dilakukan di dalam inkubator selama semalam.

Sebanyak satu konsentrasi sampel pada IC50 dibuat untuk sampel

perlakuan dan media kultur untuk kontrol sel, masing-masing sebanyak

1000 µL.

Sebuah 24 well plate yang telah berisi sel diambil dari inkubator.

Semua media kultur dari sumuran dibuang dengan mikropipet secara

perlahan. Sel dicuci dengan PBS 500 L kemudian PBS dibuang. Sampel

berupa ekstrak etil asetat daun keladi tikus atau doksorubisin sebanyak

1000 µL dimasukkan kedalam sumuran. Kemudian sebanyak 1000 µL

media kultur sel dimasukkan kedalam sumuran sebagai kontrol sel.

Kemudian diinkubasikan didalam inkubator selama 15 menit. Kondisi sel

WiDr diamati sebelum difiksasi. Media kultur dibuang seluruhnya dari

sumuran dan masing-masing dicuci dengan 500 µL PBS. PBS dibuang

dan coverslip diambil menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum

dengan hati-hati. Coverslip diletakkan di dalam 24-well plate dan diberi

label pada masing-masing perlakuan. Sebanyak 300 µL methanol dingin

ditambahkan dan diinkubasi selama 10 menit dalam freezer. Methanol


35

dibuang secara perlahan dan coverslip dijaga agar tidak terbalik.

Sebanyak 500 µL PBS kemudian ditambahkan pada coverslip dan

didiamkan selama 5 menit. PBS kemudian diambil dengan mikropipet

1000 µL kemudian ditambahkan 500 µL akuades. Akuades dibuang

setelah 5 menit dan dilakukan pencucian dengan akudest selama 2 kali.

Larutan hidrogen peroksida (blocking solution) ditambahkan pada

coverslip, lalu diinkubasikan selama 10 menit. Larutan dibuang dengan

mikropipet dan diteteskan predilute blocking serum kemudian

diinkubasikan selama 10 menit. Larutan dibuang dan ditetesi antibodi

monoklonal primer mouse anti-human COX-2. 500 µL PBS ditambahkan

kedalam sumuran dan diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang dan

ditetesi antibodi sekunder rabbit anti-mouse COX-2 yang dilabeli oleh

biotin (biotinylated universal secondary antibody) serta diinkubasi

selama 10 menit. 500 µL PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5

menit. PBS dibuang dan diteteskan dengan reagen yang berisi kompleks

streptavidin-enzim peroksidase lalu diinkubasi selama 10 menit.

Kemudian 500 µL PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit. PBS

dibuang dan diteteskan larutan substrat kromogen DAB lalu diinkubasi

selama 10 menit. Sebanyak 500 µL akuades ditambahkan kemudian

buang kembali. Larutan haemotoxylin diteteskan dan diinkubasi selama 3

menit. 500 µL akuades ditambahkan lalu di buang kembali. Coverslip

diangkat dengan pinset secara hati-hati kemudian dicelupkan dalam

larutan xylol. Coverslip kemudian dicelupkan dalam alkohol dan


36

dikeringkan. Coverslip kemudian diletakkan di atas object glass dan

ditetesi dengan mounting media. Tutup coverslip dengan coverslip kontak

dan ekspresi protein diamati dengan mikroskop.

F. Tata Cara Analisis Hasil

1. Uji MTT

Dari data yang diperoleh pada uji MTT, dihitung % viabilitas

selnya dengan menggunakan rumus :

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛 −𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑠𝑒𝑙−𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎x 100%

Setelah data % viabilitas di plot pada tabel, IC50 dihitung dengan

menggunakan program R-2.14.0, suatu aplikasi statistika open source yang

dikembangkan oleh Dr. Enade Perdana Istyastono, PhD, Apt.

2. Uji Double Staining

Sel yang berwarna hijau menunjukkan sel yang hidup, sedangkan

sel yang berwarna merah menunjukkan sel yang mati. Sel utuh berwarna

merah menunjukkan sel nekrosis sedangkan sel yang terfragmentasi

menunjukkan sel yang mengalami apoptosis karena pada sel yang

mengalami apoptosis terbentuk badan-badan apoptosis.

Pembacaan data dilakukan dengan bantuan blind reader.

Sebanyak tiga orang responden menghitung jumlah sel yang mengalami

apoptosis, nekrosis atau sel hidup pada preparat yang terdiri dari tiga

bagian tiap preparatnya. Hasil yang didapatkan berupa % rata-rata ± SD.

3. Uji Immunositokimia


37

Ekspresi protein tertentu (misal COX-2) ditunjukkan dengan

warna coklat pada sitoplasma (bukan inti sel). Pembacaan data dilakukan

dengan bantuan blind reader. Sebanyak tiga orang responden menghitung

jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 pada preparat yang terdiri dari

tiga bagian tiap preparatnya. Hasil yang didapatkan berupa % rata-rata ±

SD.

Skoring dilakukan dengan cara menghitung persentase sel yang

mengekspresikan COX-2 dalam satu preparat. Hasil negatif didapatkan

apabila sel yang mengekspresikan COX-2 ≤5% dan positif apabila sel

yang mengekspresikan COX-2 >5%. Nilai skor diberikan sesuai dengan

persentase sel yang mengekspresikan COX-2; Skor 0 : 5%; Skor 1 : 6–

25%; Skor 2 : 26–50%; Skor 3: 51–75%; dan Skor 4 : 76–100%. (Vang,

Gown, Barry, Wheeler, and Ronnet, 2006)


38

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Penyiapan Ekstrak Keladi Tikus

Dilakukan determinasi tanaman sebagai langkah pertama yang bertujuan

untuk memastikan kebenaran suatu tanaman yang diuji. Berdasarkan determinasi

yang telah dilakukan di Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta

dengan menggunakan buku acuan Flora of Java (Backer, 1963) daun yang dipakai

dalam penelitian ini adalah benar daun keladi tikus (Typhonium flagelliforme

(Lodd.) Blume (lampiran 10). Daun yang diambil sebaiknya memiliki umur yang

relatif sama agar kadar senyawa aktifnya tidak berbeda. Daun yang sudah dipetik

dicuci dengan air mengalir agar pengotor seperti debu, organisme kecil atau tanah

pada daun dapat dihilangkan. Setelah itu daun ditiriskan dan dikeringkan. Daun

yang diperoleh seberat 950,57 gram.

Pengeringan daun dilakukan dibawah sinar matahari dibawah kain hitam

agar tidak terpapar sinar matahari langsung yang mungkin merusak zat aktif

didalam daun. Pengeringan dilakukan untuk menurunkan kadar air didalam

simplisia agar terhindar dari penjamuran, menjamin kualitas agar tetap baik, dapat

disimpan dalam waktu lama dan terhindar dari kerusakan zat aktif karena

keberadaan air dapat mengaktifkan enzim yang dapat merusak zat aktif dalam

simplisia. Daun dikeringkan didalam oven agar benar-benar kering dan ditandai

dapat hancur ketika digenggam. Daun yang telah kering kemudian diserbukan di


39

Merapi Farma, Yogyakarta. Jumlah serbuk yang didapatkan dalam penelitian ini

adalah sebanyak 25 gram.

Maserasi dilakukan untuk mendapatkan zat-zat aktif yang terdapat dalam

daun keladi tikus. Maserasi merupakan salah satu cara penyarian yang sederhana

yaitu simplisia direndam dengan cairan penyari yang akan menarik senyawa aktif

yang terkandung di dalam daun. Prinsip maserasi yaitu adanya perpindahan massa

dari sel simplisia ke dalam cairan penyari mengikuti derajat konsentrasi. Maserasi

merupakan ekstraksi tanpa pemanasan, sehingga cocok digunakan untuk ekstraksi

senyawa-senyawa yang sensitif pada suhu tinggi.

Maserasi dapat dilakukan dengan atau tanpa adanya penggojogan.

Apabila maserasi yang dilakukan berupa tanpa penggojogan, maserasi

berlangsung selama seminggu. Pada penelitian ini metode maserasi yang dipilih

adalah maserasi dengan penggojogan selama 48 jam. Setelah 24 jam, cairan

penyari diganti dengan yang baru dan ditampung, hal ini dilakukan untuk

menghindari kejenuhan senyawa di dalam cairan penyari. Kecepatan maserasi

yang digunakan adalah 150 rpm, karena pada kecepatan tersebut semua serbuk

dalam wadah sudah dapat teraduk dan terjadi kontak yang terus menerus dengan

cairan penyari.

Hasil maserasi kemudian disaring agar terpisah dari serbuk, kemudian

ditampung dan dipekatkan dengan rotary evaporator dengan suhu 77,1C yang

merupakan titik didih etil asetat. Ekstrak kental yang didapatkan dimasukkan

kedalam cawan porselen dan dipanaskan diatas water bath dan diuji bobot

tetapnya. Bila tidak ada perubahan bobot dalam jangka waktu tertentu,


40

diperkirakan bahwa cairan penyari yaitu etil asetat sudah tidak terdapat di dalam

ekstrak kental. Hal ini perlu dilakukan untuk mencegah terjadinya bias, karena

kemungkinan yang menyebabkan kematian sel bukanlah ekstraknya tetapi pelarut

yang tertinggal.

B. Uji Sitotoksik Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi Tikus terhadap Sel

Kanker WiDr

Daya antikanker ekstrak etil asetat daun keladi tikus terhadap sel kanker

kolon WiDr dalam penelitian ini diketahui melalui pengujian efek ekstrak

terhadap sel kanker kolon WiDr dengan melihat korelasi antara log konsentrasi

ekstrak dan viabilitas sel. DMSO dipilih sebagai pelarut ekstrak karena telah

digunakan secara luas dan tidak mempengaruhi pertumbuhan sel ataupun bersifat

sitotoksik. Hal ini telah diteliti oleh Violante, Zerrouk, Richard, Provot, Chaumeil,

and Arnaud (2005) yang meneliti tentang daya sitotoksik DMSO terhadap sel

tumor kolon CaCo2 dan hasilnya tidak ditemukan efek sitotoksik terhadap sel

dengan kadar DMSO 10%. Menurut Sarir (2005), kematian sel yang terjadi

setelah penambahan DMSO diakibatkan karena nutrisi dalam media telah habis

atau kepadatan sel yang terlalu rapat.

Biakan sel kanker kolon WiDr ditumbuhkan dalam media kultur yang

mengandung antibiotik (penisilin-streptomisin), dan antifungal (Fungizone) untuk

mencegah terjadinya kontaminasi akibat bakteri dan jamur, FBS yang

mengandung hormone yang mampu memacu pertumbuhan sel dan juga berperan

dalam transport protein, mineral, dan lemak, dan RPMI yang berfungsi untuk

menyediakan nutrient untuk pertumbuhan sel yaitu asam amino, vitamin, garam-


41

garam anorganik dan glukosa agar sel dapat tumbuh dengan baik (Freshney,

2011).

Orientasi dalam uji MTT dilakukan untuk menentukan rentang

konsentrasi sampel yang akan digunakan. Orientasi dilakukan dengan empat

rentang konsentrasi yang berbeda. Rentang konsentrasi yang pertama adalah

10.000; 1000; 100; 10; 10; 1; 0,1; 0,01. Ekstrak yang terlalu pekat pada

konsentrasi tertinggi pada rentang ini menyebabkan terbacanya absorbansi ekstrak

oleh ELISA reader. sehingga hasilnya tidak valid dan kemudian dilakukan

orientasi dengan rentang konsentrasi kedua yang lebih rendah yaitu 5000; 1000;

100; 10; 1; 0,1; 0,01. Hasil yang didapatkan pada rentang konsentrasi ini masih

tidak valid karena ekstrak masih terlalu pekat sehingga absorbansinya terbaca oleh

ELISA reader.

Rentang konsentrasi ketiga dalam penelitian ini dari yang terkecil sampai

terbesar adalah 1; 10; 400; 100; 1000; 1200; dan 1500 g/mL. Pada rentang ini

masih terdapat ekstrak yang terbaca absorbansinya, tetapi tidak sebesar

konsentrasi sebelumnya. Konsentrasi ini dipilih agar kurva antara viabilitas sel

dan log konsentrasi ekstrak yang terbentuk berupa kurva sigmoid, yang

menggambarkan aktivitas enzim suksinat dehidrogenase (Gambar 6). Metode

MTT dilakukan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etil asetat daun keladi tikus

terhadap viabilitas sel kanker kolon. Metode ini dipilih karena sensitif, relatif

cepat dan mudah dilakukan (Sieuwerts et al, 1995). Pencucian suspensi sel

dengan PBS dilakukan setelah perlakuan sampel uji terhadap suspensi sel dan

telah diinkubasikan selama 24 jam. Proses metabolisme oleh enzim suksinat


42

dehidrogenase dilakukan sel hidup terhadap MTT yang ditambahkan dan setelah

dilakukan inkubasi menghasilkan warna ungu yang berbanding lurus dengan

jumlah sel yang masih hidup. Warna ungu ini menandakan adanya perubahan

MTT menjadi kristal formazan yang berwarna ungu.

Pembacaan hasil dilakukan dengan menggunakan ELISA reader dengan

panjang gelombang 595 nm, yaitu pada panjang gelombang maksimal kristal

formazan. Terdapat nilai minus yaitu pada konsentrasi 1000 g/mL replikasi I dan

II yang kemungkinan hal tersebut disebabkan oleh adanya kontaminasi yang

terjadi pada kontrol media, perbedaan kepadatan sel antar sumuran, dan adanya

sampel yang ikut terbawa masuk ke kontrol media sehingga kontrol media

menunjukan absorbansi yang lebih besar daripada perlakuan, sehingga hasil

perhitungan viabilitas sel bernilai minus.

Nilai IC50 dihitung dengan menggunakan program R, dan didapatkan nilai

IC50 sebesar 102 g/mL. Menurut Ueda et al (2002) nilai IC50 dibawah 100

g/mL menunjukan bahwa ekstrak tersebut memiliki potensi sebagai anti kanker.

Potensi ekstrak sebagai antikanker digolongkan dalam tiga tingkat, yaitu kuat

(IC50<20), sedang (IC50<50) dan lemah (IC50>50) (Ellithey, Lall, Hussein, and

Meyer, 2013). Ekstrak etil asetat daun keladi tikus berpotensi sebagai antikanker

namun memiliki kekuatan yang lemah terhadap sel kanker kolon WIDr.


43

Gambar 6. Kurva hubungan viabilitas sel vs log konsentrasi ekstrak keladi tikus

Dilihat dari morfologi selnya, sel yang mati terlihat lebih gelap, terlihat

dekat dengan lensa karena mengambang (tidak menempel pada dasar plate), tidak

saling menempel dan batas antar sel tidak jelas. Sel yang masih hidup memiliki

ciri berwarna lebih cerah karena sitoplasmanya masih mengandung cairan

sitoplasma yang dapat meneruskan cahaya dari mikroskop inverted, menempel

satu dengan yang lain, berbentuk bulat dan terlihat menempel di dasar plate. Sel

yang mengalami perubahan morfologi ditunjukkan oleh anak panah berwarna

merah, sedangkan sel normal ditunjukan oleh anak panah berwarna oranye pada

gambar 7. Aktivitas antikanker ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki pola

dose dependent, yaitu viabilitas sel akan menurun seiring kenaikan konsentrasi

sampel, kecuali pada seri konsentrasi yang paling tinggi, yaitu didapatkan

viabilitas sel yang justru meningkat. Hal ini disebabkan karena sampel yang

terlalu pekat, sehingga meskipun telah dicuci oleh PBS tetap meninggalkan bekas

di dalam well plate dan menyebabkan absorbansi yang lebih tinggi.

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

via

bil

itas

sel

(%)

log konsentrasi


44

Setelah pemberian MTT, perbedaan morfologi sel dapat semakin terlihat.

Sel-sel yang masih hidup dapat mengubah MTT menjadi kristal formazan

berwarna biru keunguan sedangkan pada sel yang mati tidak ditemukan adanya

perubahan yang menimbulkan warna. Reagen stopper ditambahkan untuk

melarutkan kristal formazan. Kontrol sel memiliki intensitas warna yang paling

tinggi dan jika dibandingkan dengan perlakuan, intensitas warnanya semakin

menurun seiring kenaikan konsentrasi ekstrak yang diberikan. Intensitas warna ini

akan terbaca oleh ELISA reader, dan hasilnya akan berbanding lurus dengan

viabilitas sel.

(A) (B) (C)

(D)

Gambar 7. Efek sitotoksik ekstrak daun keladi tikus terhadap sel WiDr. Pada konsentrasi ekstrak 1500 g/mL (A), dan 1200 g/mL, (B), tidak teramati bentuk sel karena

tertutup oleh sampel yang pekat. Pada konsentrasi 200 g/mL (C), terlihat beberapa sel mengalami

perubahan morfologi dan pada konsentrasi 1 g/mL (D), tidak ditemukan perubahan morfologi. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop inverted perbesaran 400x.

Terjadi perubahan morfologi Sel normal


45

Aktivitas antikanker dari tanaman keladi tikus juga dilaporkan oleh

beberapa penelitian sebelumnya, yaitu terhadap sel kanker rahim HeLa (Da’i et al,

2007), dan terhadap sel kanker leukemia P338 (Choo et al., 2001).

C. Uji Apoptosis Ekstrak Etil Asetat Daun Keladi Tikus dengan Metode

Double Staining

Apoptosis adalah kematian sel terprogram yang menghasilkan perubahan

karakteristik morfologi dan biokimia sel. Apoptosis dirangsang oleh kerusakan

DNA, adanya TNF (Tumor Necrosis Factor) atau tidak adanya faktor

pertumbuhan. Peristiwa apoptosis ditandai dengan adanya membran blebbing

tanpa hilangnya integritas membran, kondensasi dan fragmentasi kromatin,

pemadatan organela sitoplasma, dilatasi dari retikulum endoplasma, penurunan

volume sel dan pembentukan badan apoptosis (Subowo, 2011).

Peristiwa apoptosis dapat dideteksi dengan pengecatan akridin oranye –

etidium bromida. Metode ini didasarkan pada perbedaan profil fluoresensi DNA

pada sel mati dan sel hidup yang berikatan dengan akridin oranye atau etidium

bromida. Akridin oranye dapat menembus masuk ke dalam sel yang hidup atau

yang mati. Akridin oranye bila berikatan dengan DNA untai ganda menghasilkan

warna fluorosensi hijau, dan menghasilkan warna merah bila berikatan dengan

DNA untai tunggal. Etidium bromida hanya bisa masuk kedalam sel yang

membran plasmanya sudah rusak. Sel yang mengalami nekrosis mengalami

kerusakan membran sel sehingga etidium bromida dapat masuk kedalam sel

kemudian akan berikatan dengan RNA atau DNA untai tunggal dan menghasilkan

floresensi merah bila dilihat dari mikroskop fluoresens. Warna yang ditimbulkan


46

oleh etidium bromida lebih dominan daripada yang ditimbulkan akridin oranye,

sehingga pada sel yang mengalami nekrosis berwarna merah sedangkan sel yang

mengalami apoptosis berwarna oranye kemerahan. Sel yang masih hidup

berwarna hijau merata, sedangkan sel yang mengalami apoptosis memiliki warna

oranye terfragmentasi yang menandakan bahwa sel mengalami fase late apoptosis

atau berwarna hijau seperti sel hidup namun terdapat warna kekuningan di bagian

tengah sel yang berarti terdapat kondensasi kromatin yang menandakan sel

mengalami fase early apoptosis. Sel yang berwarna merah merata adalah sel yang

mengalami nekrosis (Gambar 8).

(A) (B) (C) Gambar 8. Hasil Uji Double Staining Ekstrak Keladi Tikus. Kontrol sel (A), Perlakuan

dengan ekstrak keladi tikus 102 µg/mL (B), Perlakuan dengan Doksorubisin 21 µg/mL (C)

Apoptosis Nekrosis Sel Hidup

Konsentrasi yang digunakan dalam uji ini adalah sesuai dengan nilai IC50

yang didapatkan pada uji MTT yaitu 102 µg/mL untuk ekstrak etil asetat daun

keladi tikus dan 21 µM untuk doksorubisin. Uji double staining merupakan uji

kualitatif, namun dapat dijadikan sebuah uji semi-kuantitatif, dengan pengambilan

beberapa layang pandang yaitu tiga buah foto gambaran keadaan sel tiap satu

preparat, yang dianggap mewakili seluruh keadaan sel dalam preparat tersebut.


47

Pembacaan hasil dilakukan dengan bantuan blind reader. Sebanyak tiga

orang pengamat diminta untuk menghitung jumlah sel yang mengalami apoptosis,

nekrosis dan sel yang masih hidup pada foto sel, tanpa mengetahui perlakuan

yang diberikan terhadap sel yang diamati. Tabel I menunjukan bahwa sebanyak

65.275±1.27 % sel mengalami apoptosis. Hal ini menunjukan bahwa ekstrak etil

asetat daun keladi tikus pada IC50 102 g/mL menginduksi terjadinya apoptosis,

meskipun tidak sebesar Doksorubisin yaitu sebesar 92.916±2.204 %

Menurut Mohan, et al. (2010) ekstrak keladi tikus menginduksi apoptosis

sel melalui peningkatan sitokrom c, suatu protein heme yang berperan sebagai

pembawa elektron yang larut dalam air dalam fosforilasi oksidatif mitokondria.

Sitokrom c dapat berinteraksi dengan Apaf-1 membentuk CARD (Caspase

Recruitment Domain). Beberapa CARD kemudian bergabung membentuk

kompleks apoptosome kemudian mengikat pro-caspase 9 dan mengaktivasinya

menjadi caspase 9 (inisiator kaspase). Caspase 9 mengaktivasi procaspase-3

menjadi caspase 3. Caspase 3 membelah gelsolin, suatu protein yang berfungsi

untuk memelihara morfologi sel. Jika gelsolin dibelah, timbul pembelahan

filament aktin didalam sel sehingga sel kehilangan integritasnya. Caspase 3 juga

memotong Poly ADP (Adenosine Diphosphate)-Ribose Polymerase (PARP),

sebuah enzim yang berperan dalam perbaikan dan pemeliharaan DNA. Caspase 3

merupakan caspase efektor yang menimbulkan apoptosis pada sel.


48

Tabel I. Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode double staining

Sel Apoptosis

(%)±SD

Nekrosis

(%)±SD

Hidup (%)±

SD

Ekstrak Keladi Tikus 65.27±1.27 14.16±0.48 20.94±1.42

Doksorubisin 92.91±2.20 2.975±2.59 5.41±0.0005

Kontrol Sel 1.081 0 98.9

D. Uji Imunositokimia COX-2 akibat perlakuan ekstrak

Uji imunositokimia merupakan uji yang dilakukan untuk mendeteksi

keberadaan suatu protein didalam sel. Tujuan dilakukan uji imunositokimia dalam

penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar kemampuan ekstrak dalam

menghambat ekspresi siklooksigenase-2 (COX-2), suatu protein yang banyak

diekspresikan oleh sel kanker WiDr (Palozza et al, 2004) dan memiliki aktivitas

memicu proliferasi sel (Breyer, Bagdassarian, Myers, and Breyer, 2001).

Peningkatan COX-2 didalam sel kanker kolon WiDr dapat menurunkan

kemampuan apoptosis sel dan melindungi sel dari apoptosis yang di induksi oleh

berbagai sinyal. Oleh sebab itu, hal ini dapat meningkatkan potensi tumorigenik

sel (Richter, Weiss, Weinberger, Furstenberger, and Marian, 2001). COX-2 dapat

memicu proliferasi sel dengan meningkatkan produksi PGE-2 yang dapat

menghambat terjadinya apoptosis dengan meningkatkan protein anti apoptosis

yaitu BCl -2 (Sheng, Shao, Morrow, Beauchamp, and DuBois,1998) serta

mengikat protein pro apoptosis BAX. Pemberian inhibitor COX-2 pada jaringan

atau sel karsinoma dan adenoma dapat menurunkan populasi sel, menghambat

ekspresi COX-2, dan BCl -2 (Richter et al, 2001). Pengobatan dengan inhibitor


49

COX-2 seperti NSAID tidak disarankan karena dapat berbahaya bagi ginjal dan

saluran pencernaan bila digunakan dalam waktu yang lama.

Sel yang tidak mengekspresikan COX-2 berwarna keunguan, sedangkan

yang mengekpresikan COX-2 berwarna coklat pekat, hal ini dikarenakan adanya

staining secara enzimatis oleh peroksidase pada uji imunositokimia (Gambar 9).

Skoring secara semi kuantitatif dilakukan dalam pengujian imunositokimia untuk

menentukan hasil positif atau negatif (ada tidaknya suatu protein). Skoring

dilakukan dengan cara menghitung persentase sel yang mengekspresikan COX-2

dalam suatu preparat. Hasil negatif didapatkan apabila sel yang mengekspresikan

COX-2 ≤5% dan positif apabila sel yang mengekspresikan COX-2 >5%. (Vang,

Gown, Barry, Wheeler, and Ronnet, 2006). Skor COX-2 dalam penelitian ini

adalah 3+ (51% -75% sel mengekpresikan COX-2) untuk kontrol sel, dan 2+

(26% - 50% sel mengekspresikan COX-2) untuk perlakuan dengan ekstrak keladi

tikus dan doksorubisin.

Pembacaan hasil penelitian dilakukan dengan melibatkan 3 (tiga) orang

blind reader untuk menghitung jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 dalam

suatu preparat tanpa mengetahui perlakuan yang diberikan terhadap sel yang

diamati. Hasil yang diperoleh menunjukan bahwa ekstrak etil asetat daun keladi

tikus dan doksorubisin memiliki kemampuan dalam menghambat ekspresi protein

COX-2, dan keduanya memiliki potensi yang berbeda tidak bermakna secara

statistik dengan uji t (α = 0.05). Tabel II menunjukan jumlah rata-rata sel yang

mengekspresikan COX-2 mengalami penurunan pada perlakuan ekstrak etil asetat

daun keladi tikus dan pada perlakuan kontrol positif (doksorubisin) bila


50

dibandingkan dengan kontrol sel tanpa perlakuan. Pada Tabel III terlihat adanya

perbedaan bermakna antara jumlah COX-2 pada kontrol sel dengan jumlah COX-

2 pada sel kanker yang telah diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat daun

keladi tikus dan doksorubisin.

Hasil uji imunositokimia menunjukan bahwa aktivitas antikanker yang

dimiliki oleh ekstrak etil asetat daun keladi tikus diperantarai oleh penekanan

ekspresi protein COX-2. COX-2 merupakan biomarker yang dapat dijadikan

molekul target dalam antikanker. Sel WiDr yang mengalami penghambatan COX-

2 akan mengalami apoptosis karena sifat tumorigeniknya menurun akibat tidak

lagi terlindungi dari peristiwa apoptosis yang diinduksi berbagai sinyal.

Tabel II. Jumlah rata-rata sel yang mengekpresikan COX-2 dalam tiap perlakuan

Preparat %Rata-rata ± SD

Kontrol Sel 69.36 ± 10.20

Perlakuan Ekstrak 39.22 ± 3.63

Doxorubicin 34.32 ± 4.24

Tabel III. Hasil uji statistik t-test COX-2 antara doksorubisin, ekstrak etil asetat daun keladi

tikus dan kontrol sel pada uji imunositokimia

Perlakuan yang

diberikan

Kontrol Sel Doksorubisin Ekstrak Keladi

Tikus

Kontrol Sel BB BB

Doksorubisin BB BTB

Ekstrak Keladi

Tikus

BB BTB


51

( I ) ( II ) ( III )

( IV )

Gambar 9. Hasil Imunositokimia Sel Kanker Kolon WiDr

(I) Kontrol Sel (II) Kontrol Sel tanpa antibodi (III) Perlakuan ekstrak 102 µg/mL dan (IV)

Perlakuan dengan Doksorubisin


52

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Ekstrak etil asetat daun keladi tikus memiliki aktivitas sitotoksik

dengan IC50 sebesar 102 g/mL terhadap sel kanker kolon WiDr

2. Ekstrak etil asetat daun keladi tikus menginduksi apoptosis pada sel

kanker kolon WiDr

3. Apoptosis yang diakibatkan oleh ekstrak etil asetat daun keladi tikus

terhadap sel kanker kolon WiDr diperantarai oleh penekanan ekspresi

protein COX-2.

B. Saran

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut berupa skrining dan pencarian

fraksi aktif dari daun keladi tikus.

2. Perlu dilakukan pengujian efek sitotoksik terhadap sel normal.


53

DAFTAR PUSTAKA

American Cancer Society, Colorectal Cancer Facts & Figures,

www.cancer.org/research/cancerfactsstatistics/colorectal-cancer-facts-

figures, diakses tanggal 9 Pebruari 2015.

Arends, M.J., 2013, Pathways of colorectal carcinogenesis, Appl Immunohistochem

Mol Morphol, 21 (2), 97-102.

Berridge, M.V., and Tan , A.S., 1992, Characterization of the cellular reduction of 3-

(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT):

subcellular localization, substrate dependence, and involvement of

mitochondrial electron transport in MTT reduction, Arch Biochem Biophys,

303 (2), 474-482.

Breyer, R.M., Bagdassarian, C.K., Myers, S.A., and Breyer, M.D., 2001, Prostanoid

receptors: subtypes and signaling, Annual Review of Pharmacology and

Toxicology, 41, 661–690.Brown, G., 2007, Colorectal Cancer, Cambridge

University Press, UK, p. 4.

Burry, R.W., 2011, Immunocytochemistry: A Practical Guide for Biomedical

Research, Springer, New York, pp. 66-67.

Chen, T.R., Drabkowski, D., Hay, R.J., Macy, M., Peterson, W., 1987, WiDr is a

derivative of another colon adenocarcinoma cell line, HT-29, Cancer genetic

and cytogenetics, 27 (1), 125-134.

Burry, R.W., 2011, Immunocytochemistry: A Practical Guide for Biomedical

Research, Springer, New York, pp. 66-67.

Chen, T.R., Drabkowski, D., Hay, R.J., Macy, M., Peterson, W., 1987, WiDr is a

derivative of another colon adenocarcinoma cell line, HT-29, Cancer genetic

and cytogenetics, 27 (1), 125-134.

Choo, C.Y., Chan, K.L., Sam, T.W., Hitotsuyanagi, Y., and Takeya, K., 2001, The

cytotoxicity and chemical constituents of the hexane fraction of Typhonium

flagelliforme (Araceae), Journal of Ethnopharmacology, 77, 129-131.

Cristofanon, S. F., Morceau, A. I., Scovassi, M., Dicato, L., Ghibelli, and Diederich,

M., 2009, Oxidative, multistep activation of the noncanonical NF-κB

pathway via disulfide BCl-3/p50 complex , FASEB Journal, 23, 45–57.

Cui, C., Wang, Y., Wang, Y., Zhao, M., Peng, S., 2013, Exploring the Relationship

between the Inhibition Selectivity and the Apoptosis of Roscovitine-Treated

Cancer Cells, Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2013, 7.


http://www.cancer.org/research/cancerfactsstatistics/colorectal-cancer-facts-figures

http://www.cancer.org/research/cancerfactsstatistics/colorectal-cancer-facts-figures

54

D’Allesio, M., Cerella, C.M., D'Alessio, C., Cerella, C., and Amici, et al.,

Glutathione depletion up-regulates BCl-2 in BSO-resistant cells, FASEB

Journal, 18 (13), 1609–1611.

Da’I, M., Fiveri, A., Meiyanto, E., 2007, Efek Sitotoksik Ekstrak Tanaman Keladi

Tikus (Typhonium divaricatum (L.) Terhadap Sel HeLa, Jurnal Farmasi

Indonesia, 3 (4), 163-167.

Dampstrup, L., Kuwada, S.K., Dempsey, P.J., Brown, P.J., Hawkey C.J., Poulsen,

H.S., et al., 1999, Amphiregulin acts as an autocrine growth factor in two

human polarizing colon cancer lines that exhibit domain selective EGF

receptor mitogenesis, British Journal of Cancer, 80 (7), 1012–1019.

Ellithey, M.S., Lall, N., Hussein, A., and Meyer, D., 2013, Cytotoxic and HIV-1

inhibitory activities of Red Sea marine organisms, http://www.biomedcentral.com/1472-6882/14/77, diakses tanggal 7 Maret

2015.

Farida, Y., Wahyudi, P.S., Wahono, S., Hanafi, M., 2012, Flavonoid Glycoside From

Ethyl Acetate Extract Of Keladi Tikus Typhonium flageliiforme (Lodd)

Blume Leaves, Asian Journal Of Natural & Applied Sciences, 1 (4), 16-21.

Fotakis, G., and Timbrell, J.A., 2005, In vitro cytotoxicity assays : Comparison of

LDH, neutral red, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following

exposure to cadmium chloride, Toxicology Letters, 160, 171-177.

Fournier, D.B., and Gordon, G.B., 2000, Cox-2 and Colon Cancer : potential

targets for chemoprevention, J Cell Biochem Suppl., 34, 97 – 102.

Freshney, R.I., 2011, Animal Cell Culture, a Practical Approach, 1st ed., IRL Press,

Washington DC, pp. 3-5, 8, 73, 193.

Gander, J.C., Gotzos, V., Fellay, B., Schwaller, B., 1996, Inhibition of the

proliferative cycle and apoptotic events in WiDr cells after down-regulation

of the calcium-binding protein calretinin using antisense

oligodeoxynucleotides, Experimental Cell Research, 225 (2), 339-410.

Ghosh, N., Chaki, R., Mandal, V.,and Mandal, S.C., 2011, COX-2 as a target for

cancer chemotherapy, Pharmacological Reports, 62, 233-244.

Gilang, Y., Hermawan, A., Fitriasari, A., and Jenie, R.I., 2012, Hesperidin Increases

Cytotoxic Effect of 5-Fluorouracil on WiDr Cells, Indonesian Journal of

Cancer Chemoprevention, 3 (2), 405-410.

Giovanneti, E., Backus, H.H., Wouters, D., Ferreira, C.G., van Houten, V.M.,

Brakenhoff, R.H., et al, 2007, Changes in the status of p53 affect drug


http://www.biomedcentral.com/1472-6882/14/77

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10762021

55

sensitivity to thymidylate synthase (TS) inhibitors by altering TS levels, Br J

Cancer, 96 (5), 769-775.

Hanahan and Weinberg, 2011, Hallmarks of Cancer: The Next Generation, Cell,

144(4), 646-650.

Helberstadt, C., and Emerich, D.F., 2007, Cellular Transplantation : From

Laboratory to Clinic, Elsevier Inc, USA, p. 107.

India Biodiversity Portal, 2013, http://indiabiodiversity.org/species/show/244514,

Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume diakses tanggal 7 Februari 2015.

http://www.bookoncancer.com/images/video/website%20rodent%20tuber.jpg, book

on cancer diakses tanggal 14 Mei 2014.

Javois, C.L., 1999, Immunocytochemical Methods and Protocols, Second Edition,

Humana Press Inc., New Jersey, p. 3

Kakiuchi, Y., Tsuji, S., Tsujii, M., Murata, H., Kawai, N., Masakazu, Y., et al., 2002,

Cyclooxigenase-2 Activity Altered the Cell-Surface Carbohydrate Antigens

on Colon Cancer Cells and Enchanced Liver Metastasis, Cancer Research,

62, 1567-1572.

Kavanagh, K., 2007, New Insight in Medical Mycology, Springer, The Netherlands, p.

32.

Koehne, C.H., Dubois, R.N., 2004, COX-2 inhibition and colorectal, Semin Oncol, 31

(7), 12-21.

Lai, C.S., Mas, R.H., Nair, N.K., Mansor, S.M., and Navaratnam, V., 2010,

Chemical constituents and in vitro anticancer activity of Typhonium

flagelliforme (Lodd.) Blume (Araceae), J Ethnopharmacol, 127(2), 486-494

Lupertz, R., Watjen, W., Kahl, R., Chovolou, 2010, Dose-and time-dependent effects

of doxorubicin on cytotoxicity, cell cycle and apoptotic cell death in human

colon cancer cells, Toxicology, 271, 115-121.

Mangan, Y., 2008, Cara Bijak Menaklukan Kanker, Agromedia Pustaka, Jakarta, hal.

43-44.

Markowitz, S.D., and Bertagnolli, M.D., 2009, Molexular Basis of Colorectal Cancer,

The New England Journal of Medicine, 361, 2449-2460.

Meerlo, J., Kaspers, G.J., and Cloos, J., 2011, Cell sensitivity assays: the MTT assay,

Methods Mol Bio, 731, 237-245.


http://indiabiodiversity.org/species/show/244514

http://www.bookoncancer.com/images/video/website%20rodent%20tuber.jpg

56

Mohan, S., Abdul, A.B., Abdelwahab, S.I., Al-Zubairi, A.S., Sukari, M.A., Abdullah,

R., et al., 2010, Typhonium flageliiforme induces apoptosis in CEMss cells

via actvation of caspase-9, PARP cleavage and cytochrome c release : Its

activation coupled with G0/G1 phase cell cycle arrest, Journal of

Ethnopharmacology, 131, 592-600.

Mossmann, T., 1983, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:

application to proliferation and cytotoxicity assays, J.Immunol. Meth, 65,

55–63.

Noguchi, P., Wallace, J.J., Earley, M.E., O’Brien S., Ferrone, S., Pellegrino, A.M., et

al., 1979, Characterization Of WiDr : A Human Colon Carcinoma Cell Line,

In Vitro, 15 (6), 401-408.

Osthoff, S.K., 2008, How cells die: Apoptosis and other cell death pathways,

Apoptosis, Cytotoxicity and Cell Proliferation, Roche Diagnostic GmbH,

Germany, 4, 6.

Palozza, P., Serini, S., Maggiano, N., Tringali G., Navarra, P., Ranelleti, F.O., et al.,

2005, beta-Carotene downregulates the steady-state and heregulin-alpha-

induced-COX-2 pathways in colon cancer cells, J Nutr, 135(1), 129-136.

Ranke, C., Creutzig, A., Luska, G., Wagner, H.H., Galanski, M., Bode-Boger, S., et

al., 1994, Controlled Trial of high-versus low-dose aspirin treatment after

percutaneous transluminal angioplasty in patients with peripheral vascular

disease, Clin Investig, 72, 673-680.

Riccardi, C., and Nicoletti, I., 2006, Analysis of apoptosis by propidium iodide

staining and flow cytometry, Nat Protoc, 1 (3), 1458-1461.

Richter, M., Weiss, M., Weinberger, I., Furstenberger, G., and Marian, B., 2001,

Growth inhibition and induction of apoptosis in colorectal tumor cells by

cyclooxygenase inhibitors, Carcinogenesis, 22 (1), 17-25.

Riss, T.L., 2013, Cell Viability Assays, Assays Guidance Manual, 2-13.

Ross, H.M., and Pawlina W., 2006, Histology : A text and Atlas With correlated cell

and molecular biology, Fifth Edition, Lippincot Williams & Wilkins,

Philadelphia, pp. 88-89.

Sarir, T., 2005, Uji Daya Antiproliferasi Pentagamafunon-1 (PGV-1) terhadap Sel

Kanker Payudara T47D, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta, 38-43, 61.

Scheiman, J.M., 1996, NSAIDs, gastrointestinal injury, and cytoprotection,

Gastroenterol Clin North Am, 25 (2), 279-298.


57

Sheng, H., Shao, J., Morrow, D.J., Beauchamp, D.R., and DuBois, N. R., 1998,

Modulation of apoptosis and BCl-2 expression by prostaglandin E2 in

human colon cancer cells, Cancer Research, 58 (2), 362–366.

Sigmond, J., Backus, H.H., Wouters, D., Temmink, O.H., Jansen, G., and Peters,

G.J., 2003, Induction of resistance to the multitargeted antifolate Pemetrexed

(ALIMTA) in WiDr human colon cancer cells is associated with thymidylate

synthase overexpression, Biochem Pharmacol, 66 (3), 431-438.

Sinicrope, F.A., and Gill, S., 2004, Role of cyclooxygenase-2 in colorectal cancer,

Cancer Metastasis Rev, 23 (1-2), 63-75.

Sieuwerts, M.A., Klijn, M. G. J., Peters, A. H., and Foekens, A. J., 1995, The MTT

Tetrazolium Salt Assay Scrutinized : How to Use this Assay Reliably to

Measure Metabolic Activity of Cell Cultures in vitro for the Assesment of

Growth Characteristics, IC50-Values and Cell Survival, Eur J Clin Chem

Clin Biochem, 33, 813-823.

Sriwidiyani, N.P., 2013, Mutasi K Ras pada Karsinogenesis Kanker Kolorektal,

Jurnal Ilmiah kedokteran, 44(2), 97-100.

Steinbach, G., Lynch, P.M., Philips R.K., Wallace, M.H., Hawk, E., et al., 2000,

The effect of celecoxib, a cyclooxygenase-2 inhibitor, in familial

adenomatus polyposis, N.Engl. J. Med, 342, 1946-1952.

Steinberg, M., 2012, Colorectal Cancer, Screening Guidelines Update, US

Pharmacist, http://www.medscape.com/viewarticle/776784_3, diakses

tanggal 2 Mei 2014.

Supino, R., 1995, MTT Assays, Methods in Molecular Biology, 43, pp. 137-138.

Subowo, 2011, BIOLOGI SEL, EDISI 6, Sagung Seto, Jakarta, hal. 306-307

Tacar, O., Sriamornsak, P., and Dass, C.R., 2013, Doxorubicin: an update on

anticancer molecular action, toxicity and novel drug delivery systems, J

Pharm Pharmacol, 65 (2), 157-170.

Tricot, G., 2000, New insights into role of microenvironment in multiple

myeloma, The Lancet, 355 (9200), 248–250.

Tenggara , R., and Kurniawati, A., 2011, Pengaruh Asam Asetil Salisilat terhadap

Penurunan Prevalensi Kanker Kolorektal, CDK Kalbemed, 186 (38), 350-

358.


http://www.medscape.com/viewarticle/776784_3

58

Ueda, J.Y., Tezuka, Y., Banskota, A.H., Tran, Q.L., Tran, Q.K., Harimaya, Y., Saiki,

I. and Kadota, S., 2002, Antiproliferative Activity of Vietnamese Medicinal

Plants, Biol. Pharm. Bull, 25(6), pp. 753-760

Vang, R., Gown, A.M., Barry, T.S., Wheeler, D.T., Ronnet, B.M., 2006,

Immunohistochemistry for estrogen and progesterone receptors in the

distinction of primary and metastatic mucinous tumors in the ovary : an

analysis of 124 cases, Mod Pathol, 19 (1), 97-105.

Vaughn, K., 2013, Immunocytochemistry of Plant Cells, Springer Science+Bussiness

Media, London, p. 1.

Violante, D.G., Zerrouk, N., Richard, I., Provot, G., Chaumeil, J.C., Arnaud, P.,

2002, Evaluation of the cytotoxicity effect of dimethyl sulfoxide (DMSO) on

Caco2/TC7 colon tumor cell cultures, Biol Pharm Bull, 25 (12), 1600-1603.

Waddel, W.R., and Loughry, R.W., 1983, Sulindac for polyposis of the colon, J.

Surg. Oncol, 83, 87.

Wang, Q.R., Yao, X.Q, Wen, G., Fan, Q., Li, Y., Fu, X.Q, et al., 2011, Apigenin

suppreses the growth of colorectal cancer xenografts via phosphorylation

and up-regulated FADD expression, ONCOLOGY LETTERS, 2, 43-47.

Yeatman, T. J., 2001, Colon Cancer, Encyclopedia Of Life Sciences, 1-6.

Zhong, Z., Zhou, G., Chen, X., Huang, P., 2001, Pharmacological study on the

extracts from Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume Blume,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11822289, diakses tanggal 4 Mei 2014


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11822289

59

Lampiran


60

Lampiran 1.

Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode double staining

1. Perlakuan dengan esktrak etil asetat keladi tikus

Sel Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3

Bagian Apoptosis Nekrosis Hidup Apoptosis Nekrosis Hidup Apoptosis Nekrosis Hidup

1 (Total Sel

: 30) 9 (30%)

11

(36.67%)

10

(33.33%) 12 (40%)

8

(26.67%)

10

(33.33%) 9 (30%)

11

(36.67%)

10

(33.33%)

2 (Total Sel

: 20) 17 (85%) 0 (0%) 3 (15%) 16 (80%) 0 (0%) 4 (20%) 18 (90%) 0 (0%) 2 (10%)

3 (Total Sel

: 40)

31

(77.5%) 3 (7.5%) 6 (15%) 30 (75%) 5 (15%) 5 (15%) 32 (80%) 2 (5%) 6 (15%)

Rata-rata

(%) 64.16 14.72 21.11 65 13.89 22.77 66.66 13.89 19.44

Apoptosis Nekrosis Hidup

Rata-Rata Pengamat 1 64.16 14.723 21.11

Rata-Rata Pengamat 2 65 13.89 22.776


Rata-Rata Keseluruhan(%)

±SD 65.27±1.27 14.16±0.48 20.94±1.423


61

2.2 Perlakuan dengan kontrol positif doksorubisin

Sel Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3

Bagian Apoptosis Nekrosi

s Hidup

Apoptosi

s

Nekrosi

s Hidup

Apoptosi

s

Nekrosi

s Hidup

Doksorubisin 1 93.75 0 6.25 93.75 0 6.25 81.25 12.5 6.25

Doksorubisin 2 100 0 0 85.71 14.28 0 100 0 0

Doksorubisin 3 90 0 10 90 0 10 90 0 10

Rata-rata 94.58 0 5.41 93.75 4.76 5.41 90.41 4.16 5.41


Rata-Rata Pengamat 1 94.583 0 5.417




±SD 92.916±2.20 2.975±2.59 5.4167±0.0005

2.3 Kontrol Sel






±SD 1.08 0 98.9


62

Lampiran 2.

Hasil Perhitungan Uji Ekspresi Protein dengan Imunositokimia

Preparat

Reader

1

Reader

2

Reader

3 Total Sel % Reader 1

% Reader

2 %Reader 3 Rata2

Rata-Rata

Seluruh

Kontrol Sel 1 96 111 94 150 64 74 62.66 66.88

Kontrol sel 2 104 98 89 160 65 61.25 55.62 60.62 69.36

Kontrol sel 3 110 90 107 127 86.61 70.86 84.25 80.57

Ekstrak 1 73 62 54 177 41.24 35.02 30.50 35.59

Ekstrak 2 25 20 15 51 49.01 39.21 29.41 39.21 39.22

Ekstrak 3 55 60 47 126 43.65 47.61 37.30 42.85

Doxo 1 49 45 34 127 38.58 35.43 26.77 33.59

Doxo 2 45 34 40 102 44.11 33.33 39.21 38.88 34.32

Doxo 3 43 51 45 152 28.28 33.55 29.60 30.48

Preparat %Rata-rata ± SD

Kontrol Sel 69.36 ± 10.203

Perlakuan Ekstrak 39.22 ± 3.63

Doxorubicin 34.33 ± 4.24


63

Lampiran 3. Pengolahan data uji sitotoksik MTT assay

1. Data konsentrasi ekstrak vs Absorbansi

No. konsentrasi

log

konsentrasi absorbansi

(ug/mL)

1 2 3

rata -

rata

1 1500 3.176091259 0.108 0.107 0.119 0.111

2 1200 3.079181246 0.072 0.089 0.086 0.082

3 1000 3 0.079 0.095 0.095 0.090

4 400 2.602059991 0.196 0.205 0.211 0.204

6 100 2 0.430 0.432 0.389 0.417

7 10 1 0.723 0.771 0.777 0.757

8 1 0 0.717 0.812 0.781 0.770

2. Data konsentrasi ekstrak vs viabiitas sel

konsentrasi

ekstrak

keladi tikus

viabilitas

sel

1500 0.259 99.741

1200 -3.203 103.203

1000 -2.328 102.328

400 11.321 88.679

100 36.749 63.251

10 77.338 22.662

1 78.890 21.110

3. Data Absorbansi Kontrol Media dan Kontrol Sel

kontrol

media

konsentrasi

ekstrak

keladi tikus

viabilitas

sel

0.09 1500 0.259 99.741

0.095 1200 -3.203 103.203

0.094 1000 -2.328 102.328

0.167 400 11.321 88.679

0.101 100 36.749 63.251

0.108 10 77.338 22.662

0.109 1 78.890 21.110


64

4. Data viabilitas sel dengan tiga replikasi

viabilitas sel

v1 v2 v3

rata -

rata SD

-0.139 -0.259 1.174 0.259 0.795

-4.437 -2.407 -2.766 -3.203 1.083

-3.601 -1.691 -1.691 -2.328 1.103

10.366 11.441 12.157 11.321 0.901

38.301 38.540 33.406 36.749 2.897

73.279 79.009 79.725 77.338 3.533

72.563 83.904 80.203 78.890 5.783

5. Grafik konsentrasi vs % rata-rata sel hidup


65

6. Grafik log lonsentrasi VS viabilitas sel

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

70.0

80.0

90.0

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

via

bil

itas

sel

(%)

log konsentrasi

log konsentrasi vs viabilitas sel


66

Lampiran 4. Dokumentasi uji sitotoksik MTT assay

Konsentrasi (µg/mL) Sebelum diberi MTT Sesudah diberi MTT

200

1200

1500


67

Lampiran 5. Dokumentasi uji double staining

Keterangan Gambar

Double staining Kontrol Sel

Double staining Ekstrak Keladi Tikus (1)




68

Double staining Doksorubisin (1)




69

Lampiran 6. Dokumentasi uji imunositokimia

Keterangan Gambar

Kontrol sel (1)

Kontrol sel (2)

Kontrol sel (3)

Perlakuan dengan ekstrak keladi tikus (1)


70



Perlakuan dengan Doksorubisin (1)



71



72

Lampiran 7.

Hasil analisis statistik pada uji imunositokimia dengan R

a. Uji Normalitas

Rata-rata Kontrol vs Rata-rata Ekstrak

Nilai p>0.05 maka kedua data berdistribusi normal

Rata-rata Kontrol vs Rata-rata Dokso

Nilai p>0.05 maka kedua data berdistribusi normal


73

Rata-rata Ekstrak keladi tikus VS Rata-rata Doksorubisin

Nilai p-value > 0,05 berarti kedua data terdistribusi normal

b. Uji Kesamaan Varian

Rata-rata kontrol VS Rata rata Ekstrak

Nilai p-value > 0,05 berarti kedua data memiliki kesamaan varian

Rata-rata kontrol VS Rata-rata Doksorubisin


74

Nilai p-value > 0,05 berarti data memiliki kesamaan varian.

Rata-rata ekstrak VS rata-rata Doksorubisin

Nilai p-value > 0,05 berarti data memiliki kesamaan varian

c. Uji t-berpasangan

Kontrol Sel vs Pemberian Ekstrak keladi tikus

Nilai p-value < 0,05 berarti data berbeda signifikan

Kontrol sel vs doksorubisin


75

Nilai p-value < 0,05 berarti data berbeda signifikan

Ekstrak VS doksorubisin

Nilai p-value < 0,05 berarti data tidak berbeda signifikan


76

Lampiran 8. Perhitungan IC50 Doksorubisin dengan program R


77

Lampiran 9. Perhitungan IC50 ekstrak keladi tikus dengan program R


78

Lampiran 10. Surat keterangan hasil determinasi tanaman keladi tikus


79

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “UJI AKTIVITAS

ANTIKANKER EKSTRAK ETIL ASETAT DAUN

KELADI TIKUS (Typhonium flagelliforme (Lodd.)

Blume) TERHADAP SEL KANKER KOLON WiDr

MELALUI PENEKANAN EKSPRESI PROTEIN

COX-2” dengan nama lengkap Handika Immanuel

merupakan anak pertama dari dua bersaudara pasangan

Bapak Nanang Handoko dan Ibu Hanny Buntoro. Penulis dilahirkan di Cirebon, pada

tanggal 11 Pebruari 1993. Penulis menempuh pendidikan formal di TK Kristen BPK

Penabur Cirebon (1997-1999), SD Kristen BPK Penabur Cirebon (1999-2005), SMP

Kristen 1 BPK Penabur Cirebon (2005-2008), dan SMA Kristen 1 BPK Penabur

Cirebon (2008-2011). Penulis melanjutkan studi di Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011. Semasa perkuliahan, penulis memiliki

pengalaman sebagai Asisten Dosen Praktikum Kimia Dasar (2012). Penulis aktif

dalam mengikuti kegiatan kepanitiaan seperti anggota dari seksi P3K dalam acara

Pharmacy Performance (2011), dan sebagai seksi perlengkapan dalam acara Latihan

Kepemimpinan I ISMAFARSI (2013). Penulis juga aktif dalam kegiatan organisasi

seperti Persekutuan Mahasiswa Kristen Apostolos sebagai seksi creativity and care

(2012-2013), Ikatan Senat Mahasiswa Farmasi Seluruh Indonesia), serta Dewan

Perwakilan Mahasiswa Fakultas (DPMF) Farmasi sebagai anggota dari divisi Quality

Control (2014-2015).


Documents

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI - core.ac.uk · Pengamatan ekspresi protein dengan metode imunositokimia . 33 ... suatu enzim yang mengatur sintesis prostaglandin dan di