POE Coloracion de Zielh Neelsen OK

1. OBJETIVO

Estandarizar el procedimiento para la realización de la coloración de Zielh Neelsen en el laboratorio clínico de la ESE Santiago de Tunja.

2. ALCANCE

Este documento aplica al Área de coloraciones del Laboratorio Clínico de la E.S.E. Santiago de Tunja para la realización de la coloración de Zielh Neelsen.

3. RESPONSABLE

El personal auxiliar encargado del Área de coloraciones del Laboratorio Clínico E.S.E. Santiago de Tunja.

4. REFERENTE TEÓRICO

Manual y guía técnica, MANUAL PARA EL DIAGNOSTICO BACTERIOLOGIOCO DE LA TUBERCULOSIS, parte 1 baciloscopio, Organización panamericana de la salud, oficina regional de la organización mundial de la salud, 2008, consultado el:10/08/13, disponible en: http://files.sld.cu/tuberculosis/files/2009/12/tb-labs-baciloscopia1.pdf

Ledermann Walter, UNA HISTORIA PERSONAL DE LAS BACTERIAS, Sociedad Chilena de Infectologia, Ril Editores 2007, pág. 167, Consultado el: 10/08/13, Disponible en: http://books.google.com.co/books?id=pydkwNBz9dEC&pg=PA167&dq=historia+de+la+tincion+de+ziehl+neelsen&hl=es-419&sa=X&ei=1PMHUtX5CarO2wXe24GYDw&ved=0CCwQ6AEwAA#v=onepage&q=historia%20de%20la%20tincion%20de%20ziehl%20neelsen&f=false

ELABORÓ REVISÓ APROBÓFECHA: 25/03/2014CARGO: BACTERIOLOGA AUDITOR DE CALIDAD GERENTENOMBRE:

ALEJANDRA VELASCO MONICA SALAMANCA JULIANA CORTAZAR

E.S.E. SANTIAGO DE TUNJA

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PROCEDIMIENTO

MANUAL DE PROCESOS Y PROCEDIMIENTOS

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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR PARA LA COLORACION DE ZIELH NEELSEN

http://books.google.com.co/books?id=pydkwNBz9dEC&pg=PA167&dq=historia+de+la+tincion+de+ziehl+neelsen&hl=es-419&sa=X&ei=1PMHUtX5CarO2wXe24GYDw&ved=0CCwQ6AEwAA#v=onepage&q=historia%20de%20la%20tincion%20de%20ziehl%20neelsen&f=false



http://files.sld.cu/tuberculosis/files/2009/12/tb-labs-baciloscopia1.pdf

http://files.sld.cu/tuberculosis/files/2009/12/tb-labs-baciloscopia1.pdf

Rodríguez Cavallini Evelyn, Gamboa Coronado Maria del Mar, Hernández Chavarría Francisco, García Hidalgo Jorge Danilo, BACTERIOLOGIA GENERAL: PRINCIPIOS Y PRACTICAS DE LABORATORIO, Editorial Universidad de Costa Rica, pág. 68, consultado el:10/08/13, disponible en: http://books.google.com.co/books?id=vwB0fgirgN0C&printsec=frontcover#v=onepage&q&f=false

Historia y fundamento, Disponible en: http://demostraciondelbacilodekoch.blogspot.com/2011/06/metodo-de-coloracion-de-ziehl-neelsen_03.htmlhttp://es.scribd.com/doc/39054818/Tincion-de-Ziehl-Neelsen

Fundamento de la tinción de zielh Neelsen y fotografías, disponible en: http://microinmuno.files.wordpress.com/2011/05/5-tinciones-especiales.pdf

Instituto Nacional de Salud. Laboratorio Nacional de Referencia Micobacterias. Bacteriología de tuberculosis, Baciloscopia y cultivo.

5. CAMBIOS EFECTUADOS

No. VERSIÓN DESCRIPCIÓN DEL CAMBIO FECHA

6. DESARROLLO

5.1. INTRODUCCION

La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clínicas de pacientes. Después dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a1926), un




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http://microinmuno.files.wordpress.com/2011/05/5-tinciones-especiales.pdf


http://es.scribd.com/doc/39054818/Tincion-de-Ziehl-Neelsen

http://demostraciondelbacilodekoch.blogspot.com/2011/06/metodo-de-coloracion-de-ziehl-neelsen_03.html

http://demostraciondelbacilodekoch.blogspot.com/2011/06/metodo-de-coloracion-de-ziehl-neelsen_03.html

http://books.google.com.co/books?id=vwB0fgirgN0C&printsec=frontcover#v=onepage&q&f=false

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bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 a 1894), un patólogo, plantearon otros colorantes, por lo cual se les atribuye su descubrimiento.

5.2. FUNDAMENTO

Este método se basa en que las paredes celulares de bacterias contienen ácido graso ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistencia bacilos ácido-alcohol resistente o BAAR. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis M. tuberculosis y Mycobacterium marinum M. marinum y se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.

La técnica de Z-N fuerza la penetración de la fucsina básica en la pared celular mediante la acción combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de ácidos micólicos: el calor “derrite” el componente ceroso y el fenol actúa a modo de disolvente, permitiendo el paso del colorante básico que se une a los ácidos micólicos con carga negativa. Cuando cesa la aplicación de calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las moléculas de fucsina quedan atrapadas en su espesor.




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Con la coloración de Ziehl Neelsen, las micobacterias se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul.


5.3. DEFINICIONES

BACILOSCOPIA: en una prueba seriada de tres días consecutivos, donde se toma una muestra de esputo (catarro), para ver qué




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bacteria se encuentra presente. Esta prueba se utiliza para dictar el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis.

BACTERIAS ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES: es la propiedad física de algunas bacterias a la resistencia a la decoloración de la fucsina básica (rojo) la cual penetra en la célula por acción del fenol y el calor.

MICOBACTERIAS: son bacterias aerobias y no móviles (con excepción de la especie M. marinum, que ha mostrado ser móvil dentro de los macrófagos). Tienen ácido-alcohol resistencia, no producen endosporas ni cápsulas y suelen considerarse gram positivas.

ÁCIDO MICÓLICO: Los ácido micólicos son α-alquil-β-hidroxiácidos grasos de cadena larga (60-90 átomos de carbono) y son los lípidos mayoritarios de la pared celular de micobacterias.

5.3. CONDICIONES GENERALES

El área de trabajo debe encontrarse en perfecto orden. Se requiere para esta prueba, extendidos hechos a partir de una muestra

clínica como esputo. Ver Manual de Toma de Muestras Las muestras deben estar correctamente identificadas con el número de

ingreso, nombres y apellidos completos. Los procedimientos de neutralización y disposición de los reactivos usados

para el desarrollo de la metodología, se encuentran registrados en el Plan de Gestión Integral de Residuos Sólidos y Hospitalarios del Laboratorio Clínico de la ESE Santiago de Tunja

Todas las muestras de pacientes y controles deberán ser manipulados como posibles agentes potencialmente infecciosos.

Utilizar todas las normas de Bioseguridad requeridas en el Laboratorio Clínico, para el montaje de estas pruebas, según regulaciones aplicables. (Ver Manual de Bioseguridad)




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6. EQUIPO ADICIONAL Microscopio con lente de inmersión Mecheros

7. PROCEDIMIENTO7.1. PREPARACION DEL EXTENDIDO

Coloque las muestras en el sitio de trabajo. Procese máximo 6 muestras a la vez.

Coloque el mechero entre las muestras a procesar y usted. Deje un espacio de la lamina para marcarla con lápiz de cera azul o negro,

indicando primero el número consecutivo del paciente y luego el número de la muestra (primera, segunda o tercera según el caso). El resto de la lámina es para hacer el extendido de la muestra.

Revise que el frasco de la muestra que se va a procesar y la lámina tengan el mismo número.

Coloque el mechero en la mitad entre la muestra y usted para evitar riesgo de contaminación.

Divida el bajalenguas en dos y con una de las partes seleccione la partícula útil que es el moco de color verde, café o amarillo y en algunos casos tiene sangre

Coloque la lámina por el lado que tiene el número de registro y con el bajalenguas extienda la partícula útil sobre la lámina de modo uniforme sin llegar hasta el borde de ella.

Cuando el extendido de la muestra sea muy delgado, deje secar y realice otra vez el extendido sobre la misma lamina. Tape el recipiente que contiene la muestra y deje secar el extendido a temperatura ambiente cerca del mechero. No acelere el secado pasando las láminas sobre la llama, esto deteriora el extendido y dificulta la observación al microscopio pues el calor fuerte altera la estructura de los bacilos y su posterior tinción; además puede generar aerosoles.




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Una vez secos los extendidos páselos rápidamente sobre la llama del mechero tres veces con el extendido hacia arriba con el fin de fijar la muestra.

Ver Anexo 1. Flujograma de preparación de extendido.

7.2. COLORACION

Tenga en cuenta las láminas de control de calidad de coloración de ZN control positivo y control negativo. (Ver control de calidad)

Coloque las láminas sobre el soporte con el extendido hacia arriba separadas en orden numérico.

Cubra la totalidad de la lámina con fucsina de Ziehl Neelsen previamente filtrada (rojo).

Caliente las láminas por debajo pasando la llama del mechero hasta que se produzcan vapores. Empiece a contar 10 minutos, retire el mechero y cuando los vapores desaparezcan caliente nuevamente, haga esto cuantas veces sea necesario hasta completar el tiempo.

Evite que el colorante hierva o se seque, si esto pasa agregue más colorante y continúe produciendo los vapores.

Deje enfriar y lave suavemente con agua de chorro. Cubra el extendido con alcohol ácido durante 1 minuto y después de este

tiempo lave suavemente con agua de chorro como lo hizo anteriormente. Cubra el extendido decolorado con azul de metileno durante 2 minutos, lave

suavemente con agua de chorro. Limpie con papel suave la parte de atrás de la lámina, es decir donde no

está el extendido para retirar los residuos de colorante que pueden interferir con la lectura.

Dejar secar a temperatura ambiente protegidos de la luz directa del sol. Una vez secos los extendidos revise la numeración y rotule con el nombre

del paciente, número consecutivo y el número de muestra y pase los extendidos al área de microscopía para su observación.




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Ver Anexo 2. Flujograma de Coloracion Ziehl Neelsen

8. CONTROL DE CALIDAD

Cada vez que se realize la coloración de Ziehl Neelsen es necesario haga el montaje de controles positivo y negativo con el fin de garantizar un proceso adecuado.Para el control positivo se utilizarán bacilos acido alcohol resistentes, que pueden obtenerse de la vacuna BCG.El control negativo se realizará con bacilos acido alcohol sensibles lo cual se puede lograr con una muestra negativa a la cual se haya realizado Baciloscopia.

9. REPORTE DE RESULTADOS

(-) Ausencia de BAAR en 100 campos observados(+) Menos de un BAAR por campo, en 100 campos observados(++) 1-10 BAAR por campo, en 50 campos observados(+++) + 10 BAAR por campo, en 20 campos observados

Los resultados serán registrados en la carpeta de registro de baciloscopias y adicionalmente se digitan en el software CNT por número de documento o por sección.

10. ANEXOS

ANEXO 1. FLUJOGRAMA DE PREPARACION DEL EXTENDIDOANEXO 2. FLUJOGRAMA DE COLORACION ZIEHL NEELSEN




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ANEXO 1. FLUJOGRAMA DE PREPARACION DEL EXTENDIDO




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ANEXO 2. FLUJOGRAMA DE COLORACION ZIEHL NEELSEN



Disponga las muestras en el sitio de trabajo poniendo el mechero entre las muestras a procesar y usted y proceda a marcar la lámina con lápiz azul o negro con número consecutivo seguido de un guión y número de muestra.

Revise que el frasco de la muestra que se va a procesar y la lámina tengan el mismo número.Coloque el mechero en la mitad entre la muestra y usted

Divida el bajalenguas en dos y con una de las partes seleccione la partícula útil . Coloque la lámina por el lado que está marcada y con el bajalenguas extienda muestra sobre la lámina uniformemente.

Cuando el extendido de la muestra sea muy delgado, deje secar y realice otra vez el extendido sobre la misma lamina. No acelere el secado pasando las láminas sobre la llama.

Una vez secos los extendidos páselos rápidamente sobre la llama del mechero tres veces con el extendido hacia arriba con el fin de fijar la muestra.


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No olvide realizar el montaje de los controles negativo y posistivo al momento de hacer la coloración. Coloque las láminas sobre el soporte con el extendido hacia arriba separadas en orden numérico.

Cubra la totalidad de la lámina con fucsina de Ziehl Neelsen previamente filtrada .

Caliente las láminas por debajo pasando la llama del mechero hasta que se produzcan vapores. Empiece a contar 10 minutos sin dejar hervir ni secar el colorante, en este caso reponer con más colorante.

Deje enfriar y lave suavemente con agua de chorro.

Cubra el extendido con alcohol ácido durante 1 minuto y después de este tiempo lave suavemente con agua de chorro

Cubra el extendido decolorado con azul de metileno durante 2 minutos, lave suavemente con agua de chorro.

Limpie con papel suave la parte de atrás de la lámina y deje secar a temperatura ambiente. Pase las láminas al aárea de microscopía.


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