174
PROGRAM OSPOSOBALJAVANJA OSOBA KOJE RADE S POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU BIOLOŠKIH PRIPRAVAKA Osposobljavanje osoba koje provode pokuse na životinjama te odgovorne osobe kao i voditelja nastambi za životinje i njihovih zamjenika KATEGORIJA 2 Uredile: Sofija Blažević Julija Erhardt Zagreb, ožujak 2012.

POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

  • Upload
    others

  • View
    4

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

PROGRAM OSPOSOBALJAVANJA OSOBA KOJE RADE S

POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU

BIOLOŠKIH PRIPRAVAKA

Osposobljavanje osoba koje provode pokuse na životinjama te

odgovorne osobe kao i voditelja nastambi za životinje i njihovih

zamjenika

KATEGORIJA 2

Uredile:

Sofija Blažević

Julija Erhardt

Zagreb, ožujak 2012.

Page 2: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

2

PROGRAM OSPOSOBALJAVANJA OSOBA KOJE RADE S POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA

PROIZVODNJU BIOLOŠKIH PRIPRAVAKA

Hrvatski sabor je (Na temelju članka 88. Ustava Republike Hrvatske) na sjednici 1. prosinca 2006. donio

ODLUKU O PROGLAŠENJU ZAKONA O ZAŠTITI ŽIVOTINJA. Članak 32. Ovog zakona odnosi se na ispit za

rad s pokusnim životinjama, te kaže da „(1) Pokuse na životinjama te postupke pri proizvodnji bioloških

pripravaka mogu obavljati veterinari, liječnici, farmaceuti, medicinski biokemičari, stomatolozi,

agronomi stočari ili biolozi, ako imaju položen ispit za rad sa životinjama.

(2) Kirurške zahvate na životinjama tijekom pokusa te pri proizvodnji bioloških pripravaka mogu

obavljati veterinari, liječnici, farmaceuti, medicinski biokemičari, stomatolozi, agronomi stočari ili

biolozi ako imaju položen ispit iz stavka 1. ovoga članka.“

Prema pravilniku Ministarstva poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja (NN 47/11, 26.04.2011., izdan na

temelju članka 20. stavka 3., članka 22. stavka 5. i članka 32. stavka 4. Zakona o zaštiti životinja (»Narodne novine«, broj

135/06)) O ZAŠTITI ŽIVOTINJA KOJE SE KORISTE U POKUSIMA ILI U DRUGE ZNANSTVENE SVRHE,

U dodatku III. Koji se odnosi na „Program osposobljavanja osoba koje rade s pokusnim životinjama i

životinjama za proizvodnju bioloških pripravaka“, Predložen je pregled tema koje mora poznavati

osoba koja radi sa pokusnim životinjama. Prema tom programu postoje 4 nivoa osposobljavanja, od

kojih kategorija 2 predstavlja: „Osposobljavanje osoba koje provode pokuse na životinjama te

odgovorne osobe kao i voditelja nastambi za životinje i njihovih zamjenika.“ Minimalna satnica

predviđena za ovo osposobljavanje je 60 sati.

Prema MPRRR, osobe kategorije 2 moraju biti osposobljene i upoznate najmanje sa slijedećim (sve iz

stupnja 1 i dodatna područja)

Prvi stupanj

1(a) etiku i propise vezano za smještaj i njegu životinja koje se koriste u pokusima ili za

proizvodnju bioloških pripravaka;

1(b) laboratorijske i pokusne životinje: vrste, životni ciklus, ponašanje i reprodukcijske značajke,

osiguranje okoliša primjerenog svakoj vrsti i kategoriji životinja, način usmrćivanja pojedinih

vrsta životinja, gospodarenje životinjama te uzgoj i držanje potrebnog broja životinja;

1(c) osnove bolesti laboratorijskih i pokusnih životinja;

1(d) prepoznavanje stresa laboratorijskih i pokusnih životinja;

1(e) prijevoz životinja.

Dodatno za 2 stupanj:

2(a) etiku i propise s područja zaštite životinja vezano za provođenje pokusa na životinjama;

2(b) pokusne metode;

2(c) značenje sustava smještaja i držanja životinja kao i lokalnog okoliša za sam pokus;

mikrobiološki status životinja; anatomija pokusnih životinja; anestezija, analgezija i drugi

postupci za smanjivanje/uklanjanje boli i patnje životinja; upotreba primjernih tehnika i

kirurških postupaka.

U ovom priručniku predlažemo sadržaj za osposobljavanje kategorije 2.

Page 3: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

3

U izradi ovog priručnika sudjelovali su:

Prim. mr. sc. Borislav Aleraj, dr. med., Hrvatski zavod za javno zdravstvo

Mr. sc. Maja Balija Lang, dr. vet. med., Imunološki zavod

Doc. dr. sc. Vesna Benković, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Sofija Blažević, dipl. ing., Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Dr. sc. Jadranka Bubić Špoljar, dr. Vet. Med. Genera

Dr. sc. Marko Ćaleta, Zoologijski zavod, PMF

Doc. dr. sc. Domagoj Đikić, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Dr. sc. Julija Erhardt, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Prof. dr. sc. Srećko Gajović, dr. med., Hrvatski Institut za istraživanje mozga

Doc. dr. sc. Ana Galov, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Doc. dr. sc. Andrea Gudan, dr. vet. med., Veterinarski fakultet

Prof. dr. sc. Dubravka Hranilović, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Dr. sc. Duje Lisičić, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Dr. sc. Ivna Kocijan, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Prof. dr. sc. Nada Oršolić, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Mr. sc. Branka Šošić, dr. med. vet., Uprava za veterinarstvo, MPRRR

Dr. sc. Anamarija Štambuk, Zoologijski zavod, PMF

Maja Šrut, dipl. ing., Zoologijski zavod, PMF

Doc. dr. sc. Zoran Tadić, Zavod za animalnu fiziologiju, PMF

Prof. dr. sc. Dražen Vnuk, dr. vet. med., Veterinarski fakultet

Page 4: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

4

SADRŽAJ:

UVOD U ZNANOST O LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA ................................................................ 10

Uvod ............................................................................................................................................... 10

Povijest istraživanja na životinjama u svijetu ................................................................................... 10

Povijest istraživanja na životinjama u Hrvatskoj ............................................................................... 11

Sadašnjost i budućnost ................................................................................................................... 12

Organizacije i udruženja .................................................................................................................. 12

Zakonski okvir tečaja za rad sa laboratorijskim životinjama ............................................................. 13

Kriteriji MPRRR-a za kategoriju 2: ................................................................................................ 13

Kriteriji FELASA-e za kategoriju „B“ .............................................................................................. 14

Zaključak ......................................................................................................................................... 14

Literatura ........................................................................................................................................ 15

ZAŠTITA ŽIVOTINJA KOJE SE KORISTE U ZNANSTVENE SVRHE - zakonodavne odredbe - ................. 16

Uvod ............................................................................................................................................... 16

I. Opće odredbe .............................................................................................................................. 16

II. Obveze pravnih i fizičkih osoba .................................................................................................... 17

III. Odredbe za korištenje životinja .................................................................................................. 19

III. Provođenje pokusa..................................................................................................................... 28

IV. Obveze nadležnog tijela ............................................................................................................. 29

DODATAK I. Metode usmrćivanja životinja ...................................................................................... 30

DODATAK II. Klasifikacija postupaka po težini .................................................................................. 32

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA "OD RIBA DO PRIMATA" .................................................................... 36

Ribe ................................................................................................................................................ 36

Vodozemci ...................................................................................................................................... 38

Rukovanje ................................................................................................................................... 39

Caudata (Urodela) – Repaši ......................................................................................................... 40

Gmazovi .......................................................................................................................................... 40

Rukovanje ................................................................................................................................... 41

Ptice ............................................................................................................................................... 42

Sisavci ............................................................................................................................................. 42

Pas .............................................................................................................................................. 43

Mačka ......................................................................................................................................... 44

Svinja .......................................................................................................................................... 44

Ovca ............................................................................................................................................ 45

Primati ............................................................................................................................................ 46

Držanje u zarobljeništvu .............................................................................................................. 47

Najznačajnije skupine i vrste majmuna (primata) u laboratorijskim istraživanjima ....................... 48

Literatura ........................................................................................................................................ 49

Page 5: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

5

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA – MALI GLODAVCI I KUNIĆI ................................................................ 51

Uvod ............................................................................................................................................... 51

Zašto laboratorijski glodavci i kunići?........................................................................................... 51

Glodavci (Rodentia) ......................................................................................................................... 51

Opća obilježja, evolucija i raznolikost glodavaca .......................................................................... 51

Dvojezubci (Lagomorpha) ............................................................................................................... 52

Opća obilježja, evolucija i raznolikost dvojezubaca ...................................................................... 52

Položaj glodavaca i dvojezubaca u ekosustavu i značaj za čovjeka ................................................... 53

Glodavci i dvojezubci u laboratorijskim istraživanjima ................................................................. 54

Literatura ........................................................................................................................................ 56

ZEBRICE KAO MODELNI ORGANIZAM U BIOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA ........................................... 57

Uvod ............................................................................................................................................... 57

Primjena zebrica u biološkim istraživanjima................................................................................. 57

Uzgoj ........................................................................................................................................... 58

Literatura ........................................................................................................................................ 58

PONAŠANJE ŽIVOTINJA .................................................................................................................. 60

Uvod ............................................................................................................................................... 60

Društveno ponašanje laboratorijskih miševa ................................................................................... 60

Obrambeno ponašanje laboratorijskih miševa................................................................................. 61

Agresivno (agonističko) ponašanje laboratorijskih miševa ........................................................... 62

Hijerarhijska struktura miševa u laboratorijskim kavezima .......................................................... 63

Stvaranje teritorija u laboratorijskih miševa ................................................................................ 63

Društveni život divljih kućnih miševa ........................................................................................... 63

Literatura ........................................................................................................................................ 65

GENETIKA I STANDARDIZACIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA ........................................................ 66

Laboratorijski glodavci i nastanak sojeva ......................................................................................... 66

Sojevi laboratorijskih životinja ......................................................................................................... 66

Koeficijent inbridinga (koeficijent srođenosti tj. koeficijent srodstva) .......................................... 66

Skupina genetički nedefiniranih sojeva ............................................................................................ 68

Nesrođeni sojevi (engl. Outbreed stocks) .................................................................................... 68

Nomenklatura nesrođenih sojeva ................................................................................................ 69

Izogenički sojevi .............................................................................................................................. 69

Srođeni sojevi (engl. Inbreed strain) ............................................................................................ 69

Koizogeni, kongeni ili segregirajući srođeni sojevi ........................................................................ 70

Životinje s posebnim genskim obilježjima ........................................................................................ 73

Transgenični miševi i Knock-out miševi (miševi s izbačenim genom) ............................................ 73

Nomenklatura transgeničnih sojeva ............................................................................................ 73

Literatura ........................................................................................................................................ 74

GLODAVCI KAO MODELI ZA ISTRAŽIVANJE NEUROBIOLOŠKE PODLOGE PONAŠANJA ..................... 75

Page 6: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

6

Spontano ponašanje ....................................................................................................................... 75

Uvjetovano ponašanje .................................................................................................................... 76

Literatura ........................................................................................................................................ 76

NABAVLJANJE ŽIVOTINJA I LOKALNA PRAVILA U NASTAMBI .......................................................... 77

Lokalna pravila u nastambi .............................................................................................................. 77

Uputa o podnošenju zahtjeva za odobravanje provođenja pokusa na životinjama ........................... 80

Literatura ........................................................................................................................................ 80

BRIGA NJEGA I GOSPODARENJE LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA ................................................ 81

Smještaj i gospodarenje .................................................................................................................. 82

Literatura ........................................................................................................................................ 84

PREHRANA / HRANIDBA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA .................................................................. 85

Skladišta ......................................................................................................................................... 86

Tehnički detalji ................................................................................................................................ 87

Literatura ........................................................................................................................................ 88

ZARAZE KOJE MOGU PRIJEĆI NA LJUDE OD POKUSNIH ŽIVOTINJA I NJIHOVO IZBJEGAVANJE ......... 89

Uvod ............................................................................................................................................... 89

Glavne mjere čuvanja zdravlja životinja u uzgoju u pogledu zaraznih bolesti su: .......................... 91

Glavne mjere zaštite zdravlja osoba koje rade s pokusnim životinjama ........................................ 92

Glavne mjere zaštite životinja u prirodi: ...................................................................................... 92

Glavne mjere zaštite ostalih ljudi donosno stanovništva: ............................................................. 92

Literatura ........................................................................................................................................ 93

PRAĆENJE ZDRAVLJA I BOLESTI LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA ....................................................... 94

Bakterijske infekcije ........................................................................................................................ 94

Gljivične infekcije ............................................................................................................................ 95

Virusne infekcije ............................................................................................................................. 95

Parazitarne invazije ......................................................................................................................... 95

Druge bolesti .................................................................................................................................. 95

Utjecaj bolesti na pokuse sa životinjama ......................................................................................... 95

Literatura ........................................................................................................................................ 96

BOL I OTKLANJANJE BOLI ............................................................................................................... 97

Definicija i važnost boli .................................................................................................................... 97

Klasifikacija boli ............................................................................................................................... 97

Put boli ........................................................................................................................................... 98

Životinje i bol ................................................................................................................................ 100

Prepoznavanje i procjena boli životinja ......................................................................................... 100

Otklanjanje boli ............................................................................................................................. 101

Literatura ...................................................................................................................................... 101

ANESTEZIJA I ANALGEZIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA ............................................................. 103

Uvod ............................................................................................................................................. 103

Page 7: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

7

Vrste anestezija............................................................................................................................. 103

Anesteziološki postupci ................................................................................................................. 104

Vrste i načini administracije anestetika ......................................................................................... 105

Eutanazija ..................................................................................................................................... 106

Literatura ...................................................................................................................................... 106

ANESTEZIJA; ANALGEZIJA, EUTANAZIJA I EKPERIMENTALNA KIRURGIJA ...................................... 107

Anestezija, analgezija i eutanazija ................................................................................................. 107

Eksperimentalna kirurgija.............................................................................................................. 107

DOBROBIT LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA I ODABIR KRAJNJIH TOČAKA U EKSPERIMENTU ............ 109

Literatura ...................................................................................................................................... 110

ŽIVOTINJSKI MODELI.................................................................................................................... 112

Uvod ............................................................................................................................................. 112

Inducirani (pokusni) modeli ........................................................................................................... 115

Spontani (genetski) modeli ............................................................................................................ 119

Modeli bolesti stvoreni ciljanom genetskom modifikacijom .......................................................... 120

Negativni modeli bolesti ............................................................................................................... 122

„Orphan“ model bolesti ................................................................................................................ 122

Miš-kao pokusni model u imunološkim istraživanjima ................................................................... 122

Animalni modeli u tumorskoj imunologiji ...................................................................................... 123

Značajke transplantabilnih tumora u miša ................................................................................. 125

Karcinoza peritoneuma ............................................................................................................. 125

Značajke „ksenograft“ modela................................................................................................... 126

Ostali tumorski animalni modeli ................................................................................................ 126

Metastaze na plućima ............................................................................................................... 127

Životinjski upalni modeli ............................................................................................................... 128

Upala ........................................................................................................................................ 128

Upalne bolesti i najčešće rabljeni životinjski modeli .................................................................. 128

Literatura ...................................................................................................................................... 130

DOBIVANJE I KORIŠTENJE TRANSGENIČNIH ŽIVOTINJA ................................................................ 132

Uvod ............................................................................................................................................. 132

Klasična i reverzna genetika .......................................................................................................... 132

Ciljano onemogućavanje gena postupkom «knock-out» ................................................................ 133

Prednosti, nedostaci i budućnost metode ..................................................................................... 134

Genska zamka ............................................................................................................................... 135

Vektor genske zamke .................................................................................................................... 135

Primjena genske zamke ................................................................................................................. 136

Literatura ...................................................................................................................................... 138

LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE U FARMAKOLOŠKIM I TOKSIKOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA ................ 140

Farmakološki i toksikološki modeli in vivo .................................................................................... 141

Page 8: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

8

Laboratorijske životinje koje se koriste u farmakološkim i toksikološkim istraživanjima ................. 141

Odabir soja ................................................................................................................................ 142

Testovi toksičnosti ........................................................................................................................ 142

Laboratorijski modeli i laboratorijske životinje u ekotoksikološkim testiranjima ............................ 144

Literatura ...................................................................................................................................... 144

IMUNIZACIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA U CILJU PROIZVODNJE POLIKLONSKIH I MONOKLONSKIH ANTITIJELA ....................................................................................................... 145

UVOD ............................................................................................................................................ 145

Proizvodnja poliklonskih antitijela (Pab – polyclonal antibody) ...................................................... 146

Ovca, koza i magarac ................................................................................................................ 148

Proizvodnja monoklonskih antitijela (Mab- monoclonal antibody) ................................................ 151

Literatura ...................................................................................................................................... 152

Proizvodnja Mab u miševa metodom tvorbe ascitesa ................................................................ 152

ALTERNATIVNI PRISTUPI KORIŠTENJU LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA ........................................... 153

Literatura ...................................................................................................................................... 154

DOBRA LABORATORIJSKA PRAKSA DLP/GLP (GOOD LABORATORY PRACTICE) .............................. 155

ETIKA U RADU SA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA .................................................................... 160

Prva tvrdnja: Potreba za istraživanjima na životinjama .............................................................. 161

Druga tvrdnja: Tražiti alternativne metode ................................................................................ 161

Treća tvrdnja: Životinjski osjećaj boli ......................................................................................... 161

Četvrta tvrdnja: Moralni status životinja .................................................................................... 162

Zaključak ................................................................................................................................... 162

Literatura ...................................................................................................................................... 162

VJEŽBE: Laboratorijske životinje u biološkim istraživanjima ......................................................... 164

Experimentalni uvod na neživim modelima ................................................................................... 164

Video ............................................................................................................................................ 164

OBUZDAVANJE LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA i UZIMANJE UZORAKA KRVI .................................. 165

Literatura ...................................................................................................................................... 166

MIŠ .............................................................................................................................................. 167

Rukovanje ................................................................................................................................. 167

Iniciranje i vađenje krvi ............................................................................................................. 167

Eutanazija: ................................................................................................................................ 167

Sekcija: ...................................................................................................................................... 167

ŠTAKOR ....................................................................................................................................... 168

Rukovanje ................................................................................................................................. 168

Iniciranje i vađenje krvi ............................................................................................................. 168

Eutanazija: ................................................................................................................................ 168

Sekcija: ...................................................................................................................................... 168

ISPITIVANJE PONAŠANJA ............................................................................................................. 169

Page 9: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

9

Ostale skupine životinja u laboratorijskim istraživanjima ............................................................... 169

ZEBRICE ....................................................................................................................................... 172

1. Anestezija zebrica .................................................................................................................. 172

2. Sekcija zebrica ....................................................................................................................... 172

2.1. Vađenje krvi................................................................................................................... 172

2.2. Sekcija organa................................................................................................................ 172

3. Razmnožavanje zebrica ......................................................................................................... 172

4. Embriji u različitim stadijima razvoja ...................................................................................... 172

SEMINARI .................................................................................................................................... 173

Video o istraživanjima na životinjama............................................................................................ 173

Izvođenje pokusa na živim životinjama .......................................................................................... 173

1.Planiranje, dizajn pokusa sa laboratorijskim životinjama ......................................................... 173

2. Protokoli pokusa ................................................................................................................... 173

Dobra Laboratorijska praksa (GLP): ............................................................................................... 173

Toksikologija ................................................................................................................................. 173

Udruge za zaštitu životinja ............................................................................................................ 173

PROVJERA ZNANJA ...................................................................................................................... 174

Page 10: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

10

UVOD U ZNANOST O LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA

Dr. sc. Julija Erhardt

Uvod

Istraživanja na životinjama su značajno doprinijela napretku bioloških znanosti, medicine i veterine.

Laboratorijske životinje najčešće se koriste za biomedicinska istraživanja, zatim testiranja sigurnosti

proizvoda, dok se nešto manji, ali još uvijek značajan broj životinja koristi i u edukaciji.

Proučavanje životinja i eksperimentiranje na životinjama je doprinijelo razumijevanju biologije, što je

rezultiralo boljim razumijevanjem zdravlja, bolesti i liječenja, kako ljudi, tako i životinja. Istraživanja i

dostignuća iz područja fiziologije i medicine, koja su rezultirala Nobelovim nagradama, u velikoj većini

su ostvarena eksperimentirajući na životinjama.

Osim istraživanja čiji rezultati se koriste u poboljšanju zdravlja, životinje se koriste i za ispitivanje

sigurnosti vrlo širokog spektra različitih proizvoda, koje osim lijekova, uključuju i kozmetiku,

industrijske kemikalije, pesticide, kućanske preparate, itd.

Osnovna postavka kojom se vodimo pri uzgoju i radu sa laboratorijskim životinjama je u što većoj mjeri

osigurati njihovu dobrobit. Russel i Burch su 1959. godine u svojoj knjizi „Principi humanih

eksperimentalnih tehnika“ („The principles of humane experimental technique“), uveli koncept „3R“,

koji je postao osnova humanog korištenja životinja danas. 3R predstavljaju: „Reduction“- smanjiti broj

životinja koliko je to god moguće, „Refinement“ – poboljšati uvjete i držanja životinja i smanjiti bilo koji

oblik stresa i boli na najmanju moguću mjeru i „Replacement“- koristiti alternativne metode u

istraživanjima, i zamijeniti korištenje životinje koliko god je to moguće.

Povijest istraživanja na životinjama u svijetu

Prvi pisani trag o korištenju životinja u stjecanju znanja datira još u vrijeme Stare Grčke, gdje su se

obavljale prve vivisekcije, a prvi primjeri su objavljeni u knjizi „Corpus Hippocraticum“ oko 400. god pr.

Kr. Stari Rim je također imao svog velikog liječnika i eksperimentatora na području medicine, Galena,

koji je u drugom stoljeću pr. Kr. eksperimentirao na svinjama, psima i majmunima i postavio temelje

medicinskoj praksi kako tog doba, tako i stoljećima koja su slijedila. U srednjem vijeku,

eksperimentalna znanost je zamrla gotovo čitav milenij u dijelu starog svijeta. Antička istraživanja na

području biomedicine doživljavaju svoj preporod u arapskoj medicini, a jedan od najpoznatijih liječnika

tog doba bio je Avenzoar, koji u 12. stoljeću, provodi sekcije i zahvate na životinjama, prije nego ih

pokuša izvesti na ljudima u svrhu liječenja.

Procvat empirijske znanosti u doba Renesanse oko 15. stoljeća, se osjetio i na području istraživanja

životinja. U početku su to bila istraživanja na području anatomije, gdje možemo istaknuti Vesaliusa, i

njegovo djelo „De Humani Corporis Fabrica“, 1543.). U to doba smatrano je da životinje nisu sposobne

osjećati, već funkcioniraju kao strojevi bez osjećaja. Filozof koji je uvelike doprinio tom stajalištu je bio

Rene Decartes, (1596-1650), koji je zaslužan za dualistički pristup svijetu, tj. pristup gdje je svijet

izgrađen od odvojenih supstanci tijela i duha, te da sposobnost osjećaja i mišljenja pripada isključivo

čovjeku.

Page 11: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

11

Fiziološki procesi se počinju proučavati od 17. stoljeća, i već 1655. Irski fiziolog Edmund O'Meara kaže

da „nedostojno i jadno mučenje životinja pri vivisekciji dovodi tijelo životinju u neprirodno stanje“ i

dovodi u pitanje pouzdanost rezultata dobivenih na taj način. Nadalje, zamjerka eksperimentiranju na

životinjama u tom dobu je bila i ta što se smatralo da su životinje previše različite od čovjeka i

inferiorne, pa se rezultati dobiveni na životinjama ne mogu primijeniti na ljude.

Od 18-tog stoljeća na dalje postepeno se prihvaća mišljenje da eksperimentiranje na životinjama

doprinosi napretku medicine i da daljnji razvoj medicine ovisi o daljnjem eksperimentiranju na

životinjama. Već 19. stoljeće donosi nam pokrete protiv vivisekcije i eksperimenata na životinjama prvo

u Engleskoj, a zatim u Francuskoj. U Engleskoj se osniva prvo udruženje za zaštitu životinja i donesen je

prvi zakon o zaštiti životinja u pokusima „Akt o okrutnosti prema životinjama“ („Cruelty to Animals

Act“), 1876. godine. Velik doprinos debati o eksperimentiranju na životinjama dao je Jeremy Bentham

u svom djelu „Uvod u proncipe morala i legislative“ („Introduction to the Principles of Morals and

Legislation“) iz 1789. godine, gdje postavlja svoje često citirano pitanje: „Pitanje nije da li one

(životinje) mogu razmišljati? Niti, da li mogu govoriti? Nego, da li mogu patiti?“ („The question is not,

can they reason? Nor, can they talk? but, can they suffer?“ )

Ipak, od 19. stoljeća na dalje, eksperimenti na životinjama postaju sve brojniji. Razlozi tome su brojni,

počevši od otkrića metoda anestezije, do razvoja ostalih biomedicinskih disciplina, farmakologije,

toksikologije, virologije, imunologije itd. Osobiti porast korištenja pokusnih životinja prati razvoj

farmaceutske industrije, čime se korištenje životinja u pokusima aktualizira dovodeći problematiku do

razine političkog pitanja. Povećava se ne samo ukupni broj korištenih životinja, nego i broj korištenih

vrsta. Do kraja 19. stoljeća u pokusima su uglavnom korištene domaće životinje, dok je druga polovica

20. stoljeća donijela procvat uzgoja srođenih malih glodavaca, posebice miševa i štakora, kao i veliki

porast broja korištenih životinja. Smatra se da je u svijetu 1960. godine korišteno oko 30 milijuna

kralježnjaka, dok je 1970. taj broj narastao između 100 i 200 milijuna. Broj korištenih životinja se kroz

sedamdesete stabilizirao i u 80-tim počeo opadati. Prema procjeni britanskog udruženja za aboliciju

vivisekcije (BUAV) i danas se godišnje vrše pokusi na oko 100 milijuna kralježnjaka, od toga 10-11

milijuna u Europi. Od toga oko 90% otpada na laboratorijske štakore i miševe.

Povijest istraživanja na životinjama u Hrvatskoj

Prvo korištenje laboratorijske životinje u Hrvatskoj je zabilježeno krajem 19. stoljeća kada su se u

Bjelovaru, na privatnom posjedu Dr. Schlicka u svrhu proizvodnje cjepiva protiv velikih boginja,

uzgajala prvo mlada telad, a kasnije goveda. Slijedi osnivanje Veterinarskog bakteriološkog zavoda u

Križevcima, 1901. godine, koji je imao i prostorije za laboratorijske životinje. Nastambe sa miševima,

kunićima i konjima imali su i Kraljevski zemaljski bakteriološki zavod, koji je 1912. godine osnovan u

Zagrebu, Serumski zavod, 1920. osnovan u Zagrebu, kao i Bakteriološka stanica u Splitu, osnovana

1922. godine. 1947. godine osniva se u Zagrebu Institut za medicinska istraživanja, a 1950. Imunološki

zavod, koji u svojim nastambama uzgajaju različite životinje poput štakora, miševa, zamoraca, kunića,

konja, ovaca, koza, zmija, itd.

Sredinom 20.stoljeća, prof. Borislav Nakić, osnivač Zavoda za animalnu fiziologiju Prirodoslovno-

matematičkog fakulteta u Zagrebu, prvi počinje srođivati štakore i uzgaja dva srođena soja (AGA i Y59).

Prvi sojevi srođenih štakora razvijeni u Hrvatskoj su uzgajani neko vrijeme, ali su se potom izgubili. Prve

podlinije sojeva miševa razvijene u Hrvatskoj pojavile su se u svjetskim registrima tek 1985. godine.

Page 12: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

12

Broj srođenih miševa i štakora u Hrvatskoj je sad puno veći, a na Medicinskom fakultetu u Rijeci i

Zagrebu uzgajaju se i transgenične životinje.

Sadašnjost i budućnost

Znanost o pokusnim životinjama je multidisciplinarna i danas obuhvaća proučavanje biologije pokusnih

životinja, genetike i postupaka standardizacije, kako genetičke, tako i mikrobiološke, prevenciju i

liječenje bolesti, optimizaciju eksperimentalnih procedura i uvjeta anestezije i eutanazije, uvjete

držanja i uzgoja, itd. Eksplozija istraživačkih alata i tehnologija dostupnih biomedicinskim

znanstvenicima je stvorila dosad nezabilježene mogućnosti. Tako su početkom milenija, različite

istraživačke grupe završile sekvenciranje genoma više različitih sojeva miševa. Sekvencioniranje i

manipulacija genoma igra i igrat će značajnu ulogu u biomedicinskim istraživanjima.

Mogućnost da se izmijeni genski sastav bioloških modela i istraži funkcija gena pružaju snažne alate za

određivanje njihove funkcije i modulacije. Ovim, mišji modeli humanih bolesti postaju puno

relevantniji, te uspoređivanjem humanog genoma i genoma miša omogućava istraživačima točniju

identifikaciju patoloških mehanizama bolesti kao i njihovom terapijskom liječenju putem razvoja

lijekova. Mogućnost analize i promjene genoma dovelo je do širenja netradicionalnih vrsta

laboratorijskih životinja i pristupa istraživanjima.

„Replacement“ pri radu sa laboratorijskim životinjama u svakom slučaju ostaje ultimativni cilj, a mnoge

tehnologije koje su se razvile u zadnjih 1-2 desetljeća će odigrati važnu ulogu u tome. Tako će uloga

bioinformatike postajati sve veća, a s njom i potreba za većim brojem educiranih osoba koje će biti

osposobljene da izvuku maksimum iz postojećih baza podataka, da doprinesu harmonizaciji postojećih

podataka i omoguće i olakšaju transfer informacija između grupa istraživača. Omogućavanje globalnog

iskorištavanja akumuliranih podataka i transfera informacija će u konačnici doprinijeti maksimalno

mogućem smanjivanju broja korištenih životinja u pokusima.

Organizacije i udruženja

U mnogim državama su osnovana udruženja vezana uz znanost o laboratorijskim životinjama i sada ih

je u svijetu vrlo veliki broj više ili manje aktivno. Nekoliko krovnih udruženja su tokom posljednjih

desetljeća kreirala i usmjeravala put kojim je išla znanost o laboratorijskim životinjama, pa će neka od

njih biti spomenuta dalje u tekstu. Početkom pedesetih godina prošlog stoljeća u Americi je nastalo

udruženje koje je preraslo u današnji „American Association for Laboratory Animal Science“ (AALAS).

1978 je u Europi osnovana „Federation of European Laboratory Animal Science Association“ (FELASA),

koja je kroz godine narasla na 18 sastavnih organizacija, koje predstavljaju 24 zemlje. U Hrvatskoj je

1981. Godine, osnovano Hrvatsko udruženje za laboratorijske životinje ili „Croatian Laboratory Animal

Science Association“ (CROLASA), koja je 2004. postala pridružena članica europske FELASE. Sve

razvijenije zemlje imaju udruženja koja se bave dobrobiti i brizi životinja koje se koriste u pokusima.

Veliki broj ovih udruženja uz to što se brine da osigura visoki standard u radu sa laboratorijskim

životinjama, brigu i njegu, te humani i etički pristup korištenju životinja, organizira i različite razine

edukacije za znanstvenike i tehničko osoblje koje radi sa životinjama.

Page 13: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

13

Zakonski okvir tečaja za rad sa laboratorijskim životinjama

Hrvatski sabor je (Na temelju članka 88. Ustava Republike Hrvatske) na sjednici 1. prosinca 2006. donio

ODLUKU O PROGLAŠENJU ZAKONA O ZAŠTITI ŽIVOTINJA. Prema članku 32. ovog zakona pokuse na

životinjama, postupke pri proizvodnji bioloških pripravakai kirurške zahvate na životinjama mogu

obavljati veterinari, liječnici, farmaceuti, medicinski biokemičari, stomatolozi, agronomi stočari ili

biolozi, ako imaju položen ispit za rad sa životinjama.

Prema pravilniku Ministarstva poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja „O ZAŠTITI ŽIVOTINJA KOJE SE

KORISTE U POKUSIMA ILI U DRUGE ZNANSTVENE SVRHE“, (NN 47/11, 26.04.2011., izdan na temelju

članka 20. stavka 3., članka 22. stavka 5. i članka 32. stavka 4. Zakona o zaštiti životinja (»Narodne

novine«, broj 135/06)), u dodatku III., koji se odnosi na „Program osposobljavanja osoba koje rade s

pokusnim životinjama i životinjama za proizvodnju bioloških pripravaka“, predlažu teme koje mora

poznavati osoba koja radi sa pokusnim životinjama. Prema tom programu postoje 4 razine

osposobljavanja:

1. Osposobljavanje osoba koje se brinu o životinjama (u objektima za uzgoj životinja, u objektima

za opskrbu životinjama ukoliko u njima životinje borave, u pravnim osobama za provođenje

pokusa na životinjama te pravnim ili fizičkim osobama za proizvodnju bioloških pripravaka.

Minimalna satnica predviđena za ovo osposobljavanje je 30 sati.

2. Osposobljavanje osoba koje provode pokuse na životinjama te odgovorne osobe kao i voditelja

nastambi za životinje i njihovih zamjenika. Minimalna satnica predviđena za ovo

osposobljavanje je 60 sati.

3. Osposobljavanje voditelja pokusa i njegova zamjenika. Minimalna satnica predviđena za ovo

osposobljavanje je 60 sati.

4. Osposobljavanje osobe odgovorne za zaštitu životinja odnosno doktora veterinarske medicine

odgovornog za zaštitu životinja. Minimalna satnica predviđena za ovo osposobljavanje je 60

sati.

Ova podjela odgovara organizaciji osposobljavanja koju je ustanovila FELASA, koja također sadrži 4

slične kategorije, obilježene sa „A“, „B“, „C“ i „D“.

Kriteriji MPRRR-a za kategoriju 2:

Prema MPRRR, osobe kategorije 2 moraju biti osposobljene i upoznate najmanje sa slijedećim (sve iz

stupnja 1 i dodatna područja)

Prvi stupanj

a) etika i propisi vezani za smještaj i njegu životinja koje se koriste u pokusima ili za proizvodnju

bioloških pripravaka;

b) laboratorijske i pokusne životinje: vrste, životni ciklus, ponašanje i reprodukcijske značajke,

osiguranje okoliša primjerenog svakoj vrsti i kategoriji životinja, način usmrćivanja pojedinih

vrsta životinja, gospodarenje životinjama te uzgoj i držanje potrebnog broja životinja;

c) osnove bolesti laboratorijskih i pokusnih životinja;

d) prepoznavanje stresa laboratorijskih i pokusnih životinja;

e) prijevoz životinja.

Page 14: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

14

Dodatno za 2. stupanj:

a) etika i propisi s područja zaštite životinja vezani za provođenje pokusa na životinjama;

b) pokusne metode;

c) značenje sustava smještaja i držanja životinja kao i lokalnog okoliša za sam pokus;

mikrobiološki status životinja; anatomija pokusnih životinja; anestezija, analgezija i drugi

postupci za smanjivanje/uklanjanje boli i patnje životinja; upotreba primjernih tehnika i

kirurških postupaka.

Kriteriji FELASA-e za kategoriju „B“

Prema: Report of the Federation of European Laboratory Animal Science Associations Working Group

on Education of Persons Carrying out Animal Experiments (Category B) accepted by the FELASABoard

of Management. © Laboratory Animals Ltd. Laboratory Animals (2000) 34, 229-235. FELASA Working

Group on Education of Persons Carrying out Animal Experiments

Dužnosti osobe osposobljene za B kategoriju:

a) Da je svjestan/na europskih i nacionalnih zakona i preporuka u vezi provođenja

eksperimentalnih i/ili drugih znanstvenih procedura na životinjama.

b) Da je svjestan/na i da poštuje društvenu etiku u vezi sa istraživanjima na životinjama

c) Da razumije i poštuje generalna pravila životinjskih objekata (jedinica, laboratorija), gdje se

obavljaju procedure.

d) Da razumije teoretsku podlogu zadataka koje se od nje/njega očekuju, na način da paze na

dobrobit životinja i osiguraju relevantne znanstvene rezultate.

e) Da bude kompetentan u rukovanju životinjama i drugim tehnikama koje treba izvršiti

f) Da je u stanju prepoznati bol i neugodu i da procjeni stanje (dobrobit, welfare) životinja sa

kojima radi.

g) U slučaju da se desi neočekivani ishod tokom obavljanja procedura, da je svjestan/na potrebe i

da je sposoban/na na odgovarajuće akcije.

h) Da je dobro upoznat/a sa korištenjem laboratorijskih životinja i da je kompetentan/a da

poduzme odgovarajuće mjere da minimizira faktore koji bi mogli interferirati kad se procedura

obavlja.

Zaključak

Razvojem biomedicinskih i veterinarskih znanosti i pratećih tehnologija znanstvenici različitih profila

(biokemičari, anatomi, genetičari, imunolozi, mikrobiolozi, farmakolozi, stomatolozi i fiziolozi, itd.)

obavljaju in vitro pokuse, te pokušavaju shvatiti različite aspekte funkcioniranja stanice i njenih

dijelova. Takve pokuse treba ohrabrivati i što više saznanja akumulirati in vitro. Ipak, organizam je

puno više nego suma njegovih dijelova, te da bi se dobila cjelokupna slika, bar za sada, još ne možemo

izbjeći finalnu provjeru koncepta donešenih in vitro u in vivo uvjetima. Iz tih razloga, eksperimenti na

laboratorijskim životinjama će i dalje biti suštinska komponenta biomedicinskih istraživanja, a njihov

doprinos biti vitalan u daljnjem rastu biomedicinskih znanosti i veterine.

Laboratorijske životinje su se koristile u prošlosti, koriste se danas i unatoč nastojanjima da se njihovo

korištenje smanji na minimum, vjerojatno će se koristiti još dugo vremena. Stoga je primarni cilj

Page 15: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

15

znanosti o laboratorijskim životinjama osigurati kvalitetu eksperimentiranja na životinjama uz

maksimalnu brigu o njihovoj dobrobiti. Iako je izvjesno da još duže vrijeme nećemo moći izbjeći

upotrebu životinja u istraživanjima, bitno je osigurati da se životinje ne koriste u slučajevima kada

postoje efikasne i humanije alternative.

Adekvatno educiranje ljudi uključenih u ovakve pokuse nastavlja biti ključno u pružanju adekvatnog

pristupa eksperimentiranju na životinjama. Silabus koji će biti prezentiran sudionicima tečaja je

sastavljen kompilacijom zahtjeva kako MPRRR-a, tako i FELASA-e, te zadovoljava i Hrvatske i Europske

kriterije.

Literatura

Animal Experimentation: A Student Guide to Balancing the Issues. ANZCCART Australia,

http://www.adelaide.edu.au/ANZCCART/resources/AnimalExperimentation.pdf (2. veljače 2012.)

Franziska B. Grieder and John D. Strandberg (2003) „The Contribution of Laboratory Animals to

Medical Progress — Past, Present, and Future“, ur. Jann Hau and Gerald L. Van Hoosier, Jr. u

„Handbook of

Laboratory Animal Science“ Drugo izdanje. Volumen I. Essential Principles and Practices. CRC Press.

L.F.M. van Zutphen, B.C. Kruijt, K.J. Öbrink (1993) „Introduction“ ur. L.F.M. van Zutphen, V. Baumans,

A.C. Beynen u „Principles of Laboratory Animal Science. Elsevier str. 1-8.

Quimby, W. F. Twenty-five years of progress in laboratory animal science. (1994) Lab Animals. 28, 158-

171.

Šuman L. Uvod u znanost o laboratorijskim životinjama (2011). Udžbenik Sveučilišta u Rijeci. pp. 94.

http://lsuman.digitaledition.org/ (2. veljače 2012.)

Page 16: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

16

ZAŠTITA ŽIVOTINJA KOJE SE KORISTE U ZNANSTVENE SVRHE -

ZAKONODAVNE ODREDBE -

Mr. sc. Branka Buković Šošić, dr. vet. med..

Uvod

Nadležno tijelo u području zaštite životinja koje se koriste u znanstvene svrhe je Ministarstvo

poljoprivrede, Uprava za veterinarstvo koja je odgovorno za donošenje propisa i za provođenje

službenih kontrola.

Zakonodavni okvir je određen Zakonom o zaštiti životinja (NN, 135/06) (u daljnjem tekstu: Zakon) i

Pravilnikom o zaštiti životinja koje se koriste u pokusne i druge znanstvene svrhe (Narodne novine, broj

47/11) (u daljnjem tekstu: Pravilnik) kojim je pravna stečevina Europske unije na području zaštite

životinja za pokuse preuzeta u nacionalno zakonodavstvo.

Konvencija o zaštiti životinja kralježnjaka koje se koristi u pokusima i u druge znanstvene svrhe (ETS

123) koja je stupila na snagu 1991. godine pruža osnovu za razvoj propisa kojima se određuju uvjeti,

temeljeni na znanstvenim spoznajama, kojima se mora udovoljiti pri provođenju pokusa na

životinjama.

Dobrobit životinja prepoznata je i kao vrijednost Europske unije te je uključena u članak 13. Ugovora o

funkcioniranju Europske unije (Treaty on the Functioning of the European Union).

S obzirom da se stalnim razvojem znanosti razvijaju nova znanja i uspostavljaju novi postupci potrebno

je unaprijediti i dobrobit životinja koje se koriste u znanstvenim postupcima podizanjem minimalnih

standarda njihove zaštite. Republika Hrvatska preuzela je u nacionalno zakonodavstvo pravnu

stečevinu Europske unije u ovome području te provodi mjere za njihovu primjenu i kontrolu.

Propisima se određuju minimalni standardi kojima se mora udovoljiti pri uzgoju i držanju životinja

namijenjenih pokusima, opskrbi životinjama, provođenju pokusa na životinjama i proizvodnji bioloških

pripravaka.

I. Opće odredbe

Zakon o zaštiti životinja odnosi se na sve životinje kralježnjake. Kad je riječ o zaštićenim kralježnjacima,

na njih se pored odredaba ovoga Zakona odnose i propisi o zaštiti prirode.

U svrhu zaštite životinja koje se koristi u znanstvene ili obrazovne svrhe donijete su odredbe o:

a) zamjeni i smanjenju korištenja životinja u pokusima i poboljšanju uzgoja, smještaja, skrbi i

korištenju životinja u pokusima

b) podrijetlu, uzgoju, označavanju, skrbi i smještaju te usmrćivanju životinja

c) aktivnostima uzgajivača, dobavljača i korisnika te

d) procjeni i odobrenju pokusa/projekata koji uključuju korištenje životinja.

Page 17: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

17

Propisi o zaštiti životinja koje se koristi u znanstvene svrhe primjenjuju se kad se životinje koristi ili

namjerava koristiti u pokusima ili kad ih se uzgaja s namjenom da se njihovi organi ili tkiva koriste u

znanstvene svrhe.

Tko i u kojim slučajevima može provoditi pokuse na životinjama

Pokuse na životinjama mogu provoditi samo pravne osobe registrirane za provođenje pokusa i to u

svrhu:

a) istraživanja bolesti i tjelesnih tegoba ili prepoznavanja utjecaja fizioloških i patoloških stanja u

ljudi ili životinja

b) istraživanja i razvoja lijekova i ljekovitih pripravaka namijenjenih zaštiti zdravlja ljudi i životinja

c) ispitivanja u postupku registracije lijekova i ljekovitih pripravaka kako je propisano posebnim

propisima

d) ispitivanja proizvodnih i drugih osobina i načina njihova unapređivanja za životinje u

gospodarskom i drugom uzgoju životinja

e) istraživanja uzroka i posljedica ugrožavanja okoliša

f) ispitivanja neštetnosti materijala ili proizvoda po ljudsko ili životinjsko zdravlje

g) temeljnih i primijenjenih znanstvenih istraživanja i

h) obrazovanja.

Pokuse na životinjama odobrava se ukoliko:

a) se svrha istraživanja ne može postići drugim znanstvenim metodama, te ako se pretpostavljena

bol, patnja ili ozljede životinja mogu etički opravdati očekivanim rezultatima koji su od

značenja za ljude ili životinje odnosno znanost

b) su osigurani svi uvjeti za držanje životinja i

c) je osoblje osposobljeno za rad sa životinjama.

II. Obveze pravnih i fizičkih osoba

1. Pravne osobe za provođenje pokusa na životinjama (visokoškolske i znanstveno ¬istraživačke

ustanove te stručne pravne osobe) moraju:

a) biti registrirane pri Upravi za veterinarstvo

b) imenovati osobu odgovornu za zaštitu životinja, osposobljenu za osiguranje zaštite životinja te

koja skrbi za ispravan rad i korištenje opreme

c) imenovati osposobljenu osobu koja skrbi o životinjama i odgovorna je za ispravan rad i

korištenje opreme

d) za pokuse koristiti životinje koje potječu iz odobrenih uzgoja, osim ako se radi o divljim

životinjama iz prirode (iznimka od gornjeg pravila – po rješenju Uprave za veterinarstvo)

e) biti opremljene odgovarajućim uređajima i opremom prikladnom za vrste životinja koje koriste,

čija izvedba, izgradnja i funkcioniranje trebaju osigurati što je moguće učinkovitije provođenje

pokusa, s ciljem dobivanja pouzdanih rezultata uz korištenje najmanjeg potrebnog broja

životinja i najmanji stupanj boli, patnje, iscrpljenosti ili trajnog oštećenja

f) osigurati dovoljan broj osposobljenog osoblja

g) osigurati primjerenu veterinarsku skrb (savjete i liječenje)

h) voditi evidenciju o svim korištenim životinjama (podaci o broju i vrstama nabavljenih životinja,

organizaciji od koje su nabavljene i datum njihovog dolaska)

Page 18: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

18

i) evidenciju čuvati najmanje tri godine od zadnjeg unosa podataka te je dati na uvid na zahtjev

veterinarskog inspektora/službenog veterinara.

a) Uprava za veterinarstvo registrira pravne osobe s identifikacijskim brojem koji se upisuje u

evidenciju u obliku elektroničke baze pri Upravi za veterinarstvo.

2. Pravne/fizičke osobe koje koriste životinje za proizvodnju bioloških pripravaka moraju:

a) biti odobrene od Uprave za veterinarstvo

b) imenovati odgovornu osobu za zaštitu životinja

c) imenovati osobu koja skrbi o životinjama

d) koristiti životinje iz odobrenih uzgoja, osim ako se radi o divljim životinjama iz prirode (iznimka

od gornjeg pravila – po rješenju Uprave za veterinarstvo)

e) koristiti životinje s farmi registriranih po posebnim propisima iz područja veterinarstva

3. Pravne/fizičke osobe za uzgoj životinja namijenjenih pokusima:

a) moraju biti odobrene od Uprave za veterinarstvo

b) moraju imenovati odgovornu osobu za zaštitu životinja koja je odgovorna za skrb o životinjama

uključujući i pripremu odgovarajuće njege za one vrste životinja koje su u uzgoju

c) ne smiju uzgajati životinje na način da trpe bol, patnju i strah te ih namjerno ozljeđivati,

protivno pravilima struke odnosno najnovijim znanstvenim dostignućima

d) moraju voditi evidenciju o broju i vrstama uginulih životinja

e) navedenu evidenciju moraju čuvati najmanje tri godine od datuma posljednjeg unosa podataka

te je dati na uvid na zahtjev veterinarskog inspektora/službenog veterinara.

4. Pravne/fizičke osobe za opskrbu životinjama:

a) moraju biti odobrene od Uprave za veterinarstvo

b) moraju imenovati odgovornu osobu za zaštitu životinja koja je nadležna za brigu o životinjama

uključujući i pripremu odgovarajuće njege za one vrste životinja koje drže u svrhu opskrbe

c) mogu nabavljati životinje isključivo iz pravnih ili fizičkih osoba za uzgoj životinja ili iz drugih

pravnih ili fizičkih osoba za opskrbu životinjama osim ako životinje nisu uvezene ili uzete iz

divljine u skladu s odredbama Pravilnika

d) mogu nabavljati životinje za pokuse ili za proizvodnju bioloških pripravaka i sa farmi

registriranih po posebnim propisima iz područja veterinarstva

e) ne smiju uvoziti i prodavati životinje koje potječu iz uzgoja u kojima životinje trpe bol, patnju i

strah ili su namjerno izložene ozljeđivanju

f) moraju voditi evidenciju o broju i vrstama prodanih ili isporučenih životinja, datumima prodaje

ili isporuke, imenima i adresama primatelja i broju i vrstama uginulih životinja dok su boravile u

predmetnoj nastambi

g) moraju navedenu evidenciju čuvati najmanje tri godine od datuma posljednjeg unosa podataka

te je dati na uvid na zahtjev veterinarskog inspektora/službenog veterinara.

Uprava za veterinarstvo odobrava pravne/fizičke osobe iz točke 2., 3. i 4. s identifikacijskim brojem koji

se upisuje u evidenciju u obliku elektroničke baze pri Upravi za veterinarstvo.

Page 19: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

19

III. Odredbe za korištenje životinja

1. Vođenje upisnika

Uprava za veterinarstvo vodi u elektronskom obliku upisnik (evidenciju) pravnih osoba koje provode

pokuse, pravnih/fizičkih osoba za proizvodnju bioloških pripravaka te pravnih i fizičkih osoba koje

uzgajaju životinje namijenjene pokusima i/ili koje se bave opskrbom životinjama namijenjenim

pokusima.

Upisnik se nalazi na mrežnim stranicama Ministarstva: www.mps.hr.

2. Označavanje životinja

Zakonom je određeno da životinje koje se koriste za pokuse te za proizvodnju bioloških pripravaka

moraju biti označene.

Svaki pas, mačka i nečovjekoliki majmun u svakoj pravnoj/fizičkoj osobi za uzgoj životinja i/ili opskrbu

životinjama i/ili proizvodnju bioloških pripravaka kao i pravnoj osobi koja provodi pokuse na

životinjama mora biti označen jedinstvenom identifikacijskom oznakom prije odvajanja od majke.

Neoznačeni psi, mačke i nečovjekoliki majmuni primljeni prvi puta u neku od pravnih ili fizičkih osoba,

a nakon odvajanja od majke, moraju biti označeni što je moguće prije u skladu s posebnim propisima o

označavanju životinja.

Za pse, mačke i nečovjekolike majmune koji se, prije odvajanja od majke, premještaju iz jedne od

pravnih ili fizičkih osoba u drugu, i kada ih nije praktično unaprijed označiti, vodi se potpuna

dokumentirana evidencija (u kojoj su posebice specificirane identifikacijske oznake njihovih majki) koja

mora biti čuvana u pravnoj ili fizičkoj osobi u koju su premješteni, sve dok ne budu označeni.

Identifikacijske oznake i podaci o podrijetlu svakog psa, mačke ili nečovjekolikog majmuna unose se u

evidenciju svake pravne ili fizičke osobe u kojoj borave.

3. Osposobljavanje za rad sa životinjama

Dobrobit životinja koje se koriste u pokusima uvelike ovisi o kvaliteti i profesionalnoj osposobljenosti

osoblja koje nadzire pokuse kao i osoblja koje provodi pokuse ili nadzire osoblje koje vodi brigu o

životinjama na dnevnoj osnovi te se, stoga, zahtijeva da osobe uključene u provođenje pokusa na

životinjama, uključujući potrebne kontrole životinja, moraju biti osposobljene za navedene poslove i

to:

a) osobe koja se brinu za životinje u objektima za uzgoj životinja te u objektima za opskrbu

životinjama ukoliko u njima životinje borave kao i u objektima za provođenje pokusa na

životinjama te objektima za proizvodnju bioloških pripravaka

b) voditelji nastambi za životinje i njihovi zamjenici

c) osobe koje provode pokuse na životinjama

d) voditelj pokusa i njegov zamjenik

e) odgovorna osoba i veterinar odgovoran za zaštitu životinja ili osoba odgovorna za zaštitu

životinja (u skladu s člankom 32. stavkom 3. Zakona).

Page 20: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

20

Tko može provoditi osposobljavanje

Osposobljavanje mogu provoditi pravne ili fizičke osobe registrirane pri Upravi za veterinarstvo ukoliko

dokažu da:

a) posjeduju dovoljno stručnog osoblja

b) su osigurali program za provođenje osposobljavanja (suglasnost na program daje Uprava za

veterinarstvo) i

c) upisani u evidenciju u obliku elektroničke baze koju vodi Uprava za veterinarstvo.

Obveze pravnih ili fizičkih osoba koje provode osposobljavanje:

a) po završenom osposobljavanju organizator je dužan sudionicima izdati potvrdu o

osposobljenosti

b) o izdanim potvrdama organizator je dužan voditi evidenciju

c) evidencija se vodi u obliku elektroničke baze koju vodi Uprava za veterinarstvo.

Priznaju se tečajevi za osposobljavanje koji su provedeni od strane akreditirane organizacije s

poslovnim nastanom u jednoj od država članica Europske unije u kojoj je osposobljavanje obavljeno te

se isto upisuje u evidenciju koja se vodi u obliku elektroničke baze koju vodi Uprava za veterinarstvo.

4. Zabranjeni zahvati na životinjama

U skladu s odredbama Zakona, zabranjeno je:

a) koristiti tehničke uređaje, pomoćna sredstva ili naprave kojima se u obliku kazne utječe na

ponašanje životinja, uključujući bodljikave ogrlice ili sredstva za dresuru koja uključuju

upotrebu električne struje ili kemijskih tvari, osim pri dresuri službenih pasa

b) koristiti nedopuštene stimulanse i tvari u svrhu bržeg rasta i prirasta životinja

c) prisiljavati životinje na ponašanje koje kod njih izaziva bol, patnju, ozljede ili strah

d) izlagati životinje nepovoljnim temperaturama i vremenskim uvjetima, protivno prihvaćenim

zoohigijenskim standardima za pojedinu vrstu ili nedostatku kisika, čime se kod životinja

uzrokuje bol, patnja, ozljede ili strah

e) davati životinjama hranu ili tvari čije uzimanje uzrokuje bol, patnju, ozljede, strah ili smrt

f) prisiljavati životinje na uzimanje određene hrane ili tvari, ukoliko to ne odredi veterinar u

veterinarsko-zdravstvene svrhe ili ako nije znanstveno opravdano

g) zanemarivati životinje s obzirom na njihovo zdravlje, smještaj, ishranu i njegu

h) živim životinjama odsijecati osjetljive dijelove tijela, protiv¬no odredbama Zakona

i) hraniti životinje drugim živim životinjama, osim ako je to neizbježno

j) ograničavati kretanje životinjama na način koji im uzrokuje bol, patnju, ozljede ili strah,

protivno odredbama Zakona.

5. Dopušteni zahvati na životinjama

Člankom 8. Zakona zabranjena je djelomična ili potpuna amputacija pojedinih osjetljivih dijelova

životinjskog tijela, osim zbog provođenja pokusa na životinjama, a u tom slučaju se zahvati kod kojih bi

životinja mogla patiti ili trpjeti jaku bol smiju izvoditi samo nakon analgezije odnosno anestezije i uz

postoperativnu njegu.

Page 21: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

21

Prilikom provođenja zahvata kod kojih bi životinja mogla patiti ili trpjeti jaku bol mora se koristiti opća

ili lokalna anestezija, osim ako je isto neprimjereno te analgezija ili druga odgovarajuća metoda kojom

se bol, patnja i stres svode na minimum.

Postupci koji uključuju ozbiljne ozljede koje mogu prouzročiti tešku bol ne smiju se provoditi bez

anestezije.

Pri donošenju odluke o primjerenosti korištenja anestezije, potrebno je uzeti u obzir sljedeće:

- uzrokuje li anestezija veću traumu životinji nego sam postupak i

- smatra li se da anestezija nije kompatibilna sa svrhom postupka.

Životinjama se ne smiju davati tvari koje bi uklonile i smanjile njihovu sposobnost pokazivanja boli bez

odgovarajuće doze anestetika ili analgetika.

U ovakvim slučajevima, potrebno je dostaviti znanstveno opravdanje, popraćeno pojedinostima o

režimu davanja anestetika ili analgetika.

Životinji koja može osjećati bol kad anestezija popusti treba osigurati preventivnu i postoperativnu

analgeziju ili druge odgovarajuće metode za ublažavanje boli pod uvjetom da je to kompatibilno s

namjenom pokusa.

Nakon postizanja svrhe pokusa potrebno je poduzeti odgovarajuće mjere da se patnja životinje svede

na minimum.

Anestezija se ne provodi:

a) kada bi opasnost od anestezije bila nerazmjerna dobrobiti proizašle iz iste

b) pri označavanju životinja, osim kada je to potrebno zbog sigurnosti osobe koja provodi

označavanje

c) pri pojedinim dijagnostičkim i terapijskim postupcima u skladu s pravilima struke

d) pri uzrokovanju veće boli anestezijom nego samim zahvatom i

e) ako je kontraindicirana pokusnim rezultatima koji se pokusom žele utvrditi.

Ukoliko anestezija nije moguća, koriste se analgezija ili druge prikladne metode kako bi se osiguralo da

bol, iscrpljenost, patnja ili ozljeda budu svedeni na najmanju mjeru i da životinja nije podvrgnuta jakoj

boli, iscrpljenosti ili patnji.

Promatrajući s etičkog stajališta, mora postojati gornja razina boli, patnje i stresa koja u znanstvenim

postupcima u kojima se koriste životinje ne smije biti prekoračena. U tom smislu provođenje pokusa

koji rezultiraju teškom boli, patnjom i stresom za koje je vjerojatno da će dugo potrajati i ne mogu se

ublažiti, neće biti dopušteno.

6. Postupanje sa životinjom koja trpi stalnu bol koju se ne može otkloniti

Pod uvjetom da je ta aktivnost u skladu s ciljem pokusa, životinji koja trpi značajnu bol nakon što je

popustila anestezija, treba pravodobno dati sredstva protiv boli ili, ukoliko to nije moguće, životinju

treba odmah usmrtiti na način koji joj neće uzrokovati dodatnu patnju.

Korištenje neodgovarajućih metoda usmrćivanja životinja može prouzročiti jaku bol, stres i patnju

životinje. Stručnost osobe koja provodi taj postupak također je važna. Životinje, stoga, mogu usmrćivati

samo stručne osobe koristeći metodu koja je primjerena vrsti.

Page 22: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

22

7. Prijava pokusa/korištenja životinja za proizvodnju bioloških pripravaka

Za svaki planirani pokus na životinjama, za korištenje životinja u obrazovne svrhe te za korištenje

životinja za proizvodnju bioloških pripravaka mora se prethodno podnijeti zahtjev Upravi za

veterinarstvo za odobrenje provođenja pokusa odnosno proizvodnju bioloških pripravaka.

Uz gornji zahtjev mora se priložiti obrazloženje o etičkoj i znanstvenoj opravdanosti obavljanja pokusa

izdano od nacionalnog Etičkog povjerenstva.

Rješenje o odobravanju provođenja pokusa odnosno korištenja životinja za proizvodnju bioloških

pripravaka donosi Uprava za veterinarstvo uz mišljenje Etičkog povjerenstva iz članka 34. Zakona.

8. Odobrenje pokusa

Pokusi se ne mogu provoditi bez prethodnog odobrenja nadležnog tijela te se moraju provoditi u

skladu s odobrenjem.

8.1. Zahtjev za provođenje pokusa/proizvodnju bioloških pripravaka sadrži sljedeće podatke:

a) naziv i adresu pravne ili fizičke osobe koja podnosi zahtjev za odobrenje pokusa na životinjama

b) naziv i adresu pravne ili fizičke osobe/mjesta gdje se pokus provodi

c) naziv i svrhu planiranog pokusa

d) vrstu, pasminu i broj životinja koje će se koristiti u pokusu

e) ime, prezime te stručnu spremu voditelja pokusa i njegovog zamjenika

f) ime, prezime te stručnu spremu voditelja nastambi za pokusne životinje i njegovog zamjenika

g) ime i prezime odgovorne osobe (članak 32. Zakona)

h) trajanje pokusa, odnosno razdoblje za koje se traži odobrenje

i) znanstvenu i etičku opravdanost pokusa

j) ime i prezime osobe odgovorne za zaštitu životinja

k) hoće li životinja trpjeti jaku i dugotrajnu bol te obrazloženje za provođenje takvog pokusa

l) ukoliko je anestezija nekompatibilna s ciljem pokusa obrazložiti razloge za provođenje takvog

pokusa

m) o postupanju sa životinjama po završetku pokusa i

n) o razlogu usmrćivanja životinje te obrazloženje odabrane metode usmrćivanja.

Ukoliko se planira životinju podvrgnuti pokusu u kojem će ili može osjetiti jaku bol koja će trajati dulje

vrijeme, takav se pokus mora posebno prijaviti i obrazložiti razloge za njegovo provođenje. Takav se

pokus neće odobriti ako se procijeni da se istim ne osiguravaju rezultati bitni za potrebe ljudi ili

životinja.

8.2. Trajanje odobrenja za provođenje pokusa određuje se:

- u istraživačke svrhe - za kalendarsku godinu

- u obrazovne svrhe - za akademsku godinu (ne može se produljiti)

- projekata odobrenih od tijela državne uprave nadležnog za znanost odobrava - za trajanja

projekta (može se produljiti).

8.3. Produljenje pokusa

Produljenje pokusa odobrava se rješenjem koje izdaje Uprava za veterinarstvo u slučaju trajanja

pokusa dulje od odobrenog, a uz mišljenje Etičkog povjerenstva.

Page 23: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

23

8.4. Vođenje zapisnika o provođenju pokusa/proizvodnji biološkog pripravka

O tijeku pokusa na životinjama te o postupcima proizvodnje bioloških pripravaka moraju se voditi

zapisnici.

Zapisnike moraju potpisati osobe iz članka 32. stavaka 1. do 3. Zakona i voditelj pokusa, odnosno

voditelj proizvodnje bioloških pripravaka.

Zapisnici se moraju čuvati tri godine, a na zahtjev nadležnog tijela moraju se dati na uvid.

9. Izvješćivanje

Zakonom je određeno da se o provedenim pokusima na životinjama i provedenim postupcima pri

proizvodnji bioloških pripravaka te o broju upotrijebljenih životinja moraju voditi evidencije koje se

jednom godišnje šalju Upravi za veterinarstvo.

Pravilnik pobliže određuje da:

a) pravne osobe koje provode pokuse na životinjama kao i pravne/fizičke osobe koje koriste

životinje za proizvodnju bioloških pripravaka moraju jednom godišnje, do kraja siječnja tekuće

godine, dostaviti Upravi za veterinarstvo podatke o korištenju životinja u pokusima na

propisanim obrascima

b) se podaci o korištenju životinja u pokusima isporučuju u Središnji informacijski sustav Uprave

za veterinarstvo (SVIS)

c) Uprava za veterinarstvo na temelju dostavljenih podataka sastavlja izvješće i jednom godišnje

objavljuje statističke podatke na mrežnim stranicama Ministarstva

d) su komercijalno osjetljivi podaci dostavljeni u skladu sa zahtjevima Pravilnika povjerljive naravi

i nisu dostupni javnosti.

10. Načelo zamjene, smanjenja i poboljšanja

Pokus se ne smije provoditi ukoliko je prihvatljiva i na raspolaganju druga znanstveno zadovoljavajuća

metoda za dobivanje traženog rezultata koja ne zahtijeva korištenje životinja.

Kad treba provesti pokus, potrebno je pažljivo razmotriti izbor vrsta životinja te obrazložiti razloge za

korištenje dotične vrste životinja. Prilikom odabira pokusa potrebno je izabrati onaj u kojem se koristi

najprikladnija vrsta životinja, minimalni broj životinja, životinje s najnižim stupnjem neurofiziološke

osjetljivosti, koji uzrokuje najmanje boli, patnje, iscrpljenosti ili trajnih ozljeda i za kojeg je

najvjerojatnije da će pružiti zadovoljavajuće rezultate.

10.1. Alternativne tehnike

Ukoliko su na raspolaganju, umjesto pokusa trebaj koristiti prikladne alternativne tehnike koje mogu

dati iste podatke kao što su oni dobiveni korištenjem životinja u pokusima, ali koje uključuju manje

životinja ili manje bolne postupke.

Kako postoji velika zabrinutost javnosti u pogledu korištenja životinja u pokusima uvijek je potrebno

životinje tretirati kao osjećajna bića i njihovo korištenje u postupcima treba ograničiti na područja koja

mogu koristiti zdravlju ljudi, životinja i okolišu. Korištenje životinja u znanstvene ili obrazovne svrhe

treba stoga uzeti u obzir samo kad ne postoji ili nije dostupna alternativa koja ne uključuje životinje.

Iako je poželjno zamijeniti korištenje živih životinja u postupcima drugima metodama koje ne uključuju

žive životinje, korištenje živih životinja i dalje je potrebno zbog zaštite zdravlja ljudi, životinja i okoliša.

Page 24: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

24

Međutim postojeće zakonodavstvo ima za cilj potpunu zamjenu postupaka na živim životinjama u

znanstvene i obrazovne svrhe kad to znanstveno postane moguće učiniti.

Skrb i korištenje živih životinja u znanstvene svrhe uređeni su na međunarodno uspostavljenim

načelima zamjene, smanjenja i poboljšanja. Pri odabiru metoda, načela zamjene, smanjenja i

poboljšanja (3R) trebaju se provoditi uz strogo poštivanje hijerarhije zahtjeva o korištenju alternativnih

metoda. Kad je zakonodavstvom određeno da se u pojedinim slučajevima ne mogu koristiti

alternativne metode, broj životinja je moguće smanjiti korištenjem drugih metoda i provođenjem

strategija ispitivanja, kao što je uporaba metoda in vitro i drugih metoda putem kojih bi se smanjila i

poboljšala uporaba životinja.

11. Evidencija o životinjama

Pravne/fizičke osobe koje uzgajaju životinje, opskrbljuju životinjama i provode pokuse vode evidenciju

barem o sljedećem:

a) broju i životinjskim vrstama koje su uzgojene, dobivene, dobavljene, korištene u pokusima,

puštene ili ponovno udomljene

b) podrijetlu životinja uključujući podatak jesu li uzgojene za korištenje u postupcima

c) datumima kad su životinje dobivene, dostavljene, puštene ili ponovno udomljene

d) od koga su životinje dobivene

e) ime i adresi primatelja životinja

f) broju i životinjskim vrstama koje su uginule ili su bile usmrćene u svakoj ustanovi. Za uginule

životinje navodi se uzrok smrti ako je poznat.

g) u slučaju pravnih osoba koje provode pokuse, o pokusima u kojima se koriste životinje.

11.1. Informacije o psima, mačkama i primatima osim čovjeka

1. Svi uzgajivači, dobavljači i korisnici moraju voditi sljedeće podatke o svakom psu, mački i primatu

osim čovjeka:

a) identifikacija životinje

b) mjesto i datum rođenja kad je dostupno

c) je li životinja uzgajana za korištenje u postupcima i

d) u slučaju primata osim čovjeka, je li potomak primata uzgojenih u zatočeništvu.

2. Svaki pas, mačka i primat osim čovjeka mora imati osobni karton koji prati životinju dokle se

koristi za potrebe ovoga propisa.

3. Zahtijevane informacije potrebno je čuvati najmanje tri godine nakon smrti ili udomljavanja

životinje i bit će dostupne nadležnom tijelu na zahtjev.

U slučaju ponovnog udomljavanja, relevantne veterinarske informacije o skrbi i socijalni podaci iz

pojedinačnog kartona moraju pratiti životinju.

12. Životinje uzgojene za korištenje u pokusima

Postoji potreba da se neke vrste kralježnjaka koji se koriste u pokusima uzgoje posebno za tu namjenu

tako da je njihova genetska, biološka i bihevioristička pozadina dobro poznata osobama koje izvode

postupke. Takvo znanje ujedno povećava i znanstvenu kvalitetu i pouzdanost rezultata i smanjuje

Page 25: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

25

promjenjivost, a u konačnici rezultira manjim brojem pokusa i životinja u pokusima. Nadalje, zbog

razloga dobrobiti životinja i njihovog očuvanja potrebno je ograničiti korištenje životinja uzetih iz

divljine u postupcima na slučajeve kad cilj postupaka nije moguće postići koristeći životinje uzgojene

posebno za korištenje u postupcima.

Navedene vrste životinja moraju biti uzgojene životinje (osim u slučajevima kada Uprava za

veterinarstvo odobri opće ili posebno izuzeće) i zo:

- miš (Mus musculus)

- štakor (Rattus norvegicus)

- zamorčić (Cavia porcellus)

- zlatni hrčak (Mesocricetus auratus)

- kunić (Oryctolagus cuniculus)

- nečovjekoliki majmuni

- pas (Canis familiaris)

- mačka (Felis catus)

- prepelica (Coturnix coturnix).

12.1. Korištenje primata

S obzirom na sadašnje stanje znanstvenih spoznaja, korištenje primata u znanstvenim postupcima još

uvijek je potrebno u biomedicinskom istraživanju. Zbog njihove genetske sličnosti s čovjekom i zbog

njihovih visoko razvijenih socijalnih vještina, korištenje primata u znanstvenim postupcima predstavlja

specifične etičke i praktične probleme u smislu zadovoljavanja njihovih behavioristiĉkih, okolišnih i

socijalnih potreba u laboratorijskom okruženju. Nadalje, javnost pokazuje veliku zabrinutost za

korištenje primata. Stoga korištenje primata treba biti dozvoljeno samo na onim biomedicinskim

područjima bitnim za korist ljudi za koja još nisu dostupne druge alternativne metode zamjene. S

obzirom na navedeno, primate bi se trebalo koristiti samo za temeljna istraživanja, za očuvanje dotične

vrste primata ili kada se postupci, uključujući ksenotransplantaciju, provode u vezi s potencijalno

životno ugrožavajućim stanjima kod ljudi ili u vezi sa slučajevima koji imaju značajan utjecaj na

svakodnevno funkcioniranje osobe tj. invalidna stanja.

Korištenje čovjekolikih majmuna kao čovjeku najbliže vrste s najbolje razvijenim socijalnim i

behaviorističkim vještinama može biti dopušteno samo za namjene istraživanja čiji je cilj očuvanje tih

vrsta i kad je potrebno intervenirati zbog po život ugroženog stanja ljudi ili stanja opće slabosti, a

ciljeve postupka ne bi bilo moguće postići nijednom drugom životinjskom vrstom ili alternativnom

metodom. U Europskoj uniji korištenje primata je pod nadzorom Europske komisije tako da svaka

zemlja članica dostavlja Komisiji potrebne informaciji o potrebi korištenja primata o čemu Komisija

donosi odluku.

12.2. Pokusi na divljim životinjama

Pokusi na divljim životinjama ne smiju se provoditi osim ako pokusi na drugim vrstama životinja ne bi

zadovoljili ciljeve pokusa.

Zabranjeno je obavljati pokuse na ugroženim životinjskim vrstama navedenim u Dodatku I. Pravilnika o

prekograničnom prometu i trgovini zaštićenim vrstama (»Narodne novine«, broj 72/09 i 143/10), osim

ako su ciljevi pokusa u skladu s prethodno navedenim Pravilnikom i odnose na:

- istraživanje u svrhu očuvanja dotičnih vrsta ili

Page 26: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

26

- bitne biomedicinske svrhe, kada je dokazano da je vrsta na koju se isto odnosi jedina

odgovarajuća za tu namjenu.

Potrebno je osigurati da korištenje životinja u postupcima ne predstavlja opasnost za biološku

raznovrsnost. Stoga je potrebno ograničiti na strogi minimum korištenje ugroženih vrsta.

Hvatanje primata iz divljine predstavlja visok stres za dotične životinje i nosi povećani rizik ozljeda i

patnje tijekom hvatanja i prijevoza. Stoga bi za potrebe uzgoja životinja trebalo prestati hvatati

životinje iz divljine tako da je moguće korištenje samo životinja koje su potomci životinja uzgojenih u

zatočeništvu, ili životinje iz samoodrživih uzgojnih kolonija.

12.3. Pokusi na napuštenim i izgubljenim životinjama

Napuštene domaće životinje i napuštene pse i mačke ne smije se koristiti u pokusima. Izuzeće od

ovoga zahtjeva ne smije se primjenjivati na napuštene pse i mačke.

S obzirom da pozadina napuštenih i izgubljenih životinja nije poznata i s obzirom da hvatanje i smještaj

u objekte povećava stres takvih životinja, one se ne smiju koristiti u postupcima.

13. Završetak pokusa

Smatra se da je postupak okončan kad nema više daljnjih opažanja za navedeni postupak ili kad se u

slučaju novih genetski izmijenjenih linija životinja kod njihovih potomaka ne primjećuje i ne očekuje da

će osjećati bol, patnju, stres ili trajno oštećenje koje je jednako ili veće od onog koje prouzroči ubod

igle.

Na kraju postupka odluku o održanju životinje na životu donosi veterinar ili druga kompetentna osoba.

Životinje je potrebno usmrtiti kad je vjerojatno da ostaju u stanju u kojem osjećaju umjerenu ili tešku

bol, patnju, stres ili teško oštećenje.

Kad se životinja ostavi na životu pružit će joj se skrb i smještaj koji odgovaraju njenom zdravstvenom

stanju.

13.1. Postupanje sa životinjama po završetku pokusa

Po završetku pokusa, donosi se odluka o tome hoće li životinja biti usmrćena na temelju dobrobiti

životinja i mogućeg rizika za okoliš. Životinju je potrebno usmrtiti ukoliko postoji i najmanja

mogućnost, iako je u svakom drugom pogledu vraćena u normalno zdravstveno stanje, da će trpjeti

trajne boli i iscrpljenost ili ako ne mogu biti ispunjeni uvjeti za njeno držanje.

Odluku o tome donosi voditelj pokusa ili voditelj nastambe u kojoj se provode pokusi, a ako on nije

doktor veterinarske medicine (u daljnjem tekstu: veterinar), tada uz mišljenje istoga.

Ako po završetku pokusa životinja neće biti usmrćena, mora joj biti osigurana njega primjerena

njezinom zdravstvenom stanju kao i nadzor veterinara te osigurani odgovarajući uvjeti za daljnje

držanje.

U slučaju da se na kraju pokusa životinju usmrćuje ili joj se ne mogu osigurati uvjeti za daljnje držanje,

treba je usmrtiti što je prije moguće.

Životinju se može pustiti na slobodu pod uvjetom da je provedena najveća moguća zaštita njezine

dobrobiti te ukoliko njezino zdravstveno stanje dopušta takav postupak i ako ne postoji opasnost za

javno zdravlje i okoliš.

Page 27: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

27

U nekim slučajevima životinje trebaju biti vraćene u odgovarajuće stanište ili uzgoj ili životinjama kao

što su psi i mačke treba dopustiti ponovno udomljavanje u obiteljima jer postoji visoka razina

zabrinutosti javnosti za sudbinu takvih životinja. U slučaju ponovnog udomljavanja, bitno je da

uzgajivač, dobavljač ili korisnik ima program koji omogućava odgovarajuću socijalizaciju tih životinjama

kako bi se osiguralo uspješno ponovno udomljavanje kao i izbjegao nepotreban stres životinja i

zajamčila javna sigurnost.

14. Usmrćivanje životinja

a) Usmrćivanje životinja može se provesti, uz korištenje sredstava posebne namjene i propisanih

postupaka, ako:

b) bi liječenje životinja bilo dugotrajno i povezano s patnjama, a ishod liječenja neizvjestan

c) je životinja dostigla visoku starost te joj otkazuju osnovne životne funkcije

d) životinja boluje od neizlječive bolesti

e) je takav postupak neophodan zbog provođenja mjera za kontrolu bolesti u skladu s propisima

iz područja veterinarstva, posebno onih koje mogu ugroziti ljude ili nanijeti velike gospodarske

štete

f) se provodi u svrhu obavljanja pokusa na životinjama te u svrhu proizvodnje bioloških

pripravaka odnosno nakon obavljenog pokusa ili korištenja životinje za proizvodnju bioloških

pripravaka.

Životinje može usmrtiti samo veterinar ili stručno osposobljen veterinarski tehničar pod nadzorom

veterinara, osim u slučajevima:

a) usmrćivanja životinja koje se uzgajaju i drže u svrhu proizvodnje

b) usmrćivanja životinja u svrhu obrazovanja, provođenja pokusa te u svrhu proizvodnje bioloških

pripravaka.

15. Ponovno korištenje životinja u pokusima

Životinju se ponovno smije upotrijebiti u pokusu samo na način određen Pravilnikom o zaštiti životinja

koje se koriste u pokusima ili u druge znanstvene svrhe.

Životinju se u pokusima koji uzrokuju jaku bol, iscrpljenost ili istovjetnu patnju smije koristiti samo

jednom.

Životinja koja je već korištena u jednom ili više pokusa, može ponovno koristiti u novom postupku

samo ako su ispunjeni sljedeći uvjeti:

a) stvarna težina prijašnjeg pokusa je bila „blaga“ ili „umjerena“

b) pokazalo se da je opće zdravstveno stanje životinje i dobrog osjećanja u potpunosti vraćeno

c) daljnji postupak je klasificiran kao „blag“, „umjeren“ ili „nepovratan“; i

d) to je u skladu s veterinarskim mišljenjem koje uzima u obzir životno iskustvo životinje.

Page 28: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

28

III. Provođenje pokusa

1. Uvjeti koje se mora osigurati životinjama koje se koriste u pokusima i/ili za proizvodnju bioloških

pripravaka

U vezi sa skrbi i smještajem životinja mora se osigurati da:

a) sve životinje imaju osiguran smještaj, okoliš, hranu, vodu i skrb koji su primjereni njihovom

zdravlju i dobrom osjećanju

b) su sva ograničenja opsega u kojem mogu životinje zadovoljiti svoje fiziološke i etološke potrebe

smanjena na minimum

c) se dnevno provjeravaju uvjeti okoliša, u kojima se životinje uzgajaju, drže ili koriste

d) se osigura donošenje mjera čiji cilj je uklanjanje svakog nedostatka ili nepotrebne boli, patnje,

stresa ili trajnog oštećenja koji se otkriju i

e) se životinje prevoze u odgovarajućim uvjetima.

Svako ograničenje zadovoljenja fizioloških i etoloških potreba pokusnih životinja mora biti svedeno na

najmanju moguću mjeru.

Uvjeti okoliša u kojima se životinje uzgajaju, drže ili koriste, moraju se svakodnevno provjeravati.

Pokusi se mogu provoditi i izvan pravnih osoba koje provode pokuse na životinjama po odobrenju

Uprave za veterinarstvo.

2. Uloga voditelja pokusa/voditelja nastambe

Voditelj pokusa i voditelj nastambi za pokusne životinje moraju:

a) redovito pratiti zdravstveno stanje i dobrobit pokusnih životinja kako bi se spriječila bol,

patnja, iscrpljenost ili trajna ozljeda

b) odrediti i osigurati provođenje postupaka u svrhu što žurnijeg otklanjanja bilo kojega

otkrivenog nedostatka ili patnje pokusnih životinja

c) po završetku pokusa donijeti odluku o tome hoće li životinja biti usmrćena.

3. Provođenje pokusa

3.1. Pokus provodi voditelj pokusa ili se provodi pod njegovim izravnim nadzorom.

3.2. Prilikom odabira pokusa potrebno je izabrati onaj u kojem se koristi:

a) najprikladnija vrsta životinja

b) najmanji broj životinja

c) životinje s najnižim stupnjem neurofiziološke osjetljivosti, koji uzrokuje najmanje boli, patnje,

iscrpljenosti ili trajnih ozljeda i za kojeg je najvjerojatnije da će pružiti zadovoljavajuće

rezultate.

3.3. Pri provođenju pokusa potrebno je:

a) pažljivo razmotriti izbor vrsta životinja

b) obrazložiti razloge za korištenje dotične vrste životinja

c) oblikovati pokus tako da se izbjegne iscrpljenost, nepotrebna bol i patnja pokusnih životinja.

Page 29: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

29

3.4. Pokus se ne provodi:

a) ukoliko je prihvatljiva i na raspolaganju druga znanstveno zadovoljavajuća metoda za dobivanje

traženog rezultata koja ne zahtijeva korištenje životinja

b) na divljim životinjama osim ako pokusi na drugim vrstama životinja ne bi zadovoljili ciljeve

pokusa.

IV. Obveze nadležnog tijela

1. Nadležno tijelo:

a. registrira pravne osobe za provođenje pokusa na životinjama

b. odobrava pravne/fizičke osobe za proizvodnju bioloških pripravaka

c. odobrava pravne/fizičke osobe za uzgoj životinja

d. odobrava pravne/fizičke osobe za opskrbu životinjama

e. vodi upisnik registriranih pravnih osoba

f. vodi upisnik odobrenih pravnih/fizičkih osoba

g. vodi upisnik programa na koje je dalo suglasnost

h. vodi upisnik pravnih/fizičkih osoba registriranih za provođenje programa osposobljavanja

i. osigurava da su veterinarski inspektori/službeni veterinari osposobljeni u svrhu pravilne

primjene odredaba propisa o zaštiti životinja koje se koriste u pokusima ili za proizvodnju

bioloških pripravaka

j. osigurava nadzor od strane veterinarske inspekcije.

2. Nadzor od strane veterinarske inspekcije – službene kontrole

1. Veterinarska inspekcija provodi redovite službene kontrole uzgajivača, dobavljača i korisnika,

uključujući njihove objekte, zbog provjere sukladnosti sa zahtjevima propisa.

2. Učestalost kontrola određuje se na temelju analize rizika za svaki objekt uzimajući u obzir:

a) broj i vrstu smještenih životinja

b) evidenciju uzgajivača, dobavljača ili korisnika u vezi s poštivanjem odredbi propisa

c) broj i vrstu pokusa koje provodi korisnik o kojem je riječ i

d) bilo koje informacije koje mogu upućivati na nesukladnost.

e) Nadzori se provode na barem jednoj trećini korisnika svake godine u skladu s analizom

rizika.

f) Odgovarajući dio inspekcijskih pregleda provodit će se bez prethodne najave.

g) Evidencije o inspekcijskim pregledima moraju se čuvati barem 5 godina.

Page 30: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

30

DODATAK I. Metode usmrćivanja životinja

Za usmrćivanje životinja potrebno je koristiti metode iz tablice.

Životinje napomene/metode

Ribe Vodozemci Reptili Ptice Glodavci Kunići Psi

Mačke Veliki sisavci

Primati osim

čovjeka

Prevelika doza anestetika 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Penetrirajući klin 2 Ugljični dioksid 3 Dislokacija vrata 4 5 6 Potres mozga – udarac u glavu

7 8 9 10

Dekapitacija 11 12 Omamljivanje električnom strujom

13 13 13 13 13 13

Inertni plinovi (Ar, N)

14

Slobodni projektil ispaljen iz puške ili pištolja

15 16 15

Zahtjevi

1. Kada je primjereno, koristi se s prethodnim davanjem sedativa.

2. Samo za veće reptile.

3. Samo za korištenje s postupnim dodavanjem plina. Ne upotrebljava se za fetalne oblike i

novorođene glodavce.

4. Samo za ptice do 1 kg. Ptice iznad 250 g potrebno je sedirati.

5. Samo za glodavce do 1 kg. Glodavce iznad 150 g potrebno je sedirati.

6. Samo za kuniće do 1 kg. Kuniće iznad 150 g potrebno je sedirati.

7. Samo za ptice do 5 kg.

8. Samo za glodavce do 1 kg.

9. Samo za kuniće do 5 kg.

10. Samo za novorođene životinje.

11. Samo za ptica lakše od 250 g.

12. Samo onda kad druge metode nisu moguće (posebno obrazložiti razloge za korištenje ove

metode).

13. Potrebna je posebna oprema.

14. Samo za svinje.

15. Samo na terenu, a provoditi ga mogu samo iskusni strijelci.

16. Samo na terenu, a provoditi ga mogu samo iskusni strijelci, kad druge metode nisu moguće.

Osim metoda iz tablice mogu se koristiti i druge metode:

(a) na životinjama bez svijesti, pod uvjetom da životinja ne dolazi k svijesti prije smrti

(b) na farmskim životinjama koje se koriste u istraživanju, kad cilj projekta zahtijeva da se životinje drže

u sličnim uvjetima u kojima se drže komercijalne farmske životinje. Te životinje se mogu usmrtiti u

skladu sa zahtjevima Pravilnika o zaštiti životinja u vrijeme usmrćivanja (Narodne novine, broj 83/11).

Page 31: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

31

Usmrćivanje životinja završava se jednom od sljedećih metoda:

a) potvrda trajnog prestanka cirkulacije

b) razaranje mozga

c) dislokacija vrata

d) iskrvarenje ili

e) potvrda nastupa rigor mortis.

Page 32: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

32

DODATAK II. Klasifikacija postupaka po težini

Težina postupka određuje se u odnosu na očekivani stupanj boli, patnje, stresa ili trajnog oštećenja

koje će životinja iskusiti tijekom trajanja postupaka.

Odsjek I: Kategorije težine

Nepovratna:

Postupci koji se u cijelosti provode u općoj anesteziji nakon koje se životinja neće vratiti svijesti.

Blaga:

Postupci na životinjama, nakon kojih životinje mogu osjećati kratkotrajnu blagu bol, patnju ili stres ili

postupci bez znatnog oslabljivanja dobrog stanja životinja ili općeg stanja životinja.

Umjerena:

Postupci na životinjama nakon kojih će životinje vjerojatno iskusiti kratkotrajnu umjerenu bol, patnju ili

stres, ili dugotrajnu umjerenu bol, patnju ili stres i postupci za koje je vjerojatno da će prouzročiti

umjereno oslabljivanje dobrog stanja životinja ili općeg stanja životinja.

Teška:

Postupci na životinjama nakon kojih će životinje iskusiti tešku bol, patnju ili stres ili dugotrajnu

umjerenu bol.

Odsjek II: Kriteriji za klasificiranje

Pri određivanju kategorije težine postupaka trebaju se uzeti u obzir svi zahvati ili postupanje sa

životinjama u okviru definiranog postupka. Klasifikacija se temelji na najtežim posljedicama koje će

vjerojatno iskusiti pojedinačna životinja nakon primjene svih odgovarajućih tehnika poboljšanja.

Pri klasifikaciji postupka u pojedinu kategoriju, uzet će se u obzir vrsta postupka i brojni drugi faktori.

Svi ovi faktori će se razmatrati od slučaja do slučaja.

Faktori u vezi postupaka uključivat će:

- vrstu zahvata, postupanja

- vrstu boli, patnje, stresa ili trajnog oštećenja uzrokovanih postupkom (svi elementi postupka)

te intenzitet postupka, trajanje, učestalost i raznovrsnost upotrijebljenih tehnika

- kumulativna patnja u okviru postupka

- sprječavanje prirodnog ponašanja uključujući ograničavanje standarda za smještaj, uzgoj i skrb.

U Odsjeku III su dani podaci o postupcima klasificiranim u svaku od kategorija težine na temelju faktora

povezanih s vrstom samog postupka. Ti primjeri pokazuju kakva klasifikacija bi bila najprimjerenija za

pojedinu vrstu postupka.

Međutim, za potrebe konačne klasifikacije postupka, trebaju se također uzeti u obzir sljedeći dodatni

faktori, procijenjeni od slučaja do slučaja:

- tip životinjske vrste ili genotip,

- zrelost, starost i spol životinje,

- iskustvo životinja s obzirom na postupak,

Page 33: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

33

- ukoliko će se životinja ponovo koristiti, stvarna težina prethodnih postupaka,

- metode koje su korištene za smanjivanje ili uklanjanje boli, patnje i stresa, uključujući

poboljšanja uvjeta smještaja, uzgoja ili skrbi,

- humane metode okončanja.

Odsjek III:

Primjeri različitih vrsta postupaka, klasificiranih u svaku od kategorija težine na temelju faktora

povezanih s vrstom postupka

1. Blag:

a) davanje anestezije osim za potrebe usmrćivanja

b) farmakokinetička studija s jednom danom dozom i ograničenim brojem uzetih uzoraka krvi

(ukupno < 10 % cirkulacijskog volumena) pri čemu se očekuje da tvar neće prouzročiti uočljive

negativne učinke

c) neinvazivno slikanje životinja (npr. magnetska rezonanca MRI) korištenjem odgovarajućih

sredstava za umirenje ili anestezije

d) površinski postupci, npr. biopsije ušiju i repova, nekirurška potkožna implantacija mini-pumpi i

transpondera

e) primjena vanjskih telemetrijskih naprava koja uzrokuje samo manje tegobe životinjama ili

manje smetnje normalne aktivnosti i ponašanja

f) davanje supstanci potkožno, intramuskularno, u trbušnu šupljinu, neposredno u grlo i

intravenozno putem površinskih krvnih žila, kada supstanca samo blago djeluje na životinju i

daje se u ograničenim dozama primjerenim veličini i vrsti životinje

g) indukcija tumora ili prirodno nastali tumori, koji ne uzrokuju uočljive kliničke negativne učinke

(npr. mali, potkožni, neinvazivni čvorići)

h) uzgoj genetički izmijenjenih životinja, što može prouzročiti blage učinke na fenotip

i) davanje izmijenjene hrane, koja ne zadovoljava sve prehrambene potrebe životinja i u

vremenskom okviru studije se očekuje da će postupak uzrokovati blagu kliničku abnormalnost

j) kratkotrajno (< 24h) zadržavanje životinja u metaboličkim krletkama

k) studije koje uključuju kratkotrajno odvajanje od socijalnih partnera, kratkotrajna izolacija u

kavezima odraslih druželjubivih vrsta štakora i miševa

l) modeli koji izlažu životinje štetnim podražajima koji su kratkotrajno povezani s blagom boli,

patnjom ili stresom i koje životinje mogu uspješno izbjeći

m) kombinacija ili akumulacija sljedećih primjera može rezultirati klasifikacijom „blag“:

- ocjena sastava tijela neinvazivnim mjerama i uz minimalno ograničavanje

- praćenje EKG s neinvazivnim tehnikama već naviknutih životinja s minimalnim

ograničavanjima ili bez njih

- uporaba vanjskih telemetrijskih naprava koje očekivano ne uzrokuju tegobe socijalno

prilagođenim životinjama i ne utječu na njihovu normalnu aktivnost i ponašanje

- uzgoj genetski izmijenjenih životinja, za koje se očekuje da neće imati klinički uočljiv

štetan utjecaj na fenotip

- dodavanje inertnih markera u hranu za praćenje izlučivanja probavnih produkata

- uskraćivanje hrane za < 24h kod odraslih štakor

- testiranje na terenu.

Page 34: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

34

2. Umjeren:

a) učestala primjena testnih supstanci koji proizvode umjerene kliničke učinke, i oduzimanje

uzoraka krvi (> 10 % cirkulacijskog volumena) kod svjesne životinje u roku od nekoliko dana

bez nadomještanja oduzetog volumena

b) studije za utvrđivanje opsega doze koje proizvode akutne učinke, testovi kronične

toksičnosti/kancerogenosti bez smrtnog ishoda

c) operacija u općoj anesteziji s odgovarajućom analgezijom, povezana s postoperativnom poli,

patnjom ili oslabljenjem općeg stanja. Primjeri uključuju: torakotomija, kraniotomija,

laparotomija, orhidektomija, limfadenektomija,tiroidektomija,ortopedska operacija s

učinkovitom stabilizacijom i cijeljenjem rana, presađivanje organa s učinkovitim sprječavanjem

odbacivanja, kirurško usađivanje katetera ili biomedicinskih naprava (npr. telemetrijskih

transmitera i mini pumpi itd.)

d) modeli uzrokovanja tumora ili prirodno nastali tumori, koji očekivano uzrokuju umjerenu bol ili

stres ili umjeren poremećaj normalnog ponašanja

e) zračenje ili kemoterapija s subletalnom dozom, ili s inače smrtnom dozom ali s ponovnim

uspostavljanjem imunosustava. Očekivani negativni učinci su blagi ili umjereni i kratkotrajni (<

5 dana)

f) uzgoj genetički izmijenjenih životinja, što može prouzročiti umjerene učinke na fenotip

g) stvaranje genetski izmijenjenih životinja putem kirurških zahvata

h) korištenje metaboličkih kaveza koji uključuju umjerena ograničavanja kretanja tijekom

produženog razdoblja (do 5 dana)

i) studije davanja izmijenjene hrane koja ne udovoljava sve prehrambene potrebe životinja i u

vremenskom okviru studije se očekuje da će postupak uzrokovati umjerenu kliničku

abnormalnost

j) uskraćivanje hrane na 48 sati kod odraslih štakora

k) izazivanje reakcije bježanja i izbjegavanja, pri čemu životinja ne može pobjeći ili izbjeći

podražaj te se očekuje da uzrokuju umjeren stres.

3. Težak:

a) testovi toksičnosti sa smrtnim ishodom ili pri kojima se smrtni ishod očekuje i koji uzrokuje

teška patofiziološka stanja. Na primjer, pokusi akutne toksičnosti sa jednom samom dozom

(vidi smjernice o ispitivanju OECD)

b) ispitivanje naprave čiji kvar može prouzročiti tešku bol, stres ili smrt životinje (npr. srčani

stimulatori)

c) ispitivanje jačine cjepiva koje karakterizira trajno onesposobljavanje stanja životinje i

progresivna bolest sa smrtnim ishodom u povezanosti s dugotrajnom umjerenom boli, stresom

ili patnjom

d) zračenje ili kemoterapija s letalnom dozom bez ponovnog uspostavljanja imunološkog sustava

ili ponovno uspostavljanje imunološkog sustava s imunološkom reakcijom transplantata (graft

versus host disease)

e) modeli uzrokovanja tumora ili prirodno nastali tumori za koje se očekuje da uzrokuju letalne

bolesti povezane s dugotrajnom umjerenom boli, stresom ili patnjom. Na primjer tumori koji

uzrokuju kaheksiju, invazivni tumori kosti, tumori koji izazivaju širenje metastaza, i tumori koji

uzrokuju ulceracije

f) kirurški i drugi zahvati na životinjama u općoj anesteziji, koji očekivano uzrokuju tešku i trajnu

umjerenu postoperativnu bol, patnju ili stres ili teško i trajno onesposobljenje općeg stanja

Page 35: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

35

životinja. Uzrokovanje kompliciranih fraktura, toraktomije bez odgovarajuće analgezije ili

traume koje uzrokuju višestruko zatajenje organa

g) presađivanje organa kad odbacivanje organa po svoj vjerojatnosti vodi u teški stres ili

oslabljenje općeg stanja životinja (npr. ksenotransplatacija)

h) uzgoj životinja s genetskim poremećajima koje očekivano trpe teško i trajno oslabljenje općeg

stanja, na primjer huntingtonova bolest, mišićna distrofija, kronični ponavljajući modeli

neuritisa

i) korištenje metaboličkih kaveza što uključuje teško ograničavanje kretanja tijekom produljenog

razdoblja

j) neizbježni električni šok (npr. za izazivanje naučene bespomoćnosti)

k) potpuna izolacija tijekom dugog razdoblja druželjubivih životinjskih vrsta npr. pasa i primata

osim čovjeka

l) imobilizacijski stres za izazivanje gastričkih ulceracija i zatajenja srca kod štakora

m) prisilno plivanje ili drugo vježbanje do potpune iscrpljenosti.

Page 36: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

36

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA "OD RIBA DO PRIMATA"

Dr. sc. Marko Ćaleta

Životinjski modeli se koriste u velikom broju različitih istraživanja od medicinskih istraživanja,

farmakoloških istraživanja, u kozmetičkoj industriji, agronomiji, ispitivanju hrane i preparata za kućne

ljubimce, vojnim ispitivanjima (oružja), testiranju sudara u autoindustriji itd. Velik broj prehrambenih

artikala i kozmetičkih proizvoda kao i svi lijekovi, mora proći eksperimentalno testiranje na životinjskim

modelima. Istraživanja koja koriste životinjske modele značajno doprinose napretku znanstvenih

saznanja.

Kralješnjaci su životinje koji se u najvećoj mjeri koriste kao laboratorijske životinje. U kralješnjake

ubrajamo ribe, vodozemce, gmazove, ptice i sisavce. Ribe, vodozemci i gmazovi su ektotermni

(ponekad se koristi i izraz poikilotermni) organizmi. Njihova tjelesna temperatura varira u odnosu na

temperaturu okoliša i vrlo su ograničenih mogućnosti reguliranja i zadržavanja stalne temperature

tijela. Za razliku od ektotermnih, ptice i sisavci su endotermni organizmi koji su sposobni održavati

stalnu temperaturu tijela neovisno o promjenama temperature u okolišu.

Laboratoriji su daleko od prirodnog okoliša u kojima životinje inače obitavaju i žive. Stoga sve fiziološke

potrebe kao i potrebe ponašanja moraju biti osigurane u laboratoriju. Preporučljivo je životinjama na

minimum smanjiti stres i bol, i takva briga za dobrobit životinja trebala bi biti jednako važna kao i sami

rezultati istraživanja. Ovo je važno ne samo zbog humanosti, već i zbog ekonomskih razloga kao i

potrebe da se zadovolje strogi nacionalni i međunarodni propisi i zakoni o zaštiti i dobrobiti životinja.

Za kvalitetnu brigu o životinjama u zarobljeništvu neophodno je dobro poznavati biologiju i ponašanje

pojedine vrste s kojom se radi te spoznati kako zdravlje i psihološko stanje životinje utječe na samo

istraživanje i njegove rezultate. Pokazalo se da stabilne, zdrave i mirne jedinke tj. životinje doprinose

uspjehu i kvaliteti istraživanja i njihovih rezultata. Stoga je izuzetno važno na koji način se životinje

drže, kako se transportiraju, kako se o njima brine, u kakvim uvjetima žive i kako se obavljaju

eksperimenti i istraživanja.

Ribe

Posljednjih godina povećan je interes za korištenje riba kao eksperimentalnih i laboratorijskih životinja.

Ribe se koriste i u istraživanjima ponašanja te fiziologije. Jedan od razloga za korištenje riba je i

činjenica da mnoge vrste riba proizvode velik broj jaja tj. mladih u stalnim razmacima. Kako su jaja

prozirna vrlo lako se mogu pratiti rani razvojni stadiji riba te vanjski utjecaji na njih.

Ribe su jedina skupina kralješnjaka koja živi isključivo u vodi, bilo slatkoj ili morskoj. Za potrebe ovog

tečaja, "ribama" smatramo skupinu hrskavičnjača (Chondrichthyes) i koštunjača (Osteichthyes). S

obzirom na veliku raznolikost riba, iznimna je i raznolikost anatomskih, fizioloških i etoloških značajki.

Stoga je za držanje i korištenje riba u laboratorijskim istraživanjima potrebno imati određena

predznanja o biologiji i ponašanju riba kao i o akvaristici te akvakulturi.

Postrojenja (laboratoriji) za držanje i uzgoj riba su složeni sustavi koji moraju biti tako konstruirani kako

bi se minimalizirao stres za ribe, spriječilo nastajanje bolesti i omogućili uvjeti najsličniji prirodnim.

Page 37: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

37

Akvarije i bazene potrebno je pravilno napraviti i složiti kako bi se omogućilo lagano korištenje i

manipuliranje te spriječilo ozljeđivanje osoba koje se o ribama brinu. Vrlo je važno osigurati dovoljnu

količinu i kvalitetu vode. Najvažnije je da je u vodi otopljeno dovoljno kisika kojeg je u vodi 20x manje

nego u zraku. Osim manje sposobnosti otapanja plinova, voda ima veću gustoću i viskozitet od zraka.

Ukoliko se koristi voda iz prirode ili iz vodovoda, neophodno je takvu vodu testirati i provjeriti da li

postoje onečišćenja ili patogeni. Iz vodovodne vode potrebno je ukloniti i klor ili drugi dezinficijens,

ukloniti određene otopljene tvari i ukloniti supersaturirane plinove. Osim kvalitete vode, neophodno je

imati stabilnu i odgovarajuću temperaturu vode ovisno da li se drže hladnovodne ili toplovodne vrste

riba. Preporučljivo je da prostorije u kojima se nalaze akvariji i bazeni budu dobro ventilirane i

klimatizirane zbog održavanja temperature i vlage zraka. Svjetlo je također vrlo važan faktor za držanje

riba. Potrebno je umjetno osigurati stalnu izmjenu dana i noći kako bi ribe normalno funkcionirale. U

akvarijima tj. bazenima potrebno je osigurati i pojedine etološke (bihevioralne) preduvjete u obliku

zaklona, pokrova i vodenog bilja.

Tankovi i akvariji moraju biti odgovarajuće veličine i prilagođeni veličini vrsta tj. pojedinih životnih

stadija koji se u njima drže, kao i zamišljenom broju jedinki. Osim toga, bazeni se moraju biti tako

dizajnirani i smješteni da se mogu relativno lako i brzo čistiti. Na vrhu bazena (tankova) potrebno je

staviti pokrov ili mrežicu kako bi se spriječilo iskakanje (bijeg) riba.

U laboratorijskim istraživanjima mogu se koristiti divlje vrste iz prirode ili vrste iz uzgoja tj. iz

akvarističke ili akvakulturne proizvodnje. Ukoliko se koriste jedinke iz prirode potrebno je obratiti

pažnju na način kako ih se lovi, transportira i kako se njima rukuje, a sve s ciljem minimalnog

oštećivanja i smrtnosti riba. Ovisno o vrsti, potrebno je zatražiti dozvolu od nadležnih ministarstava

ovisno da li se radi o endemskoj, ugroženoj, zaštićenojm unesenoj ili ribolovnoj vrsti. Vrlo je važno

divlje ribe držati jedno vrijeme u karanteni i aklimatizirati ih na laboratorijske uvjete i to u posebnim

akvarijima koji se tretiraju s preparatima (sredstvima) protiv parazita i bolesti.

Ukoliko se koriste ribe iz uzgoja (akvaristika ili akvakultura) potrebno je zatražiti potvrdu o njihovom

zdravstvenom stanju i kondiciji. Za specifična istraživanja i pokuse neophodno je poznavati i genetsko

porijeklo soja koji se nabavlja. Unatoč potvrdi o zdravstvenom stanju riba iz uzgoja i njih je

preporučljivo držati jedno vrijeme u karantenskim akvarijima radi aklimatizacije na laboratorijske

uvjete i eventualnog sprječavanja širenja bolesti i parazita. Nabavkom riba iz uzgoja treba biti vrlo

oprezan da li se radi o vrstama koje su unesene (strane ili alohotne) jer njihovim slučajnim ili

namjernim puštanjem u prirodu može doći do negativnog utjecaja na domaću (autohotnu) floru i

faunu.

Prehrana riba u laboratorijskim uvjetima uvelike ovisi o generalnom načinu prehrane pojedine vrste i o

tome koliko je vrsta specijalizirana odnosno prilagodljiva što se prehrane tiče. Poput i drugih

kralješnjaka ribe imaju dnevne i sezonske ritmove hranjenja koji su povezani s temperaturom vode,

reproduktivnim ciklusom i duljinom dana (u prirodi). Ribe iz prirode preferiraju živu hranu, mada

većina pokazuje veliku fleksibilnost i plastičnost te se prilično brzo prilagode na umjetnu (peletiranu)

hranu. Svakako je preporučljivo veličinu peleta i količinu dnevnog unosa prilagoditi svakoj vrsti ovisno

o habitusu (veličini) i sezonskim promjenama.

U osnovi postoje dva sustava držanja i uzgoja riba – protočni sustav i recirkulacijski sustav. Protočni

sustav je znatno jednostavniji, a glavne prednosti su mu jednostavnija konstrukcija i lako održavanje.

Jedino je potrebno osigurati stalni dotok kvalitetne vodovodne ili druge vode te ukloniti klor ili

organsku tvar. Recirkulacijski ili zatvoreni sustav koristi stalno istu vodu uz stalno aeriranje i filtriranje.

Page 38: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

38

Ovakvi sustavi su složeniji za pokretanje i održavanje te nešto osjetljiviji te postoji stalni rizik od

promjena kvalitete vode.

U laboratorijskim istraživanjima najčešće se koriste vrste iz slijedećih skupina riba: pastrvske vrste

(Salmonidae) – potočna pastrva, kalifornijska pastrva, losos; ciklidi (Cichlidae) – Tilapia, Archocentrus

nigrofasciatus; šaranske vrste (Ciprinidae) – zebrice, zlatna ribica; morske ribe – bakalar, komarča,

lubin.

Vodozemci

Vodozemci su također prilično dobra skupina kralješnjaka za držanje i korištenje u laboratorijskim

istraživanjima. Riječ amphibia dolazi od grčkih riječi amphi + bios što znači dvostruki život, od čega

dolazi i hrvatski naziv voda + zemlja. U laboratorijskim istraživanjima uglavnom se koriste žabe koje su i

daleko najbrojnija i najraznolikija skupina vodozemaca. U istraživanjima se koriste razne kopnene,

poluvodene i prave vodene vrste žaba. Koža vodozemaca relativno je tanka, propusna te vlažna s

velikim brojem žlijezda. Osim zaštitne uloge vodozemci se kožom koriste i za izmjenu plinova te

regulaciju količine vlage. Vrste koje se koriste za laboratorijska istraživanja uglavnom su dugoživuće

(oko 15 godina), veličine od 2,5 do 15 centimetara i mesojede. U Hrvatskoj živi 20 vrsta vodozemaca i

sve su zaštićene temeljem Pravilnika o proglašavanju divljih svojti zaštićenim i strogo zaštićenim

(NN99/09).

Vodozemci se dosta često koriste u različitim laboratorijskim istraživanjima od demonstracija

anatomije i fiziologije, eksperimenata s živcima i mišićima, do reproduktivnih i hormonalnih

istraživanja. Žabe se koriste i za istraživanja glasanja i komunikacije. Posebno su zanimljiva jaja

vodozemaca koja se razvijaju izvan tijela majke i imaju proziran i tanak ovoj što omogućuje vrlo

zanimljiva istraživanja iz razvojne biologije tj. embriologije. Daždevnjaci i vodenjaci su dobri modelni

organizmi za zarastanje dijelova tijela, posebice udova. Kao i za druge skupine kralješnjaka za

laboratrijska istraživanja koriste se jedinke iz uzgoja ili iz prirode.

Za držanje vodozemaca jedan od ključnih čimbenika je upravo kvaliteta i čistoća vode kako zbog

propusne i tanke kože odraslih tako i zbog nježnih i osjetljivih jaja te ličini. Stoga, ukoliko se koristi

vodovodna voda potrebno ju je ostaviti nekoliko sati da se smanji količina otopljenih plinova (uslijed

supersaturacije) i klora te da se temperatura vode prilagodi sobnoj temperaturi. pH vrijednost vode u

kojoj se drže vodozemci ne smije izlaziti iz okvira 6,5 do 8,5. Ponašanje i razmnožavanje vodozemaca

uvelike ovisi o temperaturnim uvjetima u kojima se nalaze. S obzirom da su ektotermni organizmi

preferiraju toplije uvjete kada pokazuju veću aktivnost i pokretljivost. Preporučljivo je držati

vodozemce u uvjetima temperaturnog gradijenta, tako da mogu vlastitim ponašanjem i prema

vlastitim potrebama regulirati tjelesnu temperaturu. Naime, uočeno je da stalna temperatura uzrokuje

stres kod mnogih vrsta. Punoglavci preferiraju nešto višu temperaturu okoliša od odraslih. Kako mnoge

vrste vodozemaca hiberniraju potrebno ih je držati u hladnjaku za vrijeme perioda mirovanja i osigurati

dovoljnu količinu vlage.

Vrste koje se najčešće koriste u laboratorijskim istraživanjima su iz roda Xenopus (X. laevis i X. borealis)

koje su potpuno vodene i roda Rana (R. pipiens i R. temporaria) koje su uglavnom kopnene. S obzirom

na različitost među navedenim rodovima potrebno im je osigurati različite uvjete za držanje.

Page 39: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

39

Rukovanje

Vodozemci ne vole da ih se dira i manipulira s njima i zato ih treba dirati samo ako je to neophodno.

Kako im je koža nježna i vlažna te prekrivena sluzi, potrebno je ruke prije rukovanja dobr oprati i

navlažiti. Idealno bi bilo kad bi se koristile rukavice ili meka vlažna krpa. Zbog raznolikosti vodozemaca

nemoguće je ili vrlo nezahvalno napisati jedinstvene upute za držanje i brigu o gmazovima u

laboratorijskim uvjetima. Međutim, ono što je osnovno je briga za dobrobit životinja jer o tome ovisi

uspješnost istraživanja i eksperimenata.

Xenopus spp.

Afrička pandžašica (Xenopus laevis) je jedna od najčešće korištenih i najomiljenijih vrsta zahvaljujući

činjenici što je vrlo prilagodljiva te se prilično lako može držati. Xenopus je prilično izdržljiva, akvatička

(vodena) žaba, bez slobodnog jezika. Ukoliko se ukloni iz vode na nekoliko sati može doći do isušivanja.

Vrlo često se koristi u istraživanjima embriogeneze i ranog razvoja. U laboratorijskim uvjetima mogu

živjeti i do 25 godina. Naziv pandžašica dolazi od malih, tamnih, rožnatih izraslina nalik na pandže na

unutrašnjosti stražnjih stopala. Poput riba ona je ektotermni organizam i preferira topliju (18-25°C)

stajaću vodu. Svaka nagla ili veća promjena (veća od 5°C) temperature vode može biti kobna. Unatoč

činjenici da većinu vremena provodi po vodom neophodno je ovim žabama omogućiti uzimanje zraka

na površini vode inače će se utopiti. Za držanje ove žabe u akvariju potrebno je osigurati 1-2 litre vode

po jedinki, a dubina mora biti najmanje 30 cm. Xenopus preferira da ga se drži u manjim grupama od 2-

3 jedinke. Međutim, može se držati od 12 do 20 jedinki u većim akvarijima (6-10 litara po jedinki), od

toga nešto manje ženki. Osim uobičajenog čišćenja akvarija (najmanje jednom u dva dana), potrebno je

osigurati čistu vodu (nikako ne destiliranu) i iz nje obvezno ukloniti klor (oštećuje zaštitni sloj od sluzi).

Za optimalno održavanje treba osigurati 12 satne cikluse dana i noći. Iako je optimalno držati ih u

plastičnim ili staklenim akvarijima s mutnim staklom, moguće je koristiti i akvarije s prozirnim staklom

uz obvezno osiguravanje mjesta za skrivanje u obliku plastičnih cijevi ili kamenja. Žabe treba spriječiti

da pobjegnu iz akvarija tj. da iskoče izvan njega kako ne bi došlo do isušivanja i ugibanja. Potrebno je

osigurati umjetno svijetlo sa UV frekvencijama kako bi se osigurao razvoj vitamina D i ravnoteža kalcija

i fosfora. Pandžašice je potrebno hraniti dva do tri puta tjedno u obliku malih ličinki, zrikavaca, šturaka,

dijelova jetre ili kupovnih peleta za mesojede ribe tj. žabe (punoglavci su biljojedi). Koža im je

prekrivena slojem sluzi koja ima zaštitnu ulogu i olakšava izmjenu plinova. Za baratanje potrebno je

koristiti vlažne, vodootporne (bez pudera) rukavice kako bi se minimalno oštetio zaštitni sloj. Za razliku

od ostalih vrsta žaba ne dopuštaju da ih se drži s jednom rukom oko sredine tijela. Iako se u prirodi

sezonski razmnožavaju, u laboratoriju se mogu pariti tijekom cijele godine. Postaju spolno zrele između

12 i 14 mjeseci starosti. Ženke su veće od mužjaka i imaju znatno veće "analne papile" (iznad kloake),

dok mužjaci imaju "palčane žuljeve" kao i slična zadebljanja na unutrašnjosti prednjih nogu (za

pridržavanje ženki tijekom parenja).

Rana spp.

Vrste roda Rana su polu-kopnene žabe koje žive na kopnu u vlažnim uvjetima. U vodu odlaze samo

tijekom perioda parenja. Vrlo su osjetljive na promjene količine vlage u zraku pa moraju imati površinu

s vodom u svojoj nastambi (terariju), dubine 4-12 centimetara. Ženke su veće od mužjaka, a veličina se

kreće od 7,5 do 9 centimetara (ovisno o vrsti). Potrebno je u nastambu postaviti kamenje, komade

drveta i biljke kako bi se životinjama osiguralo mjesto za skrivanje, grijanje ili olakšao pristup vodi. U

terariju veličine 30x60 cm može se držati šest jedinki. Ukoliko je visina terarija manja od 60 cm

potrebno je napraviti neki oblik pokrova tj. poklopca. Kako se radi o kopnenim vrstama može se

koristiti i vodovodna voda čija temperatura bi trebala biti između 15 i 20°C. Vrste roda Rana moraju

hibernirati barem tri mjeseca. U laboratoriju ih je tijekom hibernacije preporučljivo držati u

dekloriranoj vodi u hladnoj prostoriji (3-4°C) pri čemu je vodu potrebno mijenjati svaka 2 tjedna ili

Page 40: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

40

osigurati filtriranje i aeriranje terarija. Punoglavci su biljojedi i hrane se algama ili biljnim materijalom.

Odrasli su mesojedi koji preferiraju aktivni (živi) plijen u obliku gujavica, ličinki ili odraslih kukaca.

Desetak šturaka umočenih u multivitaminski puder dovoljan je za odraslu žabu tjedno. Parenje se

odvija sezonski (u proljeće), spolnu zrelost postižu s 3-4 godine.

Caudata (Urodela) – Repaši

Jedini predstavnik skupine repaša koji se uobičajeno koristi u laboratorijima je Meksički axolotlo

(ambistoma) - Ambystoma mexicanum. Upravo zbog posjedovanja škrga potrebna je nešto veća briga

oko kvalitete vode zbog mogućnosti osjetljivosti na gljivične infekcije. Postoji nekoliko poznatih

uzgojnih sojeva - smeđe-crni s tamnim mrljama i sivo-smeđim točkama, ali i albino oblici. Životinje se

dugačke 30-ak centimetara i imaju 3 para dobro razvijenih škrga. Spolovi se ne mogu raspoznati sve

dok nisu spolno zreli s oko jednu godinu starosti. Životni vijek aksolotla je oko 8 do 10 godina, ali u

laboratoriju rijetko žive dulje od 6 godina. Za uspješno držanje aksolotla najvažnija je kvaliteta vode.

Tvrda voda pomaže održavanju kože u dobrom stanju i obrani od infekcija, ali svakako mora biti

deklorirana. Vodovodnu vodu je također preporučljivo ostaviti da odstoji nekoliko sati kako bi se

uklonili suvišni plinovi. pH bi trebala biti između 6,5 i 8. Odrasli aksolotli mogu se držati pojedinačno ili

u grupama od 10 jedinki, a dubina vode bi trebala biti 35-40 centimetara. Polovica akvarija mora biti

natkriljena kako bi se osiguralo mračno područje. Ukoliko voda cirkulira treba brzinu cirkuliranja svesti

na najmanju moguću mjeru. Najbolje je koristiti prozračivanu (aeriranu) vodu koja se djelomično

izmjenjuje dva do tri puta tjedno. Aksolotle se ne smije izlagati direktnom sunčevom svijetlu, ali treba

im osigurati prirodno ili umjetno svijetlo (14:10 – dan:noć). Temperaturu vode potrebno je održavati

između 15 i 20°C. Što se tiče prehrane u laboratorijskim uvjetima, ona treba biti nalik na onu kod

Xenopus (jetra, srce, peletirana riblja hrana) i to 3-4 puta tjedno. Spolno sazrijevaju s oko 18 mjeseci

starosti,a u zarobljeništvu se mogu razmnožavati čitave godine.

Gmazovi

Gmazovi su jedna od najraznolikijih i najzanimljivijih skupina kralješnjaka. Najlakše za držanje i bilo

kakva laboratorijska istraživanja su mali gušteri (gušterice) i neke zmije. Pritom je potrebno dobro

poznavati biologiju i ekologiju vrste kako bi se zadovoljili sve potrebe organizma prilikom držanja u

zarobljeništvu. U Hrvatskoj živi gotovo 40 vrsta gmazova i zaštićeni su temeljem Pravilnika o

proglašavanju divljih svojti zaštićenim i strogo zaštićenim (NN99/09).

Gmazovi se koriste u genetskim istraživanjima, embriologije, razvojne biologije, etologije (ponašanja),

endokrinologije i imunologije. Pomoću gmazova istražuje se još i agresija, fiziologija stresa,

reprodukcija i toksikologija. Upravo raznolikost gmazova i njihove biologije, doprinosi njihovoj kvaliteti

kao laboratorijskih životinja. Držanje u laboratorijskim uvjetima nešto je jednostavnije i ekonomski

povoljnije nego držanje sisavaca i ptica. Naime, moguće je stvoriti prirodne uvjete i staništa što daje

mogućnost praćenja i istraživanja svih tipova aktivnosti i ponašanja kao u prirodi.

Zbog raznolikosti gmazova nemoguće je ili vrlo nezahvalno napisati jedinstvene upute za držanje i brigu

o gmazovima u laboratorijskim uvjetima. Međutim, ono što je osnovno je briga za dobrobit životinja jer

o tome ovisi uspješnost istraživanja i eksperimenata.

Za držanje gmazova u laboratorijskim uvjetima prvenstveno je potrebno osigurati dovoljno velike

terarije koji će zadovoljiti osnovne fizičke, socijalne i fiziološke potrebe životinja. S obzirom da mnogi

istraživači koriste životinje iz prirode potrebno je biti oprezan da gmazovi ne pobjegnu i tome

Page 41: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

41

prilagoditi terarij te sustav zatvaranja (zaključavanja). Terariji (posude) bi trebale biti vodootporne i

moći se lako čistiti, dezinficirati i sušiti. Po mogućnosti terariji bi trebali biti s prozirnim stjenkama kako

bi se izvana moglo pratiti ponašanje i položaj životinja. Čišćenje terarija treba biti kompromis između

čistoće i uznemiravanja, jer određena količina fekalnog materijala i feromona u terariju smanjuje stres

životinja. Zbog ektotermije gmazova potrebno je osigurati dovoljno visoku temperaturu u terariju i

prilagoditi je pojedinoj vrsti tj. njenim etološkim i fiziološkim potrebama. Idealno je omogućiti

temperaturni gradijent unutar terarija tako da životinje mogu termoregulirati samostalno i prema

vlastitim potrebama tj. birati mikrostaništa s različitim temperaturama. Fotoperiod je također vrlo

važan za kvalitetno držanje gmazova u laboratorijskim uvjetima. Zato je neophodno osigurati dovoljne

količine UV svjetlosti za normalan metabolizam kalcija i stvaranje vitamina D. Količina vlage je još jedan

od faktora koji utječu na uspješno držanje gmazova u zarobljeništvu. Mnoge vrste imaju potrebu za

vlagom u zraku posebice tijekom faze presvlačenja. Prehranu treba prilagoditi potrebama pojedinih

vrsta i pritom pokušati maksimalno kopirati prirodnu prehranu kako bi se osigurao normalan rast i

razvoj. Kako su gmazovi ektotermni organizmi, zahtijevaju i znatno manje količine energije za

preživljavanje. Stoga se hrane u manjoj količini i manjom učestalosti (od ptica i sisavaca), a opet

prilagođeno veličini i potrebama jedinke uz vitaminske dodatke. Dovoljnu količinu vode za piće u

terariju treba također prilagoditi potrebama vrste, ali preporučuje se takva posuda u koju čitava

životinja može ući i namočiti se. Za vrste koje ne piju vodu potrebno je povremeno vlažiti terarij. Kao

podlogu u terariju treba izbjegavati materijal koji životinje mogu lako progutati ili je štetan tj. toksičan,

a da s druge strane dobro adsorbira i da je otporan na rast bakterija. Broj jedinki koji se mogu držati

zajedno ovisi o tome koliko je koja vrsta teritorijalna i kolika je količina agresije koja postoji među

jedinkama. Za neke vrste potrebno je jedinke držati pojedinačno.

Rukovanje

Prilikom rukovanja gmazovima potrebno je obratiri pažnju da se sve radi vrlo oprezno i nježno kako bi

se izbjeglo ozljieđivanje i bespotrebni stres. Potrebno je vrlo oprezno rukovati s otrovnim vrstama

gmazova i primijeniti sve moguće mjere opreza i predostrožnosti kako bi se izbjegle neželjene situacije.

Za opasne životinje postoje točno definirane procedure postupanja i rukovanja.

Zeleni anolis (Anolis carolinensis)

Zeleni anolis je odličan gmazovski modelni organizam za laboratorijska istraživanja koji se koristi već

gotovo 100 godina. Najveća prednost ovog guštera je brojnost u prirodi te činjenica da se lako

razmnožava i održava. Za držanje ovog guštera potrebno je u laboratoriju simulirati period parenja i

period izvan sezone parenja. Osnovni okolišni čimbenici koji reguliraju sezonalnost su fotoperiod i

temperatura. Idealni omjer duljine dana i noći tijekom reproduktivnog perioda je 14 prema 10 sati i

pritom temperatura u terariju treba biti 28°C "danju" i 19°C "noću". Izvan reproduktivnog perioda

dan:noć su u omjeru 10:14, a temperature su 24°C odnosno 15°C. Relativna vlažnost za zelenog anolisa

treba biti oko 70%.

Prilikom baratanja gušterima potrebno ih je držati za tijelo, a izbjegavati držanje za rep kako ne bi

došlo do njegovog odbacivanja. Odrasle jedinke se u laboratoriju drže ili pojedinačno ili u grupama od

jednog mužjaka i više ženki. Više mužjaka ne treba držati zajedno tijekom reproduktivnog perioda zbog

izražene agresije. Idealna veličina terarija je 76x30x48 cm (110 litara) s dobro prijanjajućim metalnim

(perforianim ili mrežastim) poklopcem. U takvom se terarij može držati jedan mužjak s do 8 ženki. U

svaki od terarija preporučljivo je staviti UVB svjetiljku za sunčanje čime se osigurava adekvatna

temperatura i temperatudni grdijent unutar terarija. Kao podlogu se koristi mahovinasti supstrat,

usitnjeno drvo i slično. Potrebno je postaviti i posudu s vodom, ali je potrebno i dodatno sprejanje

Page 42: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

42

terarija radi vlage. Anolise se hrani se šturcima i brašnarima (ličinke i odrasli) dva do tri puta tjedno.

Šturke je preporučljivo prije hranjenja uvaljati u mješavinu kalcija i vitamina.

Osnovni preduvjeti za držanje (kopnenih) životinja u kavezima i boksovima je da životinje budu na

suhom, toplom i da su čiste. Osim toga neophodan im je slobodni pristup hrani i vodi kao i prostor za

normalno kretanje. Kavezi (boksovi) moraju biti napravljeni od neškodljivih materijala koji se lako čiste

i steriliziraju, a opet onemogućavaju životinje u bijegu.

Ptice

Ptice (Aves) su razred kralješnjaka s više od 9000 danas poznatih vrsta. Inteligencija ptica, složenost

ponašanje i sposobnost da trpe fizičku bol bili su vrlo podcjenjivani i one su bile smatrane inferiorne

prema sisavcima u svakom pogledu. Prednost ptica je to što su znatno lakše za razmnožavanje i

održavanje zbog svoje male veličine. Međutim, s obzirom da su to vrlo aktivni i pokretljivi organizmi s

razvijenim osjetnim sustavom, njihovo držanje i osiguravanje potreba u laboratorijskim uvjetima je

nešto složenije.

Ptice se koriste u istraživanjima s područja virologije, embriologije, toksikologije, farmakologije i

imunologije. Pile (kokoš – Gallus domesticus) je klasična i tipična životinja za embriološka istraživanja.

U novije vrijeme koristi se i za proizvodnju antitijela. Prednosti su to što je sakupljanje antitijela iz

jajeta potpuno neinvazivno i to što je imunizacija isto neinvazivna kroz mukoznu membranu jednjaka i

dišnog sustava. Osim kokoši u istraživanjima se ponekad koriste i pura (Meleagris gallopavo), prepelica

(Coturnix spp.), golub (Columba livia), čvorak (Sturnus vulgaris), zebe i patke.

Osim što imaju perje i krila, karakteriziraju ih neke druge anatomske specifičnosti. Ptice nemaju zube

već kljun, a probava započinje u volji (vratni dio). Bubrezi ptica su režnjeviti, a ženke imaju samo jedan

jajnik i jajovod. Poput sisavaca, endotermni su organizmi, ali u imaju višu metaboličku ratu i

temperaturu tijela. Ptice mogu proizvesti i do 200 jaja godišnje. Za izlijeganje iz jajeta potrebno je 2 do

4 tjedna. Kod kokoši, spolna zrelost nastupa između 19 i 24 tjedna. Inkubacija jaja traje 20-22 dana, a u

leglu može biti do 14 jaja. Prilikom izlijeganja pilići su teški 50-70 grama. Golub spolnu zrelost postiže

sa 6 mjeseci i može se razmnožavati i do godina. Inkubacija traje 16-18 dana, ali je najčešći broj jaja u

gnijezdu dva. Pri izlijeganju mladi imaju masu od 20 do 50 grama.

Kako pojedine vrste ptica imaju različite životne navike i potrebe, za njihovo držanje i i brigu o njima

potrebno je biti dobro upoznat s biologijom i ponašanjem svake od potencijalnih vrsta. Međutim,

najveći dio njihove anatomije i fiziologije podređen je letu kao specifičnom, ali ujedno i vrlo

zahtjevnom načinu kretanja. Prilagodbe na let kod ptica mogu imati utjecaj na istraživanja u smislu

odgovora na rukovanje (manipuliranje), stres, anesteziju, kirurške tehnike. lijekove i sl. Čak i vrste koje

su potpuno domestificirane i pripitomljene zadržavaju određene obrasce ponašanja slične divljim

tipovima.

Sisavci

Sisavci su najpoznatija i najčešće korištena skupina životinja tj. kralješnjaka koja se korsiti

laboratorijskim istraživanjima. U najvećem broju istraživanja (preko 85%) koriste se glodavci zbog svoje

male veličine, te lakšeg i isplativijeg držanja. U određenom broju istraživanja u laboratorijima koriste se

Page 43: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

43

neke druge vrste sisavaca iz redova zvijeri (Carnivora) i parnoprstaša (Artiodactyla). Među njima

najčešće se koriste pas (Canis familiaris), mačka (Felis catus), svinja (Sus domesticus), ovca (Ovis aries) i

koza (Capra hircus) koje se često, radi pojednostavljivanja terminologije, naziva zajedničkim imenom

"velike životinje".

Poput primata, "velike životinje" imaju vrlo značajnu ulogu u laboratorijskim istraživanjima zbog svoje

biokemijske i fiziološke sličnosti čovjeku. Koriste se u velikom broju istraživanja iz različitih područja

poput – molekularne genetike, razmnožavanja, ponašanja, imunologije, hematologije, endokrinologije,

mikrobiologije, prehrane, farmakologije, onkologije i dr. Osim toga, saznanja koja se sakupe vrlo su

vrijedna veterinarima u dijagnosticiranju i liječenju bolesti samih tih životinja.

Pas

Pas (Canis familiaris) pripada u red zvijeri (Carnivora) i porodicu Canidae. Iako je primarno mesožder,

smatra se omnivornim predatorom, lovcem. Pas ima izuzetno razvijen osjet njuha i čuje 4 puta bolje od

čovjeka. Poznato je da vidi u boji, ali vidi samo plavu i žutu boju dok crvenu ne vidi. Pas je nastao od

vuka tisućljetnim procesom domestifikacije (domestikacije) i selekcije od strane čovjeka. Ima potrebu

za životom u "čoporu" sa drugim psima ili čovjekom i taj socijalni kontakt mu je izuzetno važan.

Procesom selekcije i križanja nastalo je više od 100 pasmina pasa pri čemu se njihove veličine kreću od

500 g (čiuaua) do 100 kg (bernardinac).

Istraživanja na psima kao pokusnim organizmima započela su još početkom 18. stoljeća (William

Harvey koristio pse kako bi proučavao krvotok još oko 1700. godine). Poznati su i mnogi drugi pokusi

na psima poput onoga Ivana Pavlova ili Bantinga i Besta (otkrili inzulin). Danas se psi koriste u velikom

broju različitih istraživanja poput – ponašanja, anestezije, istraživanjima disanja, neurološkim

istraživanjima, radiologiji, farmakologiji, traumatologiji, zalječenju rana, prehrani, kardiološkim i

cirkulatornim istraživanjima, istraživanjima kostura, transplantacije, očiju, dijabetesa i dr.

Estrusni ciklus psa traje 7-13 dana, ovulacija je spontana, a parenje traje 10-16 dana od početka

estrusa. Skotnost (trudnoća) traju 60-66 dana. Mogu imati dva legla godišnje (estrus svakih 6-8

mjeseci), a veličina legla se kreće od 4-12 mladunaca. Mladunci sišu 7-8 tjedana. Životni vijek pasa

razlikuje se među pasminama, ali može biti i do 20 godina. Lako se razmnožava i uzgaja u

laboratorijskim uvjetima.

Godišnje se u svijetu u istraživanjima i testiranjima koristi više od 140 000 pasa. Veličina pasmine za

laboratorijska istraživanja je presudna u odabiru. Prevelike pasmine (njemački ovčar, labrador) su

složenije i teže za uzgajanje, držanje i istraživanje. Optimalna pasmina je bigl zbog manje veličine,

dobrog karaktera, male potrebe za brigom i zato što nema posebnih anatomskih i genetskih anomalija

(defekata). Bigli se također lako razmnožavaju i jednostavno drže u skupinama. Psi se mogu nabavljati

od specijaliziranih uzgajivača (bolje i češće) ili iz skloništa (azila) za pse.

Za držanje pasa za laboratorijska istraživanja potrebno je zadovoljiti određene preduvjete. Minimalna

površina za držanje psa treba osigurati dovoljno mjesta da se životinja može okrenuti i da može stajati

te ležati u normalnom položaju. Životinjama koje su smještene u manjim, pojedinačnim kavezima treba

omogućiti vježbu u obliku šetnje i trčanja. Također, psi koji nemaju osjetne kontakte s drugim psima

moraju imati dnevni pozitivni kontakt s ljudima. Preporučljiva temperatura u prostorima za držanje

pasa je između 18-29°C (ne bi trebala biti niža od 10°C), dok relativna vlažnost treba biti 30-70%.

Prostor za držanje treba dobro i ventilirati i provjetravati. U umjerenim područjima se većina pasmina

može prilagoditi na držanje na otvorenom. Hranu je potrebno davati barem na dnevnoj bazi u

odgovarajućoj količini ovisno o veličini životinje. Odrasli pas pojede dnevno 20-40 g suhe hrane po

Page 44: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

44

kilogramu tjelesne mase. Ostaci hrane i izmet moraju se uklanjati barem jednom dnevno. Kavezi

(boksovi) bi se trebali čistiti i sterilizirati barem jednom u dva tjedna.

Mačka

Mačka (Felis catus) također pripada u zvijeri, porodicu Felidae. Mačka je primjer pravog mesoždernog

predatora (lovca). U prirodi je izrazito solitarna i teritorijalna životinja. Uz čovjek se pripitomila

(domestificirala), pa danas postoji velik broj različitih pasmina. Mačka je jedina solitarna životinja koju

je čovjek pripitomio. Veličina prosječne mačke kreće se od 3-7 kilograma.

Mačka se koristi u velikom broju različitih istraživanja i ispitivanja – starenja, sluha, probave,

ponašanja, raka, endokrinološkim istraživanjima, krvotoka, genetskim, imunološkim, istraživanjima

zaraza, živčanog sustava, mišićno-skeletnim, istraživanjima oka, kože, disanja, toksikologije i dr.

Problem se mačkama je što slabije podnose uzimanje krvi, držanje i druge oblike stresa te mogu

ozlijediti istraživače. Stoga se vrlo često koriste sredstva za smirenje ili imobilizacijska pomagala.

Postaju spolno zrele s oko godinu dana. Estrusni ciklus traje 14 dana, a sam estrus 3-6 dana. Ovulacija

ženki je inducirana (potaknuta). Mužjaci su znatno promiskuitetniji pa se jedan mužjak pari sa do 15

ženki. Skotnost (trudnoća) traje 58-72 dana, a veličina legla najčešće je 3-6 mačića. Mogu imati dva

legla godišnje, a mladi sišu 4-5 tjedana.

Mačke se mogu držati u grupama u normalnim prostorijama, gdje bi im bilo preporučljivo postaviti

objekte za penjanje i igru. Mačke veličine do 4 kilograma zahtijevaju površinu od oko 0,3 m2, a 0,4 m2

ukoliko su veće od navedene mase. Visina kaveza (boksa) trebala bi biti najmanje 60 centimetara. U

kavezu je potrebno postaviti uzdignuto postolje kao mjesto odmora. Kao i kod psa, preporučljiva

temperatura u prostorima za držanje kreće se između 18 i 29°C, uz vlažnost zraka između 30 i 70%.

Temperature ispod 10°C i iznad 29,5°C nisu preporučljive za držanje mačaka. Prostor gdje se životinje

drže treba biti dobro ventiliran i provjetravan. Odrasla mačka ima dnevne potrebe za hranom u količin

od 150 grama. Ostaci hrane i izmet moraju se uklanjati barem jednom dnevno. Kavezi (boksovi) bi se

trebali čistiti i sterilizirati barem jednom u dva tjedna.

Svinja

Svinja (Sus domesticus) taksonomski pripada redu parnoprstraša (Artiodactyla). Unatoč pripadnosti

parnoprstrašima, nije preživač (Ruminantia) poput većine ostalih pripadnika ovog reda. Prema

prehrani pripada u sveždere – strvinare (sakupljače). Svinje su vrlo inteligentne i aktivne životinje koje

su uglavnom prilično mirne i pitome. Međutim, ženke s mladima i odrasli mužjaci mogu biti agresivni i

treba ih tretirati s oprezom. Uslijed procesa pripitomljavanja, selekcije i križanja nastale su različite

pasmine, kojima se veličine kreću od 15 do 300 kilograma. Zabilježeno je postupno povećanje

korištenja svinja u laboratorijskim istraživanjima.

Istraživanja na svinjama se koriste u slijedećim područjima – kardiovaskularne operacije,

transplantacija organa, ateroskleroza, dermatologija, gastrointestinalnim istraživanjima, bolestima

bubrega, dijabetesa, anesteziji, farmakologiji, krvotoku, toksikologiji i dr. Veličina tijela i kostura, koža,

zubi, probavni sustav, položaj srca i krvotok svinje, vrlo su slični onima kod čovjeka. Životinje imaju dug

životni vijek pa su odlični test organizmi za istraživanja bolesti srca i krvožilnog sustava, gerontologije i

toksikologije. Držanje svinja ne nešto složenije od ostalih "velikih životinja" zbog prosječne veličine, ali i

životnih potreba. Stoga su uzgojene pojedine pasmine koje su prosječno manje (Göttingen Minipig) i

čija masa se kreće do 40 kg. Svinje je preporučljivo, ukoliko je moguće, držati u grupama jer preferiraju

kontakt s drugim pripadnicima vrste pri čemu razvijaju strukturu (hijerarhiju) dominacije.

Page 45: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

45

Što se reprodukcije svinja tiče, estrusni ciklus traje 21 dan (18-24), dok sam estrus traje do 5 dana.

Ovulacija je spontana, a trudnoća (skotnost) traje 110-116 dana. Veličina legla može biti i do 15 mladih.

Vrijeme potrebno za odbijanje od sise je oko 7 tjedana.

Ovca

Ovca (Ovis aries) Pripada u isti red (parnoprstaši) kao i svinja, ali je i pripadnik skupine preživača

(Ruminantia). S obzirom na tip prehrane (8-10 sati dnevno pasu) ovca ima potrebu za stalnim

kretanjem (nekoliko kilometara dnevno) u potrazi za hranom. Prirodno su plašljive i snažno vezane za

život u stadu.

Ovca se koristi u nešto manjem broju tipova istraživanja od prethodnih vrsta. Ovce služe

kardiovaskularnim istraživanjima, istraživanjima reprodukcije, genetskim istraživanjima i proizvodnji

antitijela.

Razmekšavanje i fermentacija biljne hrane odvija se u prednjem dijelu probavila (burag, kapura,

knjižavci), a enzimska razgradnja na kraju u žljezdanom dijelu želuca (sirište). U probavnom sustavu vrši

se stalna fermentacija i dolazi do stvaranje plinova. Kako bi se ovca anestezirala potrebno ju je vezati i

ukloniti plinove iz probavnog sustava.

Masa odraslog mužjaka iznosi 80-100 kilograma, dok su ženke nešto lakše s masom od 50-80

kilograma. Životni vijek traje 15-ak godina, a spolnu zrelost postižu sa 4 do 8 mjeseci (ženke) ili 4 do 6

mjeseci (mužjaci). Vrijeme razmnožavanja traje od rujna do ožujka. Estrusni ciklus traje oko 18 dana.

Gestacija ili trudnoća traje 145 dana, a veličina legla se kreće od 1 do 4 janjeta.

Komparativna tablica fizioloških značajki pojedinih vrsta velikih životinja

KOKOŠ GOLUB PAS MAČKA SVINJA OVCA

masa (kg) 1,3-4 0,25-0,6 10-15 2,5-3,5 50-250 50-150

dnevne potrebe za hranom (g)

85-150 25-100 18 (suhe hrane)

po kilogramu mase

200 g 5% mase tijela 1000-2000

dnevne potrebe za vodom (ml)

200-300 40-50 1200 200-300 1l/10kg 3000-6000

životni vijek (god.) 5-8 20 10-15 12-18 16-18 lis.15

temperatura tijela (°C) 41,5 42 37,9-39,9 38-39,5 38,7-39,7 38,3-39,8

broj udisaja (min-1) 15-30 105-135 15-40 16-40 10-20 12-25

krvni tlak (mmHg) x/71(95) 43(66)/95(136) 75/120 x/150

broj otkucaja srca (min-1) 200-400 200-400 50-150 80-160 50-100 70-90

Page 46: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

46

Primati

Primati su od svih skupina životinja vjerojatno najbolji, a katkad i jedini mogući modeli. Sva saznanja o

biologiji, fiziologiji, ponašanju, psihologiji životinja mogu se u manjoj ili većoj mjeri primijeniti na

čovjeka. Životinje se koriste kada je nemoguće ili neprihvatljivo, ali i ekonomski neisplativo vršiti

ispitivanja na čovjeku. Osim sličnosti čovjeku, primati su veći i dugoživući (u odnosu na druge

laboratorijske životinje), vrlo prilagodljivi i lako uče. Najčešće korištene skupine primata u

laboratorijima su marmozeti i makake.

Primati ili majmuni (Primates) su red sisavaca (Mammalia). Udovi su im pentadaktilni (petoprsti), a

stopala plantigradna (peta je na tlu). Posjeduju stereoskopski, binokularni vid i vidni aparat im je

znatno poboljšan dok se mirisni smanjio u usporedbi s drugim sisavcima. Lubanja je velika, a mozak i

kora velikog mozga su dobro razvijeni. Uglavnom su arborealne životinje (penju se po drveću) s prilično

razvijenim šakama i manje-više nasuprotno smještenim palčevima. Prsti kod odvedenijih skupina

umjesto pandža imaju nokte što omogućuje lakše manipuliranje predmetima i bolje hvatanje. Pokazuju

složeno socijalno ponašanje i komunikaciju. U odnosu na ostale sisavce u prosjeku imaju duži životni

vijek i manji broj potomaka (1-2). Penis im je viseći, testisi skrotalni, i imaju dvije prsne sise.

U svijetu je trenutno poznato oko 370 vrsta majmuna (primata), a oni su ujedno i jedna od

najraznolikijih skupina sisavaca čije se veličine kreću od 30 g (patuljasti lemur) do 200 kg (gorila). Velik

broj vrsta primata smatra se ugroženim prvenstveno uslijed antropogenih utjecaja. Uglavnom

naseljavaju tropska i subtropska, šumska područja. Primati se najčešće hrane biljkama, voćem, kukcima

ili su oportunisti (svejedi).

Primati (majmuni) se dijele na dvije velike skupine:

podred Prosimii (Strpsirhinii) – polumajmuni - ostatak primitivnih arborealnih Primata -

Lemuri, Galago, Indriji, Lorisi.

Njihova osnovna karakteristika je da imaju vlažni dio kože oko nosnica povezan s gornjom usnom.

Uglavnom su nokturalne (aktivne noću) životinje pa imaju i svjetlucavi sloj u očima tzv. tapetum

lucidum. Osnovno osjetilo im je njuh dok je vid znatno slabije razvijen.

podred Anthropoidea (Haplorhinii) – pravi majmuni – moderni majmuni

o Tarsii – zastopaljci (ponekad se svrstavaju u zaseban podred)

o Platyrrhini - majmuni novog svijeta ili širokonosci

o Catarrhini – majmuni starog svijeta ili uskonosci

Prave majmune (Haplorrhinii) karakterizira dlakava koža između nosnica i gornje usne. Uglavnom su

aktivni danju pa slabo vide noću. Njuh im je u odnosu na polumajmune znatno slabije razvijen dok je

vid bolje razvijen.

Platyrrhini ill majmuni novog svijeta, dijele se na dvije velike porodice Cebidae i Callitrichidae. Kao što

im i samo ime kaže naseljavaju tzv. "novi svijet" tj. srednju i južnu Ameriku. Osim tog naziva koristi se i

naziv širokonosci upravo zbog smještaja nosnica koje su razmaknute i usmjerene u stranu. Palac na

prednjim udovima im je donekle oponirajući (nasuprotan). Kod većine vrsta mužjaci posjeduju os penis

(bacculum). Pojedine vrste imaju vidu boji i prehenzilne repove (mogu se s njima hvatati).

Page 47: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

47

Majmuni starog svijeta (uskonosci) nastanjuju Afriku, Europu, Aziju i Japan. Kao i kod prethodne

skupine naziv uskonosci opisuje izgled njihovog nosnog dijela kod kojeg su nosnice smještene

međusobno blizu i okrenute prema dolje. Jedna od zanimljivijih značajki im je to što kad odmaraju

uglavnom sjede. Zbog toga na stražnjicama imaju sjedne žuljeve ili zadebljanja u obliku orožnjele kože.

Za uskonosce se smatra da imaju prave nokte za razliku od prethodnih skupina koje imaju pandže.

Palčevi su im u potpunosti oponirajući (nasuprotni) i nemaju prehenzilne repove.

Majmuni starog svijeta se dijele na nekoliko porodica (Cercopithecidae, Hylobatidae i Hominidae.)

Porodicu Hominidae (čovjekolike majmune) čine orangutani, gorile, čimpanze i čovjek. Čovjekoliki

majmuni su rasprostranjeni u Aziji i Africi, a karakterizira ih veće tijelo u odnosu na ostale vrste, veliki

mozak te visoka inteligencija.

Zbog anatomskih, fizioloških, reproduktivnih i etoloških sličnosti s čovjekom, kao i zbog sličnih bolesti,

primati su jedan od najvažnijih skupina laboratorijskih životinja. Koriste se u velikom broju različitih

istraživanja poput: toksikoloških istraživanja, studijama istraživanja SIDA-e i Hepatitisa, neurološkim

istraživanjima, istraživanjima ponašanja, reprodukcije, genetike i ksenotransplatacije. Osim

navedenoga oni su prosječno i duže živući od ostalih laboratorijskih životinja te se mogu koristiti kroz

duži period.

S druge strane postoje i određeni problemi tj. mane korištenja primata u istraživanjima i

laboratorijima. Prvenstvo se radi o etičkim problemima s obzirom da životinje u manjoj ili većoj mjeri

pate. Osim toga uzgajanje i održavanje je složenije i skuplje u odnosu na manje laboratorijske životinje.

Primati se mogu sakupljati u prirodi te prodavati laboratorijima ili samostalno uzgajati u. To ovisi o

regulatornim propisima pojedine zemlje, tipu istraživanja i skupini tj. vrsti koja s koristi. Najčešće vrste

su makaka majmuni, makaki rakojed (cynomolgus majmun), vjeveričji majmuni (squirrel monkey) i

noćni majmuni (owl monkey). Koriste se još i marmozeti i hvataši (spider monkeys). Pojedine zemlje

koriste još i babune i čimpanze.

Zanimljivo je da se samo 14% istraživanja na primatima vrši u zemljama u razvoju. Preostalih 86% vrši

se u industrijaliziranim zemljama (sjeverna Amerika, Europa i Japan).

Držanje u zarobljeništvu

Primati su vrlo raznolika skupina, a u laboratorijskim istraživanjima se koristi veći broj različitih vrsta.

Stoga je potrebno dobro poznavati svaku od vrsta kako bi se uvjeti držanja životinja prilagodili

potrebama svake od vrsta. Za kvalitetno držanje primata treba se pridržavati slijedećih uputa:

kako su vrlo socijalne životinje treba ih držati u stabilnim i kompatibilnim skupinama s

razvijenom socijalnom strukturom

omogućiti dostupnost dovoljne količine svjetlosti prema potrebama vrste

osigurati dovoljno mjesta (ne samo površine već i volumena) za specifična ponašanja, vježbu i

igru

vršiti obogaćivanje prostora konopima, platformama, ljestvama, igračkama za bolje i

kvalitetnije korištenje prostora – također i materijal za grizenje, trganje i manipuliranje

osigurati čvrstu podlogu sa pogodnim substratom

osigurati mjesta za parenje, razmnožavanje i podizanje mladih

davati kvalitetnu i raznoliku hranu prilagođenu pojedinoj vrsti i njenim potrebama

Page 48: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

48

Na temelju navedenog, treba izbjegavati držanje pojedinačnih jedinki u premalim, jednoličnim,

metalnim kavezima, kao i izbjegavati hranjenje jednolikom industrijskom hranom.

Komparativna tablica fizioloških značajki nekih vrsta majmuna

marmozet makaki rezus makaki rakojed

masa (kg) 0,3-0,4 5-10 3-8

dnevne potrebe za hranom (g) 20 oko 500 J/kg oko 500 J/kg

dnevne potrebe za vodom (ml) po potrebi 40-80 40-80

životni vijek (god.) 10-16 20-30 15-25

temperatura tijela (°C) 36,6-38,6 36-40 37-40

broj udisaja (min-1) 32-50

krvni tlak (mmHg) 65/100 75/125 75/125

broj otkucaja srca (min-1) 230-312 120-180 240

sazrijevanje (god.) 1,5-2 3-5 3-5

skotnost (dana) 140-148 144-180 153-179

broj mladih 1-4 1 1

trajanje estrusa 14-28 28

Najznačajnije skupine i vrste majmuna (primata) u laboratorijskim istraživanjima

Prosimii (Strepsirhini) - polumajmuni

S obzirom da su primitivniji i manje slični i bliski čovjeku koriste se manje od ostalih tj. pravih majmuna.

Zbog specifičnog bioritma većine vrsta i specijaliziranosti nešto su teži za držanje. Mnoge vrste su

ugrožene i zaštićene međunarodnim i nacionalnim zakonodavstvom.

Koriste se rodovi: Lemur sp., Galago senegalensis (poput vjeverice); Loris tardigratus (noćni s velikim

očima).

Majmuni novog svijeta - širokonosci

Broj zuba može biti 32 ili 36 (uvijek 3 pretkutnjaka), a neki imaju prehenzilne repove.

Vrlo često se koriste u istraživanjima i kao laboratorijske životinje i pritom su dominantni marmozeti i

tamarini.

Saimiri sciureus (vjeveričji majmun) je najčešće korištena vrsta primata u laboratorijskim

istraživanjima. Masa mu je oko 800 grama.

Aotus trivirgatus (Owl monkey), teži manje od kilograma. Noćna je životinja s veliki očima, a

zahtjeva visoku temperaturu i vlagu. Najčešće se koristi u istraživanjima malarije.

Callithrix jacchus jacchus, također često korištena vrsta. Masa joj se kreće do pola kilograma.

Dobro se prilagođava na zarobljeništvo i prvi je primat koji se često uzgaja u laboratorijima. Vrlo

često se koristi u neurološkim istraživanjima.

Sanguinus oedipus oedipus, ima masu od 425-550 grama. Vrlo često se koristi u istraživanjima

raka debelog crijeva.

Sanguinus mystax, kojem se masa kreće od 600 do 650 grama, a uglavnom se koristi u

istraživanjima hepatitisa A.

Page 49: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

49

Majmuni starog svijeta – uskonosci

Broj zuba se kreće oko 32 (uvijek 2 pretkutnjaka), imaju lične vrećice, a rep ukoliko postoji nikada nije

prehenzilan.

Chlorocebus ethiops (African Green Monkey) - najčešće korištena vrsta u istraživanjima. Najviše

se koriste u istraživanjima doniranja i presađivanja bubrega i Marburg-ove bolesti.

Macaca mulatta (makaka rezus), također jedan od standardnih majmuna i drugi po učestalosti

korištenja u svijetu. Zaslužan za otkivanje rezus faktora.

Macca fascicularis (Cynomolgus monkey), treća najčešće korištena vrsta u istraživanjima.

Papio sp. (babuni), su četvrta najčešće korištena skupina. Velik su i snažni što otežava držanje i

rukovanje.

Pan sp. (čimpanze), peta najčešća skupina.

Gorilla sp. (gorile) (istraživanja ponašanja, socijalnih interakcija i ebola groznice)

Unatoč velikim protivljenjima različitih organizacija i udruga, korištenje primata istraživanjima se

povećava. Postoji ozbiljan nedostatak primata za potrebe istraživanja (posebice rezus majmuna) u

razvijenim zemljama poput sjeverne Amerike, Europe i Japana. Uzgoj u ovim zemljama je potpuno

neadekvatan i nedovoljan. Uzgoj u zemljama iz kojih majmuni potječu također neadekvatan. Transport

iz zemalja iz kojih potječu je prilično složen. Stoga se sve više istraživanja vrše u zemljama "izvorima".

Također se prelazi na nove vrste (od rezusa na makaki rakojeda i zelenog zamorca). U Hrvatskoj se

majmuni ne koriste za istraživanja i eksperimenti uglavnom zbog prevelikog troška i ekonomske

neisplativosti. Međutim, u slučaju majmuna postoji veliki etički problem zbog velike sličnosti s

čovjekom u građi, ponašanju i osjećanju boli što znači da pate način vrlo sličan čovjeku.

Literatura

Animal Welfare Unit 1999 Guidelines for the Care and Housing of Dogs in Scientific Institutions

Guideline No. 14, , NSW Agriculture, Sydney. 1-26.

Canadian Council on Animal Care 2009: Guidelines on: The care and use of farm animals in research,

teaching and testing. Ottawa, ON Canada.

Canadian Council on Animal Care 2005: Guidelines on: the care and use of fish in research, teaching

and testing. Ottawa, ON CANADA

Committee on Dogs 1994 Laboratory Animal Management: Dogs. Institute of Laboratory Animal

Resources, Commission on Life Sciences and National Research Council. National Academy Press,

Washington, 1-138.

HACC (2004): Guidelines for Use of Live Amphibians and Reptiles in Field and Laboratory Research.

Herpetological Animal Care and Use Committee.

Hau J, Van Hoosier G. L. 2003: Handbook of Laboratory Animal Science. Vol. 1, 2nd Edition. Boca

Raton, FL: CRC Press LLC.

Page 50: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

50

Institute for Laboratory Animal Research 2011: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th

Edition. Division on Earth and Life Studies. National research council oft he national academies. The

national Academic Press.

Jennings M., Prescott M. J. 2009 Refinements in husbandry, care and common procedures for non-

human primates. Joint Working Group on Refinement. Ninth report of the

BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Lab Anim, 43 (Suppl 1): 1-47.

Joint Working Group on Refinement 2004: Refining dog husbandry and care: Eighth Report of the

BVA(AWF)/FRAME/RSPCA/UFAW, Laboratory Animals, 38 (Supplement 1), 1-94

Michael S. R. 2010: Biology Of Nonhuman Primate. Biotechnology Support Services, University Animal

Care, University of Arizona, Tucson. 1-10.

Moreland A. F. 1994: Nonhuman primates: introduction and taxonomy. American College of

Laboratory Animal Medicine; Health Sciences Center for Educational Resources. University of

Washington, Seattle, Series 2, V-9010.

National Research Council 1974: Amphibians: Guidelines for the Breeding, Care, and Management of

Laboratory Animals. Washington DC: National Academy Press.

Nickum J. G. 2004: Use of Fishes in Research Committee, American Institute of Fishery Research

Biologists, American Society of Ichthyologists and Herpetologists, American Fisheries Society, 1-

Reed B, Jennings M 2010: Guidance on the housing and care of zebrafish, Danio rerio, RSPCA

Southwater: RSPCA Research Animals Department.Townsend P 2001: Laboratory birds: refinements in

husbandry and procedures: Fifth report of BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on

Refinement. Laboratory Animals 35(Supplement 1), 1-163

Wolfensohn S., Lloyd M, 2003: Handbook of Laboratory Animal Management and Welfare, 3rd Edition.

Wiley-Blackwell, 1-432.

Page 51: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

51

KOMPARATIVNA BIOLOGIJA – MALI GLODAVCI I KUNIĆI

Dr. sc. Duje Lisičić

Uvod

Zašto laboratorijski glodavci i kunići?

Istraživanja koja uključuju rad na životinjskim modelima postavljaju određene ekonomske, logističke i

praktične uvjete koje daju prednost određenim životinjama ili skupinama životinja nad drugima. Tako

su mala veličina, održavanje u skupinama, jednostavan i brz reprodukcijski ciklus, velik broj mladih i

ekonomičnost održavanja karakteristike koje se uzimaju kao pozitivne u odabiru laboratorijske

životinje. Velik broj istraživanja na životinjskim modelima vezan je za istraživanja ljudske fiziologije,

prevencije i razvoja bolesti. Ako se to uzme u obzir, životinjski modeli sisavaca su osobito povoljni zbog

toga sto sa ljudima dijele filogenetsku i fiziološku sličnost. Glodavci i kunići po navedenim kriterijima

prednjače pred drugim životinjskim skupinama što ih čini najčešćim životinjskim modelima u

laboratorijskim istraživanjima.

Glodavci (Rodentia)

Opća obilježja, evolucija i raznolikost glodavaca

Glavna obilježja glodavaca su veliki, dlijetasto građeni prednji sjekutići, raspoređeni u dva para, jedan u

gornjoj, a jedan u donjoj čeljusti. Ovi zubi su građeni od dentina, a prednji dio je prekriven čvrstim,

žuto do narančasto obojenim enamelom. Gornji i donji par zubi se pri zatvaranju čeljusti stružu jedni o

druge, zbog čega zadržavaju oštar, dlijetlast oblik. Osim ovih sjekutića, zubalo glodavaca sadrži i

kutnjake sa hrapavim vrhovima, koji su ovako građeni kao prilagodba za mljevenje biljne hrane.

Sjekutići i kutnjaci rastu cijelog života jedinke i međusobno su odvojeni prostorom bez zubi,

„dijastemom“. Ovakva građa zubala omogućuje glodavcima pristup širokom spektru biljne hrane, od

mekih listova preko vlaknastih trava do tvrdih sjemenaka, grana i kore. Zahvaljujući zubalu i

probavnom traktu prilagođenog efikasnoj probavi biljne hrane, glodavci su evoluirali u

najmnogobrojniju skupinu sisavaca i osvojili gotovo sve raspoložive ekološke niše.

Prvi glodavci su se pojavili prije 57 milijuna godina. Tijekom slijedećih 20-tak milijuna godina dolazi do

radijacije i evolucije skupine, tako da se u razdoblju od 34 do 20 milijuna godina od danas može

pronaći većina današnjih porodica. Prije 5 milijuna godina pojavljuje se porodica Muridae, danas

najbrojnija porodica glodavaca, u koju ubrajamo oko 1300 živućih vrsta.

Danas glodavci sadrže oko 2770 vrsta, raspoređenih u pet podreda: Anomaluromorpha, vjevericoliki

(Sciurimorpha), dikobrazoliki (Hystricomorpha), dabroliki (Castorimorpha) i mišoliki (Myomorpha)

glodavci. Najbrojnija od ovih podreda su mišoliki glodavci, sa oko 1680 vrsta.

Glodavci variraju veličinom od malog afričkog patuljastog miša teškog samo oko 5 g do kapibare teške

do oko 90 kg. Osnovni oblik tipičnog predstavnika glodavaca je životinja koja oblikom tijela sliči mišu ili

štakoru. Međutim, prilagodba različitim ekološkim nišama rezultiralo je varijacijama u morfologiji

glodavaca. Vrste prilagođene kopanju su zbijenog tijela, snažnih i kratkih nogu sa jakim šapama ili

velikim i isturenim prednjim zubima za odgrizanje komada zemlje. Druga krajnost su vitki penjači sa

dugim nogama i repovima, poput vjeverica. Neke vrste imaju razvijene letnice između prednjih i

Page 52: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

52

stražnjih nogu što im omogućuje klizeći let među stablima. Vrste prilagođene životu u vodi imaju

spljoštene repove i plivaće kožice među prstima, dok vrste otvorenih staništa, poput stepa ili

polupustinja, razvijaju snažne i duge stražnje noge koje im omogućuju brzo i energetski povoljno

kretanje u dugim skokovima. Među glodavcima ima nokturalnih vrsta, onih koje su aktivne cijelog

dana, kao i isključivo dnevnih vrsta.

Jednako varijabilna je i prehrana glodavaca. Iako su izvorno prilagođeni na prehranu biljnom hranom,

mnoge današnje vrste su svejedi. Među glodavcima brojni su oportunisti, čak i isključivo biljojedne

vrste se hrane širokim asortimanom biljne hrane. Nekim vrstama meso čini važan izvor hrane u

određeno doba godine, a tek mali broj vrsta su pravi lovci.

Što se tiče odnosa prema drugim jedinkama svoje vrste, među glodavcima nalazimo sve oblike

socijalnog i asocijalnog ponašanja. Na jednom kraju skale nalazimo asocijalne, strogo teritorijalne

vrste, poput evropskog hrčka (Cricetus cricetus), dok su na drugom dijelu prave eusocijalne vrste poput

afričkog golog sljepaša (Heterocephalus glaber). Najveći broj vrsta je negdje u sredini ove distribucije:

žive u manjim skupinama u kojim se jedinke međusobno prepoznaju i brane teritorij skupine od uljeza

iz drugih skupina.

Glavno osjetilo glodavaca je miris. Njime se koriste u potrazi za hranom, otkrivanju predatora,

međusobnoj komunikaciji, obilježavanju teritorija i pri reprodukciji. Dodir je dobro razvijen, i glodavci

imaju cijeli niz dugih osjetnih dlaka na raznim dijelovima tijela i oko nosa („brkovi“) koje služe za bolju

taktilnu percepciju. Sluh je vrlo dobro razvijen, a osjetilo sluha je potpomognuto velikim uškama za

prikupljanje zvučnih valova. Nadalje, mnogi glodavci mogu čuti visoke frekvencije čime se koriste kao

rano upozorenje na prisutnost predatora i kojima međusobno komuniciraju. Vid je naročito dobro

razvijen kod dnevnih i arborealnih vrsta.

Većina vrsta ima brzu reprodukciju i velik broj mladih. Neke vrste imaju tzv. eksplozije populacija (npr.

neke vrste rodova Microtus, Rattus i Mus) i na ovaj način iskorištavaju privremeno povoljne uvjete

okoliša. Druge vrste imaju umjerenije reproduktivne sposobnosti, kao odgovor na stabilniji okoliš u

kojem žive. Druga krajnost su vrste sa relativno dugim životnim vijekom i malim brojem mladih, poput

dinarskog voluhara (Dinromys bogdanovi).

Dvojezubci (Lagomorpha)

Opća obilježja, evolucija i raznolikost dvojezubaca

Glavno obilježje dvojezubaca je zubalo koje je po građi i funkciji nalik na zubalo glodavca, osim jedne

važne karakteristike: iza prednjih sjekutića imaju još jedan par malih sjekutića. Također, sloj enamela

na prednjoj površini sjekutića je jednoslojan, a kod glodavaca je dvoslojan. Dvojezubci su toliko slični

glodavcima da su do početka 20tog stoljeća bili klasificirani kao nadporodica glodavaca. Značajne

razlike u odnosu na glodavce postoje i u drugim tjelesnim obilježjima: penis nema baculum (os penis)

te je skrotum mužjaka ispred penisa. Urogenitalni i spolni otvor se otvaraju u zajednički prostor, tzv.

pseudonečisnicu. Svi dvojezubci hranu ne mogu pridržavati prednjim šapama, a prednje i stražnje šape

su im prekrivene dlakom. Svi predstavnici ovog reda su striktni biljojedi, osim jedne iznimke, što ih

također razlikuje od većinom svejednih glodavaca.

Prva životinja sa karakteristikama dvojezubaca pojavila su se u centralnoj Aziji, prije 85 milijuna godina.

Direktni dokazani predak dvojezubaca pronađen je također u Aziji, a smatra se da je živio prije 65

milijuna godina. Prvi predstavnici porodice Leporidae pojavili su se tijekom donjeg eocena, a podjela

Page 53: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

53

na dvije današnje porodice (zečevi i kunići - Leporidae i pike – Ochotonidae) dogodila se prije otprilike

37 milijuna godina.

Dvije današnje porodice broje 12 rodova sa oko 90 vrsta (što je zanimljivo ako se usporedi sa sličnim

glodavcima kojih ima preko 2000 vrsta). Pike su zastupljene samo sa jedni rodom i oko 30 vrsta, dok

zečevi i kunići imaju 11 rodova i oko 50 vrsta. Nejasno je zašto dvojezubci nisu, unatoč mnogim

sličnostima sa glodavcima, također evoluirali u brojnu skupinu.

Od prvih fosilnih primjeraka dvojezubci su zadržali temeljnu građu i malo su je mijenjali. To je tipična

građa zeca i kunića, sa vitkim tijelom i dugim stražnjim nogama. Najmanje pike teže 100 g, dok zečevi

dosežu do 5 kg. Pike sliče malim kunićima, sa kratkim nogama i malim ušima. Dvojezubci su prilagođeni

na jednu više-manje stalnu ekološku nišu: život na tlu, na otvorenom. U tome variraju od pika i kunića,

koje izlaze van po hranu a sklanjaju se u rupama kad su napadnute, do zečeva koji žive na otvorenom i

nemaju prave jazbine ili brloga. Neke vrste zečeva žive u šumama, druge u močvarama, neke pike

nastanjuju kamene gromade i sipare na planinama, ali ovdje nema vodenih, fosorijalnih ni arborealnih

vrsta, kako je to slučaj kod glodavaca. Među dvojezubcima ima nokturalnih vrsta, onih koje su aktivne

cijelog dana, kao i isključivo dnevnih vrsta.

Dvojezubci su biljojedi, te imaju posebnu prilagodbu na ovaj tip prehrane, a to je koprofagija. Na ovaj

način jedinka bolje probavlja celulozu i dolazi do vitamina važnih za život, tako da je koprofagija

esencijalna kod svih vrsta ovog reda.

Socijalnost je u ovoj skupini raznolika kao i kod glodavaca. Varira od nekih vrsta teritorijalnih i

asocijalnih pika (npr. Američka pika, Ochotona princeps) preko sezonski zadružnih zečeva do velikih i

socijalnih kolonija zadružnih vrsta stepskih pika (Ochotona curzoniae).

Dvojezubci imaju dobro razvijeno čulo vida. Čak i vrste koje se skrivaju u podzemnim rupama imaju

dobro razvijen vid, a zečevi koji žive na otvorenom imaju velike oči za brzo otkrivanje grabežljivaca.

Sluh im je također važno osjetilo: svi dvojezubci imaju dobro razvijene uške. Čak i pike, koje imaju

najmanje uši, imaju relativno velike ušne školjke ako se usporede sa prosjekom kod ostalih sisavaca.

Miris kod dvojezubaca ima važnu ulogu u međusobnoj komunikaciji i reproduktivnoj biologiji.

Zečevi i kunići imaju brzu reprodukciju, tako da mogu brzo reagirati na povoljne uvjete okoliša. Zečevi i

kunići relativno malo vremena provode sa mladima (jedan posjet leglu u 24 sata) čime smanjuju

mogućnost otkrivanja mladih od strane grabežljivaca. O reproduktivnom ponašanju pika malo se zna,

ali postoje naznake da su „umjerenije“ u brzini reprodukcije i brzi za mladunce.

Položaj glodavaca i dvojezubaca u ekosustavu i značaj za čovjeka

Glodavci i dvojezubci važna su karika u ekosustavu. Zbog brze reprodukcije i velikog broja mladih u

kombinaciji sa malom veličinom važan su izvor hrane za mnoge predatore. Rezervoar su bolesti koje

mogu utjecati na brojnost ne samo njih samih, već i ostalih životinja u ekosustavu. Zbog svoje brojnosti

imaju značajan utjecaj na vegetaciju, disperziju sjemenja kao i održavanje simbiotskih odnosa viših

biljaka i gljiva. Značajan utjecaj imaju kao introducirane vrste na lokalne ekosustave. Treba napomenuti

da samo na glodavce otpada 40% svih sisavaca!

Oduvijek su obje skupine imale snažan utjecaj na ljude. Zečevi i kunići služe kao izvor hrane, jednako

kao i neki glodavci (dabrovi, puhovi, vjeverice). Od početaka agrikulture glodavci su imali značajan

utjecaj na razvoj ljudskog društva. Kao štetočine na poljoprivrednim usjevima ili u skladištima hrane

Page 54: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

54

utjecali su na civilizacije na više načina osim preko obične kompeticije za hranu sa ljudima. Pojava

nekih domaćih životinja (npr. domaća mačka) objašnjava se postojanjem glodavaca u ljudskoj blizini.

Najsnažniji utjecaj imaju kao prijenosnici bolesti na ljude. Obje skupine danas ljudima služe kao kućni

ljubimci, te kao izvrstan model životinjskog organizma za laboratorijska istraživanja.

Glodavci i dvojezubci u laboratorijskim istraživanjima

Činčila(Chinchilla laniger)

Porijeklo: Južna Amerika

Upotreba: krzno, znanstvena istraživanja, ljubimci

Životni vijek: 16 god

Specijalnosti: koprofagija, kupanje u prašini, tišina

Sojevi: po boji

Održavanje: individualno, haremi

Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 4 mjeseca

Estrus: 41 dan, nepravilno

Gravidnost: 111 dana

Broj mladih: 2

Zamorčić (Cavia porcellus)

Porijeklo: Južna Amerika

Upotreba: znanstvena istraživanja (TBC), ljubimci

Životni vijek: 6-8 god

Specijalnosti: koprofagija, vrlo vokalni, osjetljivi, ne penju se, ne grizu

Sojevi: 3

Održavanje: u grupama

Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 3-5 tjedna

Estrus: 13-20 dana

Gravidnost: 63-70 dana

Broj mladih: oko 3

Mongolski skočimiš ili gerbil (Meriones unguiculatus)

Porijeklo: Mongolija i Sjeverna Kina

Upotreba: znanstvena istraživanja (paraziti, neurologija), ljubimci

Životni vijek: 2-4 god

Specijalnosti: vrlo pitomi i čisti, kopanje, periodi neparenja, odgođena implantacija,

monogamija

Sojevi: po sklonosti prema epileptičnim napadajima

Održavanje: u grupama

Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 10 tj.

Estrus: 4-6 dana

Gravidnost: 22-26 dana

Broj mladih: 4-5

Page 55: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

55

Hrčak (Mesocricetus auratus)

Porijeklo: Sirija

Upotreba: znanstvena istraživanja (transplantacije, Leptospira), ljubimci

Životni vijek: 2-3 god

Specijalnosti: najveći volumen krvi, hibernacija

Sojevi: brojni

Održavanje: u grupama, odrasli sami

Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 4-6 tj. (6-8 tj.)

Gravidnost: 16 dana

Broj mladih: 5-10 (do 17)

Miš (Mus musculus)

Porijeklo: Euroazija

Upotreba: znanstvena istraživanja, hrana, ljubimci

Životni vijek: 1-2 god

Specijalnosti: najčešće lab. živ., Whittenov i Bruceov efekt

Sojevi: brojni (singenični sojevi)

Održavanje: u grupama

Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 6-8 tj.

Estrus: 5-6 dana

Gravidnost: 19-21 dan

Broj mladih: 5-10

Štakor (Rattus norvegicus)

Porijeklo: Euroazija

Upotreba: znanstvena istraživanja, ljubimci

Životni vijek: 2-3 god

Specijalnosti: inteligentni i relativno pitomi, nemaju žučni mjehur

Sojevi: brojni (singenični sojevi)

Održavanje: u grupama

Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 2-3 mj.

Estrus: 5-6 dana

Gravidnost: 21-23 dana

Broj mladih: 1-20

Kunić (Oryctolagus cuniculus)

Porijeklo: Europa

Upotreba: znanstvena istraživanja (testiranje pirogena i proizvodnja antiseruma)

Životni vijek: 5-10 god

Specijalnosti: koprofagija

Sojevi: brojni

Održavanje: individualno

Razmnožavanje:

Spolna zrelost: 5 - 9 mj.

Page 56: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

56

Estrus: nepravilan

Gravidnost: 30 - 32 dana

Broj mladih: do 23

Literatura

Linzey, D.W. (2003) Vertebrate biology. The McGraw-Hill, New York.

Pough, F.H., Janis, C.M., Heiser, J.B. (2008) Vertebrate life. 8th edn. Pearson education Inc., San

Francisco.

Rollin B. E., Kesel M. L. (1995) The Experimental Animal in Biomedical Research: Care, Husbandry, and

Well-being, An Overview by Species, Volume II. Boca Raton, Fla.: CRC Press.

Williams C.S.F. (1976) Practical guide to laboratory animals.The C.V. Mosby Company, Saint Louis.

Page 57: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

57

ZEBRICE KAO MODELNI ORGANIZAM U BIOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA

Dr. sc. Anamarija Štanbuk i Maja Šrut, dipl. ing.

Uvod

Zebrica (Danio rerio, Hamilton-Buchanan 1822) je mala bentopelagična ciprinidna tropska slatkovodna

riba koja prirodno obitava u rijekama sjeverne Indije, sjevernog Pakistana, Nepala te Butana u južnoj

Aziji. Prosječna veličina odraslih jedinki je 3-5 cm, a prepoznatljive su po četiri horizontalne pruge

tamnije sive ili sivoplave boje. Pruge se protežu od škržnih poklopaca pa do repa, koji je blijedo-

mliječne boje. Spolni dimorfizam kod spolno zrelih jedinki očituje se u veličini, obliku tijela te boji.

Mužjaci su u pravilu manji i tanjeg tijela te imaju narančasto-crveni odsjaj u srebrnim prugama duž

tijela što je posebno vidljivo na analnoj peraji. Ženke su veće, a zbog velikog broja jaja koje proizvode,

mogu se prepoznati po napuhnutim trbusima. Mogu proizvesti između 50 i 200 jaja svaki dan što se

može i dodatno stimulirati primjenom prirodne hrane (Artemia sp., Daphnia sp., naupliji). Lako se

uzgaja i održava u laboratorijskim uvjetima te proizvodi veliki broj potomaka koje je lako promatrati i

manipulirati tijekom embrionalnog razvoja zbog njihove optičke transparentnosti. Dostiže juvenilnu

fazu u roku od nekoliko tjedana, a spolnu zrelost u roku 3 do 4 mjeseca. Životni vijek zebrica iznosi

otprilike 5 godina.

Primjena zebrica u biološkim istraživanjima

Zebrica se u istraživanjima koristi od 60-tih godina prošlog stoljeća, a za široku primjenu zebrice kao

modelnog organizma zaslužan je profesor George Streisinger sa Sveučilišta u Oregonu. Njega je

zanimao razvoj modela kralježnjaka za genetičke studije, u prvom redu za proučavanje razvoja i

funkcije živčanog sustava, odnosno modela koji bi bio jednostavniji od miševa koji su se tada uvelike

koristili. Tim profesora Streisingera vrlo je brzo razvio različite genetičke tehnike na zebricama, a ubrzo

su se u istraživanja uključili i ostali znanstvenici što je rezultiralo mnogobrojnim znanstvenim

publikacijama u ranim 1980-tim, čime je zebrica kao modelni organizam dobila pažnju svih svjetskih

znanstvenih institucija. Veliki razvoj u području proučavanja zebrica dogodio se ranih 90-tih godina

istraživanjima mutanata zebrica koji su korišteni u svrhu razumijevanja uloge gena u normalnom

razvoju. Budući da se do tada zebrica pokazala kao iznimno pogodan modelni organizam uslijedilo je i

sekvenciranje cjelokupnog genoma koje je započelo 2001. godine.

Zebrica se pokazala kao značajan modelni organizam u neurobiološkim, genetičkim te farmakološkim

istraživanjima kao i u istraživanjima u molekularnoj i razvojnoj biologiji te kancerogenezi. Vrlo brzo

postala je široko korišten modelni organizam za proučavanje bolesti čovjeka i razvoja kralježnjaka jer

su mnogi fiziološki mehanizmi između riba i sisavaca visoko očuvani. Osim toga brzo našla je svoju

primjenu u toksikološkim istraživanjima kao model za istraživanje staničnih i molekularnih mehanizama

putem kojih okolišni toksikanti uzrokuju poremećaje normalnih razvojnih procesa. Opsežna istraživanja

na zebricama rezultirala su velikom bazom podataka o razvojnim stadijima embrija i ličinki, stvaranjem

brojnih mutantnih linija, genetski modificiranih jedinki, kao i kompletno sekvenciranim genomom.

Razvijene su i brojne stanične linije odraslih zebrica te embrija koje su svoju primjenu našle u mnogim

istraživanjima, posebno kao model u toksikološkim studijama. Posljednjih godina, embriji zebrica su

poprimili povećanu pozornost u istraživanjima zbog jednostavnog uzgoja i manipuliranja te kratkog

embrionalnog razvoja. Također transparentnost jaja omogućava lako praćenje stadija razvoja. U

toksikološkim istraživanjima standardiziran je test toksičnosti na embrijima zebrica (engl. zebrafish

Page 58: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

58

embryotoxicity test (ZET)) u kojem se prati razvoj embrija u prvih nekoliko dana nakon oplodnje. Test

omogućava proučavanje malformacija u početnim fazama razvoja embrija te se uspješno provodi za

procjenu toksičnosti otpadnih voda, raznih okolišnih uzoraka te pojedinačnih kemikalija.

Prednosti upotrebe zebrica u biološkim istraživanjima u prvom redu su jednostavnost i niski troškovi

uzgoja i održavanja, potom mala veličina, dostupnost velike baze podataka u različitim biološkim

disciplinama, brza izmjena generacija te produkcija velikog broja jaja. Mala veličina ličinki i odraslih

jedinki posebno je pogodna za toksikološka istraživanja jer minimalizira trošak kao i količinu otopina

kojima se zebrice izlažu. Osim toga, zebrica je pogodna zbog mogućnosti polaganja velikog broja jaja.

Jedan par spolno zrelih jedinki može proizvesti 200-300 oplođenih jaja u jednom mrijestu i ukoliko se

pravilno uzdržavaju takav mrijest mogu proizvesti svakih 5-7 dana. Brz embrionalni razvoj (3 dana) te

brzo sazrijevanje zebrica omogućavaju lako proučavanje transgeneracijskih promjena prilikom

proučavanja mutageneze. Optička transparentnost embrija zebrica omogućava efikasnu identifikaciju

fenotipskih osobina te razvojnih stadija, pogotovo u testovima toksičnosti gdje se kao rezultat bilježe

različite malformacije u razvoju. Rezultate dobivene na zebricama moguće je lakše ektrapolirati na

sisavce i ljude što nije moguće proučavanjem često korištenih modelnih beskralješnjaka (Drosophila

melanogaster, Caenorhabditis elegans). U novije vrijeme otkriven je i način partenogenetskog razvoja

kako bi se proizvele homozigotne jedinke čime se omogućava lakše proučavanje mutacija te njihovog

nasljeđivanja. Zebrice se također mogu klonirati iz somatskih stanica.

Uzgoj

Optimalni uvjeti za uzgoj zebrica u laboratorijskim uvjetima dobro su definirani budući da se zebrice

kao modelni organizmi koriste niz godina. Temperatura vode trebala bi biti podešena na 26 ± 1 °C,

režim svjetlosti 12 sati svjetla i 12 sati mraka, a zasićenost kisikom iznad 80%. Prilikom održavanja na

100 L odstajale vode profiltrirane preko aktivnog ugljena trebalo bi biti maksimalno 100 jedinki.

Kontinuirano je potrebno pratiti zdravstveno stanje zebrica te ukloniti one jedinke koje pokazuju neke

od sljedećih simptoma: a) nepravilan oblik tijela; b) napuhnute s podignutim ljuščicama; c) otvorene

rane; d) oštećene peraje; e) oštećen ili odstranjen operkulum; f) upaljene, crvene škrge i ubrzano

disanje; g) predugo zadržavanje na dnu akvarija ili plutanje na površini. Odrasle zebrice hrane se

suhom hranom 1-2 puta dnevno te ličinkama vrste Artemia i odraslim jedinkama vrste Daphnia.

Prilikom razmnožavanja zebrice je potrebno staviti u akvarije kapaciteta 4 L u omjeru 2 mužjaka na 1

ženku starosti između 4-15 mjeseci. Akvariji bi trebali imati mrežu na dnu kako bi se spriječio

kanibalizam jaja. Kao stimulans za razmnožavanje može poslužiti prava biljka ili plastična imitacija. Dan

prije razmnožavanja poželjno je držati mužjake i ženke u istom akvariju, ali razdvojene pregradom.

Ujutro nakon što se upali svjetlo potrebno je maknuti pregradu. U pravilu mrijest bi trebao započeti 30

minuta nakon paljenja svjetla. Sat vremena nakon mrijesta, jaja se mogu izdvojiti pomoću pipete te

odvojiti oplođena od neoplođenih. Tokom embrionalnog razvoja jaja se mogu držati u pločama s

jažicama u 1-2 mL vode, a nakon izvaljivanja ličinki potrebno ih je prebaciti u akvarije s aeriranom

vodom. Embrionalni razvoj traje 72 sata nakon čega se iz jaja izvale ličinke koje je u početku potrebno

hraniti papučicama, a potom ličinkama vrste Artemia.

Literatura

Braunbeck T, Lammer E. Fish Embryo Toxicity Assays. German Federal Environment Agency. UBA

Contract Number 203 85 422 (2006).

Page 59: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

59

Hill AJ, Teraoka H, Heideman W, Peterson RE. Zebrafish as a Model Vertebrate for Investigating

Chemical Toxicity. Toxicological Sciences 86 (2005) 6–19.

Kimmel CB, Ballard WW, Kimmel SR, Ullmann B, Schilling TF. Stages of Embryonic Development of the

Zebrafish. Developmental Dynamics 203 (1995) 253–310.

Page 60: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

60

PONAŠANJE ŽIVOTINJA

Doc. dr. sc. Zoran Tadić

Uvod

Vrlo je teško dati jednoznačnu definiciju ponašanja, bilo životinja, bilo čovjeka. Zato se u svim poznatim

udžbenicima ponašanja životinja uopće ne pojavljuje uska definicija ponašanja. Mogli bismo zapravo

reći da je ponašanje most između molekularnih, fizioloških i ekoloških aspekata života neke životinje.

Ponašanje je poveznica između organizma i okoliša, između živčanog sustava i ekosustava. Ponašanje

je jedno od najvažnijih svojstava životinje. Kao što su na pr. krila, dlaka, anatomija i fiziologija

nerazdvojne komponente neke životinje isto je to i njeno ponašanje. Da se izrazimo računalnim

riječnikom, ponašanje je sučelje (engl. interface) između životinje i okoliša kojim ona definira svoj

odnos sa njim.

Laboratorijske se životinje već desetljećima uzgajaju u zatočeništvu, ali uglavnom nisu izgubile

komponente ponašanja po kojima su istovjetne svojim divljim rođacima. Pošto se kao laboratorijske

životinje najviše koriste miševi i štakori, u ovom ćemo se kratkom pregledu osvrnuti na njihovo

ponašanje u standardnim laboratorijskim uvjetima.

Društveno ponašanje laboratorijskih miševa

Etogram predstavlja katalog svih ponašanja neke životinje. Možemo ga vrlo grubo podijeliti na etogram

društvenih i etogram solitarnih ponašanja. Društvena se ponašanja ispoljavaju kad se jedna životinja

nalazi u doticaju sa drugom (jednom ili više) životinjom. Solitarna ponašanja ispoljavaju se kada je

životinja sama.

Miševi su najčešće korištene laboratorijske životinje – lako se održavaju i uzgajaju, a mogu se genetski

manipulirati. Laboratorijski miševi, kao i štakori, spadaju u porodicu miševa (Muridae). Često se o

miševima misli da su to zapravo mali štakori (odn. da su štakori veliki miševi). To je, međutim, samo

djelomično točno, jer se društveni život štakora jako razlikuje od onoga u miševa – u međusobnim

interakcijama štakori su manje agresivni. U istraživanju ponašanja najčešće se koriste pojedinačni

miševi i štakori, ali treba naglasiti da su oni društvene životinje i da imaju vrlo složeno društveno

ponašanje (vidi dolje) koje se gotovo nikad nemože vidjeti, ako se te životinje drže u standardnim

laboratorijskim uvjetima. Miševi se često koriste u istraživanju ponašanja, najčešće u testovima učenja

i pamćenja (na pr. testovi pasivnog izbjegavanja i testovi prostornog pamćenja) te kao modeli za

bolesti poremećaja osobnosti.

Etogram miša sastoji se o opisa oko 60 ponašanja koja su razvrstana prema njihovoj funkciji, a koja miš

pokazuje u standardnom laboratorijskom kavezu. Dio etograma prikazan je u slijedećoj tablici:

Page 61: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

61

Kategorija Elementi ponašanja

Nesocijalno ponašanje Istraživanje, pranje, samostalno čišćenje krzna, češanje,

kopanje guranjem, kopanje odbacivanjem, trešnja, skakanje,

hranjenje, sjedenje, hodanje

Socijalno ponašanje – pažnja Praćenje, prilaženje, okretanje prema drugoj jedinki

Socijalno ponašanje - istraživanje Dodirivanje, njušenje, čišćenje

Spolna aktivnost Slijeđenje, pokušaj skakanja na ženku, skok na ženku

(uspješan), čišćenje genitalija, kretnje pri parenju, hodanje

preko partnera, intromisija, povišeno čučanje

Agresivnost Prijetnja, napad, ugriz, proganjanje, agresivno čišćenje

Ofenzivna ambivalentnost Agresivno postavljanje tijela bočno prema protivniku,

agresivno podizanje tijela na dvije noge

Defenzivna ambivalentnost Kosi položaj tijela, podizanje na dvije noge, defanzivno

podizanje na dvije noge

Ambivalentnost na veću udaljenost „Cik.cak“ hodanje, „cik-cak“ kruženje

Zaustavljeno bježanje Čučanje, „freezing“

Bježanje Spuštanje tijela, izbjegavanje dodira, povlaćenje, bježanje,

skok na rešetke

Ova tabela prikazuje samo dio ponašanja koja može ispoljiti laboratorijski miš, kada ga se u

laboratorijski kavez stavi sa istim takvim mišem.

Obrambeno ponašanje laboratorijskih miševa

Miševi i štakori imaju različite strategije bijega. Štakor, u laboratorijskim uvjetima, na napad odgovara

na dva načina. Prvi je čučanje. Čučanje, kao odgovor na napad, često se u štakora može vidjeti u

kavezima, ali to je tzv. ograničeni odgovor na napad, zbog nedostatka adekvatnog prostora za

povlačenje ili bijeg. Drugi je je submisivno ponašanje: Napadnuti se štakor baci na leđa i u tom se

položaju zadrži od nekoliko sekundi do nekoliko minuta. Bacanjem na leđa, štakor sakrije one dijelove

tijela koji u drugog štakora potiču napad (na pr. donji dio leđa), a to obično ublaži agresivnost

napadača tako da on odustaje od napada.

Page 62: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

62

Za razliku od štakora, miševi nikad ne pokazuju submisivno ponašanje pa, da bi riješili problem

agresivnog ponašanja drugog miša, najčešće moraju pobjeći. Bijeg je, međutim, u laboratorijskim

kavezima, vrlo ograničen, pa se napadnuti miševi obično naglo prestanu kretati i postave se u tzv.

defanzivni okomiti položaj ili DUP (DUP - engl. defensive upright posture). U tom položaju, trbuh je

okrenut prema napadaču, a glava je od njega okrenuta. Pri izvođenju DUP-a, miš obično ima otvorene

oči, podignute uši, a glavu polako podiže prema natrag. Napadač, kada se suoči sa ovakvim

ponašanjem, obično zauzme tzv. ofenzivni bočni položaj (engl. offensive sideways posture). Ovaj slijed

događaja znade na kratko zaustaviti agresivnost napadača. Nakon ovog, napadač obično pokuša obići

subsivnog miša da bi ga ugrizao u donji dio leđa. Napadnuti se tada okrene prema napadaču i pokušava

stalno zadržati napadača okrenutog prema vlastitom trbuhu tako da se, ako mu to situacija dopusti, u

jednom trenutku naglo okrene i pobjegne.

Agresivno (agonističko) ponašanje laboratorijskih miševa

Za razliku od štakora, veći dio života mužjaka laboratorijskog miša svodi se na agresivnost prema

drugim mužjacima. Obično je ona usmjerena prema drugom mužjaku kako bi ga se eliminiralo kao

potencijalnog rivala u parenju. Mužjaci miševa, ako se drže u zasebnim kavezima, gotovo odmah

postanu agresivni i to svostvo ispoljuju kad ih se ponovno stavi zajedno. Štakori gotovo nikad ne

pokazuju ovakvo svojstvo!

Agresivnost se razvija u laboratorijskih miševa kada su otprilike stari sedam tjedana. Zanimljivo je da

nisu samo mužjaci agresivni jedan prema drugom – u određenim uvjetima znaju biti agresivne i ženke,

posebice prema mužjacima i to kada brane gnijezdo i mlade u njemu. Ženke miševa u laktaciji posebno

su agresivne prema mužjacima, a ponekad čak i prema drugim ženkama. Agresivnost miševa pod

utjecajem je hormona, a spolovi pokazuju razlite načine agresivnosti: Mužajci najčešće grizu protivnika

u leđa i sapi, rijetko u bokove i hlavu, a gotovo nikad u trbuh. Suprotno tome ženke protivnika grizu

gdje stignu, po cijelom tijelu! To znači da su napadi mužjaka ritualizirani, a ženki nisu. To ukazuje da je

DUP vjerojatno evoluirao kao obrambeni mehanizam protiv drugih mužjaka te da su mozgovi mužjaka i

ženki drugačije programirani za agresivno ponašanje. Ženke rijetko napadaju druge ženke, a mužjaci

rijetko napadaju ženke, iako se nađe i izuzetaka.

Page 63: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

63

Hijerarhijska struktura miševa u laboratorijskim kavezima

Društvena struktura miševa u zatočeništvu laboratorija potpuno je drugačija od društvene strukture

divljih miševa (vidi dolje) i manje je etološki zanimljiva. Najčešće ne postoji vrlo stroga linearna

dominacijska hijerarhija (kao u divljih miševa) nego jedan ili dva dominantna mužjaka ostvaruju

despotski način ovladavanja ostalim subordinatnim mužjacima. Međutim i ovakav se način hijerarhije

rijetko vidi, jer su spolovi, u laboratorijskim uvjetima, najčešće razdvojeni.

Stvaranje teritorija u laboratorijskih miševa

Da laboratorijski miševi, kao i divlji, mogu stvoriti teritorij, najlakše se može pokazati pogodnim

sojevima kao što su DBA, C57BL i C57/BR. Stvaranje teritorija može se potaknuti na različite načine, ali

isključivo u većim prostorima (od 2 X 2 metra, pa na više), a kada ih mužjaci jednom stvore, oni iz njih

vrlo intenzivno tjeraju sve muške došljake. Ako su dva teritorija jedan kraj drugog, oba dominantna

mužjaka slobodno se kreću po vlastitom teritoriju, ali nikada ne prelaze u susjedni teritorij.

Bihevioralna ekologija ukazuje da je do evolucije teritorijalnosti došlo zbog čuvanja različitih resursa

odn. tbog ostvarivanja isključivog prava na njih, ako su ti resursi rijetki u prostoru i vremenu. U miševa

je evolucija teritorijalnosti isključivo vezana na polaganje prava na parenje i ostvarivanje prava na

ženke. S time je u vezi i evolucija sustava parenja koji u miševa možemo opisati kao poliginija obranom

resursa (engl. resource-defence poligyny). Kao i u divljih miševa, dominantni mužjak teritorij vrlo

intenzivno obilježava mokraćom – teritorij se prepoznaje po mirisnim obilježjima, a ne po vidnim!

Društveni život divljih kućnih miševa

Kućni su miševi noćne životinje. Hrane se ostacima hrane, ali ne ustručavaju se krasti i svježu hranu.

Najviše vole biljnu hranu, ali jesti će i hranu životinjskog porijekla, ako moraju. Oni su društvene

životinje: U koloniji ih može biti preko 50, u nekoliko obitelji. Obitelj najčešće čini nekoliko odraslih

ženki i njihovi mladunci, nekoliko subdominantnih mužjaka i jedan dominantni mužjak koji brani

teritorij i koji ima ekskluzivno pravo parenja sa svim ženkama.

Miševi su noćne životinje i međusobno komuniciraju zvukom, ali najviše mirisom odn. mokraćom.

Miševi u mokraći izlučuju mirisne/signalne tvari niske molekulske mase, ali i tzv. glavne mokraćne

proteine (engl. major urinary proteins - MUP). To su posebni proteini koje proizvodi jetra, a izlučuju se

u mokraći u velikoj koncentraciji: Mužjaci oko 30 mg / ml, a ženke i do 40% više od mužjaka. Ti proteini,

u svojem aktivnom mjestu, vežu signalne molekule male molekulske mase, te ih polako ispuštaju u

okoliš. U mokraći miševi izlučuju i proteine glavnog sustava tkivne podudarnosti (MHC proteini) koji

miševima koji ih ponjuše daju informaciju o stupnju srodnosti sa jedinkom koja ih je ostavila. Ovakav

način komunikacije (MUP + MHC) omogućuje miševima da o svojim susjedima saznaju baš sve:

reproduktivni status, društveni status u koloniji, reproduktivno stanje dominantnog mužjaka, stupanj

srodnosti sa drugim jedinkama i zdravstveno stanje pojedine jedinke. Sve ove informacije, miševi ne

dobivaju preko nosa nego preko tzv. vomeronazalnog ili Jacobsonovog organa. Možemo reći da je

mokraća identifikacijska karta svake jedinke koja se mijenja kako se jedinka fiziološki mijenja. Pošto

svaka jedinka pozna specifični miris kolonije, tj. mirise mokraće drugih jedinki u koloniji, nije moguće

da u koloniju sa strane uđe strana jedinka, a da odmah ne bude prepoznata kao stranac. O spolu nove

jedinke ovisi kako će se ostale jedinke prema njoj ponašati. Ako je to mlada ženka, moguće je da je u

koloniju i prihvate. Međutim, ako je to mužjak, pa čak i spolno nezreli, najvjerojatnije će ga odmah

napasti dominantni mužjak.

Miševi prskaju svoju mokraću u tankom mlazu svuda kuda se kreću ili ju ostavljaju u malim točkama.

Svaki prostor kojim se kreću miševi prekriven je mokraćom, u tolikoj mjeri da se na mjestima gdje se

Page 64: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

64

miševi najviše kreću, od prašine i kristala mokraće, stvaraju mini stalagmiti. Takvih stalagmita ima

najviše na mjestima hranjenja i na ulazu u gnijezda.

Dominantni mužjak ima ekskluzivno pravo parenja sa svim ženkama te čuva teritorij obitelji. On

neprekidno obilazi teritorij i intenzivno ga označuje: Ženke i subdominantni mužjaci ostavljaju nekoliko

desetaka oznaka dnevno, ali dominantni mužjak ostavlja ih i nekoliko stotina. Osim toga, on u mokraći

izlučuje spojeve koji su vrlo privlačni ženkama, ali kod drugih mužjaka oni izazivaju oprez i potiču

agresivnost. Dominantni mužjaci stalno traže oznake stranih mužjaka u vlastitom teritoriju kako bi ih

odmah neutralizirali prskanjem vlastite mokraće i tako osiguravaju da je njihova oznaka teritorija uvijek

najsvježija. Većina stranih mužjaka pobjegne, kada naiđe na svježe oznake dominantnog mužjaka ili

uopće izbjegavaju ulazak na svježe označeni teritorij. Tako se smanjuje postotak agresivnih interakcija

mužjaka u kojima oba mužjaka mogu biti ozlijeđena.

Međutim, mužjak može izgubiti sposobnost čestog označavanja teritorija (ostari, razboli se, itd.), pa

drugi mužjaci češće ulaze i počnu ga označavati svojom mokraćom. Tu činjenicu odmah počnu koristiti

ženke. Naime, one će se pariti sa onim mužjakom koji najviše mokraćom označava teritorij kolonije.

Kako frekvencija označavanja teritorija rezidentnog dominantnog mužjaka pada, tako mu i ženke sve

više „okreću leđa“ i postaju nevjernije: Sve će se više pariti i sa stranim mužjacima na rubu kolonije.

Pošto mužjak ne može po mirisu prepoznati vlastito potomstvo, te će ženke uzgojiti i u koloniju unijeti

potomstvo drugog oca. Prema tome, što dominantni mužjak manje kemijski „kontrolira“ ženke, to mu

one postaju sve nevjernije.

Ako mužjak dulje vrijeme slabije označava teritorij, može se dogoditi da ga na borbu izazove i svrgne

neki mužjak izvana – mnogi dominantni mužjaci u kolonijama divljih kućnih miševa zapravo su mužjaci

koji ne potječu iz obitelji nego su svrgnuli dominantnog mužjaka i zavladali kolonijom, tj. obitelji. To je

zapravo i ženkin cilj: pariti se sa mužjakom koji je genetski što različitiji od njih. Time potomstvo dobiva

različitiji sustav gena tkivne podudarnosti što ima čitav niz povoljnih ekoloških i imunoloških posljedica

za potomstvo.

Ako nema dovoljno slobodnog prostora, može se dogoditi da dominantni mužjak počne tolerirati nove

mužjake u svojem teritoriju, ali oni tu toleranciju „plaćaju“ tako što ostavljaju vrlo malen broj

mokraćnih oznaka. Tada ih dominantni mužjak ne smatra konkurencijom, ali oni tada nisu atraktivni

ženkama – za toleranciju, tj. suživot sa dominantnim mužjakom drugi mužjaci plaćaju skupu cijenu!

Možete pomisliti da zapravo ženke samo iskorištavaju mužjake, kako bi dobile genetički što kvalitetnije

potomstvo. To je apsolutno točno, jer je to zapravo i cilj ženki: dominantni mužjaci neprestano jure po

teritoriju, prskaju mokraću uokolo da bi oznake bile svježe, a ženke kontroliraju da li oni to intenzivno

rade. Ako rade, onda su fizički OK, pa su atraktivni ženkama. Ako to ne rade velikom frekvencijom,

ženke se polako okreću od njih (jer sigurno nisu više fizički u redu). Pa kakva je onda korist za

dominantnog mužjaka, jer ženke ga „besramno“ iskorištavaju? Njegov je cilj ostaviti što je veći mogući

broj potomaka sa vlastitim genima. Zato je evolucijom u mužjaka nastala sposobnost kemijske

manipulacije ženkama i to na vrlo „perfidan“ način: Mužjaci mogu mirisom svoje mokraće mijenjati

reproduktivni status ženke i to prema slijedećoj tablici:

Page 65: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

65

Donor mokraće

Nepoznati odrasli

mužjak

Ženka koja se ne

razmnožava, a živi u

skupini ženki

Gravidna ženka ili

ženka koja doji

Akceptor

mirisa

mokraće

Juvenilna

ženka

Ubrzava pubertet Odgađa pubertet Ubrzava pubertet

Odrasla ženka Potiče estrus i ubrzava

ciklus

Produžuje anestrus ili

inducira

pseudogravidnost

Produžuje estrus

Gravidna ženka Prekida ranu fazu

gravidnosti i potiče

estrus

Tako će mlada ženka, kad dođe u kontakt sa mokraćom nepoznatog odraslog mužjaka, vrlo brzo

postati spolno zrela, čak i do šest dana ranije nego kada ne bi bila izložena njegovoj mokraći. Odrasli će

novi mužjak, ako je ženka u ranim fazama gravidnosti (zametak se još nije smjestio u uterus), svojom

mokraćom izazvati pobačaj! Dovoljno je da ju ona samo pomiriši i gubi svoje potomstvo, ali i odmah

ulazi u novi estrusni ciklus tako da će se mužjak moći brzo sa njom ponovno pariti.

Odrasle ženke žive u zajednicama i kemijski mogu manipulirati mladim i drugim odraslim ženkama.

Ženke obično legu mladunce u jednom gnijezdu i zajedno dijele sve teškoće materinstva. Ženke

preferiraju dijeliti gnijezdo sa srodnim ženkama, pa će ženke sinkronizirati i ubrzati svoje

reprodukcijske cikluse, ako prime kemijske informacije od ženki koje su već gravidne.

Često se dogodi da je razmnožavanje otežano, zbog nedostatka pogodnog prostora za uzgoj

mladunaca. Ako tri ili više ženki imaju priliku za razmnožavanje, one će signalima u mokraći inhibirati

pubertet u mladih ženki za više od 20 dana te produljiti estrusni ciklus u drugih ženki. Tako one

sprječavaju razmnožavanje u prenapučenim uvjetima. Međutim, ako prostora ima dovoljno, ovakva

inhibicija nestaje i dolazi do eksplozivnog razmnožavanja. Ovaj nevjerojatan način kemijske kontrole

omogućuje ženkama da se ubrzano razmnožavaju u pogodnim uvjetima, ali da zaustave razmnožavanje

u uvjetima kad bi potomstvo imalo smanjene mogućnosti preživljenja.

Literatura

Dixon A. K., Fisch H. U., McAllister K.H. (1990) Ethopharmacology : A Biological Approach to the Study

of Drug-Induced Changes in Behavior. Adv. Study Behav. 19: 171 – 204

Blanchard R. J., Flannelly K. N., Blanchard D. C. (1986) Defensive Behaviors of Laboratory and Wild

Rattus norvegicus. J. Comp. Psychol. 100: 101 – 107

H. Hedrich: “The Laboratory Mouse“, Elsevier Ltd., London, 2004

Page 66: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

66

GENETIKA I STANDARDIZACIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA

Doc. dr. sc. Domagoj Đikić

Laboratorijski glodavci i nastanak sojeva

Razvoj sojeva laboratorijskih glodavaca (miš, štakor, zamorac) i laboratorijskih zečeva započinje u

prvim desetljećima 20 stoljeća. Ostale manje laboratorijske životinje koje se standardno upotrebljavaju

u biomedicinskim istraživanjima (mačka, tvor, psi ) standardiziraju se tek u drugoj polovici dvadesetog

stoljeća, i to najčešće kao nesrođene uzgojne skupine u pojedinim istraživačkim centrima.

Laboratorijski glodavci ipak su najčešći modeli u biomedicinskim istraživanjima. Porijeklo većine

današnjih definiranih linija i sojeva laboratorijskih miševa potječe iz 1909 godine od rasplodnih parova

uzgajivača C.C. Little-a, koji je miševe uzgajao komercijalno kao kućne ljubimce i uočio nastanak novih

stabilnih fenotipova. Iz iste godine potječe i većina laboratorijskih štakora a porijeklo sojeva i

rasplodnih linija može se pratiti od uzgojnih parova Wilhelmine Dunning. Sojeve laboratorijskih

zamoraca razvijali su G.M. Romel i kasnije S. Wright od 1906 godine. Nekoliko sojeva ovih

laboratorijskih glodavaca u upotrebi su i danas poput primjerice soja DBA. Određeni broj sojeva

laboratorijskih miševa potječe od uzgojnih i rasplodnih skupina koje su krajem 19 i početkom 20

stoljeća uzgajane u Japanu i Kini. Primjerice Waltzing mice, su miševi koje se uzgajalo kao kućne

ljubimce jer su imali mutaciju za poremećaj u srednjem uhu što se fenotipski očituje tako da se

životinje vrte u krug dok se kreću. Uzgojem u srodstvu ovakvo se fenotipsko svojstvo ustalilo.

Geneološko stablo i kronologija nastanka sojeva laboratorijskih miševa može se naći na stranici

(http://www.informatics.jax.org/mgihome/genealogy/). U svijetu postoji nekoliko tvrtki koje prodaju

sojeve laboratorijskih glodavaca za biomedicinska istraživanja a najpoznatiji su Charles-River, Harlan i

Jaxon Laboratories. ICLAS-International Council on Laboratory Animal Science od 1972 navodi pravila

za klasifikaciju i nomenklaturu pojedinih sojeva.

Sojevi laboratorijskih životinja

Laboratorijske životinje najčešće se održavaju kao standardizirani sojevi. Uzgoj sojeva može biti u

nesrođenom ili srođenom rasplodu. Naime kolonije i skupine životinje koje su zasnovane na malom

broju rasplodnih parova imaju tendenciju povećanja stope promjene koeficijenta srođivanja, odnosno

imaju tendenciju gubitka genetičke raznolikosti i varijabilnosti (heterozigotnosti).

Koeficijent inbridinga (koeficijent srođenosti tj. koeficijent srodstva)

Koeficijent srođivanja (F) je brojčani koeficijent vjerojatnosti da su dva alela na genskom lokusu

identične kopije istog gena, po porijeklu nastala u prijašnjih generacija. Ako je vrijednost F=0 tada u

koloniji nema srođivanja, odnosno razina heterozigotnosti svih genotipova je potpun. Ukoliko je F=1

tada u koloniji 100% populacije ima homozigotni genotip. Srođivanje ili inbriding se u pojedinoj

generaciji računa prema formuli :

F=1/8Nm+1/8Nf

F-koeficijent srođivanja, Nm-broj mužjaka u rasplodu, Nf- broj ženki u rasplodu

Page 67: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

67

Iz formule je vidljivo da je koeficijent srođivanja izravno ovisan o broju rasplodnih parova i broju

generacija. Na Slici 1. Prikazana je porast koeficijenta srođivanja u ovisnosti o broju generacija i broju

rasplodnih parova u uzgojnoj koloniji. Ova pravila predstavljaju temelj za definiranje sojeva

laboratorijskih životinja čija se genotipovi (homozigotnost i heterozigotnost) i fenotipovi razlikuju s

obzirom na vrstu uzgoja.

Slika 1. Porast koeficijenta srođivanja

ovisno o broju generacija i broju

rasplodnih parova u koloniji

laboratorijskih životinja

Prema navedenome možemo podijeliti sojeve laboratorijskih životinja kako je prikazano u Tablici 1.

Tablica 1. Skupine laboratorijskih životinja s obzirom na stupanj srođivanja i genetičku uniformnost.

Skupina genetički

nedefiniranih sojeva

Skupina

Genetički djelomično

definiranih sojeva

Izogenični sojevi

Nesrođeni sojevi

(engl. outbreed stocks)

Mutanti iz nesrođenih sojeva

(engl. Mutants on outbreed

background)

Srođeni sojevi (engl. Inbreed

strain)

Genetički heterogene

skupine

Transgenični miševi iz

nesrođenih sojeva (engl.

Transgenes on an outbreed

background)

Kongenični sojevi

Segregacijski hibridi

(engl. Segregating hybrids)

Srođeni sojevi u nastanku Konsomični sojevi

Napredne križane linije (engl.

Advanced intercross lines)

Klonovi i monozigotski blizanci

Rekombinantni srođeni i

kongenični sojevi

Transgenički i knockout sojevi

stvoreni iz srođenih sojeva

Page 68: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

68

Skupina genetički nedefiniranih sojeva

Nesrođeni sojevi (engl. Outbreed stocks)

Nesrođeni sojevi su skupine genetički heterogenih životinja koji se održavaju kao zatvorene kolonije

jedinki iste vrste u kojoj se vremenom učestalost alela i genotipova mijenja najviše do jedan posto po

generaciji. Osnovna karakteristika ovih sojeva je da se ne sparuju u srodstvu a na taj se način osigurava

veća heterozigotnost alela za pojedina svojstva. Neki najčešći nesrođeni sojevi prikazani su u Tablici 2.

Poznat je veliki broj standardiziranih nesrođenih sojeva miševa i štakora. Također je poznat i jedan

nesrođeni standardizirani soj zlatnog sirijskog hrčka i jedan standardizirani soj mongolskog gerbila koji

su komercijalno dostupni u Charles Rivers Laboratories. Većina ostalih laboratorijskih životinja (primati,

mačke, tvorovi i druge životinje) uzgajaju se u pojedinim biomedicinskim istraživačkim kolonijama ali

ne postoji standardizacija poput one za miševe i štakore. Iako se za pojedine životinje koje se ponekad

upotrebljavaju u biomedicinskim istraživanjima poput primjerice za pse ili svinje sa definiranjem

pasmine koja se upotrebljava u pokusu može govoriti o relativno poznatim fenotipskim i genotipskim

svojstvima za tu pasminu.

Nesrođeni sojevi laboratorijskih glodavaca najčešće se upotrebljavaju u biomedicinskim istraživanjima

u kojima se u pojedinoj pokusnoj skupini želi simulirati raznolikost populacije na odgovor na primjerice

testirani lijek ili ksenobiotik. Međutim mjerenjem bilo kojeg biološkog pokazatelja (primjerice

aktivnosti nekog enzima kao odgovor na testiranu kemikaliju) u svakoj se skupini mora upotrijebiti više

životinja nego što bi to bio slučaj sa homozigotnim srođenim sojem. U prve četiri generacije životinje se

sparuju nasumce, a nakon toga se, s obzirom na veličinu kolonije, sparuju po posebnim protokolima

(Tablica 3).

Tablica 2. Primjeri nekih nesrođenih sojeva laboratorijskih glodavaca.

Laboratorijski miš Laboratorijski štakor Laboratorijski zamorac

Swiss albino Wistar Dunkin-Hartley

CFW Sprague-Dewly Pirbright-Hartley

SC Long-Evans Hartley

SKH-1 RNU

Prednost pri uzgoju nesrođenih sojeva je manji broj defektnih životinja u pojedinom leglu, veći

reproduktivni fitness i vitalitet potomaka što u konačnici ima i manju cijenu jer je moguće za pojedini

pokus u biomedicinskim istraživanjima osigurati veći broj životinja jednake dobi, težine i spola. Ipak,

unutar svake pokusne skupine nesrođene životinje su genetički neujednačene i ne zna se pojedini

genotip svake jedinke. Za utvrđivanje genotipa za pojedini alel od interesa potrebno je provesti

genotipizaciju svakog pojedinog alela i jedinke u pokusu. Metode genetičke kontrole kvalitete za

nesrođene sojeve nisu razvijene kao za srođene sojeve. Primjerice ne postoji standardna metoda tj.

popis alela koji čine razliku između Wistar i Sprague Dewly nesrođene sojeve štakora. Prilikom uzgoja

nesrođenih sojeva cilj je sprječavanje povećanja koeficijenta inbridinga. To se postiže protokolima

sparivanja. Tablica 3. Jedinke pojedinog nesrođenog soja razlikuju se na nekoliko tisuća lokusa.

Međutim prema Hardy-Weinbergovom zakonu frekvencije pojedinih gena u populacijama takovih

sojeva ostaju stalne. Promjene frekvencije gena u nesrođenom soju može se postići unošenjem novih

jedinki u populaciju koja se postiže unosom novih jedinki u koloniju, ponekad i namjerno. Drugi način

promjene frekvencije gena je nastankom spontanih mutacija iako je stopa nastanka spontanih mutacija

relativno visoka (105-106 po lokusu). Ponekad se u pojedinom spoju prakticira usmjerena selekcija

Page 69: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

69

odnosno namjerni odabir nekog poznatog fenotipskog svojstva. Nesrođeni se sojevi mogu promijeniti i

slučajnim genetičkim pomakom (engl. random genetic drift) je promjena učestalosti alela, tj.

genotipova koja se javlja kad se populacija smanjuje, pa sljedeća generacija može imati promijenjenu

učestalost alela zbog ispadanja velikoga broja gameta Koji će alel i u kojoj količini ispasti iz populacije,

ovisi o slučaju. Konačni rezultat može biti ili gubitak ili učvršćivanje (fiksacija) određenog alela (q = 0 ili

q = 1). Brzina kojom će se to dogoditi ovisi o početnoj učestalosti alela i veličini populacije. (Ako je

populacija veća od 100 parova, genetički pomak je manji od 1 % po generaciji.) Što je populacija manja,

određeni alel će se brže izgubiti, odnosno fiksirati, a kad se to dogodi, više neće biti genetičkoga

pomaka, osim ako se ne dogodi nova mutacija.

Genetički heterogene skupine, segregacijski hibridi (engl. Segregating hybrids) i napredne križane linije

(engl. Advanced intercross lines) uglavnom su sojevi dobiveni križanjem dva ili više srođena soja a

takvi su križanci dalje održavani po protokolima križanja nesrođenih linija.

Nomenklatura nesrođenih sojeva

Standardizirani nesrođeni sojevi obilježava se tako da se na početak stavi oznaka ustanove koja soj

uzgaja (prvo slovo je veliko, ostala su mala), zatim slijedi dvotočka pa oznaka soja (velika latinska

slova), npr. Har:WISTAR (Harlan Laboratories).

Tablica 3. Primjer protokola uzgoja nesrođenih sojeva za izbjegavanje povećanja koeficijenta

inbridinga, sustav kombinira parne i neparne brojeve.

BROJ NOVOG KAVEZA BROJ STAROG KAVEZA

IZ KOJEG JE MUŽJAK

BROJ STAROG KAVEZA

IZ KOJEG JE ŽENKA

1 1 2

2 3 4

3 5 6

4 7 8

5 9 10

6 11 12

7 2 1

8 4 3

9 6 5

10 8 7

11 10 9

12 12 11

Izogenički sojevi

To su sojevi u kojima je većina jedinki sa visokim koeficijentom srođenosti i jedinke su genetički

uniformne tj. imaju visok stupanj homozigotnosti (nose iste kopije alela za pojedini gen).

Srođeni sojevi (engl. Inbreed strain)

Srođenim sojem smatra se soj koji nastaje sparivanjem u u bliskom srodstvu (incestuoznim

sparivanjem brat X sestra) tijekom najmanje 20 generacija, prema slici 1 vidi se da se pri takovom

sparivanju koeficijent srođivanja približava vrijednosti od 1 (idealnoj teoretskoj 100% homozigotnosti).

Ovakva visoka srodnost postiže se sparivanjem potomaka i jednog od roditelja pri čemu je pravilo da se

Page 70: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

70

u sparivanje uzima uvijek mlađi od dvaju roditelja. Za standardizirane srođene sojeve moguće je pratiti

rasplodnu liniju i porijeklo soja do ishodišnih parova s početka prošlog stoljeća. Ovakvim uzgojem

postiže se izogeničnost tj. genetička istovjetnost jedinki pri čemu je prednost da se za genotipizaciju

(genetičku karakterizaciju pojedinog gena) može upotrebljavati samo jedna jedinka u koloniji.

Izogeničnost omogućuje da bilo koji rasplodni par koji započinje novu koloniju nosi iste gene kao i

jedinke koje ostaju u ishodišnoj koloniji. Izogenični su miševi histokompatibilini što omogućuje pokuse

transplantacije bez odbacivanja transplantata (što je prije i bio jedan od testova za srodnost između

jedinki sojeva). Zbog genotipske i fenotipske uniformnosti u pokusima se može dobiti veća razina

statističke preciznosti sa manjim brojem jedinki u pokusu. Promjene frekvencije alela u srođenim

sojevima je minimalan a s obzirom na stopu mutacija u populaciji (po generaciji u 105 gameta dolazi

jedna promjena po lokusu) ovakvi se sojevi mogu održavati godinama bez da se nove mutacije ustale ili

fenotipski ispolje u populaciji. Također, izogene sojeve je jednostavno identificirati genotipizacijom za

pojedine lokuse (SNP-Single nucleotide polymorphism). Za referencu o pojedinim genetičkim

markerima koji definiraju srođene sojeve najbolje je proučiti http://www.jax.org/ i

http://snpcenter.grcf.jhmi.edu/mouse_genotyping.html. Ukupni genom 11 srođenih sojeva poznat je

do danas. Rasplod u srodstvu incestuoznim sparivanjem provodi se tako da se iz svake generacije

sparuju brat i sestra i najčešće se vode kao zasebna reproduktivna linija a svi ostali potomci mogu se

upotrebljavati za pokuse. Prilikom uzgoja u srodstvu može doći do akumulacije štetnih mutacija.

Voditelji uzgoja prate parove koji imaju veći broj mladih u leglu sa većom vitalnosti i odabiru takve

jedinke za daljnji uzgoj. Ponekad za pokuse treba proizvesti veći broj životinja. Tada se može pribjeći

tzv. skupnom ili haremskom uzgoju, pri čemu se u rasplodnu skupinu stavlja nekoliko sestara i jedan

brat u većem kavezu ali se takvi potomci ne uzimaju u obzir za održavanje linije. Podlinije i podsojevi

nastaju kada se grane odvoje prije 40 generacije (između 20-40)-ostatak heterozigotnosti) ili razlike

nastale mutacijom a obilježava ih genska razlika između linija. Mogu nastati i procesima rukovanja:

hranjenja putem majke, presađivanje jajne stanice, umjetnim hranjenjem, presađivanjem jajnika ili

pohranjivanjem u smrznutom stanju ili prenošenjem skupine drugom istraživaču. Najčešći srođeni

sojevi laboratorijskih glodavaca prikazani su u Tablici 4 i 5. Za zamorce je interesantno da ako je u

prošlosti postojalo oko 20 srođenih sojeva zamoraca danas ih je ostalo samo dva (Tablica 5.).

Koizogeni, kongeni ili segregirajući srođeni sojevi

Kongenični sojevi su životinje koje se razlikuju samo u jednom kromosomskom lokusu ili regiji i

predstavljaju dragocjen model za proučavanje tog gena.

Tablica 4. Najčešći srođeni sojevi i pripadajući podsojevi laboratorijskih miševa i fenotipske osobitosti

nastale kao posljedica selekcije i uzgoja u srodstvu (slijedeća stranica)

Page 71: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

71

Soj Podsoj Osobitost

A A/ He A/J A/WySn

Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde

AKR AKR/J AKR/N AKR/Cum

Visoka pojavnost leukemija (Thy 1.2 alel u AKR/Cum, i Thy 1.1 alel u drugim podsojevima (ovi geni kodiraju površinske proteine stanica T)

BALB/c BALB/cj BALB/cAnN BALB/cBy

Osjetljivi na zračenje Uporaba u tehnologiji svaranja hibridoma Mnoge mijeloidne stanične linije su proizvedene u ovim miševima

CBA CBA/J CBAH CBA/N

Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine u CBA/J Gen (xid) uzrokuje imunodeficijenciju vezano za X kromosom u CBA/N miševa

C3H C3H/He C3H/HeJ C3H/HeN

Gen (rd) uzrokuje oštećenje retine Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde u mnogim podsojevima (nositelji virusa koji prouzrokuje tumor mliječne žlijezde, prijenos preko mlijeka majke u potomstvo

C57BL/6 C57BL/6J C57BL/6By C57BL/6N

Visoka pojavnost hepatoma (tumor jetre) poslije zračenja Visoka aktivnost komplementa

C57BL/10 C57BL/10J C57BL/10ScSn C57BL/10N

Bliski s C57BL/6 ali se razlikuju u najmanje 2 lokusa Česti partner u pripremi kongenični miševa

C57BR C57BR/cdj Učestali tumori hipofize i jetre Rezistentan na x-zračenje

C57L C57L/J C57LN

Osjetljivi na eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis (EAE) Visoka frekvencija tumora hipofize i stanica mrežnice

C58 C58/J C58/LwN

Visoka pojavnost leukemija

DBA/1 DBA/1J DBA/1N

Visoka pojavnost tumora mliječne žlijezde

DBA/2 DBA/2J DBA/2N

Slabi imunosni odgovor na neke antigene Slabi imunosni odgovor na pneumokokne polisaharide tipa III

HRS HRS/J Hairless (hr)gen obično u heterozigotnom stanju

NZB NZB/BINJ NZB/N

Visoka pojavnost autoimunih hemolitičkih anemija i nefritisa sličnom sistemskom lupusu eritematozusu (SLE) autoimune bolesti slične SLE u F1 generaciji križanih s NZW

NZW NZW/N SLE-tip autoimunostiu F1 generaciji križanih s NZW

P P/J Visoka pojavnost leukemija

SJL SJL/J Visoka razina agresije i borbe to smrti, posebice mužjaci

SWR SWR/J Naginju razvoju autoimuni bolesti, posebice EAE

129 129/J 129/SvJ

Visoka pojavnost spontanih teratokarcinoma

Page 72: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

72

Tablica 5. Srođeni sojevi laboratorijskih štakora i laboratorijskih zamorčića

Nomenklatura srođenih sojeva laboratorijskih miševa

Osnovne informacije i pravila nomenklature mogu se naći na stranicama

http://www.informatics.jax.org/mgihome/nomen/strains.shtml).

Srođeni soj obilježava se veliki latinskim slovima (npr. A, CBA) ili slovima i brojevima, s time da

je na početku oznake veliko slovo (npr. C3H, C57BL). Izuzetak mogu biti stariji sojevi (npr.

129P1/J).

Naziv soja treba biti što kraći i jedinstven (tj. novome soju ne smije se dati oznaka postojećega

soja objavljena u listi nazivlja).

Ukoliko se sojevi razdvajaju prije dvadesete generacije srođivanja, tada se smatraju srodnim

sojevima pa im se daju oznake koje ističu njihovu srodnost (npr. NZB, NZC, NZO).

Kada se jednom uzgoji, srođeni soj je genetički stabilan, međutim vremenom se mogu pokazati

i promjene. Ako je soj razdvojen u više grana, a među njima se javljaju ili bi se mogle javiti

razlike, govori se o podsojevima. Razlike se javljaju zbog fiksiranja različitih alela koji potječu od

heterozigotnosti zaostale nakon 20. generacije srođivanja ili radi nakupljanja novih mutacija.

Podsojevima istoga soja smatraju se:

- grane odvojene između 20. i 40. generacije srođivanja;

- grane koje su međusobno udaljene 20 ili više generacija od zajedničkoga pretka;

- grane u kojima je uočena razlika u genima.

Podsoj se obilježava tako da se nazivu soja iza kose crte pridruži kratica laboratorija u kojemu

je podsoj uzgojen (npr. C57BL/GoHCro). Izuzetak su oznake BALB/c, DBA/1 i DBA/2 jer ne

označavaju podsojeve, nego različite sojeve.

Ponekad se uz oznaku srođenog soja u zagradi navodi broj generacija srođivanja, npr. ACI/N

(F159).

Ako nije poznat početni broj generacija srođivanja, oznaka je npr. C3H/HeJ-ruf (F?+25).

Pravila za obilježavanje srođenih sojeva miševa donosi i nadzire Međunarodni komitet za

standardiziranu nomenklaturu miševa, a podaci se mogu naći na web stranici: http://www.

informatics.jax.org.

Križanci F1

Ukoliko se križaju jedinke iz dvaju različitih srođenih sojeva, potomci se nazivaju križanci prve

sinovljeve (filijalne) generacije (F1). Ti potomci su međusobno identični, ali su heterozigotni na

Laboratorijski štakor

Fischer Sprague-Dewly BDIX Copenhagen LEW FHH SHR BUF PCK F344 Dahl/SS WKY

Laboratorijski zamorac

Strain 2 Strain 13

Page 73: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

73

svim lokusima na kojima se roditeljski sojevi razlikuju. Za dobivanje križanaca F1 neophodno je

uvijek nanovo križati roditeljske sojeve.

Križanci F1 obilježavaju se tako da se prvo upiše kratica oznake majčinog soja, zatim kratica

oznake očevog soja i oznaka F1, npr. D2B6F1 (D2 je kratica soja DBA/2, a B6 je kratica soja

C57BL6/J) (Silver 1995).

Recipročni hibridi (tj. križanci istih sojeva, s time da je jednom majka, a drugi put otac

pripadnik istog soja) ne moraju biti identični jer iako imaju identične jezgre, po majci mogu

imati različite 51

Životinje s posebnim genskim obilježjima

Transgenični miševi i Knock-out miševi (miševi s izbačenim genom)

Transgenične životinje nastaju nespolnim putem tijekom embrionalnog razvoja kada se novi gen

neposredno u ubacuje genom. Knock-out-inaktivacija gena u genomu ugradnjom strane DNA ili

zamjena postojećeg gena mutiranom varijantom. Knock-in-uvođenje novog gena u postojeći genom.

1995. je osnovana mišja Knock-out baza podataka (MKMD mouse knockout and mutation database,

http://research.bmn.com/mkmd)

Da bi promjena bila stalna (nasljedna) transgen mora biti stabilno integriran u nasljedni materijal

spolnih stanica. Dugoročna ekspresija transgena ovisi o njegovoj integraciji u genom domaćina a

integracija je najčešće nasumična. Transgen se često integrira kao konkatamer (više uzastopno

povezanih transgena). Endogeni enzimi za popravak DNA stvaraju prekide u genomskoj DNA da bi

došlo do ugradnje. Način uvođenja transgena. Izravna transfekcija ili retrovirusna transfekcija

embrionalnih matičnih stanica i njihovo uvođenje u blastocistu provodi se retroviralna infekcija ranih

embrija, izravno mikroinjektiranjem DNA u oocite, prijenosom putem spermija, elektroporacijom ili

elektrofuzijom ili transfekcijom embrionalnih matičnih stanica. Transgenične se životinje koriste za

otkrivanje uloge pojedinih gena (Povećana ekspresija ciljnog gena, knock –out, knock-in, mutageneza),

proučavanje genskih mutacija in vivo, razumijevanje kontrole genske ekspresije i proučavanje bolesti,

genetičko obilježavanje organizma (Zeleni fluorescentni protein), proizvodnju biofarmaceutika

(primjerice proizvodnja inzulina u kravljem mlijeku, hormona rasta, interleukina, laktoferina, itd.).

Nomenklatura transgeničnih sojeva

Naziv transgena sastoji se od pet dijelova:

Oznaka Tg, što znači da se radi o transgenu.

Oznaka kako je transgen unesen: N = nehomologno unesen, R = ugrađen putem retrovirusa i H

= unesen homolognom rekombinacijom.

Oznaka što je uneseno (stavlja se u zagradu): primjerice, oznaka gena ili An = anonimna

sekvenca, Rp = reporterska sekvenca, Et = zamka za pojačavanje, Pt = promotorska zamka i Sn

= sintetička sekvenca.

Laboratorijski broj transgena.

Oznaka laboratorija.

Primjer za naziv transgena: TgN(RpPgk2)4Cas

Naziv soja u koji je transgen unesen je npr.: C57BL/6J - TgN(CD8Ge)23Jwg

Page 74: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

74

Tablica 6. Usporedba transgeničnih i knockout miševa

Osobitosti Transgenični miševi Knockout miševa

Stanice koje primaju DNA

zigote Embrionalne matične stanice (ES)

Uporabljeni DNA konstrukti

Prirodni geni ili cDNA Mutirani geni

Način dostave Mikroinjekcija unutar zigote i implantacija unutar lažno gravidne majke

Transfer embrionalne matične stanice do blastocite i implantacija unutar lažno gravidne majke

Ishod Unos gena Gubljenje gena

Literatura

Šuman L. Uvod u znanost o laboratorijskim životinjama (2011). Udžbenik Sveučilišta u rijeci. pp. 94

http://lsuman.digitaledition.org/

The Laboratory Mouse-Handbook of Experimental Animals (2004) Ed. Hedrich JH, Bullock GR, Elsevier

Academic Press. pp. 600.

The Laboratory Rat-Handbook of Experimental Animals (2000) Ed. Krinke GJ, Bullock GR, Bunton T.

Elsevier Academic Press. pp. 756.

The Laboratory Guinea Pig -Vet Lab Handout (2007) Ed. Loh R. LAC – RCULA Laboratory Animals

Centre National University of Singapore. pp. 9 5.

http://www.nus.edu.sg/iacuc/files/The%20Laboratory%20Guinea%20Pig.pdf

http://www.harlan.com/

http://www.criver.com/en-us/prodserv/bytype/resmodover/Pages/Home2.aspx

http://jaxservices.jax.org/breeding/index.html

http://www.mouseclinic.de/

Page 75: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

75

GLODAVCI KAO MODELI ZA ISTRAŽIVANJE NEUROBIOLOŠKE PODLOGE

PONAŠANJA

Prof. dr. sc. Dubravka Hranilović

Ponašanje glodavaca samo je djelomično urođeno a do određene mjere je podložno učenju, što in

omogućava adaptaciju na različite okolišne uvjete. To čini štakora i miša dobrim modelima za

proučavanje neurobiološke podloge ponašanja tj. za traženje odgovora na pitanja koje su regije mozga,

neurotransmitorski sustavi ili geni uključeni u određene vidove ponašanja. Pri tome se mogu

proučavati prirodne razlike u ponašanju među sojevima, razlike u ponašanju između životinja iz

sublinija istog soja, selektiranih za neko svojstvo kao i ponašanje životinja nakon tretmana kemijskim i

fizičkim agensima u odnosu na kontrolne životinje.

Osim za istraživanje molekularne osnove ponašanja svojstvene svim sisavcima, glodavci mogu poslužiti

i kao modeli za istraživanje neurobiološke podloge poremećaja ponašanja u ljudi. Poremećaji

ponašanja su kompleksni i mogu se razložiti na niz simptoma. Pojedini simptomi smatraju se

posljedicom mutacije jednog ili vrlo malog broja gena, a nazivaju se endofenotipovi. Pretpostavlja se

da bi se otkrivanjem molekularne podloge pojedinih endofenotipova mogle identificirati grupe gena

odgovorne za predispoziciju određenih grupa simptoma koji zajedno čine neki poremećaj. Simptomi

poput halucinacija, euforije ili osjećaja krivnje ne mogu se ispitivati na glodavcu, no oni jednostavniji,

poput senzoričke inhibicije motoričkog odgovora, stupnja anksioznosti ili sposobnosti pamćenja, mogu.

Postoji nekoliko aspekata ponašanja koji su svojstveni svim sisavcima, a koji su regulirani

neurotransmitorskim sustavima:

Spontano ponašanje

Spontano ponašanje nastaje kao rezultat izlaganja životinje uobičajenoj okolini ili pak promjenama u

okolini na koju je navikla, a njime se mogu ispitivati neurološki i emotivni aspekti ponašanja.

Horizontalno i vertikalno kretanje može se ispitivati u otvorenom prostoru (eng. open field) koje

jedinka slobodno istražuje, a sposobnost održavanja ravnoteže na rotirajućem štapu (eng. rotarod) na

kojem se životinja nastoji zadržati.

Neočekivani, jaki podražaj (zvuk ili dodir) izaziva prenuće (eng. startle) koje se manifestira treptajem

oka ili trzajem tijela. Ako jakom podražaju neposredno prethodi slabiji podražaj, trzajna će reakcija biti

znatno manja. Ta se pojava naziva senzorička inhibicija motoričkog odgovora (eng. sensory-motor

gating) i može se egzaktno mjeriti.

Ciklus budnost/spavanje (eng. rest-activity cycle) je cirkadijani ritam koji se kod glodavaca mjeri

aktivnošću na kotaču koji se postavi u životinjsku nastambu. S obzirom da životinja većinu vremena u

kojem je budna provodi na kotaču, možemo razlikovati razdoblje u kojem spava od razdoblja u kojem

je budna. Ta se razdoblja smjenjuju u pravilnom ritmu te je moguće uočiti odstupanja u duljini ciklusa,

kao i nastupanje aktivnosti u doba u kojem se to ne očekuje.

Page 76: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

76

Mjerenje stupnja anksioznosti u glodavaca temelji se na konfliktu između sklonosti ka istraživanju nove

okoline i straha od otvorenih, povišenih i osvijetljenih prostora. Najčešće se provodi u jednostavnom

labirintu (eng. zero maze ili plus maze), a odražava ga omjer vremena proveden u otvorenim i

zatvorenim dijelovima labirinta, kao i broj izlazaka u otvorene dijelove.

Urođena sklonost glodavaca ka istraživanju nove okoline naziva se eksploratorno ponašanje, a može se

mjeriti na ploči sa 16 otvora (eng. hole board) uz razinu svjetlosti koja neće djelovati anksiogeno. Pri

tome će ukupan broj istraženih otvora (tj. onih u koje će životinja gurnuti njuškicu) odražavati

eksploratorno ponašanje, a omjer unutarnjih i vanjskih posjećenih otvora razinu anksioznosti

Društvenost glodavaca također je genetički determinirana i razlikuje se između sojeva. Može se

istraživati kao udio vremena koje životinja provede u otvorenom polju u socijalnom kontaktu s

nepoznatom jedinkom (eng. social interaction) ili kao preferencija u istraživanju jedinke nad objektom

(eng. social choice).

Uvjetovano ponašanje

Uvjetovano ponašanje ispituje pojedine aspekte učenja i pamćenja.

Habituacija je najjednostavniji oblik učenja, a odvija se pri produljenoj ili opetovanoj izloženosti

istovjetnoj eksperimentalnoj situaciji. Tako je na primjer razlika u vremenu istraživanja poznatog i

nepoznatog objekta mjera prepoznavanja poznatog objekta i koristi za ispitivanje kratkotrajne

memorije.

Klasično kondicioniranje je asocijativni oblik učenja koji za posljedicu ima povezivanje nekog

senzoričkog podražaja s događajem koji slijedi. Nakon perioda učenja u kojem se životinja simultano

izlaže podražaju koji samostalno izaziva reakciju (npr. puhanje zraka u lice izaziva zatvaranje očiju) i

podražaju koji samostalno ne izaziva reakciju (npr. zvuk ne izaziva zatvaranje očiju), slijedi razdoblje u

kojem i ovaj drugi podražaj može samostalno izazvati reakciju (životinja zatvara oči nakon što čuje

zvuk).

Instrumentalno kondicioniranje je oblik učenja pri kojem se životinju nagradom motivira da izvrši

zadani zadatak. T-labirint (eng. T-maze), koji ima dva kraka, može poslužiti za ispitivanje sposobnosti

pamćenja (životinja treba naučiti da je nagrada čeka uvijek u jednom od krakova) i kognitivne

fleksibilnosti (životinja treba obrnuti naučeno, tj. shvatiti da je nagrada od sada čeka na suprotnom

kraku), dok se u osmerokrakom radijalnom labirintu može se ispitivati radna memorija (položaj

nagrade ovisi o položaju u pethodnom pokušaju, kojeg treba zapamtiti).

U tzv. Skinnerovim kutijama životinju se, umjesto nagradom, na učenje motivira kaznom (obično

laganim strujnim udarom). Pri tome životinja treba naučiti izbjegavati prostor u kojem se nalazi kazna

(pasivno izbjegavanje, eng. passive avoidance) ili na vrijeme pobjeći iz prostora kako bi izbjegla kaznu

(aktivno izbjegavanje, eng. active avoidance).

Literatura

Gejman PV, Owen MJ, Sanders AR 2003. Psychiatric Genetics, in: Tasman, A., Kay, J., Lieberman, J. (Eds.),

Psychiatry. Wiley and Sons, West Sussex, England, pp. 234-253.

Krinke GJ, Bullock GR, Bunton T. The Laboratory Rat. 1st ed. Academic Press; 2000.

Page 77: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

77

NABAVLJANJE ŽIVOTINJA I LOKALNA PRAVILA U NASTAMBI

Dr. sc. Jadranka Bubić Špoljar, dr. vet. med.

Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja objavilo je u Narodnim novinama NN 47/11

PRAVILNIK O ZAŠTITI ŽIVOTINJA KOJE SE KORISTE U POKUSIMA ILI U DRUGE ZNANSTVENE SVRHE

Stupanjem na snagu ovoga Pravilnika prestaje važiti Pravilnik o uvjetima držanja pokusnih životinja,

posebnim uvjetima za nastambe i vrstama pokusa (»Narodne novine«, broj 176/04) i Pravilnik o

vođenju evidencija o pokusnim životinjama i vrstama pokusa (»Narodne novine«, broj 176/04). Novim

se Pravilnikom 47/11 propisuju način i uvjeti korištenja životinja u pokusne ili druge znanstvene svrhe, i

to u cilju njihove zaštite.

Ovim Pravilnikom pojedini pojmovi imaju sljedeće značenje:

Životinja – bilo koji živi kralježnjak osim čovjeka, isključujući fetalne i embrionalne oblike;

Pokusna životinja – životinja koja se koristi ili je namijenjena korištenju u pokusima;

Uzgojena životinja – životinja namijenjena korištenju u pokusima te u tu svrhu uzgojena od strane

pravne ili fizičke osobe koja je odobrena za uzgoj u tu svrhu;

Pokus – svako korištenje životinje u pokusne ili druge znanstvene svrhe koje im može prouzročiti bol,

patnju, iscrpljenost ili trajnu ozljedu, isključujući najmanje bolne metode usmrćivanja ili označavanja

životinja.

Pokus započinje kada se životinju prvi puta pripremi za korištenje, a završava kada se više ne obavljaju

promatranja u vezi s tim pokusom. Pokusom se smatra i korištenje životinja u slučajevima kada se

anesteticima, analgeticima ili drugim metodama uklanja bol, patnja, iscrpljenost ili trajno oštećenje.

Pokus ne uključuje najmanje bolne postupke usmrćivanja ili označavanja životinje prihvaćene u

suvremenoj veterinarskoj praksi. Pojam pokusa se ne odnosi na neeksperimentalnu, poljoprivrednu ili

kliničku veterinarsku praksu. Pokusne životinje smještaju se u nastambe koje moraju udovoljavati

propisanim uvjetima smještaja za svaku pojedinu vrstu životinja.

Lokalna pravila u nastambi

Veterinarsko zdravstveni nadzor životinja koje su u uzgoju i pripremi za pokuse provodi svakodnevno

od strane voditelja nastambe uz pomoć tehničkog osoblja. Briga i njega obuhvaća sva materijalna i

nematerijalna sredstava koja čovjek koristi da bi pojedinu životinju doveo i održao u fizičkom i

duševnom stanju u kojem najmanje pati i postiže najbolje rezultate u pokusima.

Uz voditelje nastambe za pokusne životinje imenuje se i osoba odgovorna za zaštitu životinja koja

nadzire osiguranje dobrobiti i zdravlja životinja i to od smještaja životinja, tijekom njihovog korištenja u

pokusu do završetka pokusa.

Pravilnik o zaštiti životinja koje se koriste u pokusima ili u druge znanstvene svrhe primjenjuje na

korištenje životinja samo u pokusima koji se provode za sljedeće potrebe:

Page 78: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

78

a) razvoj, proizvodnju, ispitivanje kvalitete, učinkovitost i sigurnosti lijekova, namirnica i drugih

tvari ili proizvoda:

- za izbjegavanje, prevenciju, dijagnozu ili liječenje bolesti, narušenog zdravlja ili drugih

odstupanja ili njihovih učinaka na ljude, životinje ili biljke;

- za procjenu, otkrivanje reguliranje ili promjenu fiziološkog stanja ljudi, životinja ili

biljaka;

b) zaštitu okoliša u interesu zdravlja ili dobrobiti ljudi ili životinja;

c) temeljna istraživanja;

d) edukaciju i osposobljavanje.

Nadalje: Svakoj životinji koja se koristi ili se namjerava koristiti u pokusu, primjereno njezinom zdravlju

i dobrobiti, mora se osigurati:

- smještaj u odgovarajućoj nastambi;

- primjeren okoliš i barem minimalna sloboda kretanja;

- hrana i voda; te

- odgovarajuća skrb.

Uvjeti okoliša (mikroklimatski parametri) u kojima se životinje uzgajaju, drže ili koriste, moraju se

svakodnevno provjeravati. Također, voditelj pokusa i voditelj nastambi za pokusne životinje moraju

redovito pratiti zdravstveno stanje i dobrobit pokusnih životinja kako bi se spriječila bol, patnja,

iscrpljenost ili trajna ozljeda.

Ono što je važno za istaknuti jest da pokuse na životinjama mogu provoditi samo pravne osobe u

kojima se provode pokusi na životinjama te pravne osobe koje koriste životinje u obrazovne svrhe,

registrirane za obavljanje pokusa na životinjama od strane Uprave za veterinarstvo. Pravne ili fizičke

osobe koje koriste životinje za proizvodnju bioloških pripravaka moraju biti odobrene od Uprave za

veterinarstvo. Uprava za veterinarstvo registrira objekte s identifikacijskim brojem koji se upisuje u

evidenciju u obliku elektroničke baze pri Upravi za veterinarstvo. Također, Uprava za veterinarstvo

izdaje odobrenje s identifikacijskim brojem koji se upisuje u evidenciju u obliku elektroničke baze pri

Upravi za veterinarstvo. Za svaki planirani pokus na životinjama te za korištenje životinja u obrazovne

svrhe ili za proizvodnju bioloških pripravaka, pravne ili fizičke osobe moraju prethodno podnijeti

zahtjev Upravi za veterinarstvo za odobrenje obavljanja pokusa odnosno proizvodnju bioloških

pripravaka. Pravne ili fizičke osobe obavezne su jednom godišnje do kraja siječnja tekuće godine

dostavljaju Upravi za veterinarstvo podatke o korištenju životinja u pokusima na obrascima iz Dodatka

ovoga Pravilnika.

Osobe uključene u provođenje pokusa na životinjama, uključujući potrebne kontrole životinja od

njihove strane, moraju biti osposobljene za navedene poslove i to:

a) osobe koja se brinu za životinje u objektima za uzgoj životinja te u objektima za opskrbu

životinjama ukoliko u njima životinje borave kao i u objektima za provođenje pokusa na

životinjama te objektima za proizvodnju bioloških pripravaka moraju imati završeno

osposobljavanje na tečaju u trajanju od najmanje 30 sati;

b) voditelji nastambi za životinje i njihovi zamjenici moraju imati završeno osposobljavanje na

tečaju u trajanju od najmanje 60 sati;

c) iznimno, kad životinje koje su namijenjene korištenju u pokusima i za proizvodnju bioloških

pripravaka potječu s gospodarstava registriranih u skladu s posebnim propisima, voditelji

Page 79: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

79

nastambi za životinje i njihovi zamjenici koji su ujedno osobe koje se brinu za životinje na

takvom gospodarstvu ne trebaju imati završeno osposobljavanje iz točke a) ovoga stavka;

d) osobe koje provode pokuse na životinjama moraju imati završeno osposobljavanje na tečaju

u trajanju od najmanje 60 sati;

e) voditelj pokusa i njegov zamjenik moraju imati završeno osposobljavanje na tečaju koji traje

najmanje 60 sati;

f) odgovorna osoba te veterinar odgovoran za zaštitu životinja ili osoba odgovorna za zaštitu

životinja moraju imati završeno osposobljavanje na tečaju koji traje najmanje 60 sati.

Također, Pravne ili fizičke osobe za uzgoj i/ili opskrbu životinjama moraju biti odobrene od Uprave za

veterinarstvo te moraju udovoljavati propisanim uvjetima.

Novonabavljene životinje moraju se staviti u karantenu da ne bi ugrozile životinje koje se već nalaze u

nastambi. Kad se pokus ili promatranje ne provodi u nastambi za životinje, potrebno je osigurati

prostoriju za provođenje pokusa opće i posebne namjene.

Pravne ili fizičke osobe za opskrbu životinjama nabavljaju životinje isključivo iz pravnih ili fizičkih osoba

za uzgoj životinja ili iz drugih pravnih ili fizičkih osoba za opskrbu životinjama osim ako životinje nisu

uvezene ili uzete iz divljine u skladu sa odredbama ovoga Pravilnika. Nadalje, Pravne ili fizičke osobe za

opskrbu životinjama mogu nabavljati životinje za pokuse i sa farmi registriranih u skladu s posebnim

propisima.

Pravne ili fizičke osobe za uzgoj životinja i pravne ili fizičke osobe za opskrbu životinjama moraju voditi

evidenciju o broju i vrstama prodanih ili isporučenih životinja, datumima prodaje ili isporuke, imenima i

adresama primatelja i broju i vrstama uginulih životinja dok su boravile u predmetnoj pravnoj ili fizičkoj

osobi za uzgoj ili opskrbu. Pravne ili fizičke osobe moraju evidenciju čuvati najmanje tri godine od

datuma posljednjeg unosa i moraju je dati na uvid na zahtjev veterinarskog inspektora/službenog

veterinara.

Pravne osobe u kojima se provode pokusi moraju biti opremljene odgovarajućim uređajima i opremom

prikladnom za vrste životinja koje se koriste kao i za provođenje pokusa na njima. Njihova izvedba,

izgradnja i funkcioniranje trebaju osigurati što je moguće učinkovitije provođenje pokusa, s ciljem

dobivanja pouzdanih rezultata uz korištenje najmanjeg potrebnog broja životinja i najmanji stupanj

boli, patnje, iscrpljenosti ili trajnog oštećenja.

Pravne osobe koje provode pokuse na životinjama moraju voditi evidenciju o svim korištenim

životinjama. U toj evidenciji bilježe se podaci o broju i vrstama svih nabavljenih životinja, podaci o

organizaciji od koje su nabavljene i datum njihovog dolaska. Takva evidencija čuva se najmanje tri

godine od zadnjeg unosa podataka i daje na zahtjev veterinarskog inspektora/službenog veterinara na

uvid.

Page 80: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

80

Uputa o podnošenju zahtjeva za odobravanje provođenja pokusa na

životinjama

Zakonska osnova:

Zakon o zaštiti životinja (Narodne novine, broj 135/06)

Pravilnik o zaštiti životinja koje se koriste u pokusima ili u druge znanstvene svrhe (Narodne novine,

broj 47/11)

U zahtjevu za odobrenje provođenja pokusa na životinjama odnosno proizvodnju bioloških

pripravaka moraju biti navedeni najmanje sljedeći podaci:

a) naziv i adresa pravne ili fizičke osobe koja podnosi zahtjev za odobrenje pokusa na životinjama

b) naziv i adresa pravne ili fizičke osobe /mjesta gdje se pokus provodi

c) naziv i svrha planiranog pokusa

d) vrsta, pasmina i broj životinja koje će se koristiti u pokusu

e) ime, prezime te stručna sprema voditelja pokusa i njegovog zamjenika

f) ime, prezime te stručna sprema voditelja nastambi za pokusne životinje i njegovog zamjenika

g) ime i prezime odgovorne osobe u skladu sa člankom 32. stavkom 3. Zakona o zaštiti životinja

h) trajanje pokusa, odnosno razdoblje za koje se traži

Napomena:

Upravna pristojba do 100,00 kuna ne uplaćuje se izravno u proračun Republike Hrvatske, već se šalje sa

zahtjevom u obliku taksenih marki.

Zahtjev dostaviti na adresu:

Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja

Uprava za veterinarstvo

Miramarska 24,

10 000 Zagreb

n/r mr.sc. Branke Buković Šošić, dr.med.vet.

Literatura

Pravilnik NN 47/11, Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja

Page 81: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

81

BRIGA NJEGA I GOSPODARENJE LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA

Dr. sc. Jadranka Bubić Špoljar, dr. vet. med.

Najzastupljenije vrste životinja u biomedicinskim istraživanjima u svijetu i kod nas su laboratorijski

glodavci odnosno miševi i štakori, u zastupljenosti do gotovo 80%. Laboratorijske životinje se najčešće

koriste u temeljnim medicinskim istraživanjima, pri postupcima istraživanja genetskih bolesti i razvoju

novih dijagnostičkih metoda te za razvoj novih lijekova i terapijskih postupaka.

Važno je istaknuti opravdanost pretkliničkih i genetskih testiranja laboratorijskih životinja kao modela

pri istraživačkim postupcima, a to podrazmijeva:

- testiranja obavljena na laboratorijskim životinjama koja nam omogućuju jedinstvene

sveobuhvatne spoznaje patofiziologije i uzroka bolesti i upućuju na nova zahvatna mjesta

njenog ciljanog liječenja.

Nadalje, pokažu li prethodna ispitivanja na laboratorijskim životinjama da ispitivana supstanca kao

budući potencijalni lijek nema kliničku korist odnosno primjenjivost - izbjegnuto je nepotrebno kliničko

testiranje na ljudima-zdravim dobrovoljcima.

- pokusi na životinjama omogućavaju ispitivanja u uvjetima složene manipulacije gena i okoline

što je u čovjeka vrlo teško izvedivo odnosno gotovo nemoguće,

- Zakonske regulative nameću obavezno prethodno ispitivanje toksičnosti supstance - LD50.

Etička opravdanost upotrebe životinja u biomedicinskim i psihofarmakološkim istraživanjima jest da u

konačnici rezultiraju određenom koristi za ljude i/ili životinje.

Pritom je neophodno procijeniti znanstvenu korist u odnosu na stres, bol i nelagodu koje nanosimo

pokusnim životinja, nadalje pomno planiranje pokusa s minimalnim brojem životinja uključenih u

eksperiment. Iznimno je važno strogo procijeniti validnosti pokusnih životinjskih modela, poštivati i

pridržavati se načela "3R modela" te slijediti važeće zakonske propise zemlje u kojoj se eksperiment

provodi.

Ministarstvo poljoprivrede, ribarstva i ruralnog razvoja objavilo je u Narodnim novinama NN 47/11

Pravilnik o zaštiti životinja koje se koriste u pokusima ili u druge znanstvene svrhe, te se temeljem

njega tumači pojam njege životinja:

Životinje koje se koriste za pokuse i druge znanstvene svrhe moraju biti primjereno njegovane, ne

smije ih se nepotrebno izlagati boli, patnji, iscrpljenosti ili trajnom ozljeđivanju, a kad je to neizbježno

isto se mora svesti na najmanju moguću mjeru. Stoga se:

- svim pokusnim životinjama mora osigurati smještaj, okoliš, mogućnost barem minimalnog

kretanja, hrana, voda i njega koji su primjereni njihovu zdravlju i dobrobiti;

- bilo koje ograničenje fizioloških i etoloških potreba mora smanjiti što je više moguće.

Page 82: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

82

Smještaj i gospodarenje

Svaki objekt treba biti konstruiran, izgrađen i održavan tako da osigura prikladan okoliš za u njemu

smještene životinja, te da u njega ne mogu ulaziti neovlaštene osobe.

Prostorije u nastambama za laboratorijske životinje potrebno je redovito i učinkovito čistiti i održavati

zadovoljavajući standard higijene. Materijal ne smije biti opasan po zdravlje životinja i treba biti takav

da se životinje ne mogu ozlijediti.

Također, sve nastambe moraju raspolagati minimalnom laboratorijskom opremom potrebnom za

provođenje postupaka kao što su jednostavni dijagnostički testovi, post-mortem ispitivanja i/ili

prikupljanje uzoraka namijenjenih detaljnijim ispitivanjima.

Za provođenje pokusa u kojima se obavljaju kirurški zahvati, treba osigurati jednu ili više odvojenih

prostorija primjereno opremljenih za obavljanje kirurških zahvata u sterilnim uvjetima. Kada je to

potrebno, za postoperativni oporavak životinje treba osigurati prikladnu opremu ili prostoriju.

Potrebno je u sklopu jedinice za smještaj laboratorijskih životinja osigurati i spremište za hranu, stelju i

rezervnu opremu kao i prostoriju za odlaganje lešina životinja i drugih nusproizvoda životinjskog

podrijetla, koji nisu za prehranu ljudi. Sve ovo se mora obavljati u skladu s posebnim propisima.

Posebne mjere opreza moraju se poduzete u vezi s toksičnim ili radioaktivnim otpadom u skladu s

posebnim propisima o zaštiti okoliša.

Životni uvjeti u prostorijama za smještaj životinja i njihova kontrola:

Laboratorijske životinje koje se zaprimaju iz drugih izvora i boravit će u nastambi određeno vrijeme

obavezne su proći karantenu. Svrha karantene je:

- zaštititi druge životinje u pravnoj ili fizičkoj osobi (u instituciji);

- zaštititi ljude od zoonoza;

- poticati dobru znanstvenu praksu.

Preporuke za razdoblja karantene za uvezene životinje, sva razdoblja karantene podliježu nacionalnim

propisima i navedena su u donjoj tablici.

Vrste Dana

Miš 5 – 15 Štakor 5 – 15 Gerbil 5 – 15 Zamorčić 5 – 15 Sirijski hrčak 5 – 15 Kunić 20 – 30 Mačka 20 – 30 Pas 20 – 30 Nečovjekoliki majmuni 40 – 60

Nakon što se utvrdi da je zdravstveno stanje životinja stabilno, potrebno im je prije korištenja u

pokusima osigurati razdoblje prilagodbe novim uvjetima držanja. Potrebno vrijeme ovisi o više

čimbenika, poput stresa kojem su životinje bile izložene, što opet ovisi o drugim utjecajima kao što su

trajanje prijevoza i dob životinje.

Page 83: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

83

Laboratoijski glodavci se smještaju u kaveze. U prostorima za smještaj mora biti osiguran odgovarajući

sustav za prozračivanje koji udovoljava zahtjevima u njima smještenih vrsta vezano za opskrbu svježim

zrakom te ublažavanje različitih mirisa, smrdljivih plinova, smanjenja koncentracije prašine i uzročnika

zaraznih bolesti kao i odstranjivanje suvišne topline i vlage.

Njega počinje od trenutka kad se životinja namijeni za korištenje u pokusima i nastavlja se sve do

usmrćenja životinje ili njezina zbrinjavanja na neki drugi način, nakon okončanja pokusa.

Preporuke za držanje u kavezu malih glodavaca i kunića (pri držanju i za vrijeme pokusa):

Vrste Najmanje površina poda kaveza – cm2

Najmanja visina kaveza – cm

Miš 180 12 Štakor 350 14 Sirijski hrčak 180 12 Zamorčić 600 18 Kunić 1 kg 1400 30 2 kg 2000 30 3 kg 2500 35 4 kg 3000 40 5 kg 3600 40

Napomena: »Visina kaveza« znači okomiti razmak između poda kaveza i gornjeg vodoravnog dijela

poklopca ili kaveza.

Sustav prozračivanja pri normalnoj gustoći naseljenosti prostora treba biti takav da osigura 15 – 20

promjena zraka u jednom satu. Ukoliko se u prostoru nalazi mali broj životinja može biti dovoljno i 8 –

10 promjena zraka u jednom satu. Zabranjeno je kruženje neobnovljenog zraka. Temperaturu u

nastambama treba održavati unutar preporučenih vrijednosti za svaku pojedinu vrstu životinje. To se

odnose na odrasle i zdrave životinje.

Preporuke za temperature prostorija (životinje koje se drže u kavezima, odjeljcima ili unutarnjim

ispustima):

Vrste ili skupine vrsta Optimalni raspon u °C

Nečovjekoliki majmuni novoga svijeta 20 – 28 Miš 20 – 24 Štakor 20 – 24 Gerbil, Zamorčić, Sirijski hrčak 20 – 24 Nečovjekoliki majmuni starog svijeta 20 – 24 Prepelica 20 – 24 Kunić 15 – 21 Mačka, Pas 15 – 21 Afrički tvor 15 – 21 Perad, Golub 15 – 21 Svinja 10 – 24 Ovca, Koza 10 – 24 Goveda 10 – 24 Konj 10 – 24

Napomena: U posebnim slučajevima, primjerice kod smještaja vrlo mladih ili životinja bez dlake, može

biti potrebna viša sobna temperatura od navedene.

Page 84: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

84

Relativna vlaga u nastambama za životinje treba biti primjerena pojedinim vrstama životinja

smještenim u njima te se uobičajeno održavati na 55 % +/- 10 %. Vrijednosti ispod 40 % i iznad 70 %

relativne vlage u duljim razdobljima potrebno je izbjegavati.

U prostorijama bez prozora potrebno je osigurati kontrolirano osvjetljenje kako bi se zadovoljile

biološke potrebe životinja i osigurala zadovoljavajuća radna okolina. Također je potrebno kontrolirati

jačinu svjetlosti i ciklus svjetla i mraka. Kod držanja albino životinja potrebno je voditi računa o njihovoj

osjetljivosti na svjetlost

Nivo buke ne smije prelaziti 60 Dcb u nastambama za životinje i laboratorijima u kojima se provode

pokusi.

Laboratorijske životinje trebaju biti redovito pregledavani od strane veterinara.

Laboratorijske životinje moraju biti besprijekorno zdrave kako kako njihovo zdravsveno stanje ne bi

utjecalo na tijek i rezultate eksperimenta.

Literatura

Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition, 2010.

Pravilnik o zaštiti životinja koje se koriste u pokusima ili u druge znanstvene svrhe, NN 47/11

Page 85: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

85

PREHRANA / HRANIDBA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA

Dr. sc. Jadranka Bubić Špoljar, dr. vet. med.

Nutritivna znanstvena istraživanja u 20. stoljeću pokazala su da je prehrana moćan faktor sposoban

promijeniti fenotip životinje. Sada već sa sigurnošću znamo da izbor određenih prehrambenih navika

može povećati ili smanjiti vjerojatnost razvoja određenih bolesti.

Hrana za laboratorijske životinje mora biti posebnih zahtjeva u recepturi, ukusna, svježe pripravljena,

zadovoljavajućih prehrambenih potreba, adaptirana za određenu vrstu laboratorijske životinje, te u

skladu sa posebnim zahtjevima dobre proizvođačke prakse.

Izuzetno je važno da je proces izrade hrane za laboratorijske životinje praćen kontrolom kvalitete kao i

da je gotova hrana prošla procese analitičkih kemijske i mikrobioloških kontrola uzoraka kako bi se

izbjegle kontaminiranosti toksinima iz ugrađenih sirovina.

Postoji nekoliko vrsta dijeta, klasificiranih prema stupnju profinjenosti njihovih sastojaka. Prirodni

sastojci hrane za laboratorijske životinje su formulirani poljoprivrednim proizvodima i nusproizvodima,

te su komercijalno dostupni za sve vrste laboratorijskih životinja.

Iako nije značajan čimbenik u većini slučajeva, sastav hranjivih sastojaka varira u postocima, te može

sadržavati niske udjele prirodnih ili umjetnih kontaminanata Takozvani zagađivači hrane kao što su

ostatci pesticida iz biljaka, teških metala, toksina,i fitoestrogeni mogu biti na razinama koje utječu na

zdravstveno stanje laboratorijskih životinja, a time izazivaju i suptilne učinke na životinje koje su

podrvrgnute eksperimentu. Pravovaljanost rezultata eksperimenata je u takvim slučajevima upitna.

Certificirana hrana koristi se za studije, kao što su npr.studije pretklinička toksikologija, koje se provede

u skladu s FDA načelima dobre laboratorijske prakse (GLP certfikat).

Purificirana odnosno pročišćena hrana jest rafinirana tako da svaki sastojak sadrži pojedinu hranjivu

tvar ili hranjive tvari iz klase te stoga takva hrana nema varijabilnost u kemijskim kontaminacijama.

Kemijski definirana hrana sadrži najviše sastojaka elementarnog u sastavu kao što su pojedine

aminokiseline i specifični šećeri. Takve vrste hrane za laboratorijske životinje se ciljano koristite za

određene vrste studija u glodavaca, ali obično rijetko zbog visoke cijene koštanja i kratkog roka trajanja

hrane.

Tijekom nabave hrane za laboratorijske životinje neophodno je voditi brigu o odgovarajućem

transportu do skladišta, pohrani i daljnjem rukovanju hranom, kako bi se smanjilo uvođenje bolesti,

parazita i potencijalnih vektora bolesti (npr. insekata i drugih štetočina), te kemijskih kontaminenata u

životinjskim kolonijama. Bitno je uzorkovati hranu koja se koristi za laboratorijske životinje i slati na

analizu u laboratorije za analizu hrane.

Glodavcima se hrana poslužuje ad libitum. Različiti sojevi štakora će jesti različite količine hrane,

ovisno o njihovom genetskom porijeklu. Većina sojeva štakora će jesti do 30 grama peletirane hrane na

dan, dok će manji sojevi jesti do 15 grama dnevno.

Page 86: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

86

Miševi odnosno odrasle jedinke miševa će jesti do 5 grama peletirane hrane u ukupnom dnevnom

obroku. Iznimno, veći sojevi mogu konzumirati i do 8 grama hrane dnevno po životinji.

Hrčci - odrasle jedinke će jesti do 14 grama hrane dnevno.

Skladišta

Prostorije za smještaj i pohranu hrane trebaju biti čvrste građevine, čiste i dobro zaštićene od pristupa

glodavaca i insekata. Izloženost hrane ekstremno visokim/niskim temperaturama te krajnosti u

odstupanju relativne vlage zraka, nehigijenskim uvjetima, insekata i drugih štetočina nepovoljno utječe

na kvalitetu sastava hrane. Skladišni uvjeti smještaja moraju udovoljavati mikroklimatskim

parametrima propisanim pravilnicima za smještaj i skladištenje hrane: temperatura, vlaga i broj

izmjena zraka/sat te adekvatna osvijetljenost skladišta.

Pohrana je idealna u uvjetima:

- Temperature: 10-150C,

- RVZ: 50+-10%,

- osvijetljenost skladišta: 400Lxa

- Broj izmjena zraka/sat 5-8.

Zalihe hrane treba pohraniti (ili pohranjivati) na paletama, stalcima ili kolicima, na način koji olakšava

manipulaciju unutar skladišta.Otvorene vreće hrane trebaju biti pohranjene u posebne kontejnere za

smještaj hrane kako bi se smanjila mogućnost kontaminacije.

Većinu prirodnih sastojaka iz hrane za laboratorijske životinje kao što su žitarice ugrađene u hranu,

potrebno je iskoristiti unutar 6 mjeseci od datuma proizvodnje ili prema datumu o roku trajanja

proizvoda. Pojedine komponente ugrađene u hranu kao npr. nestabilizirani vitamin C, uglavnom ima

rok trajanja od samo 3 mjeseca odnosno potrebno je prihvatiti preporuku proizvođača. Pročišćene i

kemijski definirane hrane za laboratorijske životinje su često manje stabilne od hrana koje sadrže

prirodne sastojke i trajnost je obično manje od 6 mjeseci te je također preporuka pohranjivanje na 4 °

C.

Iradirana hrana:

Ozračena i termički obrađena autoklavirana hrana je komercijalno dostupna a njena primjena uvelike

nalazi mjesto kod “germ free”, mikrobiološki definiranih glodavaca (SPF SOPF), immunodeficijentnih i

golih (nude) miševa.

Tehnologija priprave iradirane vakumirane i autoklavirane hrane osigurava da sadržaj termo labilanih

vitamina nije ugrožen parom i / ili toplinom. Bitno je treba poštovati datum sterilizacije istaknut na

etiketi.

Page 87: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

87

Tehnički detalji

Hranilice trebaju biti projektirane i odgovarajuće smještene kako bi se omogućio jednostavan pristup

hrani te smanjila kontaminacija urinom i izmetom. Higijena pranja i održavanja hranilica propisuje se

uputama unutar jedinice za smještaj laboratorijskih životinja. Kakvoća materijala od kojega su hranilice

izrađene propisana je u uputstvima za male laboratorijske glodavce.

Kod grupnog držanja životinja kao što je kavezni sistem smještaja sa po 10 jedinki glodavaca, potrebno

je dizajnirati hranilice kako bi svima bio dostupan pristup hrani.

Redovitim čišćenjem i dezinfekcijom izbjegavamo rizike od kontaminacije.

Postoje točno propisani standardi unosa kalorija prihvaćeni u praksi kod laboratorijskih glodavaca,

kunića, čovjekolikih majmuna i nekih primata. Prednosti umjerenog unosa kalorija ograničenjem u

nekih vrsta mogu uključivati povećanje dugovječnosti i reprodukciju, smanjenje pretilosti, smanjenje

stope spontanih malignih oboljena unutar kolonije kao i neurodegenerativih poremećaja.

Kako prehrana treba biti nutricionistički uravnotežena, kod pojedinih životinjskih vrsta, primjerice

čovjekolikih primata, različito nutritivno uravnotežena hrana uključuje i dodavanje svježeg voća i

povrća. Prehranom također možemo mijenjati metabolizam, kao i razine cirkulirajućih čimbenika

(hormona, lipida, itd.) koji mogu biti biljezi za rizik od određenih bolesti.

Nagle promjene i odstupanja u recepturi za prehranu laboratorijskih životinja treba izbjegavati, jer one

mogu dovesti do probavnih i metaboličkih poremećaja.

Page 88: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

88

Prikaz recepture:

Literatura

EU vodiči i regulativa s područja hranidbe laboratorijskih životinja.

Page 89: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

89

ZARAZE KOJE MOGU PRIJEĆI NA LJUDE OD POKUSNIH ŽIVOTINJA I

NJIHOVO IZBJEGAVANJE

Prim. mr. sc. Borislav Aleraj, dr. med.

Uvod

Pokusne životinje od davnine su vrlo koristan i nužan dio medicinskog rada, a također se ljudi njima

koriste i u nekim drugim područjima, na pr. astronautici i dr. Pri tome one za volju ljudskog zdravlja i

sigurnosti moraju koji put biti usmrćene (žrtvovane) ili na određen način izlagane neugodnim, bolnim

ili za njihovo zdravlje štetnim postupcima. Razlog za primjenu pokusnih životinja je u tome da te iste

nepovoljne utjecaje ne bi trpjeli ljudi. Taj razlog međutim uvijek mora biti opravdan a to znači da nema

drugog dostupnog načina stjecanja potrebnih informacija i iskustava, te da se radi o nedvojbenoj

koristi za ljude.

Na primjer za utvrđivanje je li se netko otrovao smrtonosnim toksinom bakterije Clostridium botulinum

(bolest botulizam) i potrebno ga je ispravno liječiti kako bi preživio danas se pretežno izvodi biološki

pokus izlažući ispitivanom uzorku mlade miševe od kojih će oni koji su prethodno primili zaštitni

antitoksin ostati živi, a oni koji nisu, nažalost će uginuti ukoliko se u uzorku nalazio toksin. Alternativa

može biti neka suvremena biokemijska tehnika napr. ELISA test, no on je za sada još nepouzdan. Ako se

razvije dovoljno pouzdana i dostupna laboratorijska tehnika, biološki pokus neće biti potreban. Dakle,

pokusne životinje moraju sudjelovati u eksperimentima tj. pokusima onda kada je to opasno za ljude,

a radi se o jasnoj zdravstvenoj važnosti ili drugoj koristi za ljude.

Slična se pravila odnose i na druge životinje, koje nisu pokusne već žive u prirodi ili u blizini čovjeka.

Njihovo lovljenje, usmrćivanje i pretraživanje njihovih organa, na primjer radi utvrđivanja

rasprostranjenosti neke infekcije, ili stupnja njihove zahvaćenosti i posljedičnog rizika za ljude, također

mora biti mora biti jasno opravdano i nužno.

Životinje mogu nositi uzročnike raznih bolesti koje mogu prijeći i na ljude. Takve zaraze zajedničke

ljudima i životinjama običava se nazivati antropozoonozama ili zoonozama (1). Zaražene mogu biti

životinje iz prirode, stoka, ili kućni ljubimci, no svakako i sve pokusne životinje koje se u pravilu

posebno za to uzgajaju. Zaražavanje pokusnih životinja olakšano je i njihovim razmjerno gustim i

brojnim smještajem u uzgajalištima, ili tamo gdje se kasnije drže, teškoćama sigurne prehrane,

održavanja higijene i dr. Treba napomenuti i to da se neke pokusne životinje mogu i namjerno

zaražavati radi nekog pokusa. Sljedeća tablica pokazuje neke od važnijih zaraza koje mogu prijeći na

ljude s pokusnih životinja (2, 3)

Page 90: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

90

Tablia 1. Neke od važnijih zaraza koje mogu prijeći na ljude s pokusnih životinja

pokusne životinje zarazna bolest/uzročnik pokusne životinje zarazna bolest/uzročnik

miševi, štakori -leptospiroza -salmoneloza -hanta virusi

kunići, zamorci -tularemija

ribe -salmoneloza ptice

-salmoneloza -chlamidiajza -influenca ptica -West Nile virus

psi, mačke - ehinokokoza - dirofilarijaza - bjesnoća

svinje

-influenca -leptospiroza (bolest svinjara) - salmoneloza - tuberkuloza

stoka, goveda, ovce , koze

- prioni BSE ( "kravlje ludilo" i dr) - salmoneloza - Q groznica - leptospiroza - bruceloza

konji - leptospiroza - tetanus - West Nile virus

majmuni primati i sl.

tropske virusne hemoragijske groznice (Marburg, Ebola) monkey pox (majmunske boginje) retrovirusi

lasice (ferret) -gripa

komarci -chikungunya -West Nile virus -virus žute groznice.

stanične kulture životinjske (hrčak, zeleni mjamu-ni i dr.

-nepoznati, pretežno virusni uzročnici živo-tinja od kojih su uzeta tkiva -rotavirusno cjepivo: nedavno nađen virus PCV, svinjski circo virus za sada nejasne važnosti

sami mikroorganizmi

bakterije, virusi, parasiti, infekcije bakterija preko plasmida, namjerno, nenamjerno i dr. križanja, genski inženjering

Uz posljednji red ove tablice treba se podsjetiti da su i mnogi mikroorganizmi životinje, često i pokusne

životinje, na kojima se vrše razni genetski eksperimenti križanja, modifikacije i dr. i ne treba zaboraviti

da na početku navedena etička pravila i tu moraju biti poštovana, tj. prvenstveno da je to korisno za

ljude, ali i sigurno, obzirom na mnoge teško kontrolabilne mogućnosti "bijega" modificiranih mikroba

iz laboratorija.

Evo nekoliko primjera zaražavanja ljudi od pokusnih životinja.

Poznata je nesretna epizoda s razbolijevanjem osoba koje su na poslu došle u kontakt s majmunima

(Cercopithecus aethiops) uvezenima iz Afrike i njihovm tkivima. Majmuni su nosili virus marburške

bolesti, smrtonosne tropske virusne hemoragijske groznice pri čemu se zarazilo a nažalost i umrlo više

tih osoba a i članova njihovih obitelji, u tri grada u dvije europske zemlje kamo su majmuni stigli, jedan

od njih je bio grad Marburg u Njemačkoj po kojem je bolest i dobila ime (4).

Page 91: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

91

Iz vlastite prakse u radu s pokusnim životinjama mogu spomenuti razbolijevanje ljudi od leptospiroze

preko bijelih pokusnih miševa koji su u jednom razdoblju, kako se pokazalo nakon što su se razboljeli

ljudi, u uzgojnim leglima bili zaraženi leptospirom (ta infekcija kod miševa ne izaziva nikakvu bolest)

kojom su se prvotno najvjerojatnije zarazili u kontaktu s izlučevinama zaraženih glodavaca iz prirode, a

kasnije prijenosom jedinki iz jednih uzgoja u druge. Oboljenje kod ljudi bilo je teško, s dugim

bolovanjem a kod nekih i s trajnim neurološkim posljedicama.

U pravilu, do zaražavanja uzgojnih pokusnih životinja može doći ako postoji komunikacija prema

prirodi i drugim životinjama, tj. mogućnost ulaza divljih ili komenzalnih životinja u uzgoj ili pak

mogućnost izlaza uzgojnih životinja izvan, uključujući i zračni put ako se radi o pticama. Nadalje do

zaražavanja može doći preko životinjske hrane, najčešće to mogu biti salmonele, a i preko vode za piće.

Rijetko, životinje se mogu zaraziti i od ljudi koji s njima rukuju, na primjer tuberkuloza. Također,

tijekom izvođenja pokusa u kojima se neke od životinja namjerno zaražavanju na primjer gripom, koja

se prenosi kontaktom i zrakom, gotovo neizbježno će se zaraziti druge životinje u blizini.

Od zaraženih pokusnih životinja mogu se pod određenim okolnostima zaraziti i razboljeti ljudi koji s

njima rade. Najvažniji putovi zaražavanja mogu biti zrakom, na primjer gripa, zatim kontaktom

odnosno kontaminacijom ruku, odjeće i sl., s posljedičnim nehotičnim unošenjem zaraze u usta, u oko

ili dr., također i kontaktom kroz svježe ozljede na rukama osoba, na primjer ako ih pokusne životinje

ogrebu ili ugrizu pri radu i sl. Također može se nehotice onečistiti hrana ili voda za piće ljudi koji rade s

pokusnim životinjama.

Stoga se stalno u svrhu zaštite zdravlja ljudi trebaju provoditi mjere koje čuvaju pokusne životinje od

zaraza, kao i mjere zaštite ljudi od zaražavanja. Uz to, važne su i opće sigurnosne mjere, a to su uvjeti u

prostorima gdje se poslovi odvijaju osobito ako se radi s vrlo opasnim uzročnicima zaraza koji se šire

zrakom. Tu su potrebni posebni laboratorijski uvjeti sigurnosti, 3. i više razine, također i analogni uvjeti

odnosno razine za životinjske nastambe, koji sprečavanju da neki uzročnici stignu do osoba koje

provode pokuse, ili pak u vanjsku sredinu, do drugih ljudi (5).

Također među sigurnosne mjere pripadaju i odluke o tome kakvi se pokusi u određenim uvjetima

mogu ili smiju obavljati bez opasnosti, a što je određeno lokalnim vlastitim sigurnosnim standardom

bez obzira na podatke iz svijeta u kojima su uvjeti možda bili drukčiji odnosno sigurniji.

Glavne mjere čuvanja zdravlja životinja u uzgoju u pogledu zaraznih bolesti su:

- inicijalne životinje moraju biti pregledane i zdrave, tj. bez relevantnih uzročnika humanih zaraza

(certifikati, neposredni pregled i pretrage)

- mjesta uzgoja moraju biti zaštićena od komunikacije s životinjama izvana, uključivši ptice i

insekte, fizičkim i drugim mjerama, kao što su mreže, ograde i dr.

- hrana za životinje mora biti provjereno sigurna, bez štetnih mikroorganizama, na primjer

salmonella i dr.

- voda za pokusne životinje također mora biti pitka odnosno odgovarati standardima za ljude tj. ne

smije sadržavati humane patogene bakterije niti viruse a također niti parazite kao što su

cryptosporidia, amoeba i dr, najlakše da je to vodovodna voda.

- stalan veterinarski nadzor nad zdravstvenim stanjem životinja

- mikrobiološke kontrole (feces, krv i dr)

- u slučaju nalaza zaraze, životinje (iz)liječiti ili isključiti iz programa za pokusne životinje

Page 92: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

92

- psi moraju biti cijepljeni protiv bjesnoće, i redovito dehelmintizirani tj oslobođeni crijevnih

parazita

- stoka, od koje se uzimaju tkiva u terapijske svrhe kao što je bovini albumin, hormon rasta i dr,

moraju biti sigurno slobodna od priona BSE-a

- životinje koje se uvoze u zemlju kao što su majmuni primati i dr. moraju uz strogi certifikat o

zdravlju pri ulasku dodatno provesti nužno vrijeme u karanteni uz veterinarski nadzor i

propisane pretrage, prije nego se prebace na mjesto gdje će s njima raditi.

- DDD mjere, posebno deratizacija nastambi životinja, kao i zaštita od hematofagnih vektora

posebno komaraca (dezinsekcija, mreže i dr.)

Glavne mjere zaštite zdravlja osoba koje rade s pokusnim životinjama

- cijepljenje protiv nekih bolesti: bjesnoća, gripa, krpeljni meningoencefalitis i dr. uz

cijepljenja iz programa masovnog cijepljenja (u ovom kontekstu najvažnije: tetanus)

- čuvanje ruku od ozljeda

- izbjegavanje rada kada su na rukama svježe ozljede

- uporaba zaštitne opreme: maske, naočale, rukavice, odjeća, obuća i dr

- pranje i dezinfekcija ruku

- jelo i piće s čistim rukama u odvojenim sigurnim prostorima

- čišćenje i dezinfekcije (i sterilizacija ) prostora, površina i pribora

- sigurno odlaganje infektivnog otpada, uključivši i žrtvovane životinje

- mikrobiološki sigurni uvjeti rada: kabineti, prostrije (laboratoriji) 3. i po potrebi 4.

stupnja zaštite.

- pedantno održavanje filtera za zrak i dr.

- praćenje vlastitog zdravstvenog stanja i reagiranje na sumnjive promjene

- periodski pregledi,

- ciljani dijagnostički pregledi u slučaju razbolijevanja (spomenuti liječniku okolnosti rada s

pokusnim životinjama)

Glavne mjere zaštite životinja u prirodi:

- sprečavanje kontakta između pokusnih životinja i drugih životinja fizičkim

barijerama, gradbenim, mreže i dr.

- sprečavanje bijega pokusnih životinja, moguće i eksperimentalno zaraženih nekom opasnom

bolešću, u prirodu, ili među gospodarske ili kućne životinje

Glavne mjere zaštite ostalih ljudi donosno stanovništva:

- sve mjere zaštite izlaska mikroorganizama koji potječu iz pokusnih životinja u okolicu, zrakom,

otpadnim vodama, ili dr. jer ako se to dogodi, ti uzročnici postaju opasnost za druge ljude.

- sigurno odlaganje infektivnog otpada (ovlaštene tvrtke)

- sigurno uklanjanje usmrćenih (žrtvovanih, uginulih) životinja (ovlaštene kafilerije)

- kod nekih bolesti koje se prenose zrakom ili bliskim kontaktom osigurati ostanak osoblja koje se

moglo zaraziti u karanteni dovoljno dugo kako bi se izbjegla zaraza ukućana ili drugih ljudi,

Page 93: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

93

nažalost karantena treba katkada biti i vrlo duga, a početak može biti nejasan jer bolest ne mora

biti izražena, već blaga ili inaparentna na primjer gripa

- nadzor nad zaraznim bolestima u zemlji; provodi ga epidemiološka služba: praćenje kretanja svih

važnih zaraznih bolesti, grupiranja poznatih ili nepoznatih bolesti, grupiranja nejasnih smrti (6),

što može upozoriti na zaražavanje osoblja ili na "bijeg" nekih uzročnika izvan okvira

eksperimenta

- nadzor nad mjestima i skupinama koje obavljaju pokuse na životinjama u kojima se primjenjuju

opasni mikroorganizmi, ili mikroorganizmi koji više ne cirkuliranju među ljudima kao što je

variola, divlji polio virus, španjolska gripa, ptičja gripa A/H5N1/ i dr.

- edukacija osoba koje obavljaju pokuse na životinjama o opasnostima širenja zaraza vezanima s

gore opisanim pokusima i o delikatnim i potencijalno neugodnim okolnostima u kojima je koji

puta teško nedovoljnu ozbiljnost ili nepažnju koja na bilo koji od opisanih mogućih načina

prouzroči nenamjerno i nesvjesno širenje uzročnika zaraznih bolesti izvan prostora provedbe

pokusa, među ljude, u populaciju, razlučiti od svjesnog propusta ili namjernog postupanja.

Vrijedi podsjetiti, iako to nije tema ovog predavanja, da se sve rečeno odnosi i na zaraze koje

nisu opasne za ljude, nego za životinje jer se mogu prouzročiti ekološke štete među životinjama

u prirodi, ili ekonomske štete ako se radi o životinjama koje koriste ljudima.

Na koncu treba uz zahvalnost ponoviti da su zahvaljujući pokusnim životinjama načinjeni golemi

pomaci u medicini, u zaštiti i vraćanju zdravlja ljudi i spašavanju života, a također i u drugim

područjima života. Taj će rad i u budućnosti biti u mnogim primjerima neophodan i nastavljen

racionalno i na način koji najmanje šteti životinjama, a u pogledu rizika zaraza, uz poštovanje mjera

zaštite zdravlja životinja i ljudi koje su ovdje ukratko predstavljene. U procjeni rizika i uspostavi mjera

izbjegavanja, a i suzbijanja zaražavanja u konkretnim okolnostima s kojima se naši stručnjaci u radu

susreću, znanja opće i specijalne epidemiologije zaraznih bolesti i stručnjaci liječnici epidemiolozi stoje

svima na raspolaganju.

Literatura

1. Borčić B. Zoonoze, u Borčić B. Epidemiolgija zaraznih bolesti II izdanje, Zagreb, 2000. str. 68-74.

2. Ropac D i sur. Epidemiologija zaraznih bolesti, Medicinska naklada, Zagreb, 2003, 532 str.

3. Heymann D.L. ur. Control of communicable diseases manual, American public health association

(APHA),WHO, Washington, 2008, 746 str

4. Marburg hemorrhagic fever. WHO, www.who.int/csr/disease/marburg/en

5. Laboratory biosafety manual, poglavlje: Laboratory animal facilities i druga. WHO, Geneva, 2003,

www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/labbiosafety.pdf

6. Zakon o zaštiti pučanstva od zaraznih bolesti, Narodne novine br 79/2007.

Page 94: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

94

PRAĆENJE ZDRAVLJA I BOLESTI LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA

Doc. dr. sc. Andrea Gudan Kurilj, dr. vet. med.

Zdravstveno stanje se može definirati kao trenutni status (stanje) jedinke koje se odnosi na kliničke,

patološke i fiziološke pojave, odnosno, jednostavnije rečeno, zdravstveni status pokazuje da li je

jedinka zdrava ili ne. Praćenje zdravlja laboratorijskih životinja nije ograničeno samo na laboratorijske

izvještaje o stanju životinja, već treba predstavljati i kulturu komunikacije između tehničara, voditelja

nastambe, veterinara i znanstvenika, tako da se eventualne abnormalnosti u uzgoju ili rezultatima

istraživanja mogu na vrijeme uočiti (prepoznati) te da se mogu poduzeti odgovarajuće mjere.

Na zdravlje životinja mogu utjecati mikrobiološki čimbenici (infekcije), okoliš i genetski čimbenici. Svi

ovi čimbenici su jednako važni, međutim utjecaj okoliša i genetike treba promatrati u kontekstu

objekata za smještaj životinja i tehnika njihovog uzgoja, pa tako i praćenje bolesti nastalih djelovanjem

ova dva čimbenika zahtjeva i nešto drugačiji pristup.

Infekcije predstavljaju svakodnevnu opasnost za laboratorijske životinje i stoga zahtjevaju stalno

praćenje mikrobiološkog statusa životinje, odnosno poštovanje pravila o redovitosti kontrole i broju

životinja koje se kontroliraju (u odnosu na veličinu određene populacije laboratorijskih životinja). Osim

što mogu uzrokovati klinički manifestne bolesti, veliki broj infekcija ne dovodi do pojave kliničkih

simptoma već su latentne, ali kao takve također mogu značajno utjecati na ishod pokusa. Uz to,

infekcije na životinjama mogu dovesti i do kontaminacije biološkog materijala (transplantati, kulture

stanica, serumi itd.), a također neki mikroorganizmi mogu predstavljati i potencijalnu opasnost za ljude

(zoonoze).

Ovdje bi bilo daleko preopširno govoriti o bolestima svih životinja koje se koriste u istraživanjima, stoga

će se govoriti uglavnom o infekcioznim bolestima kod najčešćih laboratorijskih životinja (glodavci i

kunići).

Bakterijske infekcije

Većina životinja koje se koriste u istraživanjima posjeduje tzv. normalnu (fiziološku) bakterijsku floru

koja normalno nema utjecaja na rezultate istraživanja (ako životinje nisu držane u sterilnim uvjetima,

nisu slobodne od svih bakterija). Bakterijske infekcije (patogenim bakterijama) mogu uzrokovati bolest

i druge negativne posljedice za samo istraživanje. Bakterije koje najčešće uzrokuju infekcije kod

laboratorijskih glodavaca i kunića su sljedeće: gram negativne (Bordetella bronchiseptica,

Campylobacter coli/jejuni, CAR Bacillus, Citrobacter rodentium, Escherichia coli, Frabcisella tularensis,

Fusobacterium necrophorum, Haemophilus spp., Helicobacter spp. , Klebsiella pneumoniae, Leptospira

spp., Pasteurella multocida, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Spirillum minus,

Streptobacillus moniliformis, Treponema paraluis-cuniculi, Yersinia pseudotuberculosis); gram

pozitivne (Clostridium spp., Corynebacterium kutscheri, Erysipelothrix rhusiopathiae, Listeria

monocitogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp.); klamidije i mikoplazme (Chlamydia

psitacci, Mycoplasma spp.).

Page 95: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

95

Gljivične infekcije

Od gljivičnih infekcija treba spomenuti dermatomikoze uzrokovane s Trychophyton i Microsporum spp.

koje su zoonoze. Također, Pneumocystis carinii je mikroorganizam često prisutan u populaciji

glodavaca, a naročito je značajan patogen kod imunosuprimiranih životinja.

Virusne infekcije

Laboratorijski glodavci i kunići, iako bi trebali biti, nisu u potpunosti slobodni od virusa. Međutim,

posljednjih godina se značajno smanjio broj kolonija laboratorijskih životinja inficiranih virusima. Virusi

koji najčešće uzrokuju infekcije su: parvovirusi, coronavirusi, cardiovirusi i paramiksovirusi, a rjeđe se

mogu naći i drugi virusi (adenovirusi, herpetoviride, papovaviride, poksvirusi, kalicivirusi, pikornaviride,

reoviride, retroviride).

Parazitarne invazije

Laboratorijske životinje trebale bi biti slobodne od parazita. Iako parazitarne invazije u pravilu ne

uzrokuju ozbiljnije kliničke simptome, često rezultiraju subkliničkim poremetnjama i interferiraju s

rezultatima istraživanja. Paraziti koji se često nalaze kod laboratorijskih glodavaca i kunića su brojni:

ektoparaziti (grinje, uši), endoparaziti (bičaši (pr. Giardia spp.,Trichomonas spp.), amebe, sporozoe

(Encephalitozoon cuniculi, Eimeria spp., Klosiella sp.), nematodi, trakavice, metilji).

Druge bolesti

Laboratorijski glodavci i kunići mogu oboljeti i od niza drugih (spontanih) bolesti koje nastaju kao

posljedica nutritivnih i metaboličkih poremetnji (pr. amiloidoza, kalcifikacije), zatim genitourinarne

poremetnje (glomerulopatije i druge degenerativne bolesti), spontani tumori (naročito tumori mliječne

žlijezde i limforetikularni tumori).

Utjecaj bolesti na pokuse sa životinjama

Klinički oblik bolesti samo je jedan od načina na koji infekcije i druge bolesti laboratorijskih životinja

mogu imati negativne učinke na istraživanje, a izostanak simptoma bolesti također ne znači i potpuni

izostanak bolesti kod životinja. Tako subkliničke infekcije mogu utjecati na određene parametre, kao

što je primjer kod subkliničkih virusnih infekcija štakora koje mogu utjecati na težinu. Osim toga, kod

subkliničkih bolesti često se mijenja ponašanje životinja što također može značajno utjecati na

pojedina istraživanja. Prisutnost mikroorganizama ili druge bolesti može uzrokovati promjene na

organima koje mogu otežavati ili čak maskirati patološke promjene koje se npr. istražuju u

toksikološkim studijama. Također, respiratorne bolesti mogu rezultirati uginućem životinje prilikom

anestezije.

Kao što je već ranije spomenuto, mikroorganizmi prisutni u životinjama, mogu kontaminirati i biološki

materijal, što može dovesti do širenja uzročnika (naročito virusi i mikoplazme) u različite laboratorije

(npr. poznati su slučajevi širenja virusa preko inficiranih staničnih kultura).

Page 96: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

96

Mnoga istraživanja se temelje na funkcijama imunološkog sustava laboratorijskih životinja. Stoga je

važno znati da neki mikroorganizmi mogu uzrokovati imunomodulaciju bez klinički vidljive bolesti, što

može značajno utjecati na pojedina istraživanja. Osim toga, neki mikroorganizmi imaju specifičan

učinak na enzimatske, hematološke i druge parametre koji se prate tijekom istraživanja (npr. virus

hepatitisa miša dovodi do oštećenja jetre što mijenja aktivnost jetrenih enzima i na taj način utječe na

rezultate istraživanja naročito u toksikološkim i nutritivnim studijama). Također, neki mikroorganizmi

mogu inducirati tumore, potaknuti onkogeni učinak određenih gena ili pak smanjiti incidenciju tumora

kod laboratorijskih životinja, što može značajno utjecati na rezultate onkoloških istraživanja.

Temeljem navedenoga, vidljivo je da laboratorijske životinje mogu oboljeti od različitih bolesti, zbog

čega one same ili njihovi produkti negativno utječu na rezultate istraživanja. Zbog toga je vrlo važna

kontrola zdravlja i standardizacija laboratorijskih životinja, primarno mikrobiološka, kako bi se

osigurala određena kvaliteta laboratorijskih životinja te se ona održala kroz čitavo vrijeme trajanja

pokusa.

Literatura

Hillyer E. V., Quesenberry K. E.: Ferrets, Rabbits and Rodents. Clinical Medicine and Surgery. W. B.

Saunders Company, 1997.

Kornerup Hansen A: Health Status and Health Monitoring. In: Handbook of Laboratory Animal Science

(Hau J. and Hoosier G. L., Eds.). Second Edition, 2002, CRC Press LLC, 233-280.

Nicklas W., Beneux P., Boot R., Decelle T., Deeny A.A., Fumanelli M., Illgen-Wilcke B.:

Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and

experimental units. Lab. Anim. 36, 20, 2002.

Percy D. H., Barthold S. W.: Pathology of Laboratory Rodents & Rabbits. Second Edition, 2001, Iowa

State University Press.

Page 97: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

97

BOL I OTKLANJANJE BOLI

Dr. sc. Dubravka Švob Štrac

Definicija i važnost boli

Prema Međunarodnoj udruzi za proučavanje boli (1979), bol je definirana kao „neugodno osjetilno i

osjećajno iskustvo povezano s stvarnim ili potencijalnim oštećenjem tkiva ili uvjetovano tom

ozljedom“. Unatoč svojoj neugodnosti, zbog svoje važne upozoravajuće i zaštitne uloge u organizmu

bol je ključna je za opstanak ljudi i životinja.

Naime, bol predstavlja fiziološki sustav upozorenja na određene čimbenike koji dovode do boli, a koji

mogu biti škodljivi i opasni za organizam, te na koje treba reagirati. Kao dio tjelesnog obrambenog

sustava, bol okida mentalno i fizičko ponašanje s ciljem pronalaska načina da se prekine bolno iskustvo.

Signali boli prenošeni senzoričkim neuronima u leđnoj moždini aktiviraju automatske zaštitne reflekse

koji brzo odmiču ugrožene dijelove tijela od potencijalno opasnog podražaja sprječavajući ili

umanjujući oštećenje tkiva. Naravno, kako je u određenim okolnostima važno da aktivnosti poput

obrane i bijega nisu spriječene zbog boli, razvili su se razni fiziološki mehanizmi koji potiskuju osjet boli,

kao što je otpuštanje endogenih analgetika poput endogenih opioida i met-encefalina.

Istovremeno, bol predstavlja povratnu informaciju koja potiče učenje o opasnim ili prijetećim

situacijama, te načinima kako ih izbjegavati, čineći ponavljanje jednakog bolnog iskustva manje

vjerojatnim. Također, bol ima ulogu pri oporavku i zacjeljivanju. Naime, nakon ozljede osjećaj boli

usmjerava pažnju na ranu, sprječava aktivnosti, promiče mirovanje i odmor i slična ponašanja koja štite

ozlijeđeni dio tijela i vode zacjeljenju i oporavku.

Klasifikacija boli

Bol možemo klasificirati na različite načine, gledano prema jakosti, karakteru, trajanju, lokalizaciji i

izvoru patofizioloških promjena, uzroku i brojnim drugim čimbenicima. Bol u intenzitetu može se

razlikovati počevši od lagane, zatim teške, te naposljetku agonizirajuće. Može ju se doživjeti kao oštru,

pulsirajuću, mučnu, goruću, strijeljajuću ili kao kombinaciju navedenih. Prema trajanju bol može biti

akutna i kronična, koja se može pojaviti kao trajna, intermitentna ili periodična.

Razlika između akutne i kronične vrste boli ne nalazi se samo u trajanju osjećaja boli, već i u naravi

same boli. Akutna bol potrebna je za opstanak i ima zaštitnu ulogu, jer služi kao alarm na ozljedu ili

oštećenje tijela. Može trajati od samo nekoliko minuta do 6 mjeseci, a obično prestaje za manje od 1

mjeseca, odnosno nakon cijeljenja tkiva. S druge strane kronična bol obično traje dulje od 6 mjeseci,

dakle više od očekivanog razdoblja cijeljenja tkiva, a može nastati kao posljedica razvijajuće bolesti ili

poremećaja. Međutim, kronična bol može se javiti i spontano, bez prisutnosti ikakvog prepoznatljivog

fizičkog uzroka ili ozljede. Također, kronična bol obično nema zaštitnu ulogu u preživljavanju i može

dovesti do stresa i mnogobrojnih psiholoških problema.

Bol se nadalje može klasificirati i prema postanku (spontana, izazvana, potaknuta) i prema izvoru (napr.

somatska, organska, neuropatska, psihogena, itd.). Lokalizacija boli nije uvijek točna i ne mora točno

upućivati na problematično područje. Naime, osjećaji boli mogu se proširiti ili zadržati na pojedinom

Page 98: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

98

mjestu. Doživljaj boli razlikuje se od pojedinca do pojedinca, a interpretacija boli subjektivna je i

uvelike ovisi o ličnosti, dobi, spolu, iskustvu, duhovnom nasljeđu, emocionalnom stanju, motivaciji, itd.

Na konačni doživljaj bolnog podražaju utječu različiti čimbenici psihičkog stanja i utjecaja okoline.

Stoga, bol nije isključivo rezultat prijenosa bolnih impulsa od mjesta ozljede do mjesta osjeta u mozgu,

već na njeno oblikovanje utječu kvantitativni, kvalitativni i osjećajni čimbenici, te iskustvo uz kulturne,

društvene i ekonomske čimbenike.

Nemogućnost osjećanja boli, poput one u rijetkom stanju urođene neosjetljivosti na bol ili

kongenitalne analgezije, jest uzrok nesvjesnosti prema fizičkom oštećenju tkiva. S druge strane,

hiperalgezija nastaje kao posljedica pojačane podražljivosti senzoričkih neurona koja dovodi do

pojačanog oslobađanja neurotransmitora glutamata i supstance P u dorzalni rog leđne moždine.

Vezanje supstance P na NK-1 receptore i glutamata na AMPA i NMDA receptore izaziva pojačanu

podražljivost samih neurona dorzalnog roga leđne moždine, kojima se informacije o boli prenose do

viših centara u mozgu. Takvo pojačano signaliziranje o boli kao odgovor na infekciju ili oštećenje tkiva

može biti korisno (obraća se pažnja na ozljedu, te uči izbjegavanje takve ozljede ubuduće).

Osjet boli

Općenito se smatra da bol predstavlja subjektivni doživljaj koji se sastoji od dvije komponente: 1)

osjeta fizičke boli i nelagode izazvanog ozljedom ili bolešću i 2) emocionalne patnje. Percepcija boli ili

nocicepcija (od latinske riječi nocere = ozlijediti, oštetiti) predstavlja proces prijenosa signala kojim se

bolni podražaj uslijed ozljede ili oštećenja tkiva prepoznaje i prenosi od mjesta nastanka štetnog

podražaja do središnjeg živčanog sustava. Iako se pojmovi nocicepcije i boli učestalo koriste kao

sinonimi, nocicepcija se tehnički odnosi na prijenos nociceptivne informacije u mozak bez obzira na

nastanak emocionalnog ili drugih odgovora na štetan podražaj. Nocicepcija dakle predstavlja fiziološki

događaj kojim se prenose somatske informacije bez prisustva svijesti i neovisno se opaža od boli koja

predstavlja percepciju osjetilne informacije.

Postoji nekoliko ključnih koraka u procesu nocicepcije: 1) kontakt sa podražajem koji može biti

mehanički (napr. pritisak, ubod, porezotina) ili kemijski (opekotina), 2) primanje i prepoznavanje

bolnog podražaja na razini živčanog završetka, 3) prijenos informacije u središnji živčani sustav, 4)

preuzimanje informacija u mozgu za daljnju obradu i djelovanje.

Put boli

U putu boli razlikujemo 4 glavne faze:

1) Transdukcija: U koži, zglobovima, mišićima, te unutarnjim organima na završecima senzoričkih živaca

nalaze se eksprimirani receptori (nociceptori), koji se aktiviraju pod utjecajem širokog raspona

potencijalno štetnih mehaničkih, kemijskih i toplinskih podražaja, kao i raznih upalnih medijatora

(serotonin, proupalni citokini, bradikinin, histamin, prostaglandini) koji nastaju na mjestu ozljede. U

odgovoru na aktivaciju perifernih receptora podraženi živčani završeci otpuštaju svoje transmitore

(supstancu P, CGRP, neurokinin A i druge neuropeptide) u izvanstaničnu tekućinu u području na kojem

se nalaze, što pojačava osjet boli, fenomen nazvan periferna senzitizacija. Osim ove periferne

transmisije, periferni nociceptori djeluju i na centralni proces transmisije.

2) Transmisija: Nakon aktivacije nociceptora na periferiji (tzv. neuroni prvog reda) dolazi do širenja

akcijskog potencijala u kojem sudjeluju 3 glavna neurotransmitora: glutamat (dominantan kod prvog

Page 99: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

99

osjeta boli i povezan sa akutnom boli), supstanca P (otpuštena iz C vlakana i općenito povezana sa

intenzivnom i kroničnom boli, a koja sudjeluje u provođenju informacija o boli u leđnu moždinu i

mozak) i glicin (uključen u supresiju prijenosa signala boli). Električni signali iz primarnih aferentnih

aksona provode se do dorzalnih rogova u leđnoj moždini. Dva tipa aferentnih vlakana koja idu prema

leđnoj moždini prenose nociceptivne informacije: 1) mijelinizirana Aδ vlakna koja provode brze

akcijske potencijale (prva bol), a odgovaraju primarno na mehaničku i toplinsku stimulaciju (oštar

pritisak, dodir ili toplinu), 2) sporija C vlakna nemijeliziranih aksona koja odgovaraju na intenzivnu

stimulaciju sa više različitih podražaja: pritiskom, toplinom ili hladnoćom i štetnim kemikalijama. Ova

vrsta boli predstavlja dugotrajnu bol koju osjećamo kada je oštećenje već nastalo, kao što je napr.

sunčana ili neka druga opekotina. Obje tipa vlakana odlaze u leđnu moždinu, gdje uspostavljaju sinapse

s neuronima čiji se aksoni dalje protežu prema talamusu i moždanoj kori.

3) Modulacija: Aksoni neurona drugog reda u leđnoj moždini šalju senzorne informacije o boli u obliku

električnog impulsa u talamus gdje stvaraju sinapse s neuronima trećeg reda. Osjet boli prenosi se iz

leđne moždine preko nekoliko središnjih živčanih putova od kojih su u životinja dva najznačajnija

spinotalamički i spinocervikotalamički put. Spinotalamički put se klasično smatra kao glavni put

prijenosa podražaja boli u sisavaca. Stanice leđne moždine provode brze poruke akutne boli u talamus

i korteks, dok spora kronična bol također najprije putuje kroz leđnu moždinu, ali kada stigne do mozga

odjeljuje se i završava u hipotalamusu i limbičkim strukturama. Signali poslani u retikularnu formaciju i

talamus omogućuju osvješćivanje osjeta boli u obliku tupe slabo lokalizirane boli. U retikularnoj

formaciji podražaj bola može izazvati uzbuđenje, kao i aktivaciju autonomnog živčanog sustava koja

izaziva promjene u brzini otkucaja srca, krvnom tlaku, disanju i drugim aktivnostima.

4) Percepcija: U ovoj posljednjoj fazi puta bol se prenosi projekcijama neurona trećeg reda iz talamusa

u moždanu koru, pri čemu dolazi do svjesnog doživljavanja i lokalizacije boli. Neuroni lateralnog

talamusa (uključeni u diskriminaciju i lokalizaciju bolnog podražaja) protežu se u somatosenzorni

korteks, dok se neuroni medijalnog talamusa (uključeni u afektivne aspekte boli) protežu u druga

područja moždane kore.

Kada informacije o boli dospiju do mozga, neki signali idu u motorički korteks, a iz njega u leđnu

moždinu i motoričke živce. Ovi impulsi izazivaju napr. mišićne kontrakcije potrebne za odmicanje od

uzroka boli. Dakle, osim uzlaznih putova koji provode nociceptivne informacije od tijela prema mozgu,

sustav boli sastoji se i od silaznih puteva koju modiliraju informacije. Silazni putovi koji imaju podrijetlo

u somatosenzornom korteksu i hipotalamusu stvaraju sinapse sa uzlaznim putovima u meduli i leđnoj

moždini, čime inhibiraju uzlazne živčane signale i dovode do olakšavanja boli (analgezija). Naime,

slanjem odgovora natrag na periferiju, mozak može na mjestu upale potaknuti lokalno otpuštanje

supstanci koje imaju analgetički učinak, kao što su prirodni opioidini neurotransmitori endorfini,

dinorfini i enkefalini koje mogu smanjiti ili inhibirati bol.

Naime, teorija „vratarenja boli“ bazira se na uvjerenju da fizikalni i psihološki čimbenici utječu na našu

interpretaciju i odgovor na bol. Ova teorija sugerira da postoji sustav „vrata“ u dorzalnim rogovima

leđne moždine kroz koji informacija o boli mora proći na svom putu do mozga. Otvaranjem i

zatvaranjem tih «vrata» za bolnu informaciju može se utjecati sa percepciju boli. Naime, informacija

koja putuje niz silazni put boli iz viših centara u mozgu zatvara vrata stvaranjem sinapsi sa inhibitornim

neuronima u dorzalnim rogovima leđne moždine i suprimira provođenje boli.

Page 100: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

100

Životinje i bol

Znanstveni dokazi pokazuju da životinje osjećaju i reagiraju na senzornu bol i ozljedu i posjeduju bar

neke od moždanih struktura zaduženih za procesiranje boli u ljudi. Bol u životinja vjerojatno ima istu

zaštitnu svrhu kao i u ljudi i jednako je važna. Nadalje, živčani sustav životinja vrlo je sličan ljudskome,

te pokazuje jednake fiziološke odgovore kada se životinja nalazi u okolnostima u kojima ljudi osjećaju

bol. Nociceptivni živci koji detektiraju bolni podražaj izazvan ozljedom identificirani su u velikom broju

životinja, uključujući beskralješnjake. Međutim, smatra se da su beskralješnjaci sposobni proizvesti

samo reaktivni odgovor na podražaj i da nemaju sustave u mozgu neophodne za procesiranje boli kakvi

postoje u kralješnjaka. Naime, svi kralješnjaci posjeduju primitivna područja u mozgu kao što su

medula, talamus i limbički sustav kojima procesiraju nociceptivne informacije. Odgovori životinja na

bolno oštećenje sastoje se od fizioloških promjena i promjena u ponašanju. Iako obzirom na

ponašanje, životinje u boli pokazuju refleksne odgovore slične ljudskima, ovi odgovori su kompleksni i

koordinirani, te predstavljaju više od jednostavnih refleksa.

Iako je jedno od glavnih područja uključenih u percepciji bola kora velikog mozga, koja je mnogo

razvijenija u ljudi nego u životinja, osnovni impulsi, emocije i osjećaji locirani su u diencefalonu koji je

dobro razvijen u životinja, posebno u sisavaca i ptica. Iako se većina ljudi slaže da su životinje sposobne

osjećati fizičku bol ili nelagodu izazvanu ozljedom ili bolešću, nije jasno da li također mogu osjećati

emocionalnu bol i patnju. Usprkos tvrdnjama nekih znanstvenika da samo primati i ljudi mogu osjećati

emocionalnu bol, istraživanja su dokazala da majmuni, psi, mačke i ptice tijekom bolnog iskustva mogu

pokazivati znakove emocionalne boli i depresije kao što su nedostatak motivacije, letargija, anoreksija i

nereaktivnost na druge životinje. Iako ljudi i životinje dijele slične mehanizme detekcije bola, imaju

slična područja u mozgu koja su uključena u procesiranje boli i pokazuju slična ponašanja u odgovoru

na bol, doživljaj boli kod životinja i ljudi ne mora biti identičan. Naravno, iako je bol životinja možda

različita od ljudske boli to nije razlog da se smatra manje značajnom, bilo biološki ili etički.

Prepoznavanje i procjena boli životinja

Prevencija i olakšavanje boli i stresa u laboratorijskih životinja promovira cjelokupnu dobrobit životinja

i predstavlja etički imperativ. Uspješno otklanjanje boli može se postići i održavati samo kada se

znakovi boli mogu prepoznati pouzdano i točno. Za točnu procjenu boli životinje ključno je poznavanje

obrazaca normalnog ponašanja životinja i prepoznavanje njihovih promjena. Procjena boli životinja

može biti utjecana sa mnogo složenih čimbenika uključujući soj, vrstu, iskustvo, dob, zdravlje, stres i

brojne druge faktore.

Mnoge sličnosti između ljudi i životinja koriste se u detekciji animalne boli, te se različite metode

razvijene za procjenu boli u ljudi pokušavaju primijeniti i na životinjama. Utvrđivanje kliničke boli u

životinja bazira se primarno na praćenju ponašanja i promjena u fiziološkim reakcijama. Naime, u

životinja se prate fiziološki parametri poput frekvencije otkucaja srca i disanja, krvnog tlaka i

temperature tijela, te promjene biokemijskih čimbenika napr. kateholamina, kortikosteroida,

adrenalina, te proteina akutne faze i glukoze u krvi. Za utvrđivanje boli prate se i znakovi ponašanja

životinja i mjere se klinički znakovi boli (analgesiometrija) u čiju svrhu su razvijeni brojni testovi

ponašanja.

Na bol životinje može uputiti prisutnost ozljede, te promijenjeni odgovori u ponašanju poput povećane

agresivnosti i iritabilnosti, smanjene aktivnosti ili nepokretnosti, izbjegavajućeg ponašanja, letargije,

Page 101: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

101

nereaktivnosti, nevoljkosti prema dodiru, smanjene konzumacije hrane i vode, gubitka sna, promjena u

urinaciji i defekaciji te parenju i reprodukciji, hromosti, pogrbljenosti, štićenja djela tijela, nenormalnog

lizanja ili griženja, suprimiranog socijalnog ponašanje poput timarenja, pojave neuobičajenih obrazaca

ponašanja, pojačanog glasanja i mnogih drugih znakova boli i stresa.

Otklanjanje boli

Strategije otklanjanja boli uključuju primjenu lijekova, operacije i razne alternativne postupke, te

njihovu kombinaciju. Različite vrste lijekova protiv boli djeluju na različitim mjestima unutar puta boli.

Vrsta primijenjenog lijeka ovisi o uzroku boli, razini nelagode i mogućim neželjenim popratim

pojavama. Periferni analgetici djeluju na samom mjestu bolnog podražaja smanjujući upalu i bol.

Naime, ovi lijekovi interferiraju sa enzimima otpuštenim iz oštećenog tkiva koji stimuliraju lokalne

receptore boli. Takvi ne-opioidni analgetici poput aspirina, paracetamola i ne-steroidnih protuupalnih

lijekova primjenjuju se u terapiji blage do umjerene boli, te u slučajevima peri- i post-operativne boli.

Centralni analgetici djeluju na sinaptičnu transmisiju u različitim dijelovima središnjeg živčanog sustava

vezivanjem na prirodne opioidne receptore. Opioidni analgetici svoje djelovanje ostvaruju inhibicijom

uzlaznih i aktivacijom izlaznih putova percepcije boli. Slabi opioidi uglavnom se upotrebljavaju u

kombinaciji s ne-steroidnim protuupalnim lijekovima u postoperativnoj analgeziji, dok se jaki opioidi

primjenjuju za olakšavanje visokih razina boli, te se često kao i alfa-2-adrenergični agonisti

upotrebljavaju u kombinaciji s anesteticima. Pomoćni analgetici (ko-analgetici) primarno se koriste u

liječenju nekih drugih poremećaja, ali također olakšavaju bol. Ove supstance korisne su u tretmanu

neuropatske boli (kronične boli koja nastaje zbog oštećenja središnjeg živčanog sustava), a uključuju

antiepileptike, tricikličke antidepresive i anestetike. Lokalni anestetici uključujući analgetike i

miorelaksanse često se koriste u kombinaciji s općom anestezijom i sedativima. Kirurške intervencije

koje se provode u svrhu otklanjanja boli mogu biti usmjerene uklanjanju izvora boli ili u ekstremnim

slučajevima prekidanju putova boli promjenom moždanih područja povezanih s percepcijom boli

(rhizotomija i kordotomija). S druge strane, alternativna terapija boli koja ne uključuje lijekove ili

operacije odnosi se na kiropraktičke manipulacije, masažu, primjenu topline odnosno hladnoće,

akupunkturu, te mentalne tehnike kontrole poput tehnika opuštanja i odvraćanja pažnje, hipnoze i

biofeedback-a.

Literatura

Basbaum AI, Woolf CJ. Pain. Curr Biol. 1999; 9: 429-431.

Jensen MP. A neuropsychological model of pain: research and clinical implications. J Pain. 2010; 11: 2-

12.

Kuner R. Central mechanisms of pathological pain. Nat Med. 2010; 16:1 258-1266

Langford RM. Pain management today - what have we learned? Clin Rheumatol. 2006;25 Suppl 1:S2-8.

Epub 2006 Jun 2.

Mannion RJ and Woolf CJ. Pain mechanisms and management: A central perspective. The Clinical

Journal of Pain, 2000; 16: 144-156

Mao J. Translational pain research achievements and challenges. Pain. 2009; 10: 1001–1011.

Page 102: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

102

Mellor DJ. Animal emotions, behaviour and the promotion of positive welfare states. N Z Vet J. 2012;

60:1-8.

Mogil JS, Davis KD, Derbyshire SW. The necessity of animal models in pain research. Pain. 2010; 151:

12-7.

Petersen-Felix S, Curatolo M. Neuroplasticity--an important factor in acute and chronic pain. Swiss

Med Wkly. 2002;1 32 :273-178.

Raffa R. Pharmacological aspects of successful long-term analgesia. Clin Rheumatol. 2006; 25: 9-15..

Voscopoulos C, Lema M. When does acute pain become chronic? Br J Anaesth. 2010; 105: 69-85.

Zeilhofer HU. Synaptic modulation in pain pathways. Rev Physiol Biochem Pharmacol.2005; 154: 73-

100.

Page 103: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

103

ANESTEZIJA I ANALGEZIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA

Doc. dr. sc. Vesna Benković

Uvod

Pojam anestezija podrazumjeva smanjenu osjetljivost cijelog ili pojedinih dijelova tijela, a postiže se

sredstvima koja vrše depresiju živčanog tkiva lokalno ili središnjeg živčanog sustava u potpunosti.

Analgezija označava odsutnost boli.

Zakonodavstvo i načela humanog korištenja laboratorijskih životinja u znanstvenim istraživanjima

zahtijevaju da pokusi moraju biti izvedeni na način koji smanjuje bol i patnju životinja. Bolni

eksperimenti trebaju se izvodi u lokalnoj ili općoj anesteziji.

Jedan od glavnih problema anestezije i upravljanja boli kod laboratorijskih životinjama leži u činjenici

da je, u mnogim slučajevima, teško utvrditi primjerenost anestezije ili analgezije. Zbog toga se u

mnogim okolnostima primjenjuje načelo analogije gdje se bol životinja procjenjuje na temelju ljudskog

iskustva. Današnje razumijevanje fiziologije boli jasno pokazuje važnost prevencije razvoja osjetljivosti

perifernog i središnjeg živčanog sustava i razvoja boli. Ovim pristupom razvoj, intenzitet i trajanje boli

životinja će se smanjiti te ubrzati njihov oporavak.

Znanstveno prikupljanje podataka tijekom anestezije zahtjeva precizno definiranje praćenih

parametara i procjenu potencijalnih interakcija između prikupljenih podataka i samih anestezijskih

postupaka na temelju dostupnih fizioloških i farmakoloških parametara.

Životinja koja osjeća bol najčešće pokazuje znakove smanjene aktivnosti, potištenosti, promjene

ponašanja (agresivnost, uzmicanje), opiranje pregledu, promjene načina kretanja - tromosti,

neuobičajen stav ili položaj tijela, grizenje ili lizanje bolnog dijela, anoreksija, salivacije, tahikardije,

znojenja. Bihevioralni znaci vrlo su varijabilni i ovise o temperamentu životinje te je stoga važan

individualni pristupa svakoj pojedinoj vrsti životinja.

Vrste anestezija

Opća anestezija je farmakološki izazvano nesvjesno stanje karakterizirano kontroliranom,

reverzibilnom depresijom CNS-a. Redoslijed depresije nije pravilan, tako da poslije kore velikog mozga,

preskaču se medularni centri, a depresija zahvaća ganglije i mali mozak te na kraju medularne centre.

Opća anestezija treba biti stanje bezopasne, reverzibilne neosjetljivosti, pri čemu to stanje

karakteriziraju analgezija, hipnoza, mišićna relaksacija i gubitak refleksa.

Lokalna anestezija je gubitak osjeta u ograničenom dijelu tijela. Mnogi kirurški zahvati mogu se

uspješno izvesti u lokalnoj anesteziji, uz pomoć sedacije ili bez nje. Brojni zahvati na velikim životinjama

(konj, govedo) mogu se izvesti na životinji koja stoji, čime se izbjegavaju opasnosti vezane uz

dugotrajno ležanje te uz obaranje. Lokalna analgezija omogućava smanjenje potrebne dubine opće

anestezije. Tehnike lokalne anestezije ne zahtijevaju primjenu skupe ili komplicirane opreme. Lokalni

anestetici su kemijski spojevi kojima se postiže reverzibilna lokalna ili regionalna neosjetljivost uz

očuvanje svijesti, a mogu se primijeniti u obliku gela, krema, otopina ili aerosola.

Page 104: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

104

Sedacija označava centralnu depresiju i pospanost, a životinja nije svjesna okoline. Narkoza je

farmakološki izazvano stanje dubokog sna iz kojeg životinju nije lako probuditi (1-3).

Tipovi opće anestezije obzirom na način primjene anestetika jesu:

- inhalacijska (udisanje anestetičkih plinova ili para s kisikom) i

- injekcijska (ubrizgavanje otopina anestetika intravenski i.v., intramuskularno i.m., subkutano s.c.).

Za anesteziju glodavaca (zečevi, štakori, miševi) preporuča se i.v. i i.m. primjena anestetika i to

ketamina ("Narketan"), ksilazina ("Xylapan"), rompuna, tiopentala; moguće je uporijebiti sam ketamin

ili u kombinaciji s ostalima ovisno o tome koliko anestezija treba trajati.

Opći anestetici i analgetici ponekad mogu biti primijenjen na sluznicu u ustima ili rektum, kako bi se

izbjegla bolna injekcija ili neposredno metaboliziranje anestetika u jetri koje se javlja nakon oralne i

intraperitonealne primjene. Praćenje tijeka anestezije temelji se na opažanjima vezanim uz

neuromuskularne znakove nakon primjene anestetika s ciljem sigurnog izvođenja operacijskog zahvata

i sigurnog vođenja i buđenja iz anestezije. Životinja prolazi kroz različite stupnjeve anestezije koji su

povezani s dubinom anestezije. Produbljivanjem anestezije dolazi do progresivnog gubitka osjeta boli,

koordinacije motorike, refleksa, svijesti te mišićnog tonusa.

Stupnjevi opće anestezije prema Guedallu (1920. god.):

I. stupanj- stupanj voljnih pokreta, definira se kao vrijeme od početka davanja anestetika do gubitka

svijesti. Frekvencija bila i disanja su ubrzani, a svi refleksi su prisutni. Salivacija, mokrenje i defekacija

često se uočavaju u ovom stadiju anestezije;

II. stupanj - stupanj delirija je poznat također kao i stadij nevoljnih pokreta. Zbog depresije kortikalne

kontrole bilo koja stimulacija (pljesak, pad instrumenta na pod i sl.) dovode do mišične hiperaktivnosti,

hiperventilacije ili prestanka disanja. Ovaj stupanj počinje s gubitkom svijesti i traje do pojave pravilnog

disanja. Svi refleksi su još uvijek prisutni, životinja žvače i guta, zjenice su proširene te reagiraju na

svjetlost;

III. stupanj - stupanj kirurške anestezije karakterizira nesvjesno stanje, progresivna depresija refleksa te

pojava pravilnog i laganog disanja;

IV. stupanj - stupanj paralize disanja pri kojoj dolazi do depresije centra za disanje u CNS-u i prestanka

disanja. Ovo stanje može završiti srčanim arestom. Krvni tlak pada, vrijeme ponovnog punjenja kapilara

se produžuje, zjenice su proširene te dolazi do popuštanja sfinktera anusa i mokračnog mjehura. Svaka

refleksna aktivnost prestaje. Ovaj je stupanj anestezije može se ispraviti brzom ventilacijom, kako bi

što prije smanjili koncentraciju anestetika u plućima i krvotoku (3).

Anesteziološki postupci

Opća anestezija postiže se izborom odgovarajućih tehnika anestezije (inhalacijska, injekcijska,

epiduralna) te odgovarajućih preparata za anesteziju što opisuje anestezijski protokol. Izbor

anestezijskog protokola radi se za svaku pojedinu životinju, a ovisi o vrsti životinje, kliničkom statusu,

planiranom zahvatu, dostupnosti pojedinih preparata ili opreme za anesteziju (aparat za inhalacijsku

anesteziju). Anesteziološki postupci dijele se na:

1. premedikaciju,

Page 105: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

105

2. indukciju anestezije,

3. održavanje anestezije i

4. oporavak ili buđenje iz anestezije.

1. Premedikacija se odnosi na vrijeme prije uvoda u anesteziju u kojem se primjenjuju određeni

anestetici. Indukcija anestezije je period u kojem životinja gubi svijest. Započinje nakon što je uočljiv

učinak premedikacije (minimalno 10 minuta nakon intramuskularne primjene te 20 minuta nakon

potkožne primjene). U pojedinim slučajevima premedikacija i indukcija anestezije se primjenjuju

istovremeno.

2. Indukcija anestezije može biti obavljena injekcijskim ili inhalacijskim anestetikom. Ako koristimo

injekcijski anestetik za indukciju anestezije vrlo često nakon njega obavljamo endotrahealnu intubaciju

i započinjemo primjenu inhalacijskog anestetika. Ako za indukciju anestezije koristimo inhalacijski

anestetik, njega primjenjujemo preko maske ili u izrazito agresivnih životinja to je moguće učiniti

stavljanjem životinje u indukcijsku komoru. Međutim, treba napomenuti da indukcija inhalacijskim

anestetikom nije prva metoda izbora, jer se životinje boje maske, smeta im neugodan miris

inhalacijskog anestetika, pa se životinje ispočetka uspaniče.

3. Održavanje anestezije je period u kojem se anestezija održava dovoljno duboko za izvođenje

određenog operacijskog zahvata. Za vrijeme održavanja anestezije dolazi do miorelaksacije, daljnjeg

gubitka refleksa (palpebralni refleks), analgezije te se uočava depresija dišnog i kardiovaskularnog

sustava. Održavanje anestezije izvodi se ili korištenjem inhalacijskog anestetika ili injekcijskog

anestetika. Važno je pratiti vitalne funkcije (rad srca, disanje, tjelesnu temperaturu, hidraciju) tijekom i

po završetku operativnog zahvata.

4. Oporavak ili buđenje iz anestezije započinje kada se koncentracija anestetika u mozgu počne

smanjivati. Metode izlučivanja anestetika razlikuju se od anestetika do anestetika. Većina anestetika

metabolizira se u jetrima, a metaboliti se izlučuju mokraćom. Neki lijekovi se ne metaboliziraju te se

izlučuju nepromijenjeni preko bubrega. Kod korištenja barbiturata koncentracija anestetika u mozgu

smanjuje se redistribucijom anestetika u druga tkiva (masno tkivo i mišići). Inhalacijske anestetike iz

mozga odvodi krv te se izlučuju putem pluća. Oporavak je praćen povratkom pojedinih refleksa te

gubitkom miorelaksacije. Životinjama treba pružiti odgovarajuću postoperativnu njegu u vidu primjene

analgetika, antibiotika, rehidracije i parenteralne prehrane. Izbor postupaka u postoperativnom

periodu treba biti prilagođen prethodno primijenjenom operativnom zahvatu.

Vrste i načini administracije anestetika

I.v. injekcija anestetika je najsigurniji put injekcije jer omogućuje prilagodbe doze u pojedina životinja.

Precizna kontrola dubine anestezije može se postići pomoću kontinuirane infuzije kao i trenutna

primjena specifičnih antagonisti ili drugih lijekova.2 U nekih vrsta glodavaca, kao što su hrčak i zamorac

periferne vene za intravenozne injekcije mogu biti teško pristupačne što otežava ili onemogućuje

ovakav postupak. Stoga se injekciona anestezija u glodavaca primjenjuje i.p., i.m. ili s.c. I.m. injekcije

treba izbjegavati kod glodavaca, jer one mogu izazvati nepotrebne oštećenja mišića i bol. S. c.

primjena je često alternativa, jer je lako izvesti i manje bolno od i.m. injekcije, a brzina apsorpcije često

usporediva s onom nakon i.m. injekcija.

Inhalacijska anestezija je pogodna za većinu životinjskih vrsta. Prednost joj je brzo uvođenje i oporavak

u odnosu na injekcionu anesteziju. Najpogodniji način primjene inhalacionih anestetika je pomoću

Page 106: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

106

strojeva za anesteziju te isparivača koji precizno doziraju količinu anestetika. Anestezije se može postići

pomoću indukcije komore (glodavci, mačići, štenci, prasad, ptice i druge male životinje ne navikli na

držanje) ili maska za lice (samo kod životinja koje su navikli na rukovanje), a održava se pomoću maske

ili endotrahealne cijevi.

Sedativi su lijekovi koji prouzrokuju umirenje, hipnotici su lijekovi koji prouzrokuju spavanje, a

neuroleptici su lijekovi koji prouzrokuju specifičan oblik umirenja. Neki lijekovi u ovisnosti od

primijenjene doze (npr. barbiturati) uzrokuju sve stupnjeve depresije CNS-a, od blagog umirenja pa sve

do kome. Sedativi i hipnotici se koriste za umirenje životinje i mogu se primijeniti kod svih životinjskih

vrsta. Neuroleptici su lijekovi koji uzrokuju specifičan oblik umirenja, sa ukočenošću, pojačanim

tonusom skeletne muskulature i nezainteresiranošću za okolinu (svijest životinje je potpuno očuvana,

ali se ona nalazi u stanju kataleptičke nepokretnosti). Sedativi, hipnotici i neuroleptici izazivaju

umirenje, smanjenje lokomotorne aktivnosti i indiferentnost prema okolini, tjelesna temperatura je po

pravilu snižena.

Najvažniji sedativi–hipnotici su:

- tiazini (a-2-adrenergički agonisti) osiguravaju sedaciju, analgeziju i relaksaciju skeletne

muskulature kod većine domaćih i eksperimentalnih životinja; benzodiazepini posjeduju sedativni,

hipnotički, anksiolitički, antikonvulzivni učinak i dovode do relaksacije skeletne muskulature;

- barbiturati posjeduju sedativno, hipnotičko, opće anestetičko i antikonvulzivno djelovanje;

- fenotiazini-(blokiraju dopaminske receptore u CNS-u) većina se primjenjuje samo kod pasa,

mačaka i konja, a samo neki se primjenjuju i kod goveda i svinja.

Eutanazija

Eutanazija je postupak izazivanja smrti bez boli i patnje životinja, a uključuju brzi gubitak svijesti,

nepovratnu depresiju CNS. Postupak eutanazije potrebno je provesti na što humaniji način. Ovisno o

vrsti životinje najčešće se koriste farmakološko-kemijske metode koje uključuju predoziranje

injekcijskim ili inhalacijskim anesteticima i primjenjuju se kod većih životinja te mehaničko-fizikalne

metode koje se koriste kod malih laboratorijskih životinja (glodavci: CO2, CO, eter ili cervikalna

dislokacija) (1-3).

Literatura

1. Morton, D.B., Jennings, M., Buckwell, A., Ewbank, R., Godfrey, C., Holgate, B., Inglis, I., James, R.,

Page, C., Sharman, I., Verschoyle, R., Westall, L., and Wilson, A.B., Refining procedures for the

administration of substances, Lab. Anim., 35, 1, 2001.

2. Skarda, R.T., Local and regional anesthetic and analgesic techniques: dogs, in Lumb &

Jones’Veterinary Anesthesia, third ed., Thurmon, J.C., Tranquilli, W.J., Benson, G.J., Eds., Williams &

Wilkins, Baltimore, MD, 1996.

3. Wixson, S.K. and Smiler, K.L., Anesthesia and analgesia in rodents, in Anesthesia and Analgesia in

Laboratory Animals, Kohn, D.F., Wixson, S.K., White, W.J., and Benson, G.J., Eds., ACLAM and Academic

Press, New York, 1997.

Page 107: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

107

ANESTEZIJA; ANALGEZIJA, EUTANAZIJA I EKPERIMENTALNA KIRURGIJA

Prof. dr. sc. Dražen Vnuk, dr. vet. med.

Anestezija, analgezija i eutanazija

U laboratorijskih životinja sve se veći naglasak daje kvalitetnoj anesteziji i analgeziji, a s time i

smanjivanju boli/patnje same životinje za vrijeme istraživanja. Kvalitetna analgezija također utječe i na

same rezultate istraživanja, jer bol može prouzročiti neurohormonalne procese u organizmu koji mogu

npr. usporiti cijeljenje rane ili kosti. Treba napomenuti da je najkvalitetnija analgezija ona koja se

započme prije operacije, održava za vrijeme operacije, a završi najčešće nekoliko dana nakon operacije.

Polaznicima bi se ukazalo na prepoznavanje boli u pojedinih životinjskih vrsta prikazivanjem razvijenih

skala boli za pojedine životinjske vrste. Također bi se prikazale i dostupne skupine analgetika,

preporučili bi se pojedini analgetici prikladni za određene vrste laboratorijskih životinja te bi se ukazalo

i na komplikacije njihove primjene.

Anestezija je najčešće neizostavni dio pojedinog istraživanja na laboratorijskim životinjama. Prije

samog istraživanja potrebno je isplanirati koju anesteziju ćemo koristiti. Izbor korištenja injekcijske ili

inhalacijske anestezije trebao bi primarno ovisiti o vrsti zahvata koji će biti izveden i dužini trajanja

zahvata. Također je potrebno ukazati i na rizik korištenja pojedinih anestetika za osoblje koje je njima

kronično izloženo u malim dozama. Pritom bi se ukazalo i na dostupnost potkožnih vena u pojedinih

životinjskih vrsta. Ponekad je potrebno uzeti arterijsku krv za pojedine pretrage ili za mjerenje

arterijskog tlaka. Polaznicima bi se opisale dostupne arterije u pojedinih životinjskih vrsta.

Lokalnim i regionalnim anestezijama možemo si olakšati izvođenje manjih zahvata ili u kombinacijama

s općom anestezijom osigurati kvalitetni analgeziju i miorelaksaciju. Najčešće se koriste dva lokalna

anestetika, lidokain i bupivakain, a svaki od njih ima svoje osobitosti.

Ponekad je potrebno miorelaksirati životinju za izvođenje pojedinih operacijskih zahvata (oftalmološki

zahvati, zahvati u prsnom košu itd.). Potrebno je ukazati i na potencijalne komplikacije primjene

miorelaksansa da bi se anestezija sigurnije izvodila.

Za vrijeme anestezije potrebno je nadzirati i vitalne parametre u laboratorijskih životinja. Nadzorom

EKG-a, zasićenosti hemoglobina kisikom, arterijskog krvnog tlaka, izdahnutog CO2 itd. smanjuje se

smrtnost za vrijeme izvođenje operacijskog zahvata, ali i u ranom postoperacijskom periodu.

Polaznicima bi se ukazalo na eutanaziju, prikazale bi se metode obavljanja eutanazije, razgovaralo bi se

o odabiru metoda anestezije u pojedinih životinjskih vrsta te o načinu utvrđivanja smrti životinje.

Eksperimentalna kirurgija

U novije vrijeme u znanstvenom radu susrećemo se sve češće sa kirurškim zahvatima na

laboratorijskim životinjama. Operacijski zahvati izvode se na svim organima i organskim sustavima.

Polaznike je prvo potrebno upoznati s osnovama opće kirurgije. Priprema operacijskog polja, operatera

i kirurških instrumenta osnova su za izvođenje svake operacije. Pri izvođenju svakog operacijskog

Page 108: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

108

zahvata bitan je i odabir materijala za šivanje, pojedini šavovi i čvorovi te metode zaustavljanja

krvarenja. Korištenje antibioka u kirurških pacijenata ponekad je nepotrebno. Antimikrobna profilaksa

(korištenje antibiotika bez prisustva infekcije) dovoljna je u većine pacijenata, ako se poštuju principi

asepse i antisepse.

Nakon ovog općeg dijela upoznat ćemo polaznike s osobitostima pojedinih važnijih operacijskih

zahvata kao što su laparotomija i torakotomija u pojedinih vrsta životinja. Vrlo često se izvode i

ortopedski zahvati u životinja pa će ukratko biti govora i o njima. U novije vrijeme razvojem

endoskopske opreme razvila se minimalno invazivna kirurgija. Polaznike ćemo upoznati s osnovama

minimalno invazivne kirurgije te s mogućnostima primjene endoskopske opreme u laboratorijskih

životinja.

Page 109: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

109

DOBROBIT LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA I ODABIR KRAJNJIH TOČAKA

U EKSPERIMENTU

Dr. sc. Ivna Kocijan

Svaka institucija i svaka osoba koja koristi laboratorijske životinje u istraživačke ili nastavne svrhe mora

voditi brigu o njihovoj dobrobiti. Adekvatni uvjeti držanja, humana skrb o životinjama i eksperimentalni

rad koji posvećuje pažnju dobrobiti životinja preduvjet su za kvalitetno istraživanje, stjecanje

relevantnih spoznaja i napredak znanosti. Dobrobit laboratorijskih životinja moguće je osigurati

primjenjujući pristup poznat pod nazivom "tri R". Znanstvenici W.M.S. Russel i R.L. Burch objavili su

1959. godine knjigu "The principles of humane experimental technique" (u prijevodu: Principi humane

eksperimentalne tehnike) u kojoj su razradili načine kako umanjiti ili ukloniti nehumane aspekte u

držanju i radu sa životinjama. Ova je knjiga od svojeg objavljivanja postala glavna okosnica, a ujedno i

vodič, za humanu i odgovornu upotrebu životinja u biomedicinskim istraživanjima. Tijekom godina,

princip "tri R" je postao međunarodno prihvaćen pristup u biomedicinskim istraživanjima kojeg

istraživači primjenjuju prilikom donošenja odluke o uporabi životinja, te prilikom dizajniranja i

provođenja eksperimenata na životinjama.

Princip "tri R" nazvan je po engleskim riječima replacement, reduction, refinement koje u prijevodu

znače zamjena, smanjenje, poboljšanje, a odnose se na (i) zamjenu eksperimentalnih životinja in vitro

tehnikama ili drugim modelima uvijek kada je to moguće, (ii) smanjenje broja eksperimentalnih

životinja koje se koriste u istraživanju, i (iii) poboljšanje uvjeta držanja životinja i poboljšanje

eksperimentalnih tehnika. Zamjena (engl. replacement) znači potpunu zamjenu živih životinja in vitro

metodama, računalnim modelima i programima, filmovima (npr. u nastavi) i sličnim tehnikama koje

bez uporabe životinja daju isti rezultat. Zamjena se odnosi i na zamjenu životinja koje su više na

filogenetskoj ljestvici s onima na nižem stupnju, npr. uporaba beskralješnjaka umjesto kralješnjaka.

Ako nema alternative uporabi životinja, već je ona nužna, tada treba voditi računa o njihovoj dobrobiti.

Smanjenje (engl. reduction) podrazumijeva smanjenje broja životinja koje se koriste u nekom

istraživanju, što je moguće postići odabirom prikladnih eksperimentalnih protokola, standardizacijom

životinja i pomnim kontroliranjem vanjskih čimbenika. Time se postiže da se unatoč manjem broju

eksperimentalnih životinja dobiju jednakovrijedni, visokokvalitetni podaci. Ovaj pristup zahtjeva

podrobnu analizu eksperimentalnog dizajna, primjenu suvremenih eksperimentalnih tehnika, primjenu

prikladnih statističkih metoda i nadzor nad svim aspektima koji utječu na varijabilnost rezultata

istraživanja (npr. uvjeti eksperimentalnog okoliša, uvjeti u životinjskim nastambama, i sl.). Važno je

napomenuti da se pod smanjenjem ne podrazumijeva ponovna upotreba životinja koje su već bile

podvrgnute nekom zahvatu ili tretmanu, te da takav pristup nije prihvatljiv jer u pravilu narušava

dobrobit eksperimentalnih životinja. Poboljšanje (engl. refinement) se odnosi na uvjete držanja

životinja u nastambama, na postupanje sa životinjama i na eksperimentalne uvjete i protokole. Uvjeti

držanja životinja u nastambama trebaju zadovoljavati njihovu biološku narav, što znači da trebaju biti

usklađeni s fiziološkim potrebama i prirodnim ponašanjem životinja. Time stvaramo preduvjete da se u

organizmu eksperimentalnih životinja može postići homeostaza. Dugoročno odstupanje od uvjeta

homeostaze može dovesti do abnormalnog ponašanja ili obolijevanja životinje. Poboljšanje

eksperimentalnih uvjeta postiže se na način da se izbjegnu bolni i nelagodni zahvati, ili da se broj takvih

zahvata što je više moguće smanji. Prilikom dizajniranja pokusa treba voditi računa o odabiru metoda i

Page 110: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

110

protokola koji izazivaju što je moguće manje boli, stresa i nelagode kod životinja. Poboljšanje načina i

uvjeta rada s laboratorijskim životinjama doprinosi ne samo dobrobiti životinja, nego i kvaliteti pokusa.

Životinje koje se koriste u biomedicinskim istraživanjima ponekad mogu trpiti bol, nelagodu ili biti u

stanju stresa tijekom pokusa u kojem su podvgnute određenom zahvatu ili tretmanu. Ako životinja trpi

bol ili se nalazi u stanju stresa, vrlo brzo može doći do narušavanja njezinog općeg kliničkog stanja, a

posljedično i do smrti životinje. Postoje različiti klinički pokazatelji koji ukazuju da je opće stanje

životinje snažno narušeno ili da životinja ugiba. Te pokazatelje nazivamo krajnjim točkama (engl.

endpoints), a razlikujemo eksperimentalne i humane krajnje točke. Eksperimentalna krajnja točka

(engl. experimental endpoint) označava završnu točku u eksperimentu koja na temelju pojave

određenih simptoma, pokazatelja ili abnormalnosti ukazuje da su dosegnuti ciljevi eksperimenta

prema unaprijed osmišljenom protokolu. Uobičajene ekperimentalne krajnje točke su npr. jaka

toksičnost, napredovanje bolesti ili smrt. Humana krajnja točka označava trenutak u kojem se na

temelju pojave određenih pokazatelja, simptoma ili promjene u ponašanju životinje donosi odluka o

obustavi pokusa, zahvata ili tretmana, prije nego je dosegnut ciljani ishod istraživanja kako jedinka ne

bi trpila bol i izraziti stres. Životinja se tada eutanazira ili se poduzimaju radnje kako bi se bol, stres i

nelagoda uklonili ili umanjili.

Rad s laboratorijskim životinjama mora biti usklađen sa zakonskom regulativom koja zahtijeva da svako

istraživanje, testiranje ili nastavni sadržaj u kojima se koriste eksperimentalne životinje budu izvedeni

na način da se kod životinja na najmanju moguću mjeru svedu nelagoda, stres i bol. Zato se uz

eksperimentalne krajnje točke posebna pažnja mora posvetiti humanim krajnjim točkama. Humane

krajnje točke potrebno je odabrati na način da one budu vjerodostojni indikatori boli, nelagode,

stresa, narušenog općeg stanja ili predstojeće smrti. Odabrane humane krajnje točke moraju biti

precizno definirane u svakom eksperimentalnom protokolu. Najčešće studije u kojma je potrebno

detaljno razmotriti humane krajnje točke uključuju: razvoj tumora, zarazne bolesti, vakcinacije,

životinjski modeli u istraživanju bola i traume, proizvodnja monoklonskih protutijela, procjena

toksikoloških učinaka, modeli kardiovaskularnog šoka, bolesti kod kojih dolazi do demijelinizacije, uzgoj

životinja s abnormalnim fenotipovima, itd. Sljedeći znakovi mogu u kratkom vremenskom periodu

dovesti do smrti životinje, pa ih je potrebno razmotriti prilikom definiranja krajnjih točaka: gubitak

težine 15-20% od normalne vrijednosti; nemogućnost uspravljanja ili kretanja; veličina tumora

(promjer veći od 1.5 cm u miša ili 3 cm u štakora); ulcerirani, nekrotični ili inficirani tumor; otežano

disanje; dehidracija; abdominalna napetost; i drugi klinički znakovi (dijareja, krvarenje iz bilo kojeg

tjelesnog otvora, neuredno krzno i dlaka bez sjaja, dermatitis, zgrbljeni položaj tijela, žutica, anemija,

samoozljeđivanje, neurološko znakovi). Trajanje biomedicinskih studija koje kod eksperimentalnih

životinja uzrokuju bol i nelagodu treba biti najkraće moguće. Produljenje trajanja studije do točke kada

životinja ugiba (tj. smrt kao eksperimentalna krajnja točka) bez pravovremene intervencije ili

eutanazije je neprihvatljivo, osim u iznimnim slučajevima kada za to postoji vrlo čvrsto, znanstveno

utemeljeno opravdanje.

Literatura

Canadian Council on Animal Care, Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments

using animals for research, teaching and testing (1998). Ottawa, Canada.

http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf

Page 111: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

111

Guide for the Care and Use of Laboratory animals: Eighth Edition (2011). The National Academies

Press, Washington D.C., USA. http://www.nap.edu/catalog.php?record_id=12910

L.F.M. van Zutphen, B.C. Kruijt, K.J. Öbrink (1993) „Introduction“ ur. L.F.M. van Zutphen, V. Baumans,

A.C. Beynen u „Principles of Laboratory Animal Science. Elsevier

Page 112: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

112

ŽIVOTINJSKI MODELI

Prof. dr.sc. Nada Oršolić

Uvod

Potreba uporabe laboratorijskih životinja, točnije životinjskih modela izlazi i iz same definicije znanosti:

“Znanost je sistematizirana i argumentirana suma znanja u određenom povjesnom razdoblju o

objektivnoj stvarnosti do koje se došlo svjesnom primjenom određenih objektivnih metoda

istraživanja.”

Istraživač u znanstveno istraživačkom radu u biološkim i biomedicinskim istraživanjima se ne

ograničava na utvrđivanje poretka i zakonitosti na temelju opažanja i uspoređivanja, nego aktivno

intervenira u životna zbivanja kako bi utvrdio uzročne veze. Zadiranje u prirodni red stvari opravdava

se znanstvenim interesom, odnosno potrebom produbljivanja ljudskog znanja i stjecanja vještina kako

bi se pribavila izravna ili neizravna dobrobit za čovjeka i/ili druga živa bića.

Brojni poremećaji koji ugrožavaju čovjekovo zdravlje i život ne mogu se razjasniti niti učinkovito

spriječiti ili liječiti bez temeljitog istraživanja i eksperimentiranja na životinjama.Takva su istraživanja

dakle motivirana unapređivanjem ne samo ljudskog zdravlja nego i zdravlja životinja te izravnom i

neizravnom korišću koja odatle proistječe. Razvidno je da medicina, njen razvoj i budućnost uvelike

ovisi o pokusima na životinjama, doprinose dobrobiti ljudi i poboljšanju životnih uvjeta.

Za pokuse koji se moraju obavljati na životinjama vrijedi načelo da broj i moguća oštećenja životinja

budu svedena na minimalnu ili bar razumnu mjeru. Plemeniti ciljevi u radu s životinjama posebice su

iskazani na 2. svjetskom kongresu alternative i životinjske uporabe u znanosti (2nd World Congress on

Alternative and Animal Use in the Life Science (1996 Utrechtu, Nizozemska) čiji je glavni cilj bio

doprinos dijalogu između pokreta za zaštitu životinja, znanstvene zajednice, pravnih autoriteta i

industrije. Temeljem toga dat je globalni pregled na području alternative životinjama kao postupka u

okviru “tri R” načela: replacement=zamjena; reduction=smanjenje; refinement=oplemenjivanje.

Danas su jasno postavljeni zakonski propisi o dobrobiti pokusnih životinja, načinu ponašanja prema

životinjama tijekom i nakon pokusa, odabir životinja, broj, smještaj hranjenje, anestezija, analgezija i

eutanazija... Racionalizacija uporabe životinja ili dobra laboratorijska praksa (engl. good laboratory

practice, GLP) danas se uveliko primjenjuje i pokušava se racionalizirati uporaba životinja u brojnim

postupcima (primjerice, primjena rekombinantnih DNA cjepiva-cjepiva protiv hepatitisa B, ili

uvođenje “meta“ dobivenih biotehnološkim inžinjeringom uprocesu istraživanja lijekova).U provjeri

učinkovitosti cjepiva broj životinja je smanjen ali životinje su nezamjenjive u istraživanju kakvoće,

valjanosti i neškodljivosti cjepiva. Nadalje, završni dio postupka istraživanja novih lijekova i njegove

učinkovitosti i neškodljivosti mora biti proveden in vivo –rezultati in vitro nisu vjerodostojni. In vitro

modeli ne zadovoljavaju niti u istraživanju na području toksikologije i imunomodulacije. Istraživanja in

vivo na glodavcima-jedini su prikladni model za prepoznavanje negenotoksični i genotoksični

kancerogena dok je Draizeov očni test (engl. Draize rabbit eye irritation test) nezaobilazni postupak u

provjeri svih kozmetičkih proizvoda zbog složenosti mehanizama koji uzrokuju iritaciju. Smatra se da

valjanost proizvoda u kozmetičkoj industriji, njihovu sigurnost i neškodljivost nemoguće potvrditi bez

istraživanja in vivo.

Page 113: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

113

I ako znanstveno istraživačka djelatnost nosi stupanj individualne slobode i kreativnosti, svaki istraživač

nosi i stupanj osobne odgovornosti prema metodama rada i predmetu istraživanja. Točnije, svatko je u

svom djelokrugu rada dužan raditi u sukladu s profesionalnim i etičkim normama i svojom savješću

(Slika 1).

ISTRAŽIVANJE KOJE UKLJUČUJE UPORABU ŽIVOTINJA

PAŽLJIVO ODREDITi CILJEVE ISTRAŽIVANJA

PRETRAŽITI LITERATURU I BAZUPODATAKA da bi se izbjeglo ponavljanje većnapravljenogda bi se uočili svi mogući pristupirješavanja problema

POTRAŽITi SPECIJALIZIRANE IZVOREINFORMACIJA O 3R NAČELUinternetske straniceInternetske grupe za raspravu

Baze podataka

PRIKUPITI INFORMACIJE

IMAJU LI POKUSI JOŠ UVJEK SMISLA I JESU LI NEOPHODNI?

DISKUTIRATI SA STRUČNJAKOM O:

3R načeluNovim tehnikama rada

PONOVNO RAZMISLITI

MOŽE LI POKUS BITI U POTPUNOSTI IZVEDEN BEZ UPOTREBE ŽIVIH ŽIVOTINJA?

OBJAVITI PODATKE OBJAŠNJAVAJUĆI3R PRISTUP(primjerice, u ključnim riječima,sažetku ili materijalima i metodama)

UPOTRIJEBITI 3R PRISTUUP

(oplemeljivanje, zamjena, smanjenje broja –glede soja, broja, izvora životinja, korištenihtehnika i smještaja

MOŽE LI PREDISTAŽIVANJEILI

NEKI DRUGI DIO BITI BEZ UPORABE ŽIVIH ŽIVOTINJA?

DA NE

NEDA

DA

NE

Slika 1. Shematski prikaz pitanja koja si svaki znanstvenik mora postaviti prije nego se odluči koristiti

pokusne životinje u svom istraživanju.

Preuzeto iz poglavlja Stojković R. Animalni modeli. U knjizi “Metode u molekularnoj biologiji” (Urednici:

Ambriović Ristov, Andreja; Brozović, Anamarija; Bruvo Mađarić, Branka; Ćetković, Helena, Herak

Bosnar Maja; Hranilović, Dubravka; Katušić Hećimović, Silva; Meštrović Radan Nevenka; Mihaljević

Snježana; Slade Neda; Vujaklija Dušica), Institut Ruđer Bošković, Zagreb, 2007).

Page 114: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

114

Istraživanja se temelje na pokusnim modelima in vitro i in vivo. In vitro modeli se rabe na razini stanice

i mogu se rabiti u proučavanju prometa lijekova, vežućih receptora, metabolizma lijekova, puteva

prometa lijeka itd. Provjera vjerodostojnosti rezultata dobivenih in vitro zahtjeva in vivo model. Miševi

kao najčešće korišteni pokusni modeli upotrebljavaju se u istraživanjima različitih bioloških i

farmakoloških pripravaka. Istraživanja u području toksikologije, imunologije (imunosupresori, adjuvansi

i/ili modulatori imunosnog odgovora), te tumorske imunologije (negenotoksični i genotoksični

kancerogeni) zahtijevaju uporabu glodavaca kao pokusnih životinja; jedini korisni model za

prikupljanje korisnih i značajnih podataka. Pokusne životinje su model koji zamjenjuje istraživanja na

ljudima posebice u provjeri lijekova, cjepiva, toksičnosti pripravaka te učinku kemoterapije,

radioterapije imunoterapije i hipertermije. U povijesti biologije i medicine znana je činjenica da je

istraživanje na životinjama bilo temelj rada kao metoda kritičke provjere teoretskih počela i načela

medicinske prakse. Ta znanstvena metoda tijekom povijesti postala je nezaobilazna odrednica u

znanstvenim i stručnim biomedicinskim istraživanjima, poglavito u bazičnim biomedicinskim

znanostima.

Nedvojbeno je da su pokusi na životinjama omogućili izuzetno važna dostignuća u području

biomedicine koja su značajno unaprijedila zdravlje ljudi, poput otkrića novih lijekova i cjepiva, različitih

suvremenih dijagnostičkih, terapijskih i kirurških postupaka. Bez njih se također niti u budućnosti ne

može očekivati značajniji napredak u očuvanju i unapređenju ljudskog zdravlja.

Miš i štakor su laboratorijska životinje koje se danas najviše rabi u istraživanjima različitih tumora,

procesa metastaziranja te različitih oblika terapije tumora (kemoimunoterapije, radioterapije,

hipertemije, hormonske terapije itd), transplantaciji tkiva i organa, usavršavanju različitih operacijskih

zahvata, proučavanju šećerne bolesti, osteoporoze, različitih upalnih i alergijskih bolesti, ponašanja

životinja, ciljanog modificiranja različitih gena za proizvodnju miševa željenog genotipa, istraživanje

karcinogenih i teratogenih čimbenika itd.

Nužnost uporabe pokusnih životinja vidljiva je u:

A) biologiji, veterini i agronomiji; znanstvena istraživanja uz uporabu pokusnih životinja temelje se na

prikupljanju informacija za životinju ili životinjsku vrstu.

B) biomedicinskim istraživanjima; pokusne životinje rabe se u istraživanju:

- lijekova (20-25%),

- provjere valjanosti cjepiva (15-20%),

- istraživanju toksičnosti različitih pripravaka (15-20%),

- istraživanju karcinoma (10-15%)

- 30% za druge svrhe: bazična medicinska istraživanja, genetička istraživanja, dijagnoza, pokusne

operacije, edukacija i dr.

Da bi došli do točnih zapažanja i polučili pravilne rezultate vezane za cilj pokusa odabir animalnog

modela glavni je problem pokusa na životinjama. Izbor ispravnog animalnog modela nameće se kao

ključna odrednica biomedicinskih pokusa in vivo (na životinjama). Upotrebljivost ili izbor animalnog

modela ovisi prvenstveno o tome kako i koliko izabrani model odgovara/objašnjava specifična pitanja

istraživanja, odnosno u kojoj mjeri rezultate istraživanja dobivene na korištenom animalnom modelu

moguće primjeniti na čovjeka, a ne na tome koliko odabrani model nalikuje bolesti u ljudi. Iz

navedenog možemo polučiti zaključak da je izbor odgovarajućeg animanlnog modela ključna odrednica

biomedicinskih pokusa na živim životinjama. Temeljem navedenog, prije početka pokusa potrebno je

Page 115: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

115

dobro proučiti literaturu u cilju odabira najboljeg animalnog modela za postizanje vjerodostojnih

rezultata (vidi Sliku 1).

Istraživanja i rad s životinjama treba provesti u sukladu sa etičkim principima, koji su važeći u Republici

Hrvatskoj (Pravilnik o uvjetima držanja pokusnih životinja, posebnim uvjetima za nastambe i vrstama

pokusa, Narodne Novine br. 19/1999; Zakon o zaštiti životinja, Narodne novine br. 135/06) i prema

Vodiču za držanje i korištenje laboratorijskih životinja (Guide for the Care and Use of Laboratory

Animals, DHHS Publ. (NIH) # 86–23 1985).

Prilikom izbora modela treba voditi računa o:

-pogodnosti modela kao analoga,

-mogućnosti transfera informacija

-genetskoj uniformnosti modela

-dosadašnjim saznanjima

-cijeni i pristupačnosti životinja

-mogućnosti generalizacije dobivenih rezultata

-lakoći i mogućnosti prilagodbe pokusnih tehnika

-ekološkim posljedicama pokusa

-etičkim posljedicama pokusa

-mogućnostima smještaja životinja

-veličini životinja

-potrebnom broju životinja

-spolu životinja

-dužini životnog vijeka životinja

-količini podataka koje je potrebno pokusima prikupiti

-starosti životinja broju potrebnih potomaka koje je moguće dobiti

-mogućim bolestima ili fiziološkim stanjima odabranih životinja koje bi mogle utjecati na

rezultate pokusa

S obzirom na način razvijanja promjenjene homeostaze/bolesti, animalni modeli koji se danas rabe u

biomedicinskim istraživanjima podjeljeni su kako slijedi:

1. Inducirani (pokusni) modeli 2. Spontani (genetski) modeli 3. Modeli bolesti stvoreni ciljanom genetskom modifikacijom (transgenične i knock-out

životinje) 4. Negativni modeli bolesti 5. “Orphan” model bolesti

Inducirani (pokusni) modeli

Danas se u znanstvene svrhe rabi veliki broj induciranih (pokusnih) modela usvim područjima

istraživanja. Takvi modeli dobiju se primjenom kemijskih, fizičkih i biolokih tvari na zdrave životinje u

cilju prouzrokovanja neke bolesti sličnih značajki bolesti koje su nazočne u ljudima. Smatra se da mali

broj induciranih animali modela u potpunosti oponaša etiologiju (podrijetlo) ,tijek i patologiju ciljane

bolesti u ljudi. Primjerice, inducirani model dijabetesa može se prouzročii odstranjivanjem gušterače

(pankreatektomijom) ili injiciranjem preko 300 različitih dijabetogenih kemijskih spojeva a najčešće su

u uporabi aloksan, streptozotocin, vakor, ditizon, i 8-hidroksikvinolon (Tablica 1) (Oršolić i Bašić, 2008).

Page 116: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

116

Inducirani model osteoporoze možemo dobiti: ovarijektomijom, primjena agonista gonadotropin

otpuštajućeg hormona (engl. gonadotropin releasing hormone agonist); antagonista estrogenskih

receptora i inhibitora aromataze; primjena glukokortikoida; primjena retinoične kiseline. Tako

primjerice, topičkom primjenom nekih kemijskih iritanata na obrijano područje miša/štakora možemo

prouzročiti animalni model psorijaze pomoću: dekanola, propionaldehida, bromoheksana, di-n-propil

disulfida, heksil salicilata ili heptaldehida.

Ovakav eksperimentalni pristup važan je u razvoju biomedicinskih znanosti i medicine kao struke. Cilj

je dobiti uvid u načine kreiranja animalnih modela humanih bolesti (modeli infektivnih bolesti,

monogenskih bolesti i sl.) i njihovog korištenja u izučavanju pojedinih molekularnih mehanizama

važnih za nastanak pojedinih bolesti kao i istražiti mogućnost liječenja određene bolesti.

Rezultate dobivene na induciranim modelima treba oprezno tumačiti želimo li ih primjeniti na ljude s

obzirom da značajke prouzročenih bolesti u većine induciranih modela nisu potpuno podudarne s

značajkama bolesti u ljudi. Dio rezultata koji se podudara treba potkrijepiti s više različitih metoda te

dobrom statistikom koja će potvrditi učinkovitost određenog pripravka u obradi bolesti.

Page 117: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

117

Tablica 1. Animalni modeli bolesti za diabetes mellitus

Tip diabetesa Animalni modeli bolesti

Stvaranje animalnih modela Primjeri

Tip 1 Inducirani (pokusni životinjski) modeli

Dijabetes prpouzročen u zdravim životinjama

Tvari s dijabetogenim učinkom u eksperimentalnim životinjama: Aloksan Streptozotocin Vakor Ditizon 8-hidroksikvinolon

Spontani (genetski) modeli

Nasljedni poremećaji slični uvjetima nastanka dijabetesa u ljudi

Animalni modeli Tipa 1 diabetes mellitus: NOD (non-obese diabetic) mouse BB (bio breeding) rat LETL (Long Evans Tokushima lean) štakor New Zealand white rabbit Keeshond pas (engl. Keeshond dog) Kineski hrčak (engl.Chinese hamster) Celebes black ape (Macacca nigra)

Tip 2 Spontani (genetski) modeli

Nasljedni poremećaji slični uvjetima nastanka dijabetesa u ljudi

Animalni modeli of Tipa 2 diabetes mellitus: Ob/Ob miš—monogenski model pretilosti (nedostatak leptina), db/db miš—monogenetski model pretilosti (leptin resistentan), Zucker (fa/fa) štakor—monogenetski model pretilosti (leptin resistentan), Goto Kakizaki štakor KK miš NSY miš OLETF štakor Israeli sand štakor Mastima-hranjeni streptozotocin-tretirani štakor, CBA/Ca miš Diabetični Torri štakor New Zealand obese miš

Page 118: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

118

Tip 1 i Tip 2

Ugradnja novih gena kao što su insulinski receptori, IRS1, IRS2, glukokinaze, GLUT4, c-mic, TNF i drugi. Uloga ROS-a u aloksanom induciranom uništenju β-stanica je potkrijepila zaključak da su transgenični miševi s prekomjernom ekspresijom antioksidansa zaštićeni od aloksan induciranog dijabetesa.

Tip 1 i Tip 2

Transgenične životinje

Transgenične tehnike; transgenik znači uključivanje modificiranih gena (transgenea) u pronukleus zigote.Trans-gen se nasumce ugrađuje u genom domaćina, a neki potomci će iskazati promjenjeni gen.

Ugradnja novih gena kao što su insulinski receptori, IRS1, IRS2, glukokinaze, GLUT4, c-mic, TNF i drugi. Uloga ROS-a u aloksanom induciranom uništenju β-stanica je potkrijepila zaključak da su transgenični miševi s prekomjernom ekspresijom antioksidansa zaštićeni od aloksan induciranog dijabetesa.

Page 119: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

119

Spontani (genetski) modeli

Spontani (genetski) modeli jesu najbolji pokazatelji razvoja patogeneze određene bolesti u životinjskim

modelima a slični su ili se podudaraju s razvojem bolesti u ljudi. Ovakvi sojevi imaju urođene poremećaje;

nose genetske varijacije (mutacije) koje su podloga nizu bolesti u ljudi i životinja. Primjerice, životinjski

spontani modeli, prikladni za proučavanje dijabetesa tipa 1 u ljudi (diabetes ovisan o inzulinu) su svakako

NOD miševi (engl. non-obese diabetic, NOD mouse) ili BB (engl. bio breeding) štakori. U uporabi je još jako

veliki broj životinja koje spontano razvijaju dijabetes tipa 1 kao LETL štakor (engl. Long Evans Tokushima

lean rat), novozelandski bijeli kunić (engl. New Zealand white rabbit), Keeshond pas (engl. Keeshond dog),

kineski hrčak (engl. Chinese hamster) ili Celebes black ape (Macacca nigra) te dijabetesa tipa 2 (primjerice,

Ob/Ob miš (engl. Ob/Ob mouse—monogenic model of obesity) kojemu nedostaje leptin, db/db miš (engl.

db/db mouse—monogenic model of obesity ) koji je leptin rezistentan, Zucker štakor (engl. Zucker (fa/fa)

rat—monogenic model of obesity) također leptin rezistentan, Goto Kakizaki štakor, KK miš, NSY miš, OLEFT

štakor itd….) (Tablica 1). Najpoznatiji primjer spontano nastalog mutanta je „goli“ (engl. nude) miš koji je

dobar model za istraživanje tumorskih heterotransplantata (presadak tkiva ili organa s jedne vrste na drugu,

primjerice, čovjek-miš). Mnogi sojevi miševa i štakora su srođeni sojevi (uzgoj u uskom srodstvu kroz

najmanje 20 generacija) što doprinosi genetskoj ujednačenosti soja te dobivanju pouzdani podataka koje

možemo lakše tumačiti u istraživanju imunosnog ili fiziološkog odgovora.

Primjer pokusnih modela u spontanim ili prouzročenim autoimunom bolestima pokazuje Tablica 2.

Tablica 2. Pokusni modeli u autoimunim bolestima

Životinjski model Moguća bolest-ljudi Antigen Prenos bolesti (T-stanice)

Spontane autoimune bolesti

Nonobese dijabetični miš (NOD)

Inzulin –ovisni dijabetes Nepoznat Da

(NZBxNZW)F1 miš Sistemski lupus eritematosuz (SLE)

Nepoznat Da

Obese -pilići Hašimotov tiroiditis Tiroglobulin Da

Pokusno prouzročene autoimune bolesti

Miastenia gravis Miastenia gravis Acetilkolinski receptor Da

Encefalomijelitis Multipla skleroza Mijelinski bazični protein

Proteolipidni protein Da

Autoimuni artritis Reumatoidni artritis Mycobacterium

tuberculosis (proteoglikan)

Da

Autoimuni tiroiditis Hašimotov tiroiditis Tiroglobulin Da

Page 120: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

120

Modeli bolesti stvoreni ciljanom genetskom modifikacijom

Pomak u razvoju eksperimentalnih životinjskih modela postignut je tijekom ranih osamdesetih primjenom

nove tehnike prijenosa nove genetske informacije (prijenosa dijela DNA) u organizam sisavaca. Organizmi

koji u svojem genomu sadržavaju umjetno unesene genske informacije - transgenični organizmi. Unosom

stranog gena (transgena) stvaramo transgenične žiotinje koje sadrže namjernu izmjenu u genomu.Takav

prijenos genetske informacije, nespolnim putem, omogućen je primjenom genetskog inženjerstva odnosno

primjenom rekombinantne DNA tehnologije. Transgenična tehnologija-otvorila je nove mogućnosti razvoja

biomedicinskih znanosti, posebice ideju o genskoj terapiji. Tehnologija genetskog injženjerstva uključuje 4

osnovna postupka:

1. Pripravu dijelova DNA iz odabranog izvora

2. Pripravu DNA kimera na prikladan nosač-vektor

3. Uvođenje novonastali DNA kimera u funkcionalnu stanicu

4. Selekcija rekombinanata koje su prihvatile i zadržale DNA kimeru

Manipulacija embrijima ove modele je učinila posebno važnim. Novi genetski materijal u mišje zametke

može se unijeti:a) retrovirusima (SV40), b) transdukcijom ili transfekcijom embrionalnih matičnih stanica

(potječu od stanica embrionalnog čvorića mišje blastocite), c) neposrednim ubrizgavanjem rekombinirane

deoksiribonukleinske kiseline (DNA) u jedan od pronukleusa oplođene jajne stanice.

Da bi promjena bila stalna (nasljedna) transgen mora biti stabilno ugrađen u nasljedni materijal spolnih

stanica te treba treba biti konstruiran tako da se omogući njegovo ispravno izražavanje u stanicama

domaćina. Postupak zahtjeva dodavanje regulatornih elementa koji osiguravaju ispravno procesiranje RNA i

ekspresiju u određenom tkivu/organu.

Dvije metode proizvodnje transgeničnih miševi danas se naširoko koriste: a)nos željene DNA putem

embrionalnih matičnih stanica (ES stanice) kultiviranih in vitro; b) unos stranog gena-transgena u

pronukleus izolirane oplođene jajne stanice.

DNA se može uvesti u animalne stanice raznim tehnikama:

a) mikroinjicirinjem u staničnu jezgru, b) koprecipitacijom DNA s kalcijevim fosfatom u svrhu stvaranja malih čestica koje uzimaju stanice, c) ugradnjom DNA u lipidne vezikule (liposome) koji fuzioniraju s plazma membranom, d) elektroporacijom- izlaganjem stanica kratkim električnim impulsima koji otvaraju pore na plazma

membrani. e) bombardiranje česticama (sitne čestice plemenitog metala obavijene s DNA; kreću se brzinama

koja dopušta prodor kroz membranu).

Kratki slijed proizvodnje transgeničnih miševa:

a) Gen od interesa najčešće unosimo plazmidnim vektorom skupa s biljegom rezistentnosti na lijek (antibiotik i sl.).

b) plazmid unosimo u embrionalne matične stanice u kulturi

Page 121: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

121

c) embrionalne matične stanice koje nose plazmidne slijedove u svojoj kromosomskoj DNA izoliramo selekcijom

d) takve transformirane EMS injiciramo u mišju blastocistu e) mišju blastocistu prenosimo u surogat majku f) rezultat su potomci-kimere g) parenjem kimera s normalnim miševima dobivamo potomstvo koje je naslijedilo transfektirane

gene iz EM stanica.

Metodologijom inaktivacije pojedinačnog gena moguće je razviti tzv. engl. knock out model. Ovakvo ciljano

razaranje gena (engl. gene targeting) u embrijskim matičnim stanicama (engl. embryonic stem cells)

možemo postići unosom genetski izmjenjenih embrijskih matičnih stanica u embrije primatelje što vodi

ablaciji (inaktivaciji) ili modifikaciji ekspresije ciljanog gena (engl. gene knock-out). Tehnologija embrijskih

matičnih stanica omogućuje izravnu ugradnju transgena u specifično mjesto na kromosomu procesom

homologne rekombinacije – ciljano razaranje gena. Da bi zamjena sljedova DNA bila uspješna, sljedovi

moraju imati homologne dijelove koji omogućuju postupak zamjene mehanizmom homologne

rekombinacije. Stoga se na ovaj način istražuju homologni geni različitih vrsta, s tim da umetnuti odabrani

slijed može u sebi sadržavati mutaciju čiji se utjecaj želi istražiti. Ciljana genska modifikacija rabi se u

proizvodnji mišjih modela s karakteristikama ljudskih bolesti.Zahvaljujući primjeni ciljane genske

modifikacije otkrivena je funkcija brojnih gena (vidi Tablicu 1).

Osim ciljanog mjenjanja gena embrionalnih matičnih stanica u kulturi postoji i mogućnost nasumičnog

mjenjanja gena u namjeri da se pronađu novi važni geni te da se tako od genetskih promjenjenih EMS

dobije životinja nosilac ove genetske promjene. Ovakvo nasumično mjenjanje gena nazivamo genska zamka

(engl. gene trap). Pri uporabi ove metode bitno je da DNA odsječak ne posjeduje nikakvu sličnost s

genomom životinje u koji se ubacuje kako bi se odsječak mogao ugraditi u bilo koji gen a ne samo u neka

mjesta u genomu. DNA odsječak ujedno svojom prisutnošću ometa normalnu aktvinost gena unutar kojeg

se nalazi. Postupkom genske zamke moguće je odrediti gen u koji se odsječak DNA ugradio, opisati uzorak

ekspresije tog gena, te proučavati promjenu fenotipa životinje nosioca genetske promjene. Danas se teži

unaprijediti gensku zamku primjenom DNA odsječaka koji odabiru samo grupe gena s posebnim svojstvima,

te odabirom gena "uhvaćenih" u gensku zamku proučavanjem in vitro diferenciranih embrionalnih matičnih

stanica.

Zašto su potrebne transgenične životinje?

1. Za otkrivanje uloge pojedinih gena: a) knock–out (inaktivacija gena u genomu ugradnjom strane DNA ili zamjena postojećeg gena mutiranom varijantom,b )knock-in mutageneza (uvođenje nove funkcije)

2. Za proučavanje fenotipskih učinaka ekspresije transgena – proučavanja hormonskih gena, onkogena, gena uključenih u razvoj embrija i fetusa, gena važnih u imunosnom sustavu, virusnih gena, itd.

3. Za proučavanje genskih mutacija in vivo 4. Novi modeli za testiranje mutagena 5. Pročavanje sposobnosti kloniranih gena da komplementiraju mutacije u mišu 6. Za razumjevanje kontrole genske ekspresije 7. Za proučavanje bolesti (transgenične životinje kao modeli za razne ljudske bolesti 8. Za genetičko obilježavanje organizma (zeleni flourocentni protein) 9. Za proizvodnju biofarmaceutika –Pharm animals (primjerice, inzulin u kravljem mlijeku, hormona

rasta, interleukina, laktoferina……)

Page 122: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

122

Negativni modeli bolesti

U ovom modelu rabe se određene vrste, soj ili pasmina životinja u kojih se određena bolest ne pojavljuje.

Ovakvi modeli se rabe u istraživanjima mehanizma otpornosti na određene bolesti.

„Orphan“ model bolesti

Orphan“ model bolesti rabi se u opisu funkcionalnih poremećaja koji se javlaju u životinja a nisu opisani u

ljudi. Primjerice, spongiformna encefalopatija goveda (engl. Bovine spongiform encephalophaty, BSE) te

virusna leukemija mačke (engl.Feline immunodeficientncy virus, FIV). Ukoliko se i u ljudi otkriju bolesti

slične ovimopisanim u životinjama, spoznaje prikupljene uveterinarskoj medicine pomoći će u

rasvjetljavanju etiologije, patogeneze i liječenja novootkrivene bolesti u ljudi.

Miš-kao pokusni model u imunološkim istraživanjima

Danas se rabi veliki broj životinja u procesima istraživanja, primjerice oko 1800 vrsta sisavaca (glodavci,

kunić, pas, mačka, svinja, ovca, koza, primati). Najviše se rabe glodavci; glodavci čine 75-80%

laboratorijskih životinja (miš, štakor, hrčak, zamorac, gerbil). Tako, primjerice poznato je da ima više od

1000 genetički definirani srođenih sojeva miševa (Mus musculus).Osim sisavaca rabe se i: ptice, gmazovi,

vodozemci i ribe.

U biomedicinskim istraživanjima najčešće se rabe miševi kao:

1. Čisti sojevi životinja -visokosrođene životinje (sparivanje braće i sestara iz istog legla kroz najmanje 20 generacija

-Singenične životinje

-Kongenični miševi- životinje koje se razlikuju samo u jednom kromosomskom lokusu ili regiji-

dragocjen model za proučavanje tog gena

2. Životinje s posebnim genskim obilježjima

-Transgenični miševi

-Knock-out miševi (miševi s izbačenim genom)

3. Imunodeficijentni miševi

Prednosti il nedostaci uporabe miša kao pokusnog modela vidljivi su u Tablici 3.

U imunolologiji su posebice zanimljivi različiti imunodeficijentni miševi, upravo zbog svojih nedostataka,

bilo zbog nedostatne imunoreaktivnosti na određene antigene zbog nedostatka, T, B, NK stanica ili citokina

kao i neadekvatnog stromalnog okoliša. Istraživanja na imunodeficijentnim miševima mogu biti temeljana

na:

1. primarnoj imunodeficijenciji

Page 123: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

123

-životinje s urođenim nedostatkom određeni imunosnih stanica ili čimbenika imunosti

(primjerice, goli miševi, SCID, CBA/N)

-genetski modificirane životinje (trangeni ili knouck-out)

2. induciranoj imunodeficijenciji (obrada životinja s određenim protutijelima, toksičnim lijekovima, zračenjem, timektomija…)

Tablica 3. Prednosti lil nedostaci uporabe miša kao pokusnog modela

Prednosti uporabe miša kao pokusnog modela: Nedostaci uporabe miša kao pokusnog modela:

Mala životinja Mala veličina

Dobro podnose život u zatočeništvu Kratki životni ciklus

Ima veliko leglo i kratko generacijsko razdoblje Fiziologija

Troškovi uzgoja relativno niski

Brojni srođeni sojevi, rasprostranjeni po cijelom

svijetu, rezultati usporedivi

Dobivanje rezultati usporedivi, bez velikih

varijabilnosti (stalna genetska podloga)

Model za proučavanje sisavaca, posebice njihovih

specifičnih procesa kao što su:

- Inaktivacija X kromosoma

- Genomski ispis

Pripitomljenost

Kratki životni ciklus

Dobro proučena biologija

Jednostavna manipulacija i stvaranje velikog

broja potomaka

Mogućnost planiranja pokusa

Sekvencioniran genom i dobro poznat

Mogućnost stvaranja visokosrodnih sojeva

Široki rang genetičke raznolikosti (srođeni sojevi,

podsojevi, podlinije, koizogeni, kongeni ili

segregirajući srođeni sojevi)

Animalni modeli u tumorskoj imunologiji

Odabir odgovarajućeg eksperimentalnog modela je kritičan u praćenju razvoja tumora te u istraživanju

učinkovitosti lijekova protiv tumora. Vrijednost modela ovisi o njegovu valjanosti, selektivnosti,

predvidljivosti i reproducibilnosti. U istraživanju i razvoju lijekova protiv raka, animalni model je ključan za

utvrđivanje citotoksičnog učinka lijeka ili odabiru biološke tvari pogodne u terapiji tumora kako bi bila

prmjenjiva na ljude. Nema savršenih tumorskih modela za svaki ljudski tumor. Ipak, u odabiru najboljih

modelnih sustava, pažnju treba obratiti na genetsku stabilnost i heterogenost transplantiranih staničnih

Page 124: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

124

linija, njihovu imunogenost unutar domaćina životinja, te odgovarajući biološki kraj (lokalni rast, metastaze,

preživljavanje). Na primjer, Kht sarkom je tumor s visokim metastatskim potencijalom, što ga čini vrlo

pogodnim modeleom za procjenu kombiniranih-modaliteta obrade ili inhibitora metastaza.

Općenito, životinjski tumorski modeli mogu se podijeliti u spontane ili umjetno transplantirane

(transplantabilni tumor) tumore. Solidni tumori obično su transplantirani inokulacijom stanične suspenzije

potkožno (sc), intrakutano (id), intramuskularno (im), intraperitonealno (ip) ili intravenski (iv). Leukemijski

modeli mogu sedobiti transplantiranjem (injiciranjem) leukemijskih stanica samo sc, iv, ili ip.

Spontani tumorski modeli koji su idiopatski ili nastaju nakon izloženosti karcinogenim tvarima ili virusima

najuže oponašaju kliničku situaciju. Spontani tumori su obično mjerljivi samo u kasnoj fazi, njihove

metastaze nisu uniformne, a njihov odgovor na terapiju je općenito loš. Po kinetici i antigeničnosti

podsjećaju na rak u ljudi. Međutim, postoje značajne prepreke za korištenje takvih modela. Primjerice,

relativno mali postotak životinja može razviti bolest nakon izloženosti karcinogenima ili virusima, i tumori

mogu imati promjenjiv prirodni razvoj. Osim toga, nemogućnost uspostave točnog stupnja razvoja čini ove

modele kvantitativno neprikladnim za procjenu terapijskog odgovora na date spojeve. Općenito govoreći,

spontani tumorski modeli imaju najveću ulogu u proučavanju biologije karcinogeneze. U budućnosti, oni

također mogu biti važni u razvoju kemopreventivnih ili kemosupresivnih lijekova.

Modeli s najširom uporabom u eksperimentalnoj terapiji su transplantabilni životinjski tumorski modeli i

ljudski „ksenograft“ modeli.

Brojni animalni modeli se rabe u cilju što boljeg shvaćanja rasta i metastaziranja ljudskih tumora te

pronalaska odgovarajuće terapije. Takvi modeli se rabe u:

-istraživanju učinkovitosti lijeka na tumora

-proučavanju genetske i kromosomske nestabilnosti

-proučavanju signalnih puteva u nastanku tumora

-razvoju novih terapijskih vektora

S obzirom na nastanak tumora, tumori mogu biti:

1. spontani tumori a. idiopatski b. karcinogenom inducirani c. transgeni/knock-out životinje: p53, Rb, …

2. Transplantirani tumori a. Animalni tumori: Lewis-ov karcinom pluća, karcinom mliječne žlijezde miša, S 180 sarkom,

Ehrlichov solidni i/ili asctični tumor b. Ljudski „ksenograft“ model: ljdske tumorske stanične linije imlantirane u imunodeficijentne

životinje (primjerice, SCID miševa kao nositelja leukemijskih stanica ljudi) c. Transplantacija tkiva tumora ljudi u šupljine ili tkiva miševa

Page 125: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

125

Značajke transplantabilnih tumora u miša

Rane pasaže transplantiranih tumora sliče spontano nastalom tumouru; pokazuju značajnu heterogenost u

kinetiki i histologiji stanica. Unatoč tim ograničenjima, kao modeli su korišteni u skriningu za lijekove.

Transplantabilni tumori u miša mogu biti lako presađeni između jedinki istog visokosrođenog soja a od

nekih transplantabilnih tumora lako se mogu uspostaviti kulture tkiva in vitro. U Zavodu za animalnu

fiziologiju u pokusima rabimo karcinom mliječne žlijezde (MCa) miša visokosrodnog soja CBA. To je

spontano nastali karcinom u području stražnjeg mamarnog kompleksa ženke višerodkinje. Tumor

održavamo serijskim potkožnim presađivanjem ženkama istog soja. Tumor je slabo imunogeničan za

singeničnog domaćina (Bašić i Varga 1979). Unutar uzgoja Zavoda osim tumora mliječne žlijezde miša,

MCa; rabi se i metil-kolantrenom inducirani tumor; FS; melanom B17; Ehrlichov ascitični tumor, EAT; te

adenokarcinom štakora, ACa. Većina transplantabilnih tumora je nastala spontano ili prouzročena

zračenjem ili karcinogenom (primjerice, metil-kolantrenom inducirani tumor; FS). Transplantabilni tumori

su dobar model za praćenje uloge imunosnog sustava u progresiji tumora te nakon zračenja, kemoterapije,

fototerapije, hipertermije... Uporaba ovih tumora je česta, zbog lake manipulacije u uvjetima in vitro i in

vivo. Dostupni su kod mnogih visokosrođenih sojeva i imaju relativno kratak period između inokulacije

(MCa i ACa svakih 14 dana) tumora i njegovog nastanka.

Danas je vrlo često u uporabi i Erlichov ascitesni tumor (EAT) koji može biti u ascitesnom i solidnom obliku

ovisno o načinu injiciranja stanica. Ehrlichov ascitesni tumor (EAT) potječe od spontanog mamarnog

adenokarcinoma miša (Pinello i sur., 2006). Ehrlichov ascitesni tumor (EAT) je heterogeni, slabo

diferencirani, brzorastući zloćudni karcinom/tumor koji sadrži populacije stanica različite osjetljivosti na

protutumorsko liječenje. U jetri miševa, nositelja Ehrlichovog ascitesnog tumora, dolazi do znatnog

povećanja lipidne peroksidacije te do smanjenja količine antioksidativnih enzima. Stanice Ehrlichovog

ascitesnog tumora (EAT) održavaju se intraperitonealnim (i.p.) injiciranjem EAT stanica u trbušnu šupljinu

Swiss albino miševa, serijskim presađivanjem stanica svakih 7 ili 9 dana u obliku ascitesa.

Transplantabilni tumori glodavaca se dosta razlikuju u njihovim metastatskim značajkama. Neki modeli su

„spontano“ metastatski i formiraju primarne tumore i različita metastatska oštećenja prateći pojedinačna

disktretna mjesta inokulacije u solidnim tkivima. Drugi tranplantabilni tumori samo rastu na mjestu

primarne inokulacije. Takvi tumori stvaraju najčešće „ekperimentalne“ ili „umjetne“ metastaze,

dominantno ili najčešće u plućima nakon intravenskog injiciranja ali ne daju spontane metastaze.Značajka

takvih metastaza je da se dosta razlikuju s obzirom na imunogeničnost. Većina ljudskih tumorskih stanica je

slabo imunogenična; organizam ne svara učinkovitu imunosnu reakciju protiv njih. Nasuprot tome,

transplantabilni mišji tumori imaju opseg imunogenosti od slabo imunogeničnog, srednjeg do jako

imunogeničnog tumora.

Karcinoza peritoneuma

Peritonejska karcinomatoza (PK) označava diseminaciju i implantaciju tumorskih stanica u trbušnu šupljinu,

vrlo često bez sustavnih metastaza, pri čemu ishodište tumora mogu biti lokalni ili udaljeni organi. Nerijetko

se dijagnoza PK postavlja vrlo kasno, to jest kada su jako uznapredovali znakovi lokalne ili regionalne

bolesti. PK je prognostički izrazito loš znak i česti uzrok smrti pacijenata s karcinomom debelog crijeva,

želuca, kao i u drugih gastrointestinalnih i ginekoloških zloćudnih tumora (Bevanda i sur. Oršolić i sur 2010).

Međutim, valja naglasiti da su terapijski pristup, prognoza i vjerojatnost recidiva bolesti i te kako ovisni o

primarnom organu, odnosno histološkom tipu tumora.

Page 126: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

126

Peritonejska karcinomatoza, često praćena s malignim ascitesom, nerijetko se prezentira kao prvi znak

bolesti. Karcinozu peritoneuma se uspješno izaziva uštrcavanjem 5 x 103 živih tumorskih stanica MCa u

trbušnu šupljinu miša CBA intraperitonealno (ip) i pogodna je kao model za istraživanje različitih oblika

terapije PK.

Značajke „ksenograft“ modela

U istraživanju „ksenograft“ modela najčešće se rabe goli (nude) ili SCID miševi koji su imunodeficijentni u

limfocitima T i/ili B. Atimusni „nude“ miševi, nose mutirani gen (Nu, za goli) na kromosomu 11 kao

autosomno recesivni gen, napravljeni su 60-tih godina 20 stoljeća a imaju slijedeće značajke: poremećen

rast, nisku fertilnost, nemaju krzno, imunokompromitirani (nedostatan imunosni odgovor zbog nedostatka

timusa, i stanica T), aktivnost B stanica očuvana i imaju veću aktivnost NK stanica (engl. Natural killer cells).

Ove značajke dovele su do široke uporabe golih miševa u transplantaciji tkiva i drugih područja

biomedicinskih istraživanja uključujući i njihovo korištenje u transplantaciji tumora ljudi. Primjena

ksenograft modela temelji se na sposobnosti održavanja histološkog i biološkog identiteta tumora kroz

uzastopno prolaženje uvjeta in vivo što je uveliko doprinjelo u mnogim aspektima istraživanja raka,

uključujući istraživanje djelotvornosti lijekova.Prvi čovjek-miš (ksenograft) model napravljen je 1969 god. s

adenokarcinomom kolona (Rygaard i Poulson, 1969). Mjesta na koja se može injicirati tumor u ksenograft

modelu su: subkutano, intraperitonealno, intrakranijalno, intrasplenično (u slezenu), bubrežna subkapsula

ili inokulacija na specifična mjesta ili organe (orthotopic). U istraživanjima na ksenograft modelu možemo

pratiti:

1. toksičnost lijeka a. praćenje smrtnosti životinja; smrt povezana s dozom lijeka ili b. praćenje gubitka težine životinja

2. Praćenje učinkovitosti lijeka a. Testovi za klonalnost b. Testovi za rast tumora c. Povećanje životnog vijeka (odnos preživljavanja između obrađenih i kontrolnih

životinja) d. Promjene u masi i volumenu tumora

Prednosti uporabe ksenograft modela su: široka mogućnost injiciranja tumorskih staničnih linija,

implantacija solidnih tumora ljudi, i brza procjena terapijskog indeksa. Osim prednosti ovaj model posjeduje

i brojne mane, primjerice, tumori mozga su problematični za ovaj model, različito je biološko prepoznavanje

i metastaze su vrlo rijetke, kratko vrijeme umnožavanja stanica (engl. doublin times) u odnosu na orginalni

rast u čovjeka, bolja opskrba krvlju (nekroza slabo nazočna), problematično održavanje zbog rizika od

infekcije, učinak terapije je različit u miša u odnosuna čovjeka.

Ostali tumorski animalni modeli

Orthopic animalni modeli dobiju se implantacijom tumorskih stanica u ciljne organe. Orthotopic model

reproducira aspekte mikrookoliša tumora i oponaša niz važnih bioloških značajki progresije tumora,

angiogeneze, metastaziranja i otpornosti stanica tumora na terapiju (rezistencija). Zbog svoje sličnosti s

ljudskim tumorom, model se može koristiti za procjenu odgovora na različite oblike terapije. Sve se više

Page 127: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

127

ističe važnost korištenja orthotopic implantacije tumorskih stanica na modelu miša za vrednovanje

učinkovitosti antivaskularne terapije. Danas se rabe brojni transgenični tumorski modeli, primjerice knock

out miševi za p53 ili neki drugi tumor supresor gen kao i razvoj endogenih tumorskih stanica. Takvi tumori

su prikladni za terapiju monoklonskim protutijelima.

Nadalje treba istaći da izlaganje životinja kroničnom stresu može potaknuti rast tumora i angiogenezu.

Neuroendokrini stres utječe na rast i aktivnost malignog tkiva putem receptora za hormone na stanicama

tumora (Thaker i sur. 2006). Primjer i prvi eksperimentalni dokaz učinka stresa na patogenezu karcinoma

ovarija potvrđen je na modelu miša gdje je pokazano da kronični stres potiče rast i angiogenezu karcinoma

ovarija.

Metastaze na plućima

Metastaze odnosno tumorske čvoriće na plućima možemo izazvati uštrcavanjem optimalnog broja živih

tumorskih stanica u repnu venu miša. Broj tumorskih stanica koji daje optimalni broj arteficijalnih

(umjetnih) metastaza u točno određenom vremenu potrebno je utvrditi u predhodnim pokusima a najčešće

ovisi o histološkom tipu tumora. Primjerice 105 stanica fibrosarkoma u CBA ili C3Hf/Bu miševa daje

optimalan broj plućnih čvorića 14 dana nakon unosa trumorskih stanica (Bašić i sur. 1979). Za razliku, 2

105 stanica karcinoma dojke u CBA miševa daje optimalni broj metastaza između 18-21 dana nakon

venskog unosa tumorskih stanica (Oršolić i Bašić 2003, 2005, 2007) , dok 3 104 stanica istovrsnog tumora

u C3Hf/Bu miševa metastaze su vidljive 28 dana. Svakako treba istaknuti da broj stanica tumora koje daju

arteficijalne metastaze ovisi i o tipu pokusa; ako u pokusu očekujemo pospješenje nastanka broja

metastaza uporabiti ćemo manji broj tumorskih stanica i obrnuto ako očekujemo smanjenje broja

metastaza uštrcati ćemo veći broj stanica od navedenih.

U određivanje broja metastaza na plućima, miševe se usmrtei, te im se izvade pluća i fiksiraju u Bouenovoj

otopini (15 ml zasićene pikrinske kiseline, 5 ml 35% formalina i 1 ml ledene octene kiseline). Nakon fiksacije

tumorski čvorići se ističu kao bijele nakupine tkiva na površini žuto obojenog plućnog tkiva.Plućni čvorići se

broje pod lupom ili bez lupe; broje se samo jasno vidljivi okrugli čvorići. Ako je cijeli režanj gusto prožet s

metastazama, broj metastaza se označi s 40 a ako su svi plućni režnjići gusto posuti s čvorićima tada se broj

metastaza označi s 200.Zbog nazočnosti mikrometastaza poželjno je i vagati masu pluća. Pokusne podatke

dobivene u testu arteficijalnih plućnih metastaza najpouzdanije je statistički obraditi Mann Whitney U

testom.

Test plućnih kolonija ili metastaza pogodan je za istraživanje međudjelovanja metastatskih tumorskih

stanica i domaćina, u istraživanju terapijskog učinka različitih spojeva (kemoterapeutika, hormona,

imunomodulatora..), zračenja, hipertermije i drugih oblika terapije, u dokazivanju metastatske

heterogenosti tumorskih staničnih populacija, djelovanju imunoloških mehanizama, u istraživanju

mehanizama pospješujućeg učinka nekih kemoterapeutika na stvaranje arteficijalnih plućnih metastaza, u

određivanju sposobnosti stvaranja plućnih kolonija klonogenske populacije tumorskih stanica nakon nakon

terapije s kemoterapeuticima (Fidler, 1978; Evans, 1991; Malenica i sur. 2000).

Page 128: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

128

Životinjski upalni modeli

Upala

Upala je nespecifična obrambena reakcija organizma na ozljedu tkiva prouzročenu patogenim

mikroorganizmima ili nekim drugim (fizički, kemijski ili biološki) činiteljem. U upalnoj reakciji

uključeni su specifični i nespecifični mehanizmi obrane. Reakcija svrhovito pridonosi obilnijoj

opskrbi tkiva kisikom, glukozom, protutijelima, komplementom i fagocitnim stanicama. Obrambeni

mehanizmi usmjereni su prema mjestu prodora patogenog mikroorganizma u tkivo radi njegovog

uklanjanja i ponovnog uspostavljanja fiziološke djelatnosti tkiva (zacijeljenjem ozljede). Opća

obilježja upale su: a) crvenilo (lat. rubor), b) toplina (lat. calor), c) bol (lat. dolor), d) oteklina (lat.

tumor), i e) poremećaji funkcije (lat. functio laesa). Upalni proces razbuktava se gotovo pri

svakoj imunoreakciji. Nespecifična reakcija pribavlja signal koji zajedno s antigenom potiče

proliferaciju i diferencijaciju limfocita, pretežno T i B, čime utječe na razvoj i vrstu specifične

imunosti. Radi se o vremenskom slijedu dinamičkih promjena, krvožilnih, neuroloških, humoralnih

i staničnih koje se zbivaju lokalno u tkivu zahvaćenom upalom. Prema tijeku upalne reakcije i

duljine trajanja djelimo je na akutnu i kroničnu upalu. Upala se temelji na: 1) povećanju protoka

krvi kroz napadnuto područje, čime se povećava doprema leukocita i raznih topljivih molekula u to

područje (najprije se proširuju kapilare, potom arteriole, osebujan znak je crvenilo), 2) povećanju

kapilarne propusnosti koja omogućava povećanu eksudaciju sastojaka plazme (protutijela,

komplementa itd, osobitost je edem), 3) povećanju migracije leukocita u to područje.

Upalne bolesti i najčešće rabljeni životinjski modeli

Obzirom na veliki broj upalnih bolesti i stanja kojima se klinička praksa današnjice redovito susreće, a za

koje ne postoji odgovarajuća terapija, precizno osmišljeni i detaljno opisani životinjski upalni modeli od

neprocjenjive su važnosti na putu otkrića spojeva s odgovarajućim protuupalnim djelovanjem. Danas se

praktično primjenjuju brojni životinjski upalni modeli, od kojih su pojedini izmišljeni još početkom prošlog

stoljeća. Dio modela dobro je opisan obzirom na vrstu, pojavnost i reakcije upalnih medijatora, dok je veliki

broj upalnih modela u smislu navedenih parametara još uvijek nedovoljno razvijen, te nije uvijek primjeren

za detaljna istraživanja protuupalnih osobina odgovarajućeg spoja.

Upalni proces predstavlja niz reakcija koje je moguće potaknuti brojnim čimbenicima. Obzirom na složenost

etiologije i simptoma upalnog procesa, životinjski upalni modeli najčešće se dijele prema vremenskom

trajanju upalne reakcije (Slika 2). Tako postoje modeli koji upravljaju akutnu upalnu i modeli koji se bave

kroničnim upalnim procesima (Vogel i Vogel, 1997). Akutni upalni stadij karakteriziran je lokalnim širenjem

krvnih žila i povećanom kapilarnom propusnošću te nakupljanjem leukocita i makrofaga, a kronična upalna

reakcija odlikuje se tkivnom degeneracijom i fibrozom. Također, pojedini su životinjski upalni modeli

osmišljeni u cilju istraživanja lokalnog protuupalnog učinka odgovarajućeg spoja, dok drugi služe za

testiranje sustavnih protuupalnih učinaka ispitivanog spoja. Pregled najčešće rabljeni životinjskih modela

upale pokazuje Slika 2 i Slika 3.

Page 129: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

129

Klasični životinjski upalni modeli

Kronična upalaPojavnost upalnih

medijatoraAkutna upala

Model odgođenog tipa preosjetljivosti

(ovalbumin, pikril klorid)

Arthusov tip neposredne preosjetljivosti

(ovalbumin)

Model pasivne kožne anafilakse (ovalbumin)

Schultz-Daleova reakcija

Model akutne sustavne anafilakse (ovalbumin)

Model granuloma izazvanog potkožnom implantacijom (vata,

spužva, stakleni štapić)

Model propusnosti krvnih žila

Model upale poplućnice(histamin, bradikinin,

karagenin,prostaglandin, dekstran, turpentin)

Model kožnog granuloma (krotonsko ulje,

karagenin)

UV-eritem

Model adjuvantnogartritisa (Freudov

adjuvant)

Model edema uške (oksazolon, krotonskoulje, kantaridin, IL-1, arahidonska kiselina,

forbolni esteri)

Model edema šape (karagenin,formaldehid,

dekstran, albumin, kaolin)

Slika 2. Podjela klasičnih životinjskih upalnih modela obzirom na tijek upalne reakcije

Životinjski eksperimentalni modeli osmišljaju se i profiliraju u skladu s problematikom iz kliničke prakse

kako bi omogućili bolje razumjevanje molekularnih mehanizama i patofiziologije odgovarajućih bolesti, te

ubrzali postupak pronalaska djelotvornog i neškodljivog terapeutskog pripravka. Stoga, pored gore

navedenih klasičnih životinjskih upalnih modela danas postoji i niz suvremenih od kojih svakako valja

spomenuti životinjske modele upalnih kožnih bolesti poput psorijaze i atopičkog dermatitisa, zatim

eksperimentalne modele kronične obstruktivne bolesti pluća (KOBP), te sepse (Slika 3).

Idealni životinjski model trebao bi ispoljavati sve karakteristike određene bolesti, uključujući njene kliničke,

imunološke, stanične, molekularne i genetske osobine. Međutim, zbog prilično velikih razlika u

imunološkom, ali i drugim organskim sustavima između životinja i ljudi gotovo je nemoguće osmisliti

životinjski eksperimentalni model koji bi savršeno odgovarao patološkom stanju ljudi.

Nadalje, kod tako složenih bolesti, često se događa da pripravak koji je bilo aktivan u određenom

životinjskom modelu koji svojim karakteristikama nalikuje bolesti u čovjeka ne djeluje u ljudi, pa takvi

modeli nisu primjereni za ispitivanje i usporedbu djelovanja pripravaka različitih mehanizama djelovanja.

Stoga je uveden čitav niz različitih životinjskih modela, od kojih svaki održava određeni dio patofiziologije ili

Page 130: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

130

odgovarajući signalni put koji nalikuje onima u ljudi, uključujući i modele koji se izvode na životinjama

nastalim genetskim inženjeringom, te se u konačnici samo njihovim kombiniranjem može dobiti detaljni

uvid u mehanizam djelovanja i stvarnu djelotvornost odgovarajućeg pripravka.

Suvremeni životinjski upalni modeli

Atopičkogdermatitisa

KOBP-aPsorijaza

Model endotoksemije

(LPS)

Model kroničnog dermatitisa

(različite vrste haptena)

Transplantacija psorijatične kože

imunodeficijentnimAGR129 miševima

Sepse

Modeli bronhitisa (sumporni

dioksid, virusi, bakterije)

Model dermatitisa u

golokožihzamoraca izazvan superantigenom

Modeli psorijaze nastali genetskim

injženjeringom

Model kroničnog iritantnog

kontaktnog dermatitisa (TPA)

Model odgođenog tipa preosjetljivosti

(ovalbumin)

Model dermatitisa u

štakora izazvanog nedostatkom

magnezija

Model NC/Ngamiševa

Model odgođenog tipa preosjetljivosti

(ovalbumin)

Modeli plućne hipertenzije

(monokrotalin, kronična hipoksija

Modeli atopičkogdermatitisa

nastali genetskim injženjeringom

Model pasivne kožne anafilakse

(ovalbumin)

Modeli plućne fibroze

(bleomicin, mikroorganizmi, pesticid, azbest)

Modeli plućne neutrofilije (LPS,

dim cigarete)

Model emfizemapluća nastali genetskim

injženjeringom

Modeli emfizemapluća (elastaza,

papain, dim cigarete, dušični

dioksid, endotoksini)

Model iakutneozljede pluća

(LPS, sadržajcrijeva)

Modeli septičkog šoka (LPS,

mikroorganizmi, feces, crijevni

sadržaj, zimozan)

Slika 3. Životinjski modeli psorijaze, atopičkog dermatitis, kronične opstruktivne bolesti pluća (KOPB) i sepse

(LPS-lipopolisaharid, TPA-12-O-tetradekanoilforbol-13-acetat).

Literatura

Bevanda M., Orsolic N., Basic I., Vukojevic K., Benkovic V., Horvat Knezevic A., Lisicic D., Dikic D., Kujundzic

M. (2009) Prevention of peritoneal carcinomatosis in mice with combination hyperthermal intraperitoneal

chemotherapy and IL-2. International Journal of Hyperthermia 25 (2): 132-140.

Evans WC. (1991) The metastatic cell. Behaviour and Biochemistry. Chapman and Hill, Lodon, 1991.

Page 131: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

131

Fidler JI. (1978) General considerations for studies of experimental cancer metastasis. Meeth. Cancer Res

13:399-438.

Malenica B, Eljuga D, Bašić I. (2000) Test artificijalnih plućnih “metastaza” ili test plućnih kolonija. In:Radačić

M. Bašić I. Eljuga D, eds. Pokusni modeli u biomedicini. Zagreb: Medicinska naklada, 231-244.

Oršolić N. and Bašić I. (2003) Immunomodulation by water-soluble derivative of propolis (WSDP) a factor of

antitumor reactivity. J. Ethnopharmacol. 84: 265-273.

Oršolić N. and Bašić I. (2005) Water soluble derivative of propolis and its polyphenolic compounds enhance

tumoricidal activity of macrophages. J. Ethnopharmacol. 102:37-45.

Oršolić N. and Bašić I. (2007) Cancer chemoprevention by propolis and its polyphenolic compounds in

experimental animals. Phytochemistry and Pharmacology III, (Editors: V. K. Singh, J. N. Govil & C.

Arunachalam, STUDIUM PRESS, LLC, U.S.A). Recent Progress in Medicinal Plants 17: 55-113.

Oršolić N. and Bašić I. (2008) Honey bee products and their polyphenolic compounds in treatment of

diabetes. Phytopharmacology and Therapetutic Values IV, (Editors: J. N. Govil and V. K. Singh, STUDIUM

PRESS, LLC, U.S.A). Recent Progress in Medicinal Plants, 22:455-553.

Oršolić Nada, Bevanda M, Kujundžić N, Plazonić A, Štajcar D, Kujundžić M (2010) Prevention of peritoneal

carcinomatosis in mice by combining hyperthermal intraperitonal chemotherapy with the water extract

from burr parsley (Caucalis platycarpos L.) Planta Med.

Pinello KC, Fonseca Ede S, Akisue G, Silva AP, Salgado Oloris SC, Sakai M, Matsuzaki P, Nagamine MK,

Palermo Neto J, Dagli ML. (2006) Effects of Pfaffia paniculata (Brazilian ginseng) extract on macrophage

activity.Life Sci. 78(12):1287-92.

Rygaard J, Povsen CO. (2007) Heterotransplantation of a human malignant tumour to "nude" mice. 1969.

APMIS. 115(5):604-6.

Stojković R. Animalni modeli. U knjizi “Metode u molekularnoj biologiji” (Urednici: Ambriović Ristov

Andreja; Brozović Anamarija; Bruvo Mađarić Branka; Ćetković Helena, Herak Bosnar Maja; Hranilović

Dubravka; Katušić Hećimović Silva; Meštrović Radan Nevenka; Mihaljević Snježana; Slade Neda; Vujaklija

Dušica), Institut Ruđer Bošković, Zagreb, 2007.

Thaker PH, Han LY, Kamat AA, Arevalo JM, Takahashi R, Lu C, Jennings NB, Armaiz-Pena G, Bankson JA,

Ravoori M, Merritt WM, Lin YG, Mangala LS, Kim TJ, Coleman RL, Landen CN, Li Y, Felix E, Sanguino AM,

Newman RA, Lloyd M, Gershenson DM, Kundra V, Lopez-Berestein G, Lutgendorf SK, Cole SW, Sood AK.

(2006) Chronic stress promotes tumor growth and angiogenesis in a mouse model of ovarian carcinoma.

Nat Med. 12(8):939-44.

Vogel HG, Vogel WH (eds) (1997) Drug discovery and evaluation. Pharmalogical assay, Berlin, Springer-

Verlag, 390-458.

Page 132: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

132

DOBIVANJE I KORIŠTENJE TRANSGENIČNIH ŽIVOTINJA

Prof. dr. sc. Srećko Gajović, dr. med.

Uvod

Određivanje redoslijeda nukleotida ljudskog genoma događaj je koji je obilježio početak trećeg tisućljeća.

Činjenica da smo sada po prvi puta u mogućnosti «pročitati» naš nasljedni materijal, rijetko je koga ostavila

ravnodušnom. Ubrzo nakon prvog vala oduševljenja, postalo je očigledno da se iščitavanjem genoma nije za

sada ništa bitno promijenilo. Samo poznavanje genetičkog zapisa nije odmah riješilo probleme nasljednih

bolesti ili pojave tumora. Ono je tek olakšalo i ubrzalo inače dugotrajno i mukotrpno istraživanje uloge

pojedinih gena, odnosno bjelančevina kodiranih tim genima, kako u normalnim procesima unutar ljudskog

tijela, tako i u nastajanju bolesti. Istraživanje uloge pojedinih gena trajat će još mnogo godina i polako će

nalaziti svoju primjenu, na primjer, u liječenju bolesti.

Klasična i reverzna genetika

Kako se istražuje uloga gena? Ovisno o vrsti gena, njegovoj strukturi, te prostornoj i vremenskoj regulaciji

njegove aktivnosti, prilagođuje se način njegovog proučavanja. Geni odgovorni za normalan rad stanica,

mogu se istraživati u uvjetima in vitro u kulturi stanica. Gene sa složenom regulacijom vremena i mjesta

djelovanja potrebno je istraživati u uvjetima in vivo u višestaničnom organizmu, u okruženju gdje inače

djeluju. Istraživanje gena u uvjetima in vivo uglavnom počiva na analizi promjene fenotipa genetski

promijenjenih eksperimentalnih životinja - namjerna promjena strukture gena izaziva promjenu u

djelovanju gena, što se odražava na fenotip životinje nosioca te promjene.

Klasični genetičari zaključivali su o genotipu organizma na osnovu njegovog fenotipa. Takav se pristup danas

naziva klasični ili fenotipski pristup istraživanju funkcije gena. Iako u to vrijeme nije bila poznata

molekularna osnova gena, samim proučavanjem fenotipskih svojstava postavljeni su osnovni genetski

zakoni i temelji genetike.

Istraživanje gena proučavanjem promjena fenotipa nastalih spontanim mutacijama pokazalo se učinkovitim

na primjerima nižih organizama, prvenstveno prokariotima, ali i kvascima, vinskim mušicama i ribama.

Istraživanje spontanih mutacija u genetici sisavaca nije se moglo primijeniti sistematski kao u genetici nižih

organizama zbog veličine i složenosti genoma sisavaca, dugog generacijskog vremena, te relativno malog

broja potomaka po generaciji.

Primjenom mutageneze (namjernim izazivanjem mutacija), značajno se povećao i broj istraženih gena.

Postupci namjernog izazivanja mutacija su fizikalni (npr. X zračenje) i kemijski (npr. N-etil-N-nitrozourea

(ENU)). Premda je istraživanje fenotipa životinja promijenjenih mutagenezom rezultiralo otkrićem velikog

broja gena i njihovih funkcija, njihova je molekularna građa često ostala nepoznata.

Kao alternativa fenotipskom pristupu istraživanja gena razvio se tzv. genotipski pristup (obrnuta, reverzna

genetika). Genotipskim pristupom proizvode se unaprijed definirane mutacije u genu poznate strukture ali

nepoznate funkcije, pa se proučavanjem promjene fenotipa životinja nosilaca takvih mutacija upoznaje

Page 133: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

133

uloga promijenjenog gena. Miševi s promijenjenim genom, bilo da je promijenjen već postojeći gen ili

dodan novi gen nazivaju se transgeni miševi.

Postupkom ciljane promjene gena (engl. gene targeting) proizvode se transgeni miševi s mutacijom u genu

unaprijed poznate strukture. Mutacija nastaje ugradnjom strane DNA u genom embrionalnih matičnih

stanica procesom homologne rekombinacije. Iz embrionalnih matičnih stanica dobivaju se mišje mutante,

čiji fenotip služi za istraživanje uloge promijenjenog gena. Najčešća primjena ciljane promjene gena je

stvaranje “knock-out” mutanata - homolognom rekombinacijom se stvara takozvana “nul-mutacija“ kojom

je željeni gen u potpunosti inaktiviran.

Ciljano onemogućavanje gena postupkom «knock-out»

Bit postupka «knock-out» je ciljana promjena strukture gena ugradnjom komadića DNA posebno

pripremljenog u tu svrhu. Taj komadić DNA se naziva vektor. Posljedica ugradnje DNA-vektora u željeni gen

je onemogućavanje gena (ne dolazi do stvaranja odgovarajuće bjelančevine), a promjena u fenotipu

posljedica je tog nedostatka. Takva genetska preinaka može se učiniti u sisavcima (najčešće se koristi

laboratorijski miš) pomoću embrionalnih matičnih stanica, iz kojih se potom dobije životinja koja nosi tu

promjenu (transgeni miš).

Prvi uvjet koji mora biti ispunjen da bi se tom metodom postiglo uspješno onemogućavanje nekog gena jest

poznavanje njegove sekvence, jer se ciljana inaktivacija gena postiže homolognom rekombinacijom –

procesom koji se, na primjer, redovito odvija tijekom mejoze kada homologni kromosomi međusobno

zamijene dijelove koji sadrže identične ili vrlo slične redoslijede nukleotida. Početak i kraj DNA-vektora (koji

se ubacuje u stanicu) moraju biti identični dijelovima gena koji se želi inaktivirati (slika 1). Jedino ako su

dijelovi ubačene sekvence identični dijelovima ciljanog gena, stanica će homolognom rekombinacijom

ugraditi vektor upravo u ciljani gen, odnosno zamijeniti dio ciljanog gena s vektorom.

Genetska preinaka se izvodi u kulturi stanica, a preinačavaju se embrionalne matične stanice miša. One su

dobivene iz zametaka sisavca na stadiju blastociste, te imaju svojstvo da se mogu, nakon što su genetski

preinačene u kulturi, ponovo vratiti u blastocistu i učestvovati u razvoju zametka.

Unutar ubačenog vektora postoji gen koji nosi otpornost na antibiotik neomicin, koji omogućuje odabrati

stanice u čiji genom se ugradio vektor. U staničnoj kulturi kojoj je dodan neomicin rast će samo stanice koje

su otporne na neomicin, odnosno one koje su to svojstvo dobile ugradnjom vektora. Takav se odabir naziva

pozitivan. Pozitivnim odabirom se odbacuju sve stanice koje nisu ugradile vektor u svoj genom. Međutim,

vektor se u genom stanice može ugraditi i nehomolognom rekombinacijom u bilo koji dio genoma. Te

stanice su također otporne na neomicin. Kako bi se prepoznale takve stanice, neposredno iza homolognog

dijela vektora nalazi se gen za enzim timidin-kinazu. Taj dio vektora se ne može ugraditi u genom

homolognom već isključivo nehomolognom rekombinacijom. Zbog toga se nakon neomicina stanicama

dodaje antibiotik ganciklovir. Stanice u kojima je vektor ugrađen na neželjeno mjesto, te stoga izražavaju

gen za timidin kinazu, umiru zbog poremećene sinteze DNK, što je posljedica djelovanja timidin-kinaze na

ganciklovir. Takav odabir se naziva negativan odabir i njime se odstranjuju stanice koje su vektor ugradile na

krivom mjestu.

Nakon ubacivanja odgovarajućih stanica iz kulture u blastocistu, blastocista se vraća u maternicu ženke

miša, da se tamo nastavi njezin razvoj. Ukoliko je postupak uspješan, posljedica će biti da će cijeli niz

Page 134: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

134

stanica, tkiva i struktura novorođene životinje imati porijeklo od preinačenih embrionalnih matičnih stanica.

One se razlikuju od stanica domaćina po genima za boju krzna. Miševi nastali ovim postupkom koji imaju

dvije boje krzna, nazivaju se kimere, iz razloga što su im neke stanice porijekla od promijenjenih

embrionalnih matičnih stanica, a neke porijekla od nepromijenjenih stanica blastociste.

Činjenica da je dobiveno kimerično potomstvo, još uvijek ne znači da je cijeli postupak uspio. Naime,

genetska preinaka će biti održana samo ako su i spolne stanice genetski preinačene. Ako nisu, kimera neće

svoju promjenu prenijeti na potomstvo. Parenjem kimera dobiju se životinje čije su sve stanice heterozigoti

za učinjenu preinaku, a međusobnim parenjem heterozigota nastaju i homozigotni nosioci. Oni imaju oba

alela inaktivirana, te ne mogu proizvoditi odgovarajuću bjelančevinu. Promjena fenotipa posljedica je

nedostatka odgovarajuće bjelančevine i govori o ulozi gena koji se proučava.

Prednosti, nedostaci i budućnost metode

Osnovna prednost metode je mogućnost da se ciljano inaktivira gen po izboru i tako sazna njegova uloga.

Naravno, u mnogim procesima u organizmu sudjeluje više od jednog gena. Parenjem različitih «knock-out»

životinja moguće je dobiti višestruke «knock-oute», životinje kojima su inaktivirana dva ili više gena.

Mnogo je primjera u kojima je ova tehnika doprinijela razumijevanju funkcioniranja našeg organizma i

nastanka raznih bolesti. Sredinom 1990-tih, u projektu koji je trebao istražiti neke proteine u krvi, dobiven

je miš kojem je izbačen gen za protein uteroglobin. Posve neočekivano, taj je miš razvio bolest bubrega, IgA

nefropatiju, od koje u svijetu boluje više od 100 000 ljudi. Davanjem uteroglobina transgeničnim miševima,

dakle farmakološkom nadoknadom bjelančevine koja nedostaje, bolest je zaustavljena. U tijeku su

istraživanja terapije uteroglobinom na ljudima koji boluju od IgA nefropatije i preliminarni se rezultati

odlični.

Postupak ciljane inaktivacije gena je vrlo dugotrajan, a time i skup. Idući nedostatak ove metode proizlazi iz

iznimno jednostavne činjenice: bez mnogih gena život nije moguć. Ako nedostatak inaktiviranog gena

uzrokuje smrt organizma, nemoguće je saznati što taj gen radi u odrasloj životinji. Danas se to uspješno

zaobilazi raznim poboljšanjima osnovnog postupka. Tkivno specifičnim «knock-out»-om se gen ciljano

inaktivira samo u određenim stanicama i tkivima, a uvjetnim «knock-out»-om se inaktivacija gena događa u

odrasloj životinji, u unaprijed određenom trenutku.

Za istraživanje jednako neugodan ishod je da transgenična životinja ne pokazuje nikakvu promjenu

fenotipa. To bi značilo da djelovanje istraživanog gena nema nikakvog značenja u organizmu, međutim u

većini slučajeva se pretpostavlja da zadaću ovakvih gena u transgeničnoj životinji preuzimaju neki drugi

geni.

Obzirom na sve veći broj gena koji se proučava ovim postupkom danas postoje baze podataka s popisima

tisuća transgenih životinja (npr. www.bioscience.org/knockout/knochome.htm ), koje se mogu koristiti za

potrebe najrazličitijih istraživanja. Zanimljivo, postoji i izbor «knockouta mjeseca»

(tbase.jax.org/docs/monthly.html), gdje se kontinuirano biraju životinje koje su najviše doprinijele

razumijevanju nastanka raznih ljudskih bolesti. Također, postoje laboratoriji koji na komercijalnoj osnovi

izrađuju «knock-out» životinje po narudžbi. Dan kada će biti «knock-out»-irani svi mišji geni postaje izvjesna

budućnost.

Page 135: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

135

Genska zamka

Premda postupak ciljane promjene gena ima mnogo prednosti, njegova je primjena ograničena na gene čiji

je redoslijed nukleotida unaprijed poznat. Zbog sve veće zainteresiranosti za nove gene, te njihovu građu i

ulogu, pojavila se potreba za novim postupcima koji bi ubrzali proces njihovog pronalaženja i otkrivanja

njihove uloge. Postupak koji je sličan postupku ciljane promjene gena, a istovremeno ne zahtijeva unaprijed

poznavanje strukture gena, je postupak genske zamke (engl. gene trap). Taj postupak istovremeno

omogućuje pronalaženje novih gena, njihovu jednostavnu identifikaciju, te stvaranje transgeničnih miševa s

mutacijom u tim genima. Dodatna prednost tog postupka je mogućnost praćenja aktivnosti mutiranih gena

tijekom embrionalnog razvoja kao i u odraslog miša, zbog čega je pogodan za proučavanje gena uključenih

u embrionalni razvoj sisavaca.

Za razliku od ciljane promjene gena, gdje se unaprijed pripremljena DNA (vektor) ugrađuje u genom

embrionalnih matičnih stanica homolognom rekombinacijom na unaprijed određeno mjesto, kod genske

zamke se DNA vektor ugrađuje u genom nasumično. Mjesto ugradnje vektora nije unaprijed poznato niti

određeno, pa se on može ugraditi i u novi, nepoznati gen. Ugrađeni vektor služi kao molekularni biljeg i

time omogućuje kloniranje i identifikaciju gena.

Vektor genske zamke

Većina vektora genskih zamki na svom 5´-kraju sadrži primač prekrajanja (engl. splice acceptor), zatim

stopljeni gen ßgeo bez promotora, sastavljen od gena biljega lacZ i gena izbornika neoR, te poliA-signala na

3´-kraju (slika 3). Zbog nedostatka promotora ispred gena lacZ, do njegove aktivnosti, odnosno do sinteze

enzima ß-galaktozidaze (bjelančevina određena genom lacZ), dolazi samo u slučaju ugradnje vektora unutar

aktivnog gena, tj. iza aktivnog promotora. Zbog primača prekrajanja na 5´-kraju vektora, stanica smatra

vektorsku DNA sastavnim dijelom vlastitog gena. Zbog toga nakon prekrajanja glasničke RNA dolazi na

ribosomima do stvaranja stopljene bjelančevine koju čine početak bjelančevine određene «uhvaćenim»

genom, te ß-galaktozidaza i neomicin fosfotransferaza. Obzirom da se stopljena bjelančevina sintetizira u

stanici samo kada je aktivan gen u koji je ugrađen vektor genske zamke, praćenjem aktivnosti gena lacZ

dobiva se uzorak izražaja uhvaćenog gena. Aktivnost gena lacZ određuje se histokemijskim postupkom u

kojem bezbojni supstrat za enzim ß-galaktozidazu, X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-ß-D-galaktopiranozid),

mijenja boju u plavo.

Vektor genske zamke ubacuje se u mišje embrionalne matične stanice retroviralnom infekcijom ili

elektroporacijom. Embrionalne matične stanice u kojih je vektor genske zamke ugrađen u neki aktivni gen

odabiru se uzgojem na podlozi s neomicinom (gen neoR u sastavu vektora genske zamke omogućuje

stanicama rast na podlozi s neomicinom). Takve stanice vraćaju se u mišje blastociste ili morule postupkom

injekcije u blastocistu, odnosno združivanjem s morulom. Iz takvih kimeričnih blastocista ili morula nastaju

kimerični zameci, «djelomični» nosioci mutacije (slika 2).

Postupkom genske zamke proizvode se klonovi promijenjenih embrionalnih matičnih stanica u velikom

broju. Među njima se odabiru klonovi s mutacijama u genima zanimljivim za daljnje istraživanje. Taj se

odabir može vršiti analizom molekularne građe, uzorka izražaja gena, te fenotipa nosioca mutiranog gena.

Obzirom da se postupak genske zamke najčešće upotrebljava za istraživanje gena odgovornih za

Page 136: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

136

embrionalni razvoj sisavaca, odabir uhvaćenih gena za daljnju analizu obično se vrši praćenjem aktivnosti ß-

galaktozidaze u embrionalnim matičnim stanicama, a zatim kod nišjih zametaka starih 11,5 dana.

Iz odabranih promijenjenih embrionalnih matičnih stanica dobivaju se mišje linije koje su nosioci

odgovarajuće mutacije. Međusobnim križanjem heterozigotnih nosioca mutacije dobivaju se homozigoti

koji imaju ugrađeni vektor genske zamke u oba alela. Takvi transgenični homozigotni miševi se

upotrebljavaju za analizu promjene fenotipa nastale mutacijom u uhvaćenom genu.

Velik postotak gena uhvaćenih postupkom genske zamke nužan je za preživljavanje zametaka, pa mutacija u

tim genima nastala genskom zamkom dovodi do smrti zametaka homozigotnih nosioca te mutacije.

Mutacije nastale postupkom genske zamke mogu biti i subletalne, takve da samo u određenoj mjeri utječu

na razvoj i preživljavanje zametaka. Analiza promjene fenotipa transgeničnog miša može pokazati i da se

radi o mutaciji u genu nebitnom za normalni rad organizma. Postoje geni koji zbog jake i ograničene

ekspresije u kimeričnim zamecima obećavaju važnu ulogu, ali njihova mutacija ne mora imati nikakav

učinak na fenotip transgeničnog miša. Zbog toga se konačni izbor gena vrši tek nakon proizvodnje

transgeničnih miševa, na temelju proučavanja promjena njihovog fenotipa.

Unazad nekoliko godina u genskoj zamci se primjenjuje i sustav koji omogućuje stvaranje uvjetnih mutanata

kod kojih je aktivnost gena uhvaćenog genskom zamkom pod kontrolom istraživača. Na taj način, mnogi

geni važni za embrionalni razvoj, čija mutacija dovodi do smrti zametaka, postaju dostupni za istraživanje

jer se njihova aktivnost može regulirati i ugasiti u vrijeme kad je nedostatak tog gena kritičan za

preživljavanje životinja.

Svojstvo vektora genske zamke da nakon ugradnje u endogeni gen izazove stvaranje stopljenog transkripta

koji se sastoji od dijela uhvaćenog gena i gena lacZ omogućilo je jednostavno kloniranje uhvaćenog gena.

Nakon kloniranja, umnažanja i sekvenciranja uhvaćenih gena, geni se uspoređuju s genskim bazama

podataka. Usporedba s genskim bazama podataka pokazuje je li istraživani gen već otkriven i njegova građa

već poznata.

Primjena genske zamke

Prvih godina primjene genske zamke velik broj gena uhvaćenih genskom zamkom bili su novi geni (oko

70%), tako da se genska zamka smatrala vrlo učinkovitim postupkom traženja novih gena. S vremenom se

postotak novih gena pronađenih tim postupkom smanjivao. Tome je pridonijelo sekvenciranje genoma

miša, ali i činjenica da je broj gena konačan i da je primjenom bilo postupka genske zamke, bilo nekog

drugog načina traženja novih gena, broj neotkrivenih gena jednostavno smanjen. Postupak genske zamke

se, zbog nedovoljne učinkovitosti, danas gotovo uopće ne primjenjuje u svrhu otkrivanja novih gena. Time

je i primjena genske zamke u istraživanju uloge gena putem analize uzorka izražaja i fenotipa transgeničnih

životinja postala manje privlačna, obzirom da se to isto može postići i postupkom ciljane promjene gena.

Postupak ciljane promjene gena u prednosti je pred genskom zamkom jer se konstruiranjem specifičnog

vektora može promijeniti točno određeni gen, dok je kod vektora genske zamke neizvjesno u koji će se gen

ugraditi.

Međutim, ovaj se očigledni nedostatak genske zamke u odnosu na ciljanu promjenu gena, može prikazati i

kao prednost. Primjenom jedinstvenog vektora genske zamke moguće je proizvesti velik broj mutacija, dok

je za ciljanu promjenu gena potrebno konstruirati specifičan vektor za svaki pojedini gen. Postupak

Page 137: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

137

identifikacije uhvaćenih gena uznapredovao je toliko da se u relativno kratkom vremenu može analizirati

velik broj embrionalnih matičnih stanica promijenjenih postupkom genske zamke. Danas postoji nekoliko

velikih banaka klonova promijenjenih embrionalnih matičnih stanica s podacima o promijenjenim genima,

načinu ugradnje vektora genske zamke u te gene, pa čak i uzorku izražaja promijenjenog gena. Te su banke

klonova dostupne svakom istraživaču koji može naručiti željeni klon s promjenom u željenom genu i sa

željenim svojstvima. Postojanje takvih banaka značajna je ušteda vremena i novaca potrebnih za

proizvodnju transgeničnih životinja. Na taj način je postupak genske zamke ponovno dobio važno mjesto u

istraživanju gena i njihove uloge.

Slika 1. Vektor koji će se ubaciti na mjesto gena kojeg se želi inaktivirati (gen X) je građen tako da su mu

krajevi identični krajevima tog gena. To omogućuje homolognu rekombinaciju kojom će se na mjesto

odabranog gena ugraditi gen koji nosi otpornost na neomicin. Stanica koja se tako genetski preinači više

nema gen X, a otporna je na neomicin, što omogućuje da se razlikuje od stanica koje nisu ugradile vektor.

Izvan dijela vektora kojeg se želi ubaciti homolognom rekombinacijom nalazi se gen za enzim timidin-kinazu

(tk). On će se ubaciti u genom embrionalne matične stanice samo ako ne dođe do homologne

rekombinacije. Za nastavak pokusa odabiru se samo stanice koje imaju gena za otpornost na neomicin, a

nemaju gen za timidin-kinazu.

Page 138: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

138

Slika 2. 1) usisavanje preinačenih embrionalnih matičnih stanica u posebno zašiljenu staklenu kapilaru; 2)

probijanje stijenke blastociste zašiljenom kapilarom, te ubacivanje embrionalnih matičnih stanica u

blastocistu; 3) ženka (crna) sa kimeričnim potomstvom (sivo-crni); 4) odrasli kimerični (transgeni) miš.

Prilagođene fotografije iz OHSU Transgenic/ Gene Targeting Facility

Slika 3. Vektor genske zamke. Vektor ne sadrži vlastiti promotor, ali sadrži primač prekrajanja, «splice

acceptor» (SA), na svom 5'-kraju, zatim gen biljeg lacZ, gen izbornik neoR, te signal za poliadenilaciju polyA

na 3'-kraju. Pomoću primača prekrajanja vektor ostaje ugrađen u mRNA nakon prekrajanja kao jedan od

egzona gena u koji se ugradio. Ukoliko je promotor (P) tog gena aktivan, dolazi do stvaranja stopljene

bjelančevine sastavljene od N-kraja bjelančevine «uhvaćenog» gena (N), ß-galaktozidaze (ß-gal) i neomicin

fosfotransferaze (neo).

Literatura

Fuchs H, Gailus-Durner V, Adler T, Aguilar-Pimentel JA, Becker L, Calzada-Wack J, Da Silva-Buttkus P, Neff F,

Götz A, Hans W, Hölter SM, Horsch M, Kastenmüller G, Kemter E, Lengger C, Maier H, Matloka M, Möller G,

Naton B, Prehn C, Puk O, Rácz I, Rathkolb B, Römisch-Margl W, Rozman J, Wang-Sattler R, Schrewe A,

SA ATG lacZ neo poliA SA lacZ neoR polyA

ATG lacZ neo poliA

1. P ATG

SA lacZ neoR polyA

N ß-gal. neo

Page 139: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

139

Stöger C, Tost M, Adamski J, Aigner B, Beckers J, Behrendt H, Busch DH, Esposito I, Graw J, Illig T, Ivandic B,

Klingenspor M, Klopstock T, Kremmer E, Mempel M, Neschen S, Ollert M, Schulz H, Suhre K, Wolf E, Wurst

W, Zimmer A, Hrabě de Angelis M. Mouse phenotyping. Methods. 2011 Feb;53(2):120-35.

Gajović S, Mitrečić, D, Augustinčić L, Iaconcig A, Muro, AF (2006) Unexpected rescue of alpha-synuclein and

multimerin1 deletion in C57BL/6JOlaHsd mice by beta-adducin knockout. Transgenic Res, 15, 255-259

Gates H, Mallon AM, Brown SD; EUMODIC Consortium. High-throughput mouse phenotyping. Methods.

2011 Apr;53(4):394-404.

Gondo Y. Now and future of mouse mutagenesis for human disease models. J Genet Genomics. 2010

Sep;37(9):559-72.

Page 140: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

140

LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE U FARMAKOLOŠKIM I TOKSIKOLOŠKIM

ISTRAŽIVANJIMA

Doc. dr. sc. Domagoj Đikić

Životinjski modeli su desetljećima bili nezamjenjivi u farmakološkim i toksikološkim istraživanjima.

Dosadašnje spoznaje u farmakologiji i toksikologiji većim su dijelom postignute kroz pokuse na

laboratorijskim životinjama. Iako je u zadnjih nekoliko desetljeća prisutna kombinacija spoznaja iz područja

molekularne i stanične, receptorske i kompjuterske farmakologije i toksikologije i postoji tendencija

zamjene in vivo modela u toksikologiji i farmakologiji za modele in vitro ili in silico, kompleksne fiziološke

interakcije koje nastaju u živom organizmu se zasada ne može zamijeniti drugim modelima. Do danas in

vitro i in silico metode služe kao preliminarni modeli koji prethode in vitro pokusima ili služe kao nadupuna

za bolje razjašnjenje rezultata dobivenih na pokusnim životinjama. U budućnosti će biti moguće zamijeniti

pokuse na živim životinjama u velikoj mjeri, a tako i princip 3R (engl. reduction, refinment replacement)

kompletnije primijenitii.

Tablica1. Usporedba glavnih područja farmakoloških i toksikoloških istraživanja u kojima se pokusi izvode

na laboratorijskim životinjama.

Farmakološka istraživanja Toksikološka istraživanja

Farmakološki i terapeutski učinci novih lijekova

Određivanje terapeutske (TD) odnosno učinkovite (efektivne ED) doze Biotrasnformacija Farmakodinamika Farmakokinetika Biološke interakcije i učinci(specifični npr. receptorski i nespecifični npr. sistemski)

Regulatorna toksikologija

Određivanje toksične doze (LD50, IC50, LC50)

Biotransformacija

Toksikodinamika

Toksikokinetika

Biološke interakcije i učinci (specifični npr. receptorski i nespecifični npr. sistemski) Procjena otrovnosti

Procjena rizika ksenobiotika

Klinička toksikologija

Toksikologija hrane

Toksičnost industrijskih

kemikalija

Agrokemikalije

Ekotoksikologija

Indutrijske kemikalije i

onečišćenje okoliša

Ostala toksikološka

istraživanja (kozmetička

toksikologija i sl.)

Sigurnost lijekova i otrovnost novih i starih lijekova, (poklapa se sa područjem toksikologije)

Page 141: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

141

Farmakološki i toksikološki modeli in vivo

Danas postoji veliki broj sofisticiranih protokola u farmakologiji i toksikologiji koji uključuje pokuse na

laboratorijskim životinjama, posebice u pretkliničkim istraživanjima novih lijekova i zakonskoj regulativi o

određivanju maksimalno dopuštenih koncentracija pojedinih tvari u okolišu. Na stranicama www.ich.org

(International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals

for Human Use (ICH)) nalaze se direktive koje govore koje standarde sigurnosti moraju zadovoljiti lijekovi za

ljudsku upotrebu. Jedni od najvažnijih su Standard guidance CMP/ICH/539/00, CMP/EWP/560/95 i sl.

Životinjski farmakološki modeli mogu se podijeliti u dvije skupine: životinjski modeli u farmakodinamici i

životinjski modeli u farmakokinetici. Najčešći životinjski modeli u farmakologiji infekcijskih bolesti, upali,

boli, dijabetesu, živčanim bolestima detaljno su opisani u drugim poglavljima. Slično, regulatorne agencije

izdaju direktive sa detaljnim protokolima koje varijable treba mjeriti kako bi se utvrdio pojedini tip

toksičnosti, poput primjerice europske OECD (www.oecd.org), zatim European medical agency

(http://www.ema.europa.eu/ema/index) ili američke FDA (www.fda.gov/ebr/guidelines/).

Istraživanja učinkovitosti lijekova za liječenje pojedinih bolesti provode se na životinjama koje su oboljele

(primjerice zaražene patogenima ili inokulirane tumorskim stanicama) ali se za pojedine bolesti koriste i

farmakološki modeli u kojima se kemijskom lezijom izazove neka patološka promjena (pr. Aloksanski model

dijabetesa). Transgeničke i knock-out životinje koriste se za stvaranje modela bolesti koje imaju genetičku

podlogu. Medjutim, u istraživanjima farmakodinamike ili biotransformacije pojedinog lijeka uglavnom su se

u pokusima koristile zdrave životinje. Danas se sve više zagovara da se u takvim istraživanjima paralelni set

pokusa koji opisuje apsorpciju, distribuciju biotransformaciju i eliminaciju lijekova mora provesti i na

bolesnim životinjama jer se u bolesnim životinjama fiziološki procesi mijenjaju (patofiziološki).

Laboratorijske životinje koje se koriste u farmakološkim i toksikološkim

istraživanjima

Kroz testiranje toksičnosti ksenobiotika na životinjskim modelima pokušava se procijeniti potencijalni rizik i

učinci otrovnih tvari i organizma čovjeka ali i toksične učinke na neciljne vrste u okolišu (ekotoksikološka

istraživanja). Ne postoji idealan životinjski model za testove toksičnosti. Procjena rizika toksičnosti pojedine

istraživane kemikalije koja je primijenjena komparativno na nekoliko vrsta daje bolju procjenu toksičnosti za

organizam čovjeka.

Laboratorijski glodavci (poglavito miš i štakor) najčešći su modeli za procjenu toksičnosti. Također jedan dio

spoznaja dobiven je pokusima na laboratorijskim zamorcima i sirijskom hrčku, iako u manjoj mjeri u odnosu

na prethodne dvije vrste. Miš i štakor nezamjenjivi su u određivanju otrovnosti (LD50) pojedine kemikalije

za organizam sisavaca ali i za studije specifičnih učinaka (hepatotoksičnost, neurotoksičnost,

imunotoksičnost, nefrotoksičnost, toksikokinetičke i biotransformacijske studije). Kunići su također čest

toksikološki model posebice u istraživanjima dermalne toksičnosti i iritacije očiju. Od životinja koje nisu

glodavci u toksikološim su se istraživanjima uglavnom koristio pas (najčešće pasmina je Beagle) a u novije

vrijeme patuljaste svinje koje sve više zamjenjuju pokuse na psima. Mačke i primati se koriste relativno

rijetko, iako primati imaju najsličniju biotranformacijsku fiziologiju u usporedbi sa ljudskim organizmom.

Štakori i psi su najčešći modeli ekskrecije toksina putem žući i opstrukciju žući toksinima. Postoje i neka

fiziološka ograničenja koja uvjetuju odabir vrste životinje za toksikološka istraživanja, primjerice u

istraživanjima biotransformacije i ekskrecije glukuronski put je manje zastupljen mačke, acetilacija u psa,

Page 142: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

142

sulfokonjugacija u svinje i sl. Za razvoj i istraživanje novih veterinarskih lijekova u pokusima se koriste

životinje za koje je lijek namijenjen.

Odabir soja

Većina farmakoloških i toksikoloških istraživanja provodila se na nesrođenim sojevima laboratorijskih

životinja (poglavito Swiss albino miš, Wistar i SD štakor ili nesrođeni sojevi psa pasmine Beagle). Razlog

tome bila je niža cijena većeg broja životinja ali i genetička heterozigotnost takvih sojeva koji bi trebali

simulirati raznolikost odgovora u većim populacijama. Međutim, napretkom genetičkih analiza i

genotipizacije pojedinih sojeva glodavaca za koje se zna koje alele posjeduju na nekim ključnim receptorima

za toksične učinke (primjerice AhR, Aryl-hidrocarbon receptor) i manjeg broja životinja u pokusnoj

podskupini koja daje manju varijabilnost mjerenih parametara, sve se više sugerira upotreba pojedinih

srođenih sojeva u toksikološkim i farmakološkim istraživanjima. Tako se primjerice nesrođeni štakori Wistar

i dalje koriste kao toksikološki model u Europi dok se u Americi koristi srođeni soj F344 (National

Toxicology Program).

Prema nekim najnovijim preporukama toksikologa ali i farmakologa, kao zamjena za nesrođene sojeve,

najbolje bi bilo pokuse provesti na dva ili nekoliko srođenih sojeva glodavaca koji se genotipski razlikuju i

usporediti razliku u fiziološkom odgovoru između dvaju sojeva.

Testovi toksičnosti

Određivanje doze neke kemikalije i njenog toksičnog učinka kojeg ona postiže u živom sustavu u

određenom vremenu izloženosti temelj je toksikoloških i farmakoloških istraživanja. Istraživane kemikalije

se najčešće primjenjuju na jedan od tri načina:

1. Dermalno

2. Inhalacijski

3. Oralno

Pokuse koji se provode možemo prema tome podijeliti na:

1. Testovi određivanja efektivne doze ED50 (za lijekove) i letalne doze LD50 i LC50 (za veliki broj

kemikalija kojima je čovjek svakodnevno izložen). Ovakvi testovi služe kao podloga procjeni

doze koja je otrovna za čovjeka i služi za opis otrovnosti kemikalija.

2. S obzirom na vrijeme izloženosti/ponavljanje doze i toksični ili farmakološki učinak: akutne,

subkronične, kronične i cijeloživotne testove toksičnosti (za lijekove je testiranje vremena

izloženosti uglavnom samo u prve tri kategorije a rjeđe cijeloživotno)

U ovakvim pokusima uglavnom se istražuju specifični učinci poput:

1. Genotoksičnost, mutagenost, kancerogenost

2. Reproduktivna toksičnost, embriotoksičnost, endokrina disrupcija, teratogenost

3. Imunotoksičnost

4. Neurotoksičnost

5. Hepatotoksičnost

6. Nefrotoksičnost

7. Iritacija kože ili iritacija oka

Page 143: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

143

Tablice 1-3. Primjeri testiranja toksičnosti

Akutna toksičnost

Vrsta životinje

Štakor se preporučuje za inhalacijsku i dermalnu toksičnost, za dermalne testove preferiraju se zečevi kao i za testove iritacija oka (Draizeov test, primjenjuje se od1944 do danas); osim glodavaca vrlo rijetko se koriste ostale životinje

Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci Broj životinja 5-10 za srođene sojeve, 10 ili više za nesrođene sojeve

Doza

Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka koja se aplicira jednokratno ako je aplikacija intraperitonealna, oralna, subkutana, intradermalna, intramuskularna; Za inhalacijsku aplikaciju izloženost minimum 4 sata a za dermalnu izloženost vrijeme izlaganja je do 24 sata (do analize)

Vrijeme trajanja pokusa i vrijeme analize

Do 24 sata od aplicirane doze, iznimno do 48 sati ako se istražuje eliminacija neke kemikalije

Subkronična toksičnost

Vrsta životinje Glodavci i to najčešće štakori a rjeđe miševi; zečevi uglavnom za dermalnu toksičnost;

Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci

Broj životinja Minimum 10 po spolu za nesrođene sojeva glodavaca; 5 za srođene sojeve, 4 za druge veće životinjske vrste (pas svinja) iznimno 1 životinja ako je pokusna životinja primat

Doza Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka, preporučuje se svakodnevna aplikacija pojedinoj dozi osim za bioakumulativne kemikalije koje zahtijevaju posebne protokole

Vrijeme trajanja pokusa i vrijeme analize

28 dana ili 90 dana, ovisno o vrsti životinje

Kronična toksičnost

Vrsta životinje Glodavci i to najčešće štakori, miševi i psi, pokusi se moraju provoditi na minimalno dvije vrste kako bi se kompenzirale razlike u fiziologiji

Dob Mlade životinje, najčešće oko 3-6 mjeseci

Broj životinja Minimum 20 po spolu za nesrođene sojeva glodavaca; 5 za srođene sojeve, 4 za druge veće životinjske vrste (pas, svinja) iznimno 1 životinja ako je pokusna životinja primat

Doza Minimalno tri doze, niska (najčešće NOEL), srednja i visoka, preporučuje se svakodnevna aplikacija pojedinoj dozi osim za bioakumulativne kemikalije koje zahtijevaju posebne protokole

Vrijeme trajanja pokusa i vrijeme analize

12-24 mjeseci, ovisno o vrsti životinje, za aditive u hrani minimalno 24 mjeseca do tri godine

Page 144: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

144

Laboratorijski modeli i laboratorijske životinje u ekotoksikološkim testiranjima

U tvari opasne za okoliš svrstat će se i tvari koje zbog njihovih fizikalno-kemijskih, toksikoloških i

ekotoksikoloških svojstava mogu predstavljati opasnost za strukturu odnosno funkciju drugih prirodnih

ekosustava (flora, fauna, organizmi u tlu, pčele, ozonski omotač itd.) (R 54 i R 59). Prema ekotoksikološkim

svojstvima tvari opasne za okoliš (simbol N, Tvari opasne za okoliš) svrstavaju se u 3 skupine, prvenstveno

prema djelovanju na vodene ekosustave:

1. skupina tvari visoko toksičnih za vodene organizme:

• akutna toksičnost 96-satna LC50 za ribe ili

• 48-satna EC50 za Daphnie ili 72-satna IC50 za alge iznosi do 1 mg/l;

• tvar nema laku biodegradaciju ili je koeficijent n-oktanol/voda (Pow) >3,0 osim ako je

eksperimentalno utvrđeni faktor biokoncentracije (BCF) <100 (simbol N, R 50 i R 53).

2. skupina tvari toksičnih za vodene organizme:

• akutna toksičnost 96-satna LC50 za ribe ili

• 48-satna EC50 za Daphnie ili

• 72-satna IC50 za alge iznosi od 1 mg/l do 10 mg/l;

• tvar nema laku biodegradaciju ili je Pow >3,0 osim ako je eksperimentalno utvrđeni BCF <100

(simbol N, R 51 i R 53).

3. skupina tvari štetnih za vodene organizme:

• akutna toksičnost 96-satna LC50 za ribe ili

• 48-satna EC50 za Daphnie ili

• 72-satna IC50 za alge iznosi od 10 mg/l do 100 mg/l;

• tvar nema laku biodegradaciju (R 52 i R 53).

Literatura

Principles and Methods of Toxicology (2001) Ed. A Wallace-Hayes. CRC publishing international. pp 1912.

http://www.emea.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002831.

pdf

http://www.eu.elsevierhealth.com/media/us/samplechapters/9780443069116/9780443069116.pdf

Wei L. (1997) Transgenic Animals As New Approaches In Pharmacological Studies. Annual Review of

Pharmacology and Toxicology. 37: 119-141. DOI: 10.1146/annurev.pharmtox.37.1.119

Page 145: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

145

IMUNIZACIJA LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA U CILJU PROIZVODNJE

POLIKLONSKIH I MONOKLONSKIH ANTITIJELA

Mr. sc. Maja Lang Balija, dr. vet. med.

UVOD

Što je imunološki odgovor?

Temelj imunološke reakcije je prepoznavanje stranog agensa i njegovo neutraliziranje/uklanjanje iz

organizma. To se zbiva nespecifičnim (tj. prirođenim) i specifičnim (tj. stečenim) mehanizmima.

Nespecifična ili prirođena imunost djeluje bez prethodnog susreta organizma sa stranim agensom i

usmjerena je protiv gotovo svih antigena što ulaze u organizam. Ona razlikuje strano od vlastitog, no ne

razlikuje vrstu stranog agensa i ne može se pojačati izlaganjem takvom agensu.

S druge strane, specifična imunost (stečena, adaptivna) razvila se kasnije i djeluje protiv točno određenog

antigena, ali tek nakon prethodnog susreta s njim.

Što su antitijela?

Antitijela (protutijela, imunoglobulini, γ globulini) su bjelančevine ili proteini iz grupe globulina. Kod

sisavaca se stvaraju kao reakcija na strane supstance (tzv. antigene) koje su prodrle u organizam. Jedan

točno određeni antigen inducira njemu odgovarajuće antitijelo, koje preko specifične nekovalentne veze

uglavnom prepoznaje antigen kao stranu supstancu. Specifično vezanje antitijela na antigene je bitan dio

obrane organizma od prodrlih stranih supstanci u organizam. Antitijela uglavnom ne „prepoznaju“

cjelokupnu strukturu antigena nego jedan te isti karakteristični dio tzv. antigen determinantu (epitop). Pri

kontaktu sa antigenom antitijelo provodi tzv. humoralni imunosni odgovor.

Osnovnu građu svakog imunoglobulina čine četiri polipeptidan lanca dva teška lanca (heavy chains, H) i dva

laka lanca (light chains, L) međusobno povezana disulfidnim vezama u tako da molekula ima oblik slova Y.

N-terminalni krajevi su mjesta namijenjena vezanju antigena, a C-terminalni kraj namijenjen je interakciji s

drugim komponentama imunološkog sustava pri obavljanju izvršnih funkcija imunoglobulina. Proteolitički

enzim pepsin cijepa molekulu na dva dijela od kojih se C-terminalni (konstantni) dio naziva fragmentom Fc a

preostali dio fragmentom F(ab)2. Enzim papain, pak, cijepa molekulu imunoglobulina nešto više, dijeleći je

na tri fragmenta: Fc fragment i dva fragmenta F(ab), koji iskazuju različit stupanj varijabilnosti i čiji se vršni,

najpromjenljiviji dijelovi nazivaju hipervarijabilnim područjima imunoglobulina i to su mjesta vezanja s

antigenom.

U većine sisavaca razlikuje se pet razreda imunoglobulina - IgG, IgM, IgA, IgD, IgE - međusobno različitih s

obzirom na veličinu molekule, električni naboj, sastav aminokiselina i sastav ugljikohidrata. Osim toga neke

klase je moguće pronaći samo kod određenih životinjskih vrsta (ptice IgA, IgM i IgY) ili se pojavljuju samo u

određenim dijelovima organizma gdje imaju različite uloge. Osnovno svojstvo imunoglobulina je njegova

bifunkcionalnost. Dio molekule namijenjen je vezanju s antigenom, a drugi dio obavljanju tzv. izvršnih

funkcija, t.j. interakciji s drugim stanicama i imunocitima te topljivim komponentama, poput komplementa.

Pripadnost određenom razredu ovisi o građi, t.j. sastavnim dijelovima imunoglobulina.

Page 146: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

146

Što su poliklonska odnosno monoklonska antitijela?

Poliklonska antitijela su antitijela proizvedena od različitih B- limfocitnih klonova. Predstavljaju smjesu

molekula imunoglobulina (heterogena populacija), od kojih svaki prepoznaje isti antigen, ali reagira s

različitim antigenskom determinantama (epitopima) danog antigena, različitim afinitetima. Mogu biti

različitih izotipova.

Monoklonska antitijela su monospecifična antitijela koja su identična, zato što su proizvod jednog B-

limfocitnog klona. Predstavljaju homogenu populaciju koja prepoznaje isti epitop za kojeg imaju izrazito jaki

afinitet. Sva su istog izotipa.

Proizvodnja poliklonskih antitijela (Pab – polyclonal antibody)

Antigen (imunogen)

Ranije se antigen definirao kao molekula koja može potaknuti B- limfocit na stvaranje antitijela (engl.

“ANTIbody GENerator”). Danas taj izraz ima šire značenje i označava svaku molekulu koju mogu prepoznati

mehanizmi stečene imunosti, bez obzira jesu li posredovani limfocitima B ili T. Molekula antitijela obično se

ne veže na cijelu molekulu antigena već, zbog svoje specifičnosti, samo na dio antigenske molekule, koji se

naziva epitop. Jedna molekula antigena može imati, i obično ima, više različitih epitopa. Stoga bi bilo

ispravnije govoriti o specifičnosti antitijela za određeni epitop, a ne za cijeli antigen.

Antigeni (imunogeni) u cilju dobivanja poliklonskih antitijela mogu biti proteini, peptidi, ugljikohidrati,

nukleinske kiseline, lipidi, steroidi, virusi, bakterije i različite druge prirodne ili sintetske tvari. Dobar

imunogen mora biti dovoljno velik da bi ga imunološki sustav mogao prepoznati, razgradiv, imati određenu

čistoću kako bi se stvorila što specifičnija antitijela i mora biti dostupan u količini i obliku koji je podesan za

aplikaciju u domaćina.

Imunogeni proteinske prirode mogu biti cjeloviti nativni ili denaturirani proteini, veći dijelovi proteinskih

molekula s nekim drugim proteinom (tzv. fusion protein) ili umnoženi ekspresijom u bakterija s plazmidom

koji sadrži odgovarajući antigen, zatim sintetski peptidi (10-15 aminokiselina), koje se obično onda vežu za

neki veći proteinski nosač (hemocijanin, goveđi albumin, mišji albumin ili ovalbumin) i na kraju kemijski

prilagođeni neimunogeni ili slabo imunogeni proteini koji dodatkom dinitrofenolne skupine, denaturacijom

i sl. postaju jači imunogeni.

Priprava antigena za imunizaciju životinja mora se obaviti prema principima dobre laboratorijske prakse.

Adjuvant

Adjuvanti (lat. adjuvare, pomagati) obuhvaćaju tvari različite strukture i podrijetla, koje se koriste uz razne

antigene kako bi pomogle inducirati brzu, snažnu i dugotrajniju specifičnu imunoreakciju. Točan način

djelovanja adjuvanata nije u potpunosti istražen, ali je iz iskustva poznato i pokusima utvrđeno da mnoge

tvari mogu nespecifično pridonijeti imunogenosti nekog antigena.

Prema podrijetlu mogu se razvrstati u biološke i kemijske. Kao biološki adjuvanti koriste se različite

bakterije (Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium bovis, Bordetella pertusis, Corynebacterium

parvum, Corynebacterium granulosum, Nocardia rubra) i virusi, bakterijski i gljivični polisaharidi, muramil

Page 147: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

147

dipeptid, vitamini (A i D vitamin), saponini, timusni hormoni, limfokini, te interferon i drugi citokini. Od

kemijskih adjuvanata najpoznatiji su aluminij-hidroksid i aluminij-sulfat, kalcij-fosfat, levamisol, liposomi,

poliakrilni adjuvanti i uljne suspenzije.

Pri primjeni adjuvanata treba misliti na to da mnoge od tih tvari djeluju toksično na tkivo i uzrokuju jaku

lokalnu granulomatoznu upalu ili apscese. Neki potiču senzibilizaciju anafilaksijskog tipa, izazivaju znakove

serumske bolesti i nefritis, a pojedini djeluju onkogeno.Idealni adjuvant trebao bi prije svega biti siguran,

dakle ne bi smio izazvati lokalne i sistemske reakcije, preosjetljivost, autoimune bolesti i sl. Morao bi biti

kemijski definiran, biorazgradiv, te stabilan s obzirom na adjuvantsko djelovanje i toksičnost. Adjuvant ne bi

smio biti imunogen, niti ulaziti u reakciju s antigenom . Međutim, efikasnost takvog adjuvanta ne bi mogla

biti univerzalna za sve antigene, budući da se oni razlikuju u patogenezi, a time i u sposobnosti indukcije

određenog tipa imunološke reakcije. Stoga je nužno poznavati mehanizme djelovanja adjuvanata, radi

lakšeg određivanja optimalnog adjuvanta za pojedini antigen. Adjuvanti mogu djelovati na jedan ili više

načina. Pet je poznatih mehanizama djelovanja adjuvanta:

imunomodulacijom, što znači da preferirano potiču TH-1- ili TH-2-tip odgovora

očuvanjem konformacijskog integriteta antigena što rezultira njegovom efikasnijom prezentacijom

antigen prezentirajućim stanicama (AP-stanice)

induciranjem aktivacije CD8+ T-stanica

selektivnim usmjeravanjem antigena na pojedini tip AP-stanica

nakupljanjem antigena na mjestu imunizacije

Pokusna životinja

Poliklonska antitijela najčešće se dobivaju imunizacijom odgovarajućeg domaćina in vivo (miš, kunić, hrčak,

štakor, zamorčić, pile, koza, ovca, magarac, konj, ljama), a potom se izoliraju iz njihovih imunosnih krvnih

seruma. Vrlo je važno za imunizaciju odabrati ne samo životinjsku vrstu, već i soj ili pasminu životinjske

vrste, jer ponekad o tome ovisi uspjeh imunizacije. Nadalje, na imunološki odgovor životinje ovisi i spol i

dob životinje. Bez obzira o kojoj se vrsti životinje radi, činjenica je, da ona u proizvodnju poliklonskih

antitijela mora ući zdrava i prilagođena na nove uvjete okoline.

Za izradu dijagnostičkih poliklonskih antitijela najčešće se koriste miševi i kunići, dok se za potrebe

dobivanja velikih količina dijagnostičkih i/ili terapijskih seruma koriste farmske životinja (ovca, koza, konja,

ljama). Danas se sve češće koristi i imunizacija kokoši i dobivanje specifičnih IgY antitijela iz jajeta (dobivaju

se bez žrtvovanja ili višekratnog krvarenja životinja, nisu križno reaktivna s imunoglobulinima sisavaca,

atraktivna s etičkog stanovišta smanjenja broja životinja koje se koriste u pokusima).

Imunizacijski protokol

Princip imunizacije je da se prvom primjenom određene količine imunogena (primarna imunizacija ili

primovakcinacija) potakne imunološki sustav na prepoznavanje strane tvari i proizvodnju antitijela, a

naknadnim redovnim primjenama (sekundarna imunizacija ili revakcinacija) pojača proizvodnja antitijela u

krvi. Da bi se to ostvarilo mora biti odabran odgovarajući put ulaska antigena u organizam koji može biti

potkožan (subkutano, sc.), u mišićje (intramuskularno, im.), u peritonejsku šupljinu (intraperitonejski, ip.), u

krvožilni sustav (intravenski, iv.) i u kožu (intradermano, id.) (tablica 1.). Intravenska se injekcija kuniću daje

tako da se prvo pritisne vena na bazi uške, a zatim se igla infuzijskog kompleta uvede u zadebljalu

marginalnu venu uške. Intravenska se injekcija mišu daje u repnu venu, nakon provedene dilatacije žila

Page 148: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

148

grijanjem repa. Intramuskularne se injekcije primjenjuju u mišić stražnje noge (miš) ili u glutealni mišić

(kunić). Intradermalno apliciranje je korektno izvedeno kada se na mjestu aplikacije može napipati mjehurić

ubrizgane tekućine; intradermalno se aplicira na više mjesta na tijelu životinje.

Tablica 1. tehnike aplikacije za pojedine životinjske vrste

Miš, štakor

ORALNO zaobljena kanila; čvrsto obuzdati; vertikalan postav; cijev preko nepca u jednjak

INTRADERMALNO koža na leđima

SUBKUTANO koža vrata

INTRAMUSKULARNO stražnja strana bedrenih mišića

INTRAVENOZNO lateralne repne vene

INTRAPERITONEALNO lateralno od linije albe / etažno

Zamorčić

ORALNO zaobljena kanila; čvrsto obuzdati; vertikalan postav; cijev preko nepca u jednjak

INTRADERMALNO koža na leđima

SUBKUTANO koža vrata

INTRAMUSKULARNO stražnja strana bedrenih mišića

INTRAVENOZNO prednja i stražnja limbična vena, kanuliranje jugularne vene

INTRAPERITONEALNO lateralno od linije albe / etažno

Kunić

ORALNO silikonska sonda; otvarač za usta; vertikalan postav; cijev preko nepca u jednjak

INTRADERMALNO koža na leđima

SUBKUTANO koža vrata

INTRAMUSKULARNO stražnja strana bedrenih mišića

INTRAVENOZNO marginalne ušne vene

INTRAPERITONEALNO lateralno od linije albe / etažno

Ovca, koza i magarac

ORALNO sonda, otvarač za usta; cijev preko nepca u jednjak

INTRADERMALNO -

SUBKUTANO koža vrata ili leđni dio (područje prsa)

INTRAMUSKULARNO mišić prednje ili stražnje noge

INTRAVENOZNO jugularna vena

INTRAPERITONEALNO na sredini trbušne šupljine

Page 149: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

149

Tablica 2. Maksimalnih volumena imunizacijskih otopina po mjestu

vrsta maksimalni volumen po

mjestu prva imunizacija

(injekcija) docjepljivanje

miš 100 µL s.c. s.c.

miš 50 µL i.m.

(za jednu stražnju nogu) i.m.

zamorčić, štakor 200 µL s.c., i.m. s.c., i.m. kunić 250 µL s.c., i.m. s.c., i.m.

ovce, koze, magarci 500 µL

(na više mjesta po 250 µL) s.c., i.m. s.c., i.m.

Kemijske i fizikalne karakteristike inokulata moraju biti u cijelosti poznate. Vodi se računa o pH, viskoznosti,

koncentraciji, sterilnosti, pirogenosti te o nazočnosti štetnih agensa. Uz volumen (tablica 2.), važna je i

količina antigena, te temperatura inokulata. Osoba koja obavlja aplikaciju mora imati odgovarajuće znanje i

vještinu.

Ovisno o životinjskoj vrsti, parenteralne se injekcije daju na različitim mjestima na tijelu životinje, sa ili bez

anestezije (ovisno o postupku). Mjesto aplikacije se prvo očisti 70%-tnim etanolom. Uvjek se koristimo

sterilnim iglama i brizgalicama. U primovakcinaciji aplicira se na maksimalno 4 mjesta, a docjepljivanje se

obavlja najviše 3 puta s minimalno 2 tjedna razmaka među docjepljivanjima.

Nakon imunizacije životinje je potrebno promatrati (monitorirati) najmanje 3x tjedno i pratiti eventualno

nastajanje nuspojave kao što su bol, otečenje, absceci, formiranje fistula infekcije ili ulceracije na ili pokraj

mjesta aplikacije antigena.

Sakupljanje krvi

Tijekom imunizacijskog postupka povremeno moramo obavljati kontrolu visine postignutog titra antitijela

na dotični antigen (ocjenjivanje uspješnosti postupka). Stoga se krv se prikuplja u svrhu:

1. evaluacija serumskih antitijela

2. evaluacija površinskih biljega leukocita periferne krvi

3. proizvodnja specifičnih antitijela za dijagnostičke svrhe

4. proizvodnja hiperimunih plazmi za terapijske svrhe

Postoji više metoda za prikupljanje krvi. Odabir neke od metoda ovisi o životinjskoj vrsti, potrebnoj količini

krvi, učestalosti krvarenja i o tomu da li je preživljenje pokusne životinje nužno. Prikladnim tehnikama od

svake se životinje može dobiti mala količina krvi bez utjecaja na ukupno zdravlje životinje.

Tablično je prikazan prosječni volumeni krvi odraslih jedinki različitih vrsta, očekivani volumeni krvi nakon

iskrvarenja, te volumeni krvi koji se mogu dobiti pri uzorkovanju.

Page 150: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

150

Tablica 3. Volumeni uzoraka krvi u malih laboratorijskih vrsta životinja

Vrsta Ukupni volumen

krvi u odrasle živ. (mL)

Siguran volumen jednog vađenja

(mL)

Praktičan dijagnostički

volumen (mL)

Volumen krvi koji se dobije

iskrvarenjem životinje (mL)

miš M 1,5-2,4

Ž 1,0-2,4

0,1-0,2

0,1

M 0,8-1,4

Ž 0,6-1,4

štakor M 29-33

Ž 16-19

M 2,9-3,3

Ž 1,6-1,9 0,3

M 13-15

Ž 7,5-9

kunić 58,5 5-50 1 31-310

hrčak M 6,3-9,7

Ž 7,1-11,2

M 0,6-0,9

Ž 0,7-1,1 0,3

M 2,9-4,5

Ž 3,3-5,2

zamorčić M 59-84

Ž 48-63

M 6-8

Ž 5-6 0,5

M 29-42

Ž 24-31

Tablica 4. Mjesta venepunkcije kod laboratorijskih životinja

Vrsta životinje mjesto venepunkcije komentar

sve vrste lateralna vena safena

(v. saphena lateralis)

U malenih vrsta teško vidljiva,

pokretljiva

kunić rubna ušna vena

središnja ušna arterija rizik od pojave nekroze

štakor lateralna repna vena

(v. coccygea) prethodno zagrijati rep

zamorčić, činčila, kunić, štakor jugularna vena

(v. jugularis) potrebna anestezija

zamorčić prednja šuplja vena

(v. cava antherior) potrebna anestezija

Tablica 5. Preporučena veličina igala (jedinica mjere G) za uporabu kod laboratorijskih životinja

Vrsta ip. im. iv. sk.

Zamorčić 21-25 25 25-27 23-25

Hrčak 23-25 25 25-27 25

Miš 27 27 27-28 25

Kunić 21-23 23-25 23-25 21-25

Štakor 23-25 25 25-27 25

Pas 21-23 21-23 21-23 21-23

Page 151: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

151

Proizvodnja monoklonskih antitijela (Mab- monoclonal antibody)

Metodu proizvodnje monoklonskih antitijela objavili su znanstvenici Georges Köhler i Cesar Milstein 1975.

godine (1984. god. su za to otkriće dobili Nobelovu nagradu), a temelji se na in vitro fuziji stanica koje

proizvode antitijela s tumorskim stanicama, čime nastaje tzv. hibridom: stanica sposobna proizvoditi

antitijela (zahvaljujući genomu limfocita koji proizvodi antitijela) i neograničeno dugo živjeti u uvjetima in

vitro (zahvaljujući genomu tumorske stanice koja se može razmnožavati u neograničenom broju generacija).

Tom je metodom moguće in vitro proizvesti neograničene količine posve čistih antitijela zadane

specifičnosti, afiniteta i avidnosti (avidnost je mjera čvrstoća veze između antigena i antitijela) protiv bilo

kojeg antigena, koja su našla široku primjenu u laboratorijskoj dijagnostici kao i pri liječenju. Veće količine

potrebne su za dijagnostičke kitove ili reagense (0,1 do 0,5 g) za rutinske dijagnostičke procedure ili za

predkliničke evaluacijske studije (0.1 do 10g) ali i za profilaktičke i terapijske namjene (više od 10g).

Životinjski modeli u stvaranju i proizvodnji Mab

Klasična procedura izrade monoklonskih antitijela obuhvaća dvije različite procedure u laboratorijskih

životinja: imunizacija u cilju produkcije klonova B limfocita i proizvodnja Mab pomoću metode izazivanja

ascitesa.

Imunizacija

Odabir životinjske vrste kao donatora imunih stanica slezene za fuziju uvelike ovisi o raspoloživim mijeloma

staničnim linijama i porijeklu antigena. Miš je najčešća životinja koja se koristi za imunizacije zato što postoji

mnogo mijelomskih staničnih linija koje su raspoložive (npr. BALC/c), ali se koriste i štakori, hrčci i ljudi kao

izvori B stanica. Imunizacijski protokol sličan je onome za proizvodnju poliklonskih antitijela. Na kraju

imunizacijskog perioda (3 dana iza docjepljivanja) životinje se žrtvuju, a odstranjuje im se slezena za

izolaciju B stanica. Umjesto slezene mogu se koristiti i druga limfatička tkiva kao što su mezenterijalni limfni

čvorovi ili periferni intestinalni limfni čvorovi.

Fuzija i selekcija

Fuzijom imunosnih limfocita B i tumorskih mijelomskih stanica dobivaju se hibridne stanice koje zadržavaju

odlike obiju stanica iz koje su nastale (produkcija protutijela i tumorski rast).

Fuzija se obično postiže primjenom polietilenglikola (PEG) da se destabilizira stanična membrana pa one

postaju sklone fuziji s bliskim stanicama. Kako bi se fuzionirane stanice odvojile od nefuzioniranih koristi se

selekcija pomoću HAT medija (skraćenica za hipoksantin, aminopterin i timidin). Aminopterin je antagonist

folne kiseline koji blokira glavni put sinteze nukleotida. Normalna stanica može stvarati DNA korištenjem

već gotovih nukleotida, za što joj je potreban HGPRT (hipoksantin-gvanin fosforibozil transferaza te TK

(timidin kinaza). Ukoliko tekuća hranjiva podloga ima ova dva enzima (timidin i hipoksantin) normalna

stanica će rasti i u prisustvu aminopterina. Mijelomske stanice koje se koriste za fuziju (poput SP2/0

stanice) imaju defektni gen za HGPRT, a uz dodatak aminopterina ne mogu koristiti niti jedan od navedenih

putova stvaranja DNA, te ugibaju u HAT podlozi ukoliko se ne spoje s limfocitima B i tako nadoknade genski

nedostatak. Nefuzionirani limfociti B također propadaju kroz nekoliko dana, te tako u kulturi ostaju samo

stanice nastale fuzijom.

Nakon testiranja supernatanta kulture identificiraju se oni koji produciraju protutijela od interesa pa se te

stanične kulture dalje uzgajaju i zamrzavaju.

Page 152: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

152

Proizvodnja Mab u miševa metodom tvorbe ascitesa

Miševima se injicira intraperitonealno 0,5 ml Pristana pomoću brizgalice od 2 ml i igle od

25-G 7 dana prije injiciranja hibridomskih stanica. Hibridom od kojeg se želi dobiti ascites

treba biti sinergičan s vrstom i sojem laboratorijskih životinja u kojih se proizvodi ascites.

Alternativno mogu se koristiti imunodeficijentni sojevi miševa (scid i nude). Pristan će

inducirati nespecifčnu upalnu reakciju u peritonealnoj šupljini te će injicirane hibridomske

stanice rasti kao ascites-tumor i nastaviti lučiti protutijela.

Hibridomske stanice uzgoje se u bočici za uzgoj kultura stanica (inkubator 37 ºC uz 5%

CO2). Nakon toga brizgalicom od 5 ml i iglom od 25-G injivirati mišu 1 ml suspenzije stanica

intraperitonealno. Broj miševa odredi se prema potrebnoj količini ascitesa i protutijela. Od

jednog miša dobije se 10 ml ascitesa.

Nakon 5-7 dana skupiti ascites. Uhvatiti miša čvrsto lijevom rukom, nategnuti kožu na

trbuhu te u donji lijevi kvadrant zabosti iglu 18-G u abdomen 1 cm duboko. Paziti da se ne

ozljede trbušni organi . Pustiti ascites da kapa u epruvetu od 50 ml.

Nakon 2 dana ponovno se skupi ascites. Obično nakon 3-5 vađenja ascitesa životinja razvije

čvrst tumor te prestaje produkcija ascitesa. Životinju je tada potrebno eutanazirati.

Ascites se centrifugira 10 min pri 1500xg te se skupi supernatant. Acsites treba

dekomplementirati (vodena kupelj 45 min pri 56 ºC). Odredi se titar antitijela

odgovarajućim metodama. Nakon toga se ascites alikvotira i smrzne (na -20ºC zadržava

svojstva maksimalno nekoliko godina, a na -80ºC neograničeno).

Literatura

Andreis I, Batinić D, Čulo F, Grčević D, Marušić M, Taradi M, Višnjić D. (2004) IMUNOLOGIJA. Medicinska

naklada, Zagreb, VI. izdanje.

Cox JC i Coulter AR (1997) Adjuvants- A classification and review of their modes of action. Vaccine 15: 248-

256

Han, J. (2003) Handbook of Laboratory Animal Science; chap.16 Hendriksen, C. and Hau, J.Production od

Polyclonal and Monoclonal Antibodies. CRC Press LLC

Leenarars M and Hendriksen CFM (2005) Critical steps in the Produciton od Polyclonal and Monoclonal

Antibodies: Evaluation and Recommendations, ILAR Jour., vol.46, No 3, 269-279

Marlies Leenaars P.P.a et all. (1999): The Production of Polyclonal Antibodies in Laboratory Animals, The

Report and Recommendations of ECVAM Workshop, ATLA 27, pp79-102

Stites DP, Stobo J, Wells JV (1989) Osnovna i klinička imunologija, Appleton&Lange, 6th ed.

Page 153: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

153

ALTERNATIVNI PRISTUPI KORIŠTENJU LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA

Doc. dr. sc. Ana Galov

William Russell i Rex Burch su još davne 1959. godine ukazali na utjecaj humanosti prema laboratorijskim

životinjama na sami znanstveni pokus u svojoj knjizi "The Principles of Humane Experimental Technique"

(Načela humanih pokusnih tehnika), te su opisali etičku ali i znanstvenu važnost humanih tehnika. Autori su

opisali osnovnu metodologiju kojom se mogu postići humani pokusi, a zasniva se na "poboljšanju" (engl.

refinement), "smanjenju" (engl. reduction) i "zamjeni" (engl. replacement) - takozvani koncept "tri R" koji

se može primjenjivati u eksperimentalnim protokolima. Pojam poboljšanje uključuje svaku metodu koja

smanjuje ili u potpunosti isključuje nanošenje boli životinjama tokom pokusa. Ono je više od same

analgezije i anestezije, uključuje pomno promišljanje svakog postupka. Poboljšanje također obuhvaća i

upotrebu onih životinjskih vrsta koje se nalaze niže na filogenetičkoj ljestvici (npr. zamjena primata

miševima je tehnika poboljšanja). Pojam smanjenje uključuje korištenje manjeg broja životinja u

istraživanju. Međutim, broj životinja se ne bi smio smanjiti toliko da ugrožava dobivanje relevantnih

rezultata, čime bi i onaj mali broj životinja koji se koristio bio uzaludno potrošen. Pojam zamjena uključuje

upotrebu onih tehnika koje ne koriste žive životinje, te obuhvaća in vitro tehnike. Svaka metoda ili

procedura koja ima za posljedicu zamjenu ili smanjenje broja potrebnih životinja, ili poboljšanje procedura

kojim se smanjuje patnja životinja, smatra se alternativnom metodom.

Poticaj za razvoj alternativnih metoda uglavnom je etičke prirode, međutim postoje i neki drugi čimbenici

koje treba uzeti u obzir. Primjerice, upotreba laboratorijskih životinja je skupa, eksperimenti traju dugo i

teško ih je standardizirati.

Humana upotreba laboratorijskih životinja se smatra ona kojom se osigurava njihova dobrobit. Za

minimalnu razinu dobrobiti životinja, potrebno je zadovoljiti barem slijedećih pet osnovnih potreba

životinja: potreba za adekvatnom prehranom, potreba za svježom vodom, potreba za odstranjivanjem boli i

bolesti, potreba za odstranjivanjem uznemirenosti i straha, te potreba za normalnim ponašanjem. Očito je

da provođenje istraživanja pri kojima se vodi briga o dobrobiti životinja vodi do boljih znanstvenih rezultata.

Kontrola boli i uznemirenosti i vođenje računa o dobrobiti životinja su sastavni dijelovi zakona koji se

odnose na upotrebu laboratorijskih životinja u zemljama zapadne Europe i Sjeverne Amerike.

Općenito je alternativne metode lakše uvesti u fundamentalna ili inovativna istraživanja nego u

primijenjena istraživanja, zato što veliki broj primijenjenih istraživanja zahtijeva stroge standardne

procedure i regulatorne smjernice.

Do danas je razvijeno nekoliko alternativnih pristupa koji se zasnivaju na "zamjeni", a uključuju metode ili

strategije koje ne koriste životinje. Jedan od primjera je testiranje pirogena koji je prvotno razvijen na

kunićima, kasnije je razvijen LAL (engl. Limulus Amoebocyte Lysate) test koji se provodi korištenjem krvi

praklještara Limulus polyphemus, da bi konačno bio razvijen test koji potpuno zamjenjuje upotrebu

životinja, a koristi ljudsku krv. Slijedeći primjer je proizvodnja monoklonskih protutijela tehnikom

hibridoma, za čiju su se proizvodnju koristili miševi ili štakori, da bi kasnije bila razvijena alternativna in vitro

metoda kojom se hibridoma stanice propagiraju u velikim volumenima medija za kulturu stanica. Također je

jedan od primjera "zamjene" testiranje fototoksičnosti proizvoda koji se nanose na kožu. Standardni test

fototoksičnosti koristi zamorčiće, dok se zamjenski test zasniva na upotrebi stanica u kulturi, te osim što ne

uzrokuje patnju životinja, ima i dodatnu prednost što je relativno brz i niske je cijene.

Page 154: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

154

Što se tiče "smanjenja", eksperiment bi se morao provesti tako da se koristi minimalni broj životinja, ali

opet dovoljan za postizanje ciljeva eksperimenta. Smanjenje broja životinja se može postići tako da se vrlo

jasno definiraju ciljevi, da se vrlo promišljeno napravi plan eksperimenta, te da se koriste prikladne

statističke analize. Nažalost, mnogi eksperimenti su loše isplanirani, a ponekad se koriste i pogrešni

statistički testovi, tako da zaključci koji proizlaze nisu valjani, a životinje nisu upotrjebljene učinkovito. Jedan

od ključnih pristupa za postizanje smanjenja broja životinja je minimizirati raznolikost korištenih životinja

tako da se koriste životinje koje su međusobno što sličnije, a to se postiže korištenjem visokosrodnih sojeva.

Isto tako je vrlo važno osigurati zdravlje i visoke standarde brige za životinje, jer bolesne životinje i one pod

stresom mogu pokazati različite odgovore na tvari koje se ispituju, čime se povećava varijacija

eksperimentalnih rezultata, a time se povećava i broj životinja koji je potreban za takva istraživanja.

Nadalje, važno je da se istraživanja provode po principima dobre laboratorijske prakse, GLP (engl. Good

Laboratory Parctice), koji u pojedinosti propisuju načine uzgoja i ishrane životinja, te koji postavljaju

standarde po kojima se osigurava kvalitetan rad sa životinjama.

U slučaju kada je jedini mogući način pribavljanja znanstvenih informacija korištenjem životinja, te kada je

učinjeno sve potrebno da bi se broj životinja smanjio na najmanji mogući, tada preostaje jedino još

upotrijebiti tehnike "poboljšanja" kojima se bol i uznemirenost životinja smanjuje na minimum. Te tehnike

osim što pozitivno utječu na dobrobit životinja, također i povećavaju vrijednost eksperimentalnih podataka.

Literatura

Goldberg A., Drnec K. (2003) Alternatives: Refinement, Reduction, and Replacement of Animal use in the

Life Sciences. U: Handbook of Laboratory Animal Science, Second Edition: Essential Principles and Practices,

Volume I. Jann Hau i Gerald L. Van Hoosier,

Jr., urednici. CRC Press LLC, 2003.

Zutphen L.F.M., Baumans V. i Beynen A.C. (urednici) (1993) Principles of Laboratory Animal Science, A

contribution to the humane use and care of animals and to the quality of experimental results. Elsevier,

Amsterdam.

www.frame.org.uk

Page 155: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

155

DOBRA LABORATORIJSKA PRAKSA DLP/GLP (GOOD LABORATORY

PRACTICE)

Dr. sc. Jadranka Bubić Špoljar, dr. vet.med.

Dobra laboratorijska praksa je sistem smjernica za ispravno osiguranje kvalitete koji osigurava

organizacijske procese i uvjete pod kojima se rad u laboratoriju planira, izvodi, nadzire, zapisuje i arhivira.

GLP Principi dobre laboratorijske prakse utemeljeni su 1976. godine u SAD, a stupili su na snagu i u praksi

saživjeli 1979. Godine.

Kvaliteta i uspješnost pružanja usluga određenih /referalnih/ laboratorija u velikoj mjeri ovisi od njenom

unutarnjem ustroju i organizacijskoj strukturi osoblja i opreme. Uvođenje dobre laboratorijske prakse

posebno je bilo važno u područjima kao što je analiza hrane i analiza i kvaliteta lijekova, zaštita okoliša, itd.

U današnjim razmjerima, principi ustroja dobre laboratorijske prakse prerasli su u sistem osiguranja

kvalitete, koji se može implementirati na sve djelatnosti. Po tom principu, uvođenje sistema osiguranja

kvalitete u laboratorije je stručan i organizacijski zahtijevan posao, koji podrazumijeva i odgovornost za

sprovođenje zadanih zahtjeva, a predmetni laboratorij mora odrediti prioritete, strategiju i ciljeve osnutka.

Glavni cilj laboratorijskog rada je izdavanje vjerodostojnih i pouzdanih rezultata analiza koji moraju biti

znanstveno utemeljeni i zakonski potkrijepljeni.

Ustroj GLP nam osigurava vjerodostojnost podataka koji su odraz rezultata dobivenih tijekom provedbi

studija. GLP načela također osiguravaju tzv. sljedivost podataka odnosno ponavljanje/rekonstrukciju

dobivenih podataka kojima se može ući u trag. GLP promiče međunarodno prihvaćanje testova.

MISIJA GLP uključuje:

- Test sustave i kontrole procesa

- SOP standardne operativne pisane procedure za laboratorije ; one definiraju kako provesti protokol

navedenih aktivnosti.

- Osoblje i organizacija laboratorija

- Rutinski pregled, čišćenje, održavanje, testiranje i kalibriranje

- Propisati akcije koje treba poduzeti kao odgovor na kvar opreme

- Analitičke metode

- Definiranje polaznih podataka sirovina

- Osiguranje kvalitete programa

- Izvedbe studija

- Izvješća rezultata studija

- Arhiviranje materijala i zapisa

Standardizacija postupaka provođenja laboratorijskih ispitivanja podrazumijeva:

- Prijem i razmatranje zahtjeva

- Prihvaćanje zahtjeva i/ili potpisivanje ugovora o ispitivanju

- Uzorkovanje

- Prijem i evidenciju uzoraka

- Pripremu uzorka za ispitivanje

Page 156: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

156

- Ispitivanje uzorka

- Analizu rezultata i kontrolu ispitivanja

- Izradu izveštaja o ispitivanju

- Verifikaciju ispitivanja

- Izdavanje izvešća o ispitivanju

U laboratorijima se koriste standardizirane metode ispitivanja koje zadovoljavaju potrebe korisnika i koje su

prikladne za testna ispitivanja.

Neposredno uz prostor gdje se vrši priprema i ispitivanje uzoraka trebaju se nalaziti kompletne metode

ispitivanja i pisane upute (SOP) za rukovanje opremom sa kojom se vrši ispitivanje (na radnom mestu ili u

neposrednoj blizini).

Proces provođenja laboratorijskih ispitivanja

Uključuje izradu izvještaja o ispitivanju:

- Po završetku laboratorijskih ispitivanja radi se izvještaj o ispitivanju tako što se svi rezultati analiza

ispitivanih uzoraka prikazuju tabelarno i/ili grafički.

- Ostali podaci koji su neophodni za izradu izvještaja o ispitivanju (podaci o korisniku usluga, mjestu

uzorkovanja, samom uzorku, postupku uzorkovanja, metodama ispitivanja, i dr. unose se u izvještaj.

na osnovu zahtjeva, ponude i/ili ugovora sa korisnikom i prijemnog lista uzorka.

Izvještaj također uključuje i navode i informacije o specifičnim uvjetima ispitivanja:

- o rezultatima ispitivanja koji se odnose samo na ispitivane uzorke

- ukoliko je uzorak oštećen, obavezno je to opisati

- ako uzorkovanje nije adekvatno izvršeno

- ako su ispitivanja ponovljena

U slučaju kada laboratorij vrši uzorkovanje obavezno je u izvještaj upisati podatke o rukovanju uzorkovanju i

količini i vrsti uzoraka, mjestu uzorkovanja, metodi, standardu, idr.

Rukovanje ispitanim uzorcima:

- Nakon završetka procesa ispitivanja vrši se klasifikacija i uklanjanje ispitanog materijala

- Klasificirani otpad se privremeno odlaže u laboratoriju u za to predviđeni prostor, a potom se

adekvatno zbrinjava prema Zakonu o otpadu i Zakonu o kemikalijama.

Ukoliko postoji potreba da se ispitani uzorak ili njegov dio čuva, postupa se kako je definirano protokolom.

Važno:

IZ SVIH PROVEDENIH STUDIJA UVIJEK OSTAVITI UZORAK ZA SUPERANALIZU I ČUVATI GA PROPISNO POD

KLJUČEM

Page 157: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

157

Provođenje Sustava kvalitete u laboratoriju:

Osiguranje kvalitete je kontinuirani proces unapređenja rada laboratorija kroz pronalaženje grešaka,

rješavanje problema, preduzimanje popravnih radnji, unutarnju i vanjsku kontrolu rada, učestvovanje u

ispitivanju osposobljenosti laboratorija, kao i u razvoju postupaka interne kontrole kvalitete osoblja koje

provodi sustav kvalitete. Osiguranje kvalitete je glavni faktor za dobijanje pouzdanih i vjerodostojnih

rezultata.

Osiguranje kvalitete laboratorija opisuje i uključuje sve mjere koje se primjenjuju u laboratoriju da bi se

postigao kvalitetan rad koji osigurava vjerodostojne i pouzdane rezultate provedenih analiza. Navedene

mjere uključuju:

Upravljanje kvalitetom

Kontrolu kvalitete

Sistem kvalitete

Upravljanje kvalitetom:

Primarna svrha upravljanja kvalitetom je sprečavanje nastanka grešaka

Upravljanje kvalitetom je prvi stupanj osiguranja kvalitete analitičkih postupaka, a predviđa

primjenu tehnika i postupaka radi ispunjavanja zahtjeva za kvalitetom

Aktivnosti vezane uz upravljanje kvalitetom sadrže mere kojima se postiže statistički nadzor

točnosti ispitivanog postupka, odnosno opisuje mjere koje se primenjuju za postizanje ponovljivih i

pouzdanih rezultata.

Upravljanje kvalitetom čini:

Odgovornost i educiranost osoblja u laboratoriju – svi zaposleni u laboratoriju, bez obzira na vrstu posla

koju obavljaju, moraju biti upoznati s važnošću svog posla i potrebom profesionalne odgovornosti za

njegovo obavljanje, bez obzira na hijerarhijsku postavku u laboratoriju.

Svi zaposleni u laboratoriji moraju biti u stanju dokazati vještine i osposobljenost za obavljanje pojedinih

poslova u laboratoriju. Laboratorij (ili institucija čiji je laboratorij sastavni dio) dužna je propisati minimalne

zahtjeve koje zaposlenik mora zadovoljiti da bi obavljao određene radne zadatke.

Odgovarajuća opremljenost laboratorija = bitan element upravljanja kvalitetom.

Sva oprema i instrumenti koji se koriste u radu moraju biti na ispravan način održavani i kalibrirani.

Laboratorij mora imati pisane postupke održavanja opreme i instrumenata, kao i postupke kalibriranja i

učestalost izvođenja pojedinih postupaka/provjere kontrole. Svi postupci održavanja i kalibriranja moraju

biti zapisani i dokumentirani.

Standardni radni postupci moraju se razviti unutar laboratorija, a cilj im je postizanje ujednačenog načina

izvođenja određene analize u laboratorijskim uslovima, i dobijanje pouzdanih rezultata.

Page 158: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

158

Validacija je dokumentirani proces određivanja pogodnosti mjernog sistema za dobivanje korisnih

analitičkih podataka. Za laboratorije je posebno bitna validacija metoda i validacija analitičkih instrumenata.

Svrha validacije je da se ispitivanjem i prikupljanjem objektivnih dokaza potvrdi da je odabrana metoda

prikladna za upotrebu i da ispunjava predviđeni zadatak.

Validacija metode je proces utvrđivanja parametara izvođenja metode i njenih ograničenja, kao i

identifikacija faktora koji mogu utjecati na njeno izvođenje.

Validacija analitičkih instrumenata je postupak provjere tehničkih karakteristika instrumenata u svrhu

dobivanja pouzdanih analitičkih podataka.

Referentni materijal definira se kao materijal komjem su jedna ili više karakteristika istorodne i dobro

određene da bi se mogle upotrijebiti za kalibraciju aparata, ocjenu metode ili za dodjelu vrijednosti

materijalu.

Referentni materijal se u laboratoriju koristi za kalibraciju instrumenata, validaciju metoda, procjenu

odstupanja pri mjerenju, edukaciju i internu kontrolu kvalitete.

Postoji nekoliko tipova referentnog materijala: čiste supstance, standardni rastvori ili smjese i referentni

materijali u matriksu.

Školovanje i usavršavanje osoblja laboratorija – jako je važno da laboratoriji sve svoje zaposlene

kontinuirano školuju kako bi svi mogli obavljati poslove koji se od njih traže.

Edukacija zaposlenih mora biti planirana i u skladu sa radnim zadacima zaposlenih.

Svaka edukacija/usavršavanje zaposlenih mora biti dokumentirana.

Nadzor laboratorija – svi segmenti rada laboratorija od uzorkovanja odnosno prijema uzoraka u laboratorij

do pisanja izvještaja, uključujući i nadzor okoline, mogu biti predmet nadzora laboratorija.

Svaki laboratorij mora definirati na kojim mjestima i koliko često će se provoditi nadzor, odrediti zahtjeve

koji moraju biti zadovoljeni, i odrediti osobe koje će provoditi nadzor.

Dokumentacija = važan element osiguranja kvalitete laboratorija.

Najveći dio dokumentacije odnosi se na dokumentaciju sistema kvalitete koji obuhvaća sve aspekte

osiguranja kvalitete (model sistema osiguranja kvalitete, metodologiju, standardne procedure izvođenja,

itd).

Sigurnost rada u laboratoriju – dužnost rukovodstva laboratorija jest osigurati da se prije početka rada u

laboratoriju svaki zaposlenik upozna sa pravilima o sigurnosti rada u laboratoriju, potencijalnim

opasnostima rada sa kemikalijama, rukovanja laboratorijskim priborom i opremom, itd.

Dužnost svakog laboratorija je da na vidnom mjestu istakne pravila rada sa potencijalnim opasnostima kao i

uputu za pružanje prve pomoći u slučaju nezgode.

Page 159: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

159

Kontrola kvalitete:

• Kontrola kvalitete je mehanizam kojim se provjerava prihvatljivost dobivenih rezultata ispitivanja, a

primjenjuje se radi ocjene efikasnosti upravljanja kvalitetom

• Kontrola kvaliteta se dijeli na unutarnju i vanjsku

Unutarnja kontrola kvalitete sastoji se od postupaka koje sprovodi laboratorijsko osoblje u cilju

kontinuirane procjene kvalitete rezultata dobivenih određenim analitičkim postupkom.

Unutarnja kontrola kvaliteta uključuje:

- slijepe probe (reagenasa, rastvora, itd)

- standarde

- surogat uzorke

- nezavisna mjerenja

- analizu kontrolnih uzoraka

- interne uzorke za ispitivanje

- izradu kontrolnih karti

- slijepe uzorke

- ponavljanje mjerenja

Unutarnja kontrola kvalitete u laboratoriju mora biti na takvom nivou da se može dokazati valjanost

rezultata.

Primjer iz laboratorijske prakse:

Za rutinsku analizu je prihvatljivo da udio unutarnje kontrole kvalitete u ukupnom radu laboratorija bude

5%, što znači da od 20 analiziranih uzoraka 1 mora biti kontrolni.

Vanjska kontrola kvaliteta zasniva se na ispitivanju osposobljenosti laboratorija pomoću

međulaboratorijskih uporednih ispitivanja. Ispitivanje osposobljenosti laboratorija je u organizaciji

referentnih laboratorija ili ovlaštenih institucija u kojima grupe laboratorija analiziraju jedan ili više

identičnih parametara homogenog i stabilnog ispitivanog uzorka.

Page 160: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

160

ETIKA U RADU SA LABORATORIJSKIM ŽIVOTINJAMA

Sofija Blažević, dipl. ing.

Svrha ovog predavanja je da potakne polaznike na razmišljanje o etičkoj dimenziji svojih istraživanja. Svaka

čovjekova djelatnost ima moralnu težinu, a ona se u znanosti često zanemaruje.

Suvremena istraživanja u prirodnim znanostima, naročito biomedicina, uključuju provedbe pokusa na živim

životinjama. Odluka korištenja životinja u istraživanjima zahtjeva kritično mišljenje i odgovorno postupanje.

Mogućnost korištenja životinja sa svrhom istraživanja je privilegij

koji društvo daje znanstvenoj zajednici, s očekivanjem da će takvo

korištenje pridonijeti sticanju novog znanja ili će poboljšati

dobrobit ljudi i/ili životinja. Ključno pitanje je: da bi umanjio ili

izbjegavao ljudsku patnju, ima li čovjek pravo izvoditi pokuse na

životinjama, te tako njima uzrokovati bol i patnju?

Trenutačno postoje dvije jake i aktivne pozicije vezane za

istraživanja na životinjama. Oni koji zagovaraju prava životinja

inzistiraju da čovjek nema pravo nanositi bol životinjama, unatoč

dobrim namjerama. Suprotno njima su oni koji misle da bi bilo ne-

etično ukinuti programe koji, se baziraju na istraživanjima na

životinjama, a mogli bi dovesti do efikasnog liječenja ljudskih

bolesti. Prva mišljenje je mišljenje raznih udruga i pokreta za

zaštitu životinja, a drugo većine znanstvenika. Oba ekstrema su

jaka i nažalost često u sukobu zbog nedovoljnog truda obiju

strana da komuniciraju.

Bez obzira na vlastiti stav prema istraživanju s laboratorijskim životinjama, činjenica je da ovo pitanje stvara

etičku dilemu, tj. situaciju u kojoj nema rješenja koje bi bilo pozitivno za sve strane koje su u nju uključene.

U većini slučajeva, rješenje će biti moralno nezadovoljavajuće na neki način. Etička dilema vezana za rad s

laboratorijskim životinjama se može sažeti u četiri tvrdnje:

1. Eksperimentiranje na živućim životinjama je jedini način kojim se može doći do otkrića, osobito u

prevenciji i terapijama ozbiljnih ljudskih bolesti.

2. Moralni je imperativ pronaći nove načine kako prevenirati i tretirati ozbiljne ljudske bolesti.

3. Tijekom istraživanja na živućim životinjama, pojedine životinje će neminovno patiti ili osjetiti

tjeskobu, te intervencije neće koristiti životinjama koje su u pitanju.

4. Moralni je imperativ sačuvati dobrobit životinja, napose, ne smijemo životinji uzrokovati patnju

ako ta patnja nije nadoknađena s nekom vrstom benefita.

Očito je da se ove tvrdnje kose jednu s drugom. Većina ljudi bi se složila da je druga tvrdnja korektna, ali

prva, treća i četvrta imaju i pobornike i protivnike, te ćemo ih prodiskutirati u tekstu koji slijedi.

Etika: grana filozofske znanosti

koja proučava zakone po kojima

se ravna ljudsko ponašanje.

Životinja: višestanični heterotrofni

eukariotski organizmi. Čovjek

(Homo sapiens) je također

životinja, ali u kontekstu ovih

predavanja naziv „životinja“ se

odnosi na „ne-ljudske životinje“.

Laboratorijske životinje: odnosi

se na životinje koje se koriste za

istraživanja i podrazumijeva samo

kralježnjake.

Page 161: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

161

Prva tvrdnja: Potreba za istraživanjima na životinjama

Često se kaže da se istraživanja na životinjama moraju obavljati ako želimo uživati prednosti koje ona

donose ljudima.

Pitanje je da li je to stvarno tako? Odgovor mi mogao biti: često, ali ne uvijek. Pošto ne možemo razmatrati

konkretne znanstvene projekte, možemo načelno reći da je vrlo malo vjerojatno da istraživanja na

životinjama mogu biti potpuno nepotrebna, tj. da se sva dostignuća koja proizlaze iz tih istraživanja mogu

dobiti metodama koje ne koriste životinje. Iz toga bi slijedilo da se takvi pokusi moraju provesti. Pitanje

ostaje, koji točno? Istina je da ima mnogo eksperimenata koji su loše dizajnirani, provođeni u lošim

uvjetima, ili pak nepotrebno ponavljaju prethodna istraživanja. Jesu li ti pokusi bili potrebni? Ovi su

eksperimenti moralno loši jer troše resurse, ali naročito jer bi uzrokovana bol životinjama bila potpuno

neopravdana. Pitanje je što u slučaju kada je eksperiment dobro isplaniran i proveden? Trebali bi se pitati

da li je bilo potrebno raditi ga na životinjama ili su se slični rezultati mogli postići alternativnim metodama.

Ako je odgovor da su se mogli, onda ne možemo reći da je istraživanje na životinjama bilo potrebno.

Također se dovodi u pitanju da li treba provesti na životinjama neka istraživanja koja su usmjerena ka

liječenju loših navika kod čovjeka kad bi se isti mogli ispraviti poticajući – kroz akcije javnog zdravstva i sl. -

zdraviji stil života ili izbjegavanje rizičnog ponašanja.

Pitamo se također o prikladnosti istraživanja za razvitak novih lijekova ili higijenskih proizvoda kad već

postoje neki koji služe toj svrsi. „Velika korist za čovječanstvo“ se u ovim slučajevima dovodi u pitanje.

Postoje otpori korištenju životinja za fundamentalna istraživanja, koja ne donose neposrednu ljudsku

korist, nego samo unapređuju opće znanje. U ovom slučaju bismo trebali istaknuti da je napredak u borbi

protiv bolesti često ovisio o znanju do kojeg se došlo fundamentalnim istraživanjima.

Sva ova pitanja nam pokazuju da nije uvijek jasna nužnost eksperimentiranja na životinjama. Pošto neki

eksperimenti nemaju jasnu neposrednu korist, mogli bismo reći da je znanstvena kvaliteta jedini kriteriji

koji bi trebali slijediti u odluci da li je eksperiment osigurao važnu korist za čovječanstvo.

Druga tvrdnja: Tražiti alternativne metode

Većina ljudi bi se slaže da je potrebno tražiti alternativne metode korištenju životinja, koje bi također

koristile u prevenciji i liječenju ljudskih bolesti.

Ovdje se također nameće dilema, što bi bilo bolje koristiti u slučaju da su te alternativne metode mnogo

skuplje nego laboratorijske životinje?

Treća tvrdnja: Životinjski osjećaj boli

Pojedine životinje neminovno pate i osjete tjeskobu tijekom istraživanjima. Činjenica je da postoji

višestoljetna tradicija istraživanja u prirodnim znanostima. Zbog nedostataka analgetika i anestetika, pri

istraživanjima se sigurno uzrokovala bol i patnja životinja. Tome je doprinijelo i mišljenje, koje je također

vladalo stoljećima, da su životinje slične strojevima i da ne osjećaju bol kao što je osjeća čovjek, pa da su i

postojali analgetici i sedativi, vjerojatno se ne bi koristili. Također treba istaknuti da su se anestetici počeli

koristiti kod čovjeka tek 1840-ih godina, a krajem 19. također i kod životinja. Danas je većini znanstvenika

jasno da životinje osjete bol i da pate uslijed nasilja koje se vrši nad njima. Naravno to ne znači da sve

životinje uključene u istraživanja neminovno pate. Bol se može jako reducirati ili čak eliminirati u mnogim

Page 162: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

162

istraživanjima koristeći alternativne i/ili neinvazivne metode za uzorkovanje, , kao i korištenjem analgetika i

anestetika da bi smanjili stres. Životinje se mogu držati u obogaćenom okolišu koji također smanjuje stres.

Isto tako, bolji modeli kao i dobro planiranje i dizajn eksperimenta omogućuju da se pokusi provode s

manjim brojem životinja, i tako smanjiti neizbježnu bol.

Četvrta tvrdnja: Moralni status životinja

Jesu li životinje moralno manje vrijedne od čovjeka?

Ovo je teško pitanje, koje uključuje našu evaluaciju da li su životinje „moralna bića“, i ako nisu da li to

implicira i obavezuje ljude na „moralno“ ponašanje prema njima.

Istina jest da životinjsko ponašanje ne smatramo moralnim, tj. nećemo kazniti psa koji je ugrizao prolaznika,

nego vlasnika koji ga nije obuzdao. Moramo se zapitati ovisi li naše ponašanje, o tome je li subjekt našeg

djelovanja moralno biće ili ne? Drugim riječima, to što životinje nisu moralna bića (tj. da ne djeluju

slobodno) znači da se mi ne moramo prema njima odnositi moralno? Ljudsko ponašanje, ukoliko nije

prisilno, je uvijek podložno moralnoj procjeni, bez obzira na subjekt, iako subjekt utječe na moralnu

procjenu pojedinog ponašanja. Većina nas, manje ili više svjesno, misli da čovjek zaslužuje poseban obzir,

koji ne možemo pripisati životinjama. Ali, koju vrstu obzira hoćemo i/ili moramo stvarno dati životinjama?

Obzir kao prema živim bićima koja su na istoj razini kao i čovjek, ili obziri kao prema bićima koja zaslužuju da

se dobro gospodari s njima?

Zaključak

U ovom smo tekstu pokušali potaknuti raspravu o odnosu čovjeka prema životinjama u istraživanjima.

Potreba za tečajevima za osobe koje rade sa laboratorijskim životinjama je niknula nakon što je znanstvena

zajednica, pobuđena sa strane društva, uvidjela da se ne odnosi uvijek dobro prema životinjama koje koristi

u istraživanjima; da može i mora bolje raditi u istraživanjima; da mora postići standarde kako bi ta

istraživanja bila smislena i korisna. Etičko razmišljanje ima veliki utjecaj na poboljšanje tih istraživanja.

Znanstvenici će uvijek moći bolje objasniti svoje metode kad su upoznati s etičkim dilemama koje te

metode izazivaju kao i etičkim teorijama koje se nalaze iza različitih rješenja tih dilema.

Literatura

Veliki dio ovog teksta je prilagođen iz Olsson AS, Robinson P, Pritchett K, Sandoe P. Animal Research Ethics.

In: Hau J, Van Hoosier G, editors. Handbook of Laboratory Animal Science, Volume 1: Essential Principles

and Practices. 2nd ed. Boca Raton, Florida: CRC Press; 2003. p. 22-39.

Festing S, Wilkinson R. Talking Point on the use of animals in scientific research. EMBO Rep 2007; 8:526-30.

Gannon F. Animal rights, human wrongs? Introduction to the Talking Point on the use of animals in

scientific research. EMBO Rep 2007; 8:519-20.

Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Research Council (US); Committee for the

Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Washington (DC): National Academies

Press (US); 2011.

Page 163: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

163

McCarthy CR. 1999. Bioethics of laboratory animal research. ILAR J 40:1-37.

Perry P. 2007. The ethics of animal research: A UK perspective. ILAR J 48:42-46.

Predavanja Masters degree in Bioethics, Sveučilišta u Navarri, Pamplona, Španjolska; ak.god. 2011.-2012.

Rollin BE. Talking Point on the use of animals in scientific research. EMBO Rep 2007; 8:521-525.

Page 164: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

164

VJEŽBE: LABORATORIJSKE ŽIVOTINJE U BIOLOŠKIM ISTRAŽIVANJIMA

Experimentalni uvod na neživim modelima

Polaznici će prije rada sa živim životinjama sve postupke koji će se provesti na živim modelima, vježbati prvo

na lutkama. Smisao ovog djela vježbi je pomoći polaznicima da se riješe eventualnog straha od rukovanja sa

živortinjama i da se naviknu raditi sa priborom (šprice, igle, itd.) s kojima će se susretati na vježbama.

Video

Prije svake vježbe bit će prikazan video u kojim se demostrariju svi postupci koji polaznici moraju sami – uz

vodstvo instruktura – izvesti na životinjama. Smisao videa je pokazati dobru laboratorijsku praksu u

rukovanju sa životinjama. Videom se također izbjegava korištenje dodatnih životinja za demostraciju

postupaka.

Page 165: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

165

OBUZDAVANJE LABORATORIJSKIH ŽIVOTINJA I UZIMANJE UZORAKA KRVI

Doc. dr. sc. Vesna Benković

Pravilno, sigurno, čvrsto ali nježno rukovanje laboratorijskim životinjama bitno je u smanjenju napetosti

životinja i istraživača te za opuštenu atmosfera u laboratoriju kao preduvjet za humani postupak prema

laboratorijskim životinjama.

Postoje značajne razlike pri rukovanju i obuzdavanje različitih vrsta životinja u laboratoriju, ali nekoliko

važnih principa primjenjuje se jednako na sve vrste. Oni uključuju: nježno ali čvrsto rukovanje životinjom,

polagan ali odlučan pristup životinji bez naglih pokreta, korištenje rukavica za jednokratnu uporabu, pranje

ruku prije i poslije rukovanja, čista zaštitna odjeća te korištenje odgovarajuće tehnike za obuzdavanje

životinje. Životinjama koje se koriste u eksperimentalnim protokolima koji uključuju opsežne manipulacije

treba oprezno rukovati, često prije početka istraživanja kako bi se omogućilo da životinje prilagode na

postupak rukovanja (često rukovanje čini ih poslušnijima. Odrasli miševi prilikom rukovanja hvataju se za

rep blizu baze repa i stavljaju na čvrstu površinu npr. žice poklopca. Lagano se prihvaćaju za višak kože na

vratu i leđima palcem i kažiprstom, a malim prstom se prihvaća rep životinje. Rotacijom ruke životinja leži u

dlanu imobilizirana za pregled ili manipulaciju. Štakori se obuzdavaju tako da podižu hvatanjem baze repa

kao i miševe. Posebnu pažnju treba obratiti na hvatanje štakora u području prsnog koša i sprečavanje

okretanja glave i ugriza. Životinje ne bi trebao prečvrsto držati kako bi mogle nesmetano disati. Danas je u

upotrebi veliki broj uređaja i pomagala za manipulaciju laboratorijskim životinjama kao što su pleksiglas

cilindari koji omogućuju pristup repu životinje za intravenske injekcije ili uzimanje krvi ili fleksibilna

transparentana vrećica konusnog oblika otvorena na bazi, a na vrhu ima mali otvor za disanje (1,2).

Pravilno obuzdavanje laboratorijskih životinja preduvjet je za primjenu tvari koje se apliciraju putem

injekcija (parenteralno) kao što su anestetici i analgetici te testirane tvari. Postoji pet najčešće korištenih

načina parenteralne primjene: potkožno (s.c.), intraperitonealno (i.p.), intravenski (i.v.), intrakutano (i.c.) i

intramuskularno (i.m.). Sve tehnike nisu prikladne za svaku vrstu životinja. Doziranje i volumen tvari koje se

apliciraju moraju biti pažljivo određene obzirom na vrstu životinje koja se koristi, vrstu i svojstva tvari koje

se daju, mjesto aplikacije i dr. Veličinu šprica i igle treba pažljivo odrediti kako bi smanjilo i spriječilo

oštećenje tkiva a osigurala točna primjena neke tvari.3,4 I.m. injekcija izbjegava se u miša, jer je količina

tvari koja se može ubrizgati mala tako da tehnika nije praktična. Kod štakora količina tvari koja se daje i.m.

ograničena na 0,25 ml. S.c. injekcije se mogu primijeniti lako kod miševa (volumen aplicirane tvari ne veći

od 1 ml kod odraslih miševa (> 25 grama)) i štakora ( količina aplicirane tvari može biti do 5 ml u odraslih

štakora (> 300 grama)). Intraperitonealna injekcija u miševa i štakora aplicira tvari u prostor oko

abdominalnih organa, pri čemu treba izbjegavati injekciju izravno u organ. Volumen tvari u odraslih miševa

ne smije prelaziti 1 do 2 ml. Intravenskom injekcijom u repnu venu miša može se aplicirati do 0,5 ml tvari.

Glavna funkcija vena je termoregulacija pa će primjena topline na cijelu životinju ili lokalno na rep

uzrokovati venodilataciju i olakšati pristup krvnoj žili i aplikaciju tvari. Aplicirati bi trebalo polako kako bi se

izbjeglo preopterećenje cirkulacije ili ruptura vene. Primjena ove tehnike kod štakora može biti otežana

ljuskavošću repa (3,4).

Uzimanje uzoraka krvi iz laboratorijskih životinja tijekom eksperimentalnih postupaka neophodno je za

određivanje hematoloških i biokemijskih parametara, farmakokinetike, imunološkog statusa organizma,

kliničke patologije itd. Uzorci krvi se mogu dobiti iz različitih mjesta u tijelu, koristeći različite metode: iz

Page 166: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

166

vena, iz arterija, iz orbitalnog sinusa, iz srca ili dekapitacijom. Izbor metode ovisi o nekoliko čimbenika,

uključujući svrhu prikupljanja krvi, potreba za arterijskim ili venskim uzorkom krvi, trajanje i učestalost

uzimanja uzoraka, te je li eksperiment terminalan za životinje. U malih vrsta, krv se često prikuplja sa

životinja pod anestezijom, kako bi pomogli u imobilizaciji i za smanjenju boli u životinja. Pri odabiru metode

za uzimanje uzoraka krvi u svjesnih životinja, u obzir se mora uzeti mogućnost za stres-inducirane učinke na

biokemijske parametara. Uzorci krvi mogu biti prikupljeni od životinja koje su preživjele postupak ili

žrtvovanih životinja. Volumen prikupljene krvi od životinja koje moraju preživjeti postupak ograničen je

kako bi se spriječilo stanje anemije i hipovolemija. Volumen krvi procjenjuje se na temelju tjelesne težine.

Vrijedi opće pravilo 1-3-6 koje navodi da je prosječni volumen krvi većine laboratorijskih životinja iznosi 6%

tjelesne težine (60 ml/kg), najveći volumen krvi koji se može očekivati od žrtvovanih životinja je 3% tjelesne

težine (30 ml/kg), a najviše 1% tjelesne težine (10 ml/kg) može biti prikupljeni tijekom bilo kojeg razdoblja

od dva tjedna kod životinja koje prežive eksperimentalne postupke. Postoje različite metode koje se koriste

za prikupljanje krvi iz miševa i štakora. Venepunkcija je općenito zadovoljavajući način za višekratno

prikupljanje manjih količina krvi. Repne vene korisne su za prikupljanje male količine (<0,1 ml) u krvi.

Tehnika venepunkcije slična je tehnici i.v. injekcije jer mali volumen krvi uvlačimo u štrcaljku umjesto da

ubrizgavamo materijal. Moguće je i korištenje igle bez šprice, a prikupljena krv sa skuplja u određeni

spremnik (cjevčica za mikrohematokrit ili vacutainer). Za prikupljanje veće količine krvi iz preživjelih

životinja pogodno je uzimanje krvi iz orbitalnog sinusa uz opću anesteziju životinje.Općenito krv ne bi

trebao prikupljati iz istog oka više od 3 puta, u razmaku od najmanje 1 tjedan između krvarenja. Srčana

punkcija je preferirana tehnika za prikupljanje velike količine krvi. Izvodi se u općoj anesteziji a nakon

završetka postupka životinja mora biti žrtvovana (1-4).

Literatura

1. Diehl, K.-H., Hull, R., Morton, D., et al., A good practice guide to the administration of substances and

removal of blood, including routes and volumes, J. Applied Toxicol. 21, 15, 2001.

2. Lawson, P.T., Ed., Assistant Laboratory Animal Technician, American Association for Laboratory Animal

Science, Sheridan Books, Chelsea, MI, 1999, p. 45.

3. Olfert, E.D., Cross, B.M., and McWilliam, A.A., Eds., Guide to the Care and Use of Experimental Animals,

Vol. 1, Canadian Council on Animal Care, Ottawa, Ontario, 1993,

4. van Zutphen, L.F.M., Baumans, V., and Beynen, A.C., Eds., Principles of Laboratory Animal Science, rev.

ed., Elsevier, Amsterdam, 2001.

Page 167: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

167

MIŠ

Rukovanje, iniciranje, vađenje krvi i sekcija

Rukovanje

Hvatanje i premještanje: Uzmi miša iz kaveza, stavi ga na ruku i odnesi na neko drugo mjesto. Ponovo uzmi

miša i istim postupkom ga vrati u kavez. Ovo ponovi nekoliko puta sve dok se miš ne navikne na proces

hvatanja i premještanja.

Obuzdavanje: Po naputku asistenta uzmi miša za rep i stavi ga na rešetke kaveza. Držeći ga za rep, grabi

miša za kožu vrata i ramena, zatim prihvati rep sa malim prstom i naprstnjakom iste ruke. Ovo ponovi

nekoliko puta sve dok se miš ne navikne na proces obuzdavanja.

Iniciranje i vađenje krvi

Anestezija i analgezija: Obuzdaj miša i iniciraj intraperitonealno odgovarajuću mješavinu anestetika i

analgetika.

Iniciranje i vađenje krvi: Kad je miš anestetiziran (provjeri refleks oka i šapice), izvedi slijedeće:

Kaniliranje

Intravenozno iniciranje u repnu venu

Vađenje krvi iz repne arterije

Subkutano iniciranje

Vađenje krvi iz femoralne vene

Vađenje krvi iz srca

Eutanazija: Cervikalna dislokacija.

Sekcija: Identifikacija unutarnjih organa

Page 168: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

168

ŠTAKOR

Rukovanje, iniciranje, vađenje krvi i sekcija

Rukovanje

Hvatanje i premještanje: Uzmi štakora iz kaveza, stavi ga na ruku i odnesi na neko drugo mjesto. Ponovo

uzmi štakora i istim postupkom ga vrati u kavez. Ovo ponovi nekoliko puta sve dok se štakor ne navikne na

proces hvatanja i premještanja.

Obuzdavanje: Po naputku asistenta zgrabi štakora za tijelo i drži ga par sekunda. Ovo ponovi nekoliko puta

sve dok se štakor ne navikne na proces obuzdavanja.

Iniciranje i vađenje krvi

Anestezija i analgezija: Obuzdaj štakora i iniciraj intraperitonealno odgovarajuću mješavinu anestetika i

analgetika.

Iniciranje i vađenje krvi: Kad je štakor anestetiziran (provjeri refleks oka i šapice), izvedi slijedeće:

Kaniliranje

Intravenozno iniciranje u repnu venu

Vađenje krvi iz repne arterije

Subkutano iniciranje

Intradermalno iniciranje

Vađenje krvi iz femoralne vene

Vađenje krvi iz jugularne vene

Vađenje krvi iz srca

Eutanazija: Predoziranje s primijenjenim anestetikom. Cervikalna dislokacija ili pneumotoraks zbog

potvrde farmakokemijske eutanazije.

Sekcija: Identifikacija unutarnjih organa

Page 169: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

169

ISPITIVANJE PONAŠANJA

Ostale skupine životinja u laboratorijskim istraživanjima

1. Snalaženje u okolišu

(spacijalna memorija – u vodi)

Kretanje

Anksioznost

Istraživanje (Hole-board test)

Kognitivna rigidnost (T-labirint)

2. Socijalno ponašanje

3. Gmazovi kao laboratorijska životinje

Hvatanje i premještanje zmije (Kukuruzna zmija – Elaphe guttata)

Biometrija zmija

Percepcija okoliša – Mjerenje kemorecepcije

Demonstracija vađenja krvi kod gmazova

4. Ostale laboratorijske životinje – kukci

Brzina trka i izdržljivost kod pepeljastog žohara (Nauopheta cinerea)

Page 170: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

170

1. Snalaženje u okolišu:

a. Kretanje:

Minuta Broj kretanja

1

2

3

4

5

b. Anksioznost:

Minuta Broj kretanja

1

2

3

4

5

c. Hole-board test:

d. T-maze: _______ od 10.

2. Social choice:

Datum: Temp.: Vrijeme pokusa: Radio:

♀ / ♂ Težina: Br. Kaveza: Br. Jedinki:

Pokus

Broj Lat. do 1. prijelaza

Habituacija Rearing

Prelasci

vrijeme (sek.) Vrijeme latencije

1.š. + predmet Štakor

Predmet

+ 2. štakor 1. štakor

2. štakor

Page 171: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

171

Biometrija i temperatura:

Istrazivaci: Vanjska temp/˚C Datum:

Vrijeme Vrsta Temp/˚C BL/mm SVL/mm

Duz gl/mm

Sir gl/mm

Vis gl/mm

Tezina Ostalo

Kemorecepcija:

Brzina trka:

Datum: Vrsta Istraživači:

Vrijeme Br. živ. Vrijeme trka Duž. staze Brzina

Izdržljivost:

Datum: Vrsta Istraživači:

Vrijeme Br. živ. Vrijeme trka Duž. staze Brzina

Vrsta: Datum: Istrazivac:

Vrijeme Tretman Latencija Broj palucaja

Ugriz Vrijeme do ugriza

Ostalo

Vrsta: Datum: Istrazivac:

Vrijeme Tretman Latencija Broj palucaja

Ugriz Vrijeme do ugriza

Ostalo

Vrsta: Datum: Istrazivac:

Vrijeme Tretman Latencija Broj palucaja

Ugriz Vrijeme do ugriza

Ostalo

Page 172: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

172

ZEBRICE

1. Anestezija zebrica Uranjanjem u otopinu 0.2% tricaina. Eutanazija se izvodi inkubacijom u ledenoj vodi ili na ledu.

2. Sekcija zebrica

Na vježbama će biti demonstrirano vađenje krvi te sekcija pojedinačnih organa.

2.1. Vađenje krvi

Krv se zebricama vadi iz repne vene. Škaricama se odstrani repna peraja te se mikropipetom uvuče nekoliko

mikrolitara krvi u prethodno heparinizirani nastavak. Krv se po potrebi može razrijediti u otopini fosfatnog

pufera.

2.2. Sekcija organa

Zebrica se položi na podlogu za seciranje te se pričvrsti iglicama. Napravi se rez na trbušnoj strani tijela od

analne peraje do operkuluma, ukloni se operkulum te se nastavi rez duž bočne strane tijela. Na taj način se

uklone koža te mišićni sloj pa se mogu vidjeti organi u trbušnoj šupljini. Nakon toga pristupa se izdvajanju

pojedinačnih organa. Kod mužjaka se prvo izdvajaju testisi koji su pričvršćeni za dorzalni dio trbušne

šupljine. Kod ženki se izdvajaju jajnici u kojima se mogu razaznati oocite u različitim stadijima razvoja.

Sljedeće se izdvaja cijeli probavni sustav te se potom odvaja jetra, žućni mjehur i slezena. Nakon toga

izdvaja se plivaći mjehur koji se sastoji od prednje i stražnje komore. Potom se secira bubreg koji je

smješten duž dorzalne strane tijela, a na njemu se mogu razlikovati 3 regije (glava, tijelo te repna regija).

Nadalje, izdvajaju se škrge te srce koje je smješteno ventralno od škrga. Na kraju se izdvaja mozak pažljivim

razdvajanjem lubanje i okolnog tkiva.

3. Razmnožavanje zebrica

Na vježbama će se pokazati akvariji za uzgoj i razmnožavanje zebrica te će se demonstrirati postupak

pripreme za mrijest zebrica.

4. Embriji u različitim stadijima razvoja

Sudionici će moći vidjeti oplođena i neoplođena jaja te embrije u različitim stadijima razvoja koji traje 72h,

počevši od prvih dioba oplođenog jaja, potom blastule, gastrule te kasnijih stadija sve do izvaljivanja mladih

ličinki.

Page 173: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

173

SEMINARI

Video o istraživanjima na životinjama

Na početku tečaja će se polaznicima pokazati dokumentarni film o istraživanjima na životinjama u kojem se

također ističu i polemike koje postoji oko takve vrste istraživanja. Poanta prikazivanja filma je ukazati na

široki spektar tema vezanih za rad sa životinjama, te ih potaknuti na razmišljanje.

Izvođenje pokusa na živim životinjama

1.Planiranje, dizajn pokusa sa laboratorijskim životinjama

2. Protokoli pokusa

Sa polaznicima će se analizirati i komentirati nekoliko protokola za različite eksperimentalne procedure

pokusa na životinjama. Potom će dobiti zadatak da sami formuliraju i slože eksperimentalni protokol za

zadani pokus.

Dobra Laboratorijska praksa (GLP):

Za seminar treba pročitati 3 rada koji će polaznici dobiti i u kojima su opisani razni pokusi sa životinjama.

Potrebno će biti odgovoriti na pitanja vezana za kvalitetu istraživanja, npr.: je li potrebno koristiti životinje

za takav eksperiment, je li eksperiment dobro napravljen, jesu li se poštivala etička načela pri izvođenju

eksperimenta, itd.. Također će trebati diskutirati alternativne načine izvedve dotičnih eksperimenata.

Toksikologija

Polaznici će analizirati protokole kojima se ispituje imunotoksličnost, reproduktivna toksičnost,

neuurotoksičnost i toksikologija hrane, te će imati priliku osmisliti i analizirati slične protokole. Time će steći

osnovne kompetencije da organiziraju, prate i vode toksikološki pokus prema direktivama OECD.

Udruge za zaštitu životinja

Polaznicima će se u sustretu s udrugama za zaštitu životinja u kratkom seminaru dati prilika da čuju njihove

ciljeve. Smisao ovog seminara je omogućiti prostor za razgovor o etičkim aspektima rada sa životinjama.

Page 174: POKUSNIM ŽIVOTINJAMA I ŽIVOTINJAMA ZA PROIZVODNJU … kategorija 2/Prirucnik kategorija 2.pdf · Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2 2 PROGRAM OSPOSOALJAVANJA

Osposobljavanje za rad sa laboratorijskim životinjama Kategorija 2

174

PROVJERA ZNANJA

Na kraju tečaja polanici će rješavati pismeni ispit. Ispitom će se pokazati jesu li usvojili potrebno znanje da

bi mogli dobro i odgovorno raditi sa životinjama.

Polaznici koji uspješno polože ispiut će dobiti certifikat o položenom tečaju.