Ogólny podział:

1. W zależności od składu i funkcji podłoża dzielimy na:- proste- wzbogacone- specjalne- wybiórcze (selektywne)- różnicujące- transportowe- transportowo-wzrostowe

2. Ze względu na konsystencję pożywki:- stałe (dodatek agaru; żelatyny; żelu krzemionkowego. Agar –dodany w

stężeniu – 0,5 – 1% = podłoże półpłynne; 1,5-3% = podłoże stałe)- płynne

Najprostszym podłożem płynnym jest: bulion mięsny – wyciąg mięsny + 1% peptony + 0,5% NaCl bulion drożdżowy – wyciąg drożdżowy + pepton + NaCl

Podłoża wzbogacone: są to podłoża z dodatkiem krwi, surowicy lub innych składników, zawierających dodatkowe czynniki wzrostowe, które umożliwiają hodowlę i rozwój najbardziej wybrednych pod względem odżywczym bakterii

Podłoża specjalne: są to podłoża z dodatkiem węglowodanów lub innych specyficznych substratów. Służą m.in. do określania cech hodowanych drobnoustrojów np. właściwości fermentacyjnych danego drobnoustroju, lub do wytwarzania specyficznych produktów metabolizmu takich jak: toksyny, antybiotyki itd. Przykładem podłoży specjalnych są pożywki wchodzące w skład tzw. szeregów biochemicznych używanych do identyfikacji bakterii – podłoże Kliglera, podłoże Stuarta (wykrywanie urezay)

Podłoża różnicujące: są to podłoża gdzie może rosnąć kilka lub kilkanaście gatunków drobnoustrojów, ale każdy z nich wytwarza charakterystyczne, łatwe do zróżnicowania kolonie, co pozwala na ich szybką i dalszą, już ukierunkowaną, szczegółowa identyfikację.Stałe podłoża różnicujące często są jednocześnie wybiórczymi dla określonej grupy, rodzaju drobnoustrojów i są nazywane wybiórczo-różnicującymi.Podłoża wybiórczo-różnicujące: np.

podłoża do hodowli bakterii z rodziny Enterobacteriaceae: MacConkey, Endo, SS, Levina; podłoża do hodowli maczugowców: podłoże Clauberga z tulerynem potasu

podłoże do hodowli gronkowców: podłoże Champamana podłoże do hodowli grzybów i pleśni: podłoże Saburoda

Podłoża wybiórcze: są to podłoża z dodatkiem takim substancji, które umożliwiają wzrost tylko pewnych określonych gatunków bakteryjnych czy grzybiczych a jednocześnie hamują wzrost innych gatunków. Podłoża te pozwalają na wyizolowanie jednego lub kilku gatunków bakteryjnych czy grzybiczych z materiału, w którym znajduje się cała masa drobnoustrojów.Np. podłoże z dodatkiem fioletu krystalicznego, które umożliwia wzrost tylko bakterii Gram-ujemnych, podłoże do hodowli prądków – Löwenssteina-Jensena, różne podłoża selektywne do hodowli bakterii z rodzaju Campylobacter, Yersinia, Vibrio, gatunków Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, itd.; wiele z nich zawiera antybiotyki jako składnik selekcjonujący drobnoustroje.

Do podłoży dodawane są barwniki (wskaźniki), które zmieniają swoje zabarwienie w zależności od pH podłoża (często jest to błękit bromotymolowy, czerwień fenolowa, purpura bromkokrezolowa i inne). Przy podłożach wybiórczo-różnicujących zmiana zabarwienia w czasie wzrostu określonego drobnoustroju informuje o określonej właściwości w zależności od danego substratu (np. rozkład laktozy, manitolu itd.)

Hodowla drobnoustrojów może być prowadzona:

w warunkach tlenowych – cieplarki 35°- 37° C lub 22°-30°C, 42°C w warunkach mikroaerofilnych (eksykatory i generatory wytwarzające gaz i/lub jego

mieszaniny o określonym stosunku ilościowym i/lub procentowym np. CO2; H2+CO2

w warunkach beztlenowych – generatory z gotową

Czas inkubacji hodowli: 24h do 7 doby/ dla grzybów niedoskonałych - 14 dni

Metody hodowli drobnoustrojów, połączone z wyosobnieniem i identyfikacją, nazywane metodami konwencjonalnymi (klasycznymi) pozostają do chwili obecnej referencyjne w diagnostyce mikrobiologicznej.

Do hodowli bakterii i grzybów najczęściej wykorzystywane są podłoża stałe, rzadziej płynne.

Posiew materiałów oraz posiewy bakterii lub grzybów na podłoża stałe dokonywany jest przy użyciu ezy: platynowe, z drutu Kanthalowego, plastikowe =jednorazowe

Najczęściej stosowana technika = technika posiewu redukcyjnego (technika posiewu z izolacją).

Kolonia jest zbiór komórek wyrastających na podłożu stałym, widoczny gołym okiem.

Przyjmuje się (w posiewach półilościowych i ilościowych), że jedna kolonia odpowiada jednej komórce bakteryjnej lub grzybiczej.

Posiew redukcyjny

Izolacja drobnoustrojów

Kolonia bakterii i/lub grzyba

Zamiast liczby komórek przypadających na g (gram) lub ml (mililitr), wprowadzono do badań ilościowych określenie cfu (ang. colony forming units), czyli jednostki tworzące kolonie.

Przy opisie kolonii (osobnik I rzędu) = MORFOLOGIA KOLONII najczęściej bierze się pod uwagę:

1. kształt – okrągły, owalny, nieregularny, postrzępiony, gwiazdkowaty, promienisty, soczewkowaty, głowa meduzy i inne,

2. wielkość – średnica kolonii w mm,3. brzeg – równy, falisty, zatokowaty, postrzępiony, poszarpany, ząbkowany i inny;4. powierzchnia – gładka, szorstka, drobno- lub gruboziarnista, pomarszczona matowa,

błyszcząca, brodawkowata itp.;5. struktura – bezkształtna, szorstka, nitkowata, ziarnista i inne;6. wyniosłość ponad powierzchnię – brak, wypukła, płaska, stożkowata, o wyniosłym

brzegu i zapadłym środku, kopulasta ze środkiem wzniesionym w postaci guziczka, itp.;

7. kolor – barwa w świetle odbitym i przepuszczalnym, zabarwienie samej kolonii, zabarwienie podłoża (barwniki rozpuszczalne). Najczęstsze barwy – biała, żółta, pomarańczowa, czerwona, czarna, zielona, niebieska, brązowa, i inne;

8. przejrzystość – przejrzysta, mętna, przeświecająca, opalizująca, nieprzejrzysta9. konsystencja – masłowata, sucha, lepka, błoniasta, skórzasta, ciągła, śluzowata,10. zapach – mdławy (np. Pseudomonas aeruginosa = kredki świecowe, jaśmin), kwaśne

= gronkowce, piwa, miodu, gliny itp.,11. zawieszalność – zdolność do tworzenia jednolitej zawiesiny w roztworze soli

fizjologicznej – łatwa; niezawieszalna – grudkowa,12. inne cechy, takie jak: typ hemolizy na podłożu z dodatkiem krwi:

- typ β – całkowita liza wokół kolonii- typ α – częściowa liza, zazielenienie wokół kolonii- typ γ – brak hemolizy

Typy wzrostu na podłożach płynnych, jako ocena morfologii niektórych drobnoustrojów, wiążą się ściśle ze sposobem oddychania.Drobnoustroje tlenowe rosną na powierzchni podłoża płynnego; względne beztlenowce powodują zmętnienie całej pożywki, a beztlenowce tworzą osad na dnie próbówki – np. wzrost drobnoustrojów na podłożu półpłynnym Schedlera.

Podłoża opis:

Agar MacConkey – podłoże wybiórczo-różnicujące; służy do izolacji pałeczek Gram-ujemnych z materiałów klinicznych. Jest to podłoże diagnostyczne o słabej wybiórczości. Zawartość soli żółci i fioletu krystalicznego hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, które mają duże wymagania odżywcze. Zawartość laktozy jako jedynego cukru pozwala na odróżnienie pałeczek laktozo-dodatnich od laktozo-ujemnych. W obecności zawartego w podłożu wskaźnika – czerwieni obojętnej, wskutek zależnego od rozkładu laktozy zakwaszenia środowiska, kolonie bakterii rozkładających laktozę zabarwiają się na kolor różowy. Kolonie, które aktywnie rozkładają laktozę (np. Escherichia coli), są ponadto otoczone różową strefa wytrąconych soli kwasów żółciowych. Kolonie szczepów rozkładających laktozę słabo lub z opóźnieniem (np. Citrobacter sp.) mogą pozostać bezbarwne lub stają się lekko różowe dopiero po 48 godzinach hodowli. Pałeczki laktozo-ujemne (np. Shigella sp.; Salmonella sp.; Pseudomonas sp.;) mają bezbarwne kolonie. Podłoże hamuje mgławicowy (rozpełzliwy) wzrost bakterii z rodzaju Proteus np. Proteus mirabilis.

2.4.1. Identyfikacja i wykonanie antybiogramu dla pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae – Escherichia coli.

2.4.2. Wykonanie preparaty mikroskopowego z kolonii bakteryjnej barwionego metodą Grama (Załacznik 1).2.4.3. Wykonanie testu bibułowego – wykrywanie indolu.2.4.4. Wykonanie krótkiego szeregu biochemicznego dla pałeczek z rodzaju Enterobacteriaceae:

2.4.4.1. Podłoże Kliglera: jest to stałe podłoże diagnostyczne dla pałeczek Gram-ujemnych o małych wymaganiach odżywczych, szczególnie używane w diagnostyce Enterobacteriaceae. Pozwala ono zbadać zdolność rozkładu glukozy, laktozy i wytwarzanie siarkowodoru. Przygotowane jest w probówkach w postaci małych półskosów (rysunki 1, 2, 3,). Podłoże wymaga starannego posiewu zarówno w części słupkowej (wkłucie), jak i skośnej. Proporcja masy podłoża do posianego inokulum w obu częściach jest odwrotna – w części słupkowej przy małym inokulum jest dużo podłoża, a w skośnej odwrotnie. Podłoże zawiera między innymi glukozę i

Pałeczka Gram-ujemna z rodziny Enterobacteriaceae – fermentująca laktozę Escherichia coli

Wykonanie preparatu met. GramaTest bibułowy – wykrywanie indolu

Rząd biochemiczny lub identyfikacja met. automatyczna karty GNI+

Wykonanie antybiogramu: met. krążkowo-dyfuzyjna, E-testy , met. automatyczna

laktozę (w proporcji 1:10), tiosiarczan i jony żelaza, które są wskaźnikiem wytwarzania H2S, oraz wskaźnik pH.Rozkład glukozy przejawia się zakwaszeniem i zażółceniem wyjściowo łososiowego podłoża. Zmiana postępuje szybciej w części skośnej, gdzie wkrótce pojawia się powrót do barwy wyjściowej, z powodu wtórnej alkalizacji będącej wynikiem rozkładu aminokwasów (skos łososiowy + słupek żółty = rozkład glukozy – schemat III-3). Jeżeli będzie rozkładana laktoza, żółte zabarwienie obu części utrzymuje się przez wiele godzin (skos żółty + słupek żółty = rozkład laktozy – schemat III-2).Brak rozkładu cukrów wiąże się z alkalizacją pożywki, która pogłębia swoją wyjściową barwę – przyjmując kolor czerwony – schemat III -1.Wytwarzanie w czasie fermentacji cukrów dużych ilości CO2 lub H2

uwidacznia się przez rozerwanie lub unoszenie podłoża.Tworzenie się H2S z tiosiarczanu zachodzi powoli w kwaśnym środowisku słupka i powoduje powstawanie nierozpuszczalnego czarnego strątu siarczku żelaza. Ocena podłoża powinna być dokonana po 24 godzinach.

1. 2. 3.

Schemat III. Podłoże Kliglera i efekt fermentacji cukrów – 1. - brak frementacji cukrów; 2. - rozkład laktozy; 3. – rozkład glukozy

2.4.4.2 . Rozkład mocznika (wytwarzanie ureazy) – najpopularniejsze podłoże ubogie, podłoże Stuarta – w postaci płynnej. Podłoże to zawiera między innymi mocznik (2%), tryptofan oraz wskaźnik pH – czerwień fenolową . Bakterie posiewa się na podłoże i inkubuje przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Bakterie wytwarzające enzym ureazę rozkładają mocznik do NH3 i CO2. Powstający w trakcie hodowli NH3 alkalizuje podłoże i powoduje zmianę barwy z żółtej (schemat IV – 1) na różowoamarantową (schemat IV – 2).Dodanie do podłoża odczynnika Ehrlicha w skład, którego wchodzi : p-dimetyloaminobenzaldehyd, alkohol amylowy i stężony kwas solny - w przypadku reakcj dodatniej powoduje pojawienie się ciemnoamarantowej

obrączki na powierzchni podłoża (tryptofan zawarty w podłożu za pośrednictwem tryptofanazy przekształcany jest w indol, skatol i kwas pirogronianowy i NH3.

1. 2. 3. Schemat IV. Podłoże – rozkład mocznika (wytwarzanie ureazy); 1- brak wytwarzania ureazy, 2-wytwarzanie ureazy, 3- wytwarzanie indolu.

Tabela 2. Wstępna identyfikacja pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae na podstawie wyniku reakcji biochemicznych uzyskanych na podstawie krótkiego szeregu biochemicznego.

Gatunek Glukoza Laktoza Gaz H2S Ureaza IndolE. coli + + + (-) (-) +Klebsiella sp. + + + (-) + +/-Enterobacter sp. + + + (-) (-) (-)Citrobacter sp. + + + + (-) +/-Serratia marcescens + (-) (-) (-) (-) (-)Proteus mirabilis + (-) + + + (-)Proteus vulgaris + (-) +/- + + +Morgalella morgani/Providentia rettgeri + (-) (-) (-) + +Salmonella sp. + (-) +/- + (-) (-)Shigella sp. + (-) +/- (-) (-) +/-

Pałeczki Gram-ujemne niefermentujące:Np. Pseudomonas aeruginosa

Wzrost kolonii P.aeruginosa na agarze MacConkey’u

Opis testu API20NZestaw do identyfikacji niefermentujących pałeczek Gram-ujemnych nie należących do

rodziny Enterobacteriaceae - API 20NE (Nr kat. 20050 firmy, bioMérieux) jest

Kolonie laktozo- ujemne

Wzrost kolonii P.aeruginosa na podłożu Columbia agar + 5% krwinek baranich

wystandaryzowaną mikrometodą do identyfikacji drobnoustrojów nie należących do

Enterobacteriaceae, takich jak: Psudomonas spp., Acinetobacter spp., Flavobacterium spp.,

Vibrio spp., Aeromonas spp. i inne.

Skład testuTest API 20NE (bioMérieux) składa się z 20 mikrostudzienek zawierających

odwodnione substraty i podłoża tworzące szereg biochemiczny, w skład którego wchodzi 8

testów powszechnie stosowanych, takich jak: redukcja azotanów, wytwarzanie indolu,

fermentacja glukozy, dehydrolaza argininy, ureaza, hydroliza eskuliny, hydroliza żelatyny,

-galaktozydaza oraz 12 testów asymilacyjnych takich jak: asymilacja glukozy, arabinozy,

mannozy, mannitolu, N–acetyloglukozaminy, maltozy, glukonianu, kaprynianu, adypinianu,

jabłczanu, cytrynianu, octanu fenylu, które umożliwiają określenie zdolności adaptacji

enzymatycznej badanych drobnoustrojów.

Materiały (firmy bioMérieux)1. Test API 20NE (Nr kat. 20050) z Kartami Wyników

2. NaCL 0,85% Medium (2 ml) (Nr kat. 20070)

3. McFarland Standard (0,5) (Nr kat. 70900)

4. Jałowy olej mineralny (Nr kat. 70100)

5. Odczynniki Griessa do wykrywania azotynów – NIT 1 (Nr kat. 70440) oraz NIT 2

(Nr kat. 70450)

6. Odczynik JAMES do wykrywania indolu (Nr kat. 70540)

7. Odczynnik OX do wykrywania oksydazy (Nr kat. 70460)

8. Książka Kodów API 20 NE (Nr kat. 20090)

WykonanieTest API 20NE wykonano wg standardowej procedury podanej przez producenta w

następujących etapach:

9. Przygotowanie pasków testu API 20NE.

10. Przygotowanie badanej zawiesiny bakteryjnej.

11. Napełnienie pasków testu API 20NE sporządzoną zawiesiną bakteryjną.

12. Inkubacja testów w temperaturze 30C przez 48 godzin.

13. Odczyt szeregu biochemicznego po 24 godzinach zgodnie z Tabelą Odczytu

(Załącznik 1) oraz zapis wyników na Karcie Wyników.

14. Dalsza inkubacja testu API 20NE.

15. Ponowny odczyt wyników reakcji biochemicznych w celu uzyskania 7 - cyfrowego

kodu numerycznego, będącego ostateczną identyfikacją gatunkową pałeczek Gram-

ujemnych niefermentujących odczytaną z Książki Kodów.

Procedura wykonania API20N – schemat.

Odczyt API20N po inkubacji w 30°C w warunkach tlenowych przez 24 godziny.

2.4.3. Wykonanie oznaczenia lekooporności:

2.4.3.1. Oznaczanie lekooporności metodą krążkowo-dyfuzyjną Kirby-Bauera Metoda krążkowo-dyfuzyjna Kirby-Bauera jest oparta na dyfuzji antybiotyku

zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk dyfunduje promieniście przez agar, tworząc gradient stężeń. Największa jego koncentracja występuje przy brzegach krążka i spada wraz z odległością od krążka. Wielkość strefy zahamowania wzrostu bakterii jest wprost proporcjonalna do stopnia wrażliwości bakterii na antybiotyk - im większa jest strefa zahamowania, tym bakteria jest bardziej wrażliwa. W zależności od wielkości strefy, bakterie określa się jako: wrażliwe, średnio wrażliwe lub oporne na podstawie przyjętych standardów (M100-S10NCCLS, 2000). Metoda krążkowo-dyfuzyjna jest najczęściej używaną metodą testowania lekooporności. Jest ona dobrze wystandaryzowana, powtarzalna, relatywnie tania. Posiada jednak ograniczenia. Nie jest wiarygodna w testowaniu wolno-rosnących organizmów, bezwzględnych bakterii beztlenowych. Niektóre antybiotyki słabo dyfundują w agarze, przez co różnica w strefach zahamowania dla bakterii wrażliwych i opornych jest niewielka, co może prowadzić do nieprawidłowego określenia lekooporności (antybiotyki glikopeptydowe, polimyksyna B).

2.4.3.2. Materiały: podłoże agar Mulera- Hinton (MHA2) 1 ml jałowej 0,85% soli fizjologiczna (NaCl) krążki bibułowe z antybiotykiem – np. firma Oxoid zawiesina bakteryjna – w skali 0,5 McFarlanda wzorzec – 0,5 McFarlanda jałowe wymazówki

2.4.3.3. Procedura przygotowania inoculum i interpretacja wyników

Inoculum przygotować ze świeżej, osiemnastogodzinnej hodowli bakterii na podłożu MHA2. Kilka kolonii bakterii zawiesić w jałowym fizjologicznym roztworze 0,85% NaCl, celem uzyskania zawiesiny o gęstości 0,5 w skali McFarlanda, co w przybliżeniu odpowiada liczbie od 1  108 do 2  108 c.f.u./ml. Gęstość zawiesiny oznaczyć nefelometrycznie przy użyciu kolorymetru (Nr kat. V1210 firmy bioMérieux).

Gotową zawiesinę w ciągu 15 minut rozprowadzić na powierzchni podłoża MHA2 przy użyciu jałowej wymazówki. Po 15 minutach na posiane podłoże nakłożyc krążki z antybiotykami i chemioterapeutykami. Tak przygotowane płytki w ciągu następnych 15 minut wstawić do cieplarki i inkubowć w warunkach tlenowych 16-18 godzin, w temperaturze 37C.Wyniki interpretować zgodnie z zaleceniami NCCLS, według średnicy uzyskanych stref zahamowania wzrostu.

Fotografia. Lekwrażliwość krażkowo-dyfuzyjna podłoże Muller-Hinton - P.aeruginosa