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Plate-forme de Recherche Clinique en CYTOMIQUE
Biomarqueurs cellulaires innovants CPER 2007-2013: Innovations thérapeutiques et
Technologies de la Santé (ITTS-CIC-B)
Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires du CHUN (Pr F Plenat) dédié à la recherche clinique et translationnelle Mutualisation des compétences Complémentarités humaines et technologiques Ouverture régionale et interrégionale
Ensemble type « Flow cytometry core facility » Cytométrie en flux multiparamétrique Cell Search Veridex Image Stream System (Amnis)
Une démarche commencée en 2005!
Cytométrie de flux multiparamétrique
Navios (Beckman Coulter) Software Kaluza
CMF 3 lasers 10 couleurs <… 5 Laboratoire d’Immunologie (Pr GC FAURE, Pr MC BENE,
Dr M de CARVALHO) Service d’Hématologie biologique (Pr T LECOMPTE, Dr V
LATGER) Unité de thérapie cellulaire et tissulaire (Pr JF STOLTZ, Pr
A DALLOUL) Anatomopathologie (Pr F PLENAT, Dr K MONTAGNE)
CancéropoleCytométrie de flux multiparamétriqueEvénements rares et populations discrètes… après « single platform » et
Onco-Hématologie NoE European Leukemia Net STIC DHOS Maladie résiduelle (LAL, LAM) Maladie Résiduelle LLC Myélodysplasies Projet INCA SIGLAM Phase périphérique des LMNH
Réponse immunitaire anti-tumorale et thérapie cellulaire Tregs, cellules dendritiques, cellules NK Production cytokiniques spécifiques d’Ag
Microparticules et cellules endothéliales
Cytométrie de flux multiparamétrique (2)MC Béné, au nom du GEIL, GTLLF, GOELAMSMoelle normaleMaladie résiduelle
valorisation démarche détection et quantification d’événements rares au sein des « bermudes »
CD34 CD45
CD13 SSC
Publications récentes Four- and five-color flow cytometry analysis of
leukocyte differentiation pathways in normal bone marrow: a reference document based on a systematic approach by the GTLLF and GEIL.
Arnoulet C, Béné MC, Durrieu F, Feuillard J, Fossat C, Husson B, Jouault H, Maynadié M, Lacombe F.
Cytometry B Clin Cytom. 2010 Jan;78(1):4-10. How and why minimal residual disease studies are
necessary in leukemia: a review from WP10 and WP12 of the European LeukaemiaNet.
Béné MC, Kaeda JS. Haematologica. 2009 Aug;94(8):1135-50.
ELN http://www.leukemia-net.org/content/diagnostics/diagnostics/morphology
Consensual Documents provided by WP10 Created by: M.C. Béné , generated 2008/01/12 ,
last changed: 2008/04/22 …. useful for the immunophenotypic
diagnosis of leukemias by flow cytometry. Flow cytometry atlas
Created by: F Lacombe, C Arnoulet, F Durrieu, J Feuillard, C Fossat, B Husson, H Jouault, M Maynadié, MC Béné , generated 2008/07/12 , last changed: 2009/01/04
Cytométrie de flux multparamétrique (2) Réponse immunitaire anti-
tumorale spécifique (M de Carvalho, P Eschwege + …) Antigènes candidats (cancer
prostate) Problématique: événements rares
+ caractérisation multiparamétrique phénotypique et fonctionnelle de sous populations cellulaires
Signatures cytokiniques Transfert de l’expérience
acquise dans la réponse spécifique anti-mycobacterium tuberculosis et anti-adenovirus
Cytométrie de flux multiparamétrique (3) Microparticules, thrombose et cancer (V Latger-
Cannard, Th Lecompte)
Standardization of platelet-derived microparticle counting using calibrated beads and a Cytomics FC500 routine flow cytometer: a first step towards multicenter studies? Robert S, Poncelet P, Lacroix R, Arnaud L,
Giraudo L, Hauchard A, Sampol J, Dignat-George F.
J Thromb Haemost. 2009 Jan;7(1):190-7. Epub 2008 Oct 18.
Projets en cours Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN)
(V Latger, MC Béné) Déficit en molécules GPI-linked
Lymphocytoses B (JF Lesesve, MCB) SIGLAM (MCB - INCA)
Activation intracellulaire
Septiflux recherche translationelle Inserm (J Feuillard Limoges, S Gibot et Immuno
Nancy) Marqueurs lymphoïdes et monocytaires
Cell Search Veridex® Combinaison de méthodes
Immunologiques spécifiques Séparation immunomagnétique Quantification en imagerie photonique automatisée
Standardisation et automatisation de la phase préparative
Très grande sensibilité (5 évts/tube de 7,5mL) soit #10-7 outil de choix pour l'étude des cellules
endothéliales circulantes en recherche clinique.
Validation antérieure en recherche clinique pour les cellules tumorales circulantes pour des études pronostiques.
Capacités d’isolement des cellules en vue d’études moléculaires complémentaires
Projets Cell Search Cancéropole et au-delà…
Cellules Tumorales Circulantes (CTCs) Sein (CIC Cancérologie CHU-CLCC E Luporsi –
GSK/NOVARTIS – INCA?) Poumon
AO Cancer 2009 Région Lorraine, Nancy Y Martinet, JM Vignaud comparaison ISET STIC Nice, Strasbourg P Oudet, M Beau-Faller
Prostate (Nancy Urologie: J Hubert, P Eschwege; Paris: S Loric LIBM) Validation clinique en réseau interrégional, national, voire
européen (IMI?) Cellules Endothéliales Circulantes (CECs)
Thérapies antiangiogéniques Inflammations: sepsis (CPRC S Gibot) Neuroectodermoses: Sclérose tubéreuse de Bourneville (J
Hubert, Necker)
Résultats littérature Stratification Baseline levels
predicts outcome Changes predicts
survival
Cell search CTCs (1) CERONC – Poumon (Y Martinet, E Quoix,
M Beau-Faller, P Oudet) Evaluation de l’intérêt clinique de la
détection des cellules tumorales circulantes dans le cancer bronchique métastatique
Avec ajout de marqueurs d’intérêt (EGFR, X) Isolement des cellules en vue d’études
moléculaires CERONC – Prostate (P Eschwege, J
Hubert, D Peiffert) Evaluation préthérapeutique
Autres projets CTCs Cancer Poumon
Projet CIRCUBRON C Clement Duchene
Cancer ORL Collaboration CAV: G Dolivet, R
Mastronicola Dilution limite
B Faivre: Thrombose, Hémostase et Cancer ORL
Cell Search CECs (2) Projet Sepsis
CPRC CHU Nancy (Pr S Gibot, GCF) Quantification des CEC Isolement des CECs pour études
moléculaires Projet STB (Sclérose Tubéreuse de Bourneville)
Evaluation des CECs comme biomarqueurs d’angiogénèse pour l’évaluation et le suivi des tumeurs vasculaires rénales
Demande en cours ASTB, PHRC maladies rares (GCF, Pr J Hubert, Necker – D Joly, Lyon – O Rouvière)
Sepsis…. STB Résultats
préliminaires Collaboration
Bordeaux
Sepsis (CPRC) C3, B2 Suivi séquentiel
Autres projets CECs Hémangiomes (propranolol-6)
Maladie Rendu-Osler
Vascularites (10)
Suites infarctus (<20) Anévrysmes aortiques?
Eclampsie (2)
Thérapeutiques anti-angiogéniques (12)
Imagerie en fluxImage stream X AMNIS®
Le système AMNIS®, système d’imagerie en flux combinant cytométrie en flux et imagerie photonique
Observation directe, de la localisation précise, cellule par cellule, des marqueurs fluorescents utilisés pour identifier: membrane, organites intracellulaires, noyau.
Parmi les applications réalisables en simultané Marquages membranaires multiples et colocalisation de
marqueurs de surface Marquages nucléaires (FISH en suspension) Translocation nucléaire, Apoptose Etudes fonctionnelles Coopérations cellulaires (synapse immunologique)
Image stream X AMNISApplications…. etc
Biologie cellulaire – Immunologie
Cancérologie
Cycle Cellulaire
Signalisation Cellulaire Analyse Morphologique
Mort cellulaire
Dommage de l’ADN
Interactions cellulaires
Spectral decomposition
element
detector
laserbrightfield illuminator
cells in flowvelocity detector
autofocus
Frame.movtdiSynchCW2.mov
Spectral decomposition
element
detector
laserbrightfield illuminator
cells in flow velocity
detectorautofocus
ImageStream Layout
Untreated MCP-1 60.99.5MCP-1Untreated
Shape Change, Primary Monocytes
Circularity = average radius divided by radial varianceMCP-1 causes a ‘loss in circularity’ in the majority of the monocytes
R3
MONOMONOMONO
T CELLT CELLT CELL
MONOMONOMONO
T CELLT CELLT CELL
1e50 1e4-1e3 1e3 1e6
Intensity_A-750 CD3
1e5
1e6
1e4
-1e3
0
1e3
Inte
nsity
_PE
CD
14
9_BF 6_SSC 7_DAPI 2_FITC NFkB 3_PE CD14 4_PETR CD45 11_AF647 CD16 12_A750 CD3
325
718
969
1246
9_BF 6_SSC 7_DAPI 2_FITC NFkB 3_PE CD14 4_PETR CD45 11_AF647 CD16 12_A750 CD3
316
943
1142
3592
Monocytes
T cells
NF-kB translocation in whole blood subsets
Incubate PBMC with CpGB
Label pDC with BDCA PE, CD71 or CD107a FITC
Quantify: Internalization and colocalization of CpGB to endosomes and lysomes
Internalization / trafficking in primary cells
Collect 20,000 event image files on the ImageStream
Chongwei CuiDr. Pat Fitzgerald-BocarslyUMDNJ
T cell / APC interactions
Identification of molecular recruitment to the immune synapse. Dr. Brandon Burbach
University of Minnesota
%ADAP in Synapse0 20 40 60 80 100
0
.2
.4
.6
.8
1
1.2
R5
%ADAP in Synapse
Asp
ect R
atio
Inte
nsity
_AD
AP
OVA
%ADAP in Synapse0 20 40 60 80 100
0
.2
.4
.6
.8
1
1.2
R5
%ADAP in Synapse
Asp
ect R
atio
Inte
nsity
_AD
AP
UNTX
17.6
1.3
ImageStream: Standard
Imaging
Cells exhibit common artifacts
associated with defocus making
spot counting difficult
Jurkat cells probed with ChrX (Spectrum Green) and Chr8 (Spectrum Orange)
ImageStream: Extended
Depth of Field Imaging
Same sample (different cells) with
WFC element. FISH spots
maintain size independent of focal
position within nucleus
EDF – FISH analysis
Cell Cycle / Mitosis / Apoptosis
ProphaseMetaphase Anaphase TelophaseInterphase Atypical
• HL60 cells were labeled with anti-HLA AF488 and DRAQ5• DNA condensation pattern and Brightfield contrast help distinguish the phases of mitosis from apoptotic and interphase nucleiIntensity_DRAQ5
0 1e4 2e4 3e4 4e4 5e4 6e4
0
1
2
3
4
G0/1
G2/M
Sub-G0
Intensity_DRAQ5
Nor
mal
ized
Fre
quen
cy %
DNA Content
CV= 4.0
Apoptotic
Plate-forme de recherche clinique en CYTOMIQUE
Biomarqueurs cellulaires innovants CPER: Innovations thérapeutiques et Technologies de
la Santé (ITTS-CIC-B) Plateau technique au sein du Pôle Laboratoires
du CHUN (REDIF: Pr Th Lecompte; CIC-B Pr GC Faure) dédié à la recherche clinique
Ensemble type « Flow cytometry core facility » Cytométrie en flux multiparamétrique Cell Search Veridex Image Stream System (Amnis)