1

POLITECHNIKA ŚLĄSKA

WYDZIAŁ CHEMICZNY

KATEDRA CHEMII ORGANICZNEJ, BIOORGANICZNEJ I BIOTECHNOLOGII

AUTOREFERAT pracy doktorskiej

Aleksandra GRUCA

Syntetyczne glikozydowe pochodne genisteiny jako potencjalne

związki uwrażliwiające komórki nowotworowe na cytotoksyczne

działanie promieniowania jonizującego

Synthetic glycosidic genistein derivatives as potential sensitizers of tumour cells

to the cytotoxic effects of ionizing radiation

Promotor: prof. dr hab. Zdzisław KRAWCZYK

Promotor pomocniczy: dr Aleksandra RUSIN

Gliwice 2014

2

Praca doktorska wykonana w ramach Studium Doktoranckiego Politechniki Śląskiej.

Praca finansowana ze środków UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01w ramach Programu

Operacyjnego Kapitał Ludzki współfinansowanego ze środków Europejskiego Funduszu

Społecznego oraz z grantu Narodowego Centrum Nauki (2012/05/N/NZ1/00022).

Praca doktorska została wykonana w Centrum Badań Translacyjnych i Biologii

Molekularnej Nowotworów Centrum Onkologii - Instytutu im. M. Skłodowskiej - Curie,

oddział w Gliwicach.

3

Podziękowania

Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Panu prof. dr hab. Zdzisławowi Krawczykowi

za nieocenioną pomoc udzieloną w trakcie przygotowywania pracy doktorskiej, cierpliwość

i wyrozumiałość oraz motywację do krytycznego spojrzenia na problematykę badawczą.

Szczególne podziękowania pragnę złożyć Panu Profesorowi za pomoc w jasnym

formułowaniu myśli naukowej oraz inspirację do zgłębiania zagadnień naukowych.

Chciałam wyrazić głęboką wdzięczność Pani dr Aleksandrze Rusin, bez której moja praca

doktorska nie mogłaby powstać. Dziękuję za inspirację do badań, niezastąpioną pomoc

w planowaniu doświadczeń oraz kreatywne podejście w poszukiwaniu rozwiązań problemów

biologicznych. Pragnę również podziękować za pomoc w redagowaniu pracy oraz motywację

do opracowania samodzielnych koncepcji na tle istniejącej literatury naukowej.

Dziękuję Panu prof. dr hab. inż. Wiesławowi Szeji za udostępnienie związków do doświadczeń

oraz umożliwienie wykonywania badań w ramach współpracy pomiędzy Katedrą Chemii

Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii Wydziału Chemicznego Politechniki Śląskiej

w Gliwicach a Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów

w Centrum Onkologii w Gliwicach.

Pragnę podziękować Panu prof. dr hab. n. med. Leszkowi Miszczykowi, kierownikowi

Zakładu Radioterapii Centrum Onkologii w Gliwicach za udostępnienie przyspieszacza

liniowego, dzięki czemu możliwe było wykonanie doświadczeń do niniejszej pracy.

Szczególne wyrazy wdzięczności składam pracownikom Centrum Badań Translacyjnych

i Biologii Molekularnej Nowotworów oraz Katedry Chemii Organicznej, Bioorganicznej

i Biotechnologii Wydziału Chemii Politechniki Śląskiej w Gliwicach za przekazaną wiedzę,

pomoc w zakresie technik eksperymentalnych oraz prawdziwie naukową atmosferę w pracy.

W szczególności pragnę podziękować Pani dr Agnieszce Gogler-Pigłowskej,

Panu prof. dr hab. Markowi Rusinowi, Pani mgr Annie Habryce, Pani dr Iwonie Domińczyk,

Panu mgr Radosławowi Kitlowi oraz Panu dr Piotrowi Świerkowi za pomoc i życzliwość.

.

Chciałabym również podziękować rodzinie oraz przyjaciołom, za nieustanne wsparcie oraz

motywację. W szczególności dziękuję mojej Mamie za pomoc w wyborze drogi zawodowej

oraz nigdy niegasnącą wiarę we mnie.

Niniejszą pracę pragnę dedykować mojej Mamie, której wieloletnie nauki wyrażone

są słowami Jana Pawła II: „Tam, gdzie jest człowiek cierpiący, musi znaleźć się człowiek,

który otoczy cierpiącego wsparciem”.

4

SPIS TREŚCI

I. WPROWADZENIE ............................................................................................................ 5

II. CEL PRACY ....................................................................................................................... 6

III. WYNIKI ............................................................................................................................. 7

III.1. Ocena właściwości cytotoksycznych badanych pochodnych genisteiny oraz

promieniowania jonizującego ....................................................................................... 10

III.2. Interakcje analizowanych związków z promieniowaniem jonizującym ...................... 11

III.3. Hamowanie aktywności receptora naskórkowego czynnika wzrostu EGFR przez

genisteinę i jej pochodne .............................................................................................. 15

III.4. Hamowanie indukowanej promieniowaniem jonizującym aktywacji EGFR .............. 17

III.5. Hamowanie aktywności ścieżek przekazu sygnału zależnych od EGFR przez genisteinę

i jej pochodne ............................................................................................................... 19

III.6. Hamowanie aktywności topoizomerazy II przez genisteinę i jej pochodne ................. 22

III.7. Podsumowanie wyników badań ................................................................................... 24

IV. WNIOSKI ......................................................................................................................... 27

V. BIBLIOGRAFIA .............................................................................................................. 28

VI. DOROBEK NAUKOWY ................................................................................................. 30

5

I. WPROWADZENIE

Rozwój wiedzy w dziedzinie onkologii umożliwił scharakteryzowanie w komórkach

wielu typów nowotworów potencjalnych celów molekularnych o istotnym znaczeniu

dla skutecznej chemoterapii i radioterapii i racjonalizujących stosowanie terapii kombinowanej

[1]. Zastosowanie chemoterapii celowanej w kombinacji z radioterapią jest szczególnie

uzasadnione w przypadku pacjentów, u których niepowodzenie radioterapii związane jest

z istnieniem w masie guza komórek radioopornych, a zwiększenie dawki energii

promieniowania jonizującego (IR, ang. ionising irradiation) do wartości umożliwiającej

ich wyeliminowanie nie jest możliwe ze względu na równoczesny wzrost toksyczności terapii

względem tkanek prawidłowych. Jeśli znane są mechanizmy radiooporności komórkowej

w danym typie nowotworu, możliwe jest zastosowanie związków promieniouwrażliwiających

celujących właśnie w te, ściśle określone cele molekularne, bez dodatkowego zwiększania

toksyczności terapii [2-4].

Koncepcja pracy doktorskiej łączy ze sobą dwie strategie poszukiwania leków

do zastosowania w kombinacji z radioterapią, szeroko eksplorowane i opisane w ostatnich

latach [5-8], a mianowicie:

poszukiwanie radiouczulaczy wśród związków o znanych celach molekularnych, które

to cele zostały równocześnie określone w literaturze jako determinanty komórkowej

radiooporności;

projektowanie analogów związków pochodzenia naturalnego w oparciu o analizę SAR

(ang. structure activity relationship, związek pomiędzy strukturą chemiczną

a właściwościami biologicznymi) z nadzieją na otrzymanie pochodnych o ulepszonych

właściwościach biologicznych i farmakokinetycznych oraz równocześnie przewidywanej

niskiej toksyczności ogólnoustrojowej.

Kontrola promienioczułości komórek nowotworowych za pomocą związków

naturalnych mogłaby zwiększyć skuteczność radioterapii oraz równocześnie ograniczyć efekty

uboczne prowadząc do poprawy wyników leczenia [6]. Wśród licznych mechanizmów

molekularnych determinujących radiooporność nowotworów wymienia się często nadekspresję

genów prożyciowych oraz hiperaktywację białek prożyciowych, między innymi czynników

wzrostowych [9, 10]. Substancje radiouczulające celują w rozmaite mechanizmy

radioprotekcyjne, niektóre upośledzają również podstawowe funkcje komórkowe, takie

jak replikacja DNA, prowadząc do zablokowania podziałów komórek i w efekcie zahamowania

wzrostu guza [11, 12]. Z tego względu genisteina jako związek naturalny zdolny do hamowania

równocześnie aktywności receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR, ang. epidermal

growth factor receptor) [13] oraz enzymu uczestniczącego w replikacji DNA –

topoizomerazy II (TOPO II) [14, 15], a jednocześnie blokujący cykl komórkowy w najbardziej

radiowrażliwej fazie G2/M [16, 17], wydaje się wyjątkowo interesująca jako naturalny związek

wyjściowy do konstruowania pochodnych mogących działać jako efektywne radiouczulacze.

Należy podkreślić, że, mimo iż genisteinę testowano w kombinacji z radioterapią w badaniach

przedklinicznych [17-19], nie są znane prace, w których pokazano by, że mechanizmem

6

odpowiedzialnym za jej właściwości radiouczulające jest zdolność do hamowania aktywności

EGFR czy TOPO II.

Ze względu na to, że hiperaktywację EGFR obserwuje się w wielu typach nowotworów

[20, 21], a ponadto aktywność EGFR pobudzana jest po zastosowaniu promieniowania

jonizującego (co uznawane jest jako jeden z nowotworowych mechanizmów radiooporności)

[21-23] receptor ten jest znanym celem dla terapii przeciwnowotworowej. Zablokowanie

funkcji EGFR skutkuje obniżeniem poziomu proliferacji i wzrostu komórek nowotworowych,

obniżeniem odporności na czynniki indukujące śmierć komórkową, spadkiem poziomu

inwazyjności komórek nowotworowych oraz ich zdolności do rozsiewu i adhezji, może

też ograniczać zdolność komórek do naprawy uszkodzeń DNA [24].

Topoizomeraza II, jako enzym regulujący topologię DNA, uczestniczy

w podstawowych procesach komórkowych takich jak replikacja DNA, transkrypcja,

rekombinacja oraz utrzymanie struktury chromatyny [25-28]. Zahamowanie jej funkcji przez

związek z grupy „trucizn” TOPO II wywołuje powstanie podwójnych pęknięć w nici DNA,

co może prowadzić do śmierci komórki [29-31].

Pomimo trwających od około 20 lat intensywnych badań skierowanych na poznawanie

funkcji i właściwości przeciwnowotworowych genisteiny, izoflawon ten nie został dotychczas

wdrożony do leczenia. Wśród głównych przeszkód wymienia się zbyt niską aktywność

genisteiny, czyli działanie w zbyt wysokich stężeniach niemożliwych do osiągnięcia w osoczu

krwi oraz niską biodostępność izoflawonu i jego słabe wchłanianie z przewodu pokarmowego

[32]. W celu poprawy właściwości farmakokinetycznych genisteiny od prawie dwóch dekad

prowadzone są badania, których celem jest uzyskanie skutecznego analogu, który

wykazywałby większą stabilność w ustroju oraz działał przeciwnowotworowo w niższych

stężeniach [33].

II. CEL PRACY

Pierwszym celem niniejszej pracy było zbadanie czy i w jakim stopniu nowe

glikozydowe pochodne genisteiny zsyntezowane w Katedrze Chemii Organicznej,

Bioorganicznej i Biotechnologii Politechniki Śląskiej wykazują zwiększoną właściwość

hamowania wzrostu komórek nowotworowych w porównaniu ze związkiem macierzystym,

genisteiną. Aby to wyjaśnić dla każdego z badanych związków określono wartość IC50.

Drugim celem było zbadanie czy i które z badanych pochodnych genisteiny

hamujących proliferację komórek nowotworowych w niższym stężeniu niż genisteina

wykazują właściwość uwrażliwiania komórek nowotworowych na działanie promieniowania

jonizującego, a zatem czy mogą być brane pod uwagę jako potencjalne radiouczulacze.

Trzecim celem pracy było określenie wybranych elementów mechanizmu hamowania

wzrostu komórek nowotworowych przez glikozydowe pochodne genisteiny. W tym celu

dla każdego z badanych związków określono:

właściwość modulowania poziomu EGFR oraz aktywności/fosforylacji EGFR;

właściwość hamowania aktywności/fosforylacji elementów szlaków zależnych

od EGFR, a mianowicie szlaku AKT oraz szlaku MAPK;

7

właściwość hamowania aktywności topoizomerazy II.

Badania niniejszej pracy miały charakter przesiewowy i w zamierzeniu powinny wskazać

pochodną/pochodne o najlepszych właściwościach radiouczulających, które w następnej

kolejności można by zakwalifikować do badań in vivo.

III. WYNIKI

W niniejszej pracy doktorskiej badaniami przesiewowymi objęto 10 pochodnych

genisteiny zsyntetyzowanych w zespole prof. Wiesława Szeji. Modyfikacja cząsteczki

genisteiny polegała na wprowadzeniu podstawników przy węglu C-7 oraz C-4’. Podstawnikami

były reszty cukrowe ramnalowe bądź laktalowe związane z aglikonem wiązaniem

O–glikozydowym lub C–glikozydowym. Pochodne genisteiny, które poddano badaniom

biologicznym w niniejszej pracy doktorskiej można zaklasyfikować do czterech grup:

Grupa I, to glikozydy genisteiny, w których reszta cukrowa połączona jest z aglikonem

w pozycji C-7. Ta grupa reprezentowana jest przez pochodną o nazwie G21. Pochodna

G21 traktowana jest w niniejszej pracy jako związek referencyjny, wybrany

na podstawie wcześniejszych badań [34, 35]. G21 w początkowych badaniach

zaklasyfikowano jako strukturę wiodącą, która mogłaby zostać wykorzystana do nowych

syntez chemicznych [35].

Grupa II to glikokoniugaty podstawione w pozycji C-7, w których reszta cukrowa jest

oddalona od cząsteczki genisteiny poprzez alkilowy łańcuch, przy czym reszta cukrowa

połączona jest z łącznikiem wiązaniem O-glikozydowym. W tej grupie znajdują

się badane pochodne o nazwie RAM-2, RAM-3 i RAM-5.

Grupa III to analogi omówionych uprzednio O-glikokoniugatów podstawione w pozycji

C-7, w których reszta cukrowa połączona jest z łącznikiem alkilowym poprzez wiązanie

C-glikozydowe. W tej grupie znajdują się badane pochodne o nazwie RAM-C-3α,

RAM-C-4α i RAM-C-5α. Zastąpienie wiązania O-glikozydowego, potencjalnie

wrażliwego na hydrolizę enzymatyczną, wiązaniem C-glikozydowym miało na celu

zwiększenie stabilności pochodnych w komórkach i/lub krwioobiegu.

Grupa IV to glikokoniugaty genisteiny, w których reszta cukrowa połączona

z łącznikiem alkilowym wiązaniem O-glikozydowym podstawiona jest w pozycji C-4’

genisteiny. W tej grupie znajdują się badane pochodne o nazwie RAM-2’, RAM-3’

i RAM-5’.

Pełne nazwy związków chemicznych wraz z podziałem na klasy, stosunkiem anomerów oraz

odnośnikami literaturowymi do opisów syntez zebrano w tabeli III-1.

8

Tabela III-1. Związki chemiczne używane w doświadczeniach. W tabeli przedstawiono pełne nazwy i wzory chemiczne związków, stosunek anomerów α/β, podział na grupy

w zależności od miejsca podstawienia i rodzaju wiązania glikozydowego w strukturze związku oraz odnośniki literaturowe, w których opisana została procedura chemicznej

syntezy każdej pochodnej.

Klasa Nazwa Nazwa wg IUPAC Struktura chemiczna Stosunek anomerów Opis syntezy

Str

uktu

ra

wio

dąc

a

Genisteina 5,7-dihydroksy-3-(4-

hydroksyfenylo)chromen-4-on

- -

Wią

zanie

O-g

lik

ozy

dow

e

po

dst

awie

nie

prz

y C

-7

G21

7–O–(2,3,4,6–tetra–O–acetylo–β–D–

galaktopiranozylo)–(14)–(6–O–

acetylo–heks–2–en–α–D–erytro–

piranozylo) genisteina

tylko α Rusin et al., 2009

RAM-2

5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–

trideoksy–α–L–erytro–heks–2–

enopiranozylo)–2–O–etoksy]–3–(4–

hydroksyfenylo)chromen–4–on

α/β = 10/1

RAM-3

5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–

trideoksy–α–L–erytro–heks–2–

enopiranozylo)–3–O–propyloksy]–3–

(4–hydroksyfenylo)chromen–4–on

α/β = 4.2/1 Rusin et al., 2011

RAM-5

5–hydroksy–7–[(4–O–acetylo–2,3,6–

trideoksy–α–L–erytro–heks––

enopiranozylo)–5–O–pentyloksy]–3–(4–

hydroksyfenylo)chromen–4–on

α/β = 4/1

9

Wią

zanie

C-g

likozy

dow

e podst

awie

nie

prz

y

C-7

RAM-C-3α

5–hydroksy–7–O–[3–(4–O–acetylo–

2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–

enopiranozylo)propylo]–3–(4–

hydroksyfenylo)chromen–4–on

tylko α

RAM-C-4α

5–hydroksy–7–O–[4–(4–O–acetylo–

2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–

enopiranozylo)butylo]–3–(4–

hydroksyfenylo)chromen–4–on

tylko α Rusin et al., 2014

RAM-C-5α

5–hydroksy–7–O–[5–(4–O–acetylo–

2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–

2enopiranozylo)pentylo]–3–(4–

hydroksyfenylo)chromen–4–on

tylko α

Wią

zanie

O-g

lik

ozy

do

we

po

dst

awie

nie

prz

y

C-4

’

RAM-2’

5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–

2,3,6–trideoksy–β–L–erytro–heks–2–

enopiranozylo)–2–etoksyfenylo]–

chromen–4–on

α/β = ¼

RAM-3’

5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–

2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–

enopiranozylo)–3–propyloksyfenylo]–

chromen–4–on

α/β = 6/1 Byczek et al., 2013

RAM-5’

5,7–dihydroksy–3–[4–(4–O–acetylo–

2,3,6–trideoksy–α–L–erytro–heks–2–

enopiranozylo)–5–pentyloksyfenylo]–

chromen–4–on

α/β = 6/1

10

Doświadczenia prowadzono na komórkach dwóch linii nowotworowych: raka gruczołu

krokowego (linia DU145) oraz raka jelita grubego (linia HCT116) pochodzących

z kolekcji ATCC (American Type Culture Collection) utrzymywanych w banku komórkowym

Centrum Onkologii. Komórki linii HCT116 charakteryzuje występowanie mutacji aktywujących

w genach K-RAS oraz PI3CK, które powodują konstytutywną aktywację szlaków RAF-MAPK oraz

PI3K-AKT niezależnie od poziomu aktywności EGFR [36]. Wybrane linie należą do szybko

proliferujących komórek nowotworowych, zawierających wysokie stężenie topoizomerazy II

oraz o wysokim poziomie ekspresji EGFR [37, 38]. Równocześnie komórki wybranych linii

wykazują zróżnicowaną radiooporność [39, 40]. Ponadto, dane z piśmiennictwa pokazują,

że w przypadku nowotworów gruczołu krokowego i jelita grubego obserwuje się słabsze efekty

działania inhibitorów EGFR w kombinacji z promieniowaniem w porównaniu do innych typów

nowotworów [41-43]. Wydaje się zatem racjonalne poszukiwanie związków o potencjalnie większej

skuteczności terapeutycznej w odniesieniu do wymienionych typów nowotworów.

III.1. Ocena właściwości cytotoksycznych badanych pochodnych genisteiny oraz IR

Właściwości cytotoksyczne pochodnych genisteiny oraz ich wpływ na wrażliwość komórek

nowotworowych na promieniowanie jonizujące badano stosując test klonogenności, w którym

wyznaczano wartość IC50 (takie stężenie związku, które powoduje obniżenie mierzonego efektu,

tu proliferacji komórkowej, o połowę). Wartości IC50, obliczone z zastosowaniem programu

CalcuSyn (http://www.biosoft.com/w/calcusyn.htm) opartego na algorytmach opracowanych przez

Chou-Talalaya [44, 45] dla każdego związku oraz promieniowania jonizującego przedstawiono

w tabeli III-2.

Tabela III-2. Wartości IC50 [µM] wraz z odchyleniami standardowymi wyznaczone w teście klonogenności

dla genisteiny oraz jej pochodnych, na które eksponowane były komórki linii nowotworowych jelita grubego

HCT116 oraz gruczołu krokowego DU145. Komórki inkubowano z pochodnymi przez 24 h. Wyznaczono również

IC50 dla IR. Wartości obliczone zostały na podstawie danych uzyskanych z przynajmniej 3 niezależnych

eksperymentów. Na czerwono zaznaczono pochodną o najniższej wartości IC50.(G21 – związek referencyjny)/

Czcionką pogrubioną zaznaczono wartości IC50 niższe od 5 μM, czyli, zgodnie z danymi literaturowymi, możliwe

do osiągnięcia w ustroju [46].

Badany związek IC50

(komórki HCT116)

IC50

(komórki DU145)

IR 1.97 ± 0.39 3.30 ± 0.65

GENISTEINA 31.3 ± 5.5 35.0 ± 8.8

G21 1.2 ± 0.3 3.0 ± 0.3

RAM-2 27.0 ± 8.2 43.8 ± 23.0

RAM-3 2.6 ± 1.5 11.0 ± 6.0

RAM-5 5.9 ± 0.1 11.0 ± 2.0

RAM-C-3α 19.4 ± 1.6 39.1 ± 4.4

RAM-C-4α 6.5 ± 0.8 3.8 ± 1.0

RAM-C-5α 12.5 ± 3.2 11.5 ± 4.3

RAM-2' 3.3 ± 0.9 5.1 ± 0.5

RAM-3' 13.2 ± 1.0 18.9 ± 5.1

RAM-5' 7.00 ± 0.1 6.7 ± 0.8

11

Otrzymane dane pokazały, że 8 spośród 10 badanych pochodnych genisteiny wywoływało

znacząco silniejsze działanie cytotoksyczne niż genisteina. Równocześnie żaden z badanych

związków nie obniżał potencjału klonogennego komórek silniej niż referencyjna pochodna G21.

Ogólnie, komórki HCT116 były bardziej wrażliwe na działanie badanych pochodnych i jedynie

związki RAM-C-4α i RAM-C-5α wykazywały silniejszy lub zbliżony efekt cytotoksyczny

w stosunku do komórek DU145.

W przypadku linii HCT116 najsilniej ograniczającymi potencjał klonogenny komórek były

dwie pochodne, a mianowicie RAM-3 oraz RAM-2’. W przypadku komórek DU145 najsilniej

cytotoksycznie działała pochodna RAM-C4α. Na podstawie przedstawionych powyżej wyników

do dalszych badań wybrano 8 związków, dla których wartość IC50 była istotnie niższa

niż dla genisteiny. Związki wyeliminowane z dalszych analiz to RAM-2 i RAM-C-3α. Potwierdzono

ponadto, że większą radiowrażliwością cechowała się linia nowotworowa ludzkiego raka jelita

grubego.

III.2. Interakcje analizowanych związków z promieniowaniem jonizującym

W celu określenia czy badane pochodne genisteiny wykazują zdolność do zwiększania

cytotoksycznego efektu promieniowania jonizującego zastosowano test klonogenności. Porównano

efekt hamowania wzrostu komórek HCT116 i DU145 przez IR oraz badane związki pojedynczo

z efektem uzyskanym po zastosowaniu kombinacji obu tych czynników. Wyniki doświadczenia

pokazane są na rycinie III.1 (komórki HCT116) i na rycinie III.2 (komórki DU145).

Przedstawione wyniki pokazują, że połączone działanie badanych związków

i promieniowania jonizującego wywoływało silniejszy efekt cytotoksyczny, niż kiedy komórki

eksponowane były na działanie każdego z czynników (IR lub badany związek) oddzielnie. Jeżeli

odrzuci się wartości skrajne (uzyskane w wyniku ekspozycji komórek na największą dawkę

promieniowania i najwyższe zastosowanie stężenie badanego związku), to w przypadku komórek

HCT116 najsilniejszy efekt cytotoksyczny występował dla kombinacji pochodnej RAM-5

w stężeniach 2.5 oraz 5 μM z dawką IR odpowiednio 1 Gy lub 2 Gy.

Dla wszystkich pozostałych związków obserwowano poprawę efektu cytotoksycznego

kombinacji terapii w porównaniu do monoterapii, jednak w stopniu słabszym niż dla RAM-5.

Najsłabszy efekt cytotoksyczny występował w przypadku pochodnej RAM-5’ stosowanej

w kombinacji z promieniowaniem. Należy zaznaczyć, że dla pochodnych RAM-5 i RAM-C-4α

w kombinacji z promieniowaniem efekt cytotoksyczny występował już przy stężeniach zbliżonych

do wartości IC50 i niższych, natomiast dla pozostałych efekt występował dla stężeń przekraczających

wartość IC50.

W przypadku komórek DU145 najsilniejszy kombinowany efekt cytotoksyczny

obserwowano dla pochodnych RAM-5, RAM-2’, RAM-3’ oraz, przeciwnie niż w komórkach

HCT116, RAM-5’. Dla pozostałych związków poza G21 oraz RAM-C-5α obserwowano poprawę

efektu cytotoksycznego kombinacji terapii w porównaniu do monoterapii. Należy zaznaczyć,

że w przypadku pochodnych RAM-5 i RAM-2’ kombinowany efekt cytotoksyczny występował

już dla stężeń zbliżonych do wartości IC50 i niższych, natomiast dla pozostałych efekt występował

dla stężeń przekraczających tę wartość.

12

Rycina III.1. Przeżycie klonogenne komórek linii HCT116 po ekspozycji na genisteinę

lub jej pochodne pojedynczo lub w kombinacji z promieniowaniem. Komórkom podawano związki i/lub

promieniowanie jonizujące w stężeniach/dawkach o stałym współczynniku proporcjonalności. Komórki były

eksponowane na pochodne genisteiny przez 24 h przed napromienianiem. Ramkami zaznaczono najlepsze

osiągnięte efekty kombinacji.

Z porównania danych przedstawionych na rycinach III.1 i III.2 wynika,

że w badanych warunkach jedynie pochodne RAM-5 i RAM-3’ wykazywały silny kombinowany

efekt cytotoksyczny zarówno wobec komórek HCT116 jak i komórek DU145, przy czym jedynie

pochodna RAM-5 wykazywała kombinowany efekt toksyczny przy stężeniach zbliżonych

lub niższych niż wartość IC50. Należy zauważyć, że powyższe dane zaznaczają jedynie tendencję

osiąganych efektów, dlatego niezbędne było przeprowadzenie analizy uzyskanych wyników

w programie CalcuSyn.

W celu określenia jaki charakter (działanie addytywne lub synergistyczne) ma efekt łączenia

działania promieniowania jonizującego z pochodnymi genisteiny wyznaczono indeks kombinacji

metodą Chou-Talalaya korzystając z programu CalcuSyn. Wartości indeksu kombinacji (CI)

pozwalają określić rodzaj efektu kombinacji, i tak:

wartości CI powyżej 1.1 oznaczają antagonizm,

CI w zakresie 0.9-1.1 oznacza efekt addytywny,

CI w zakresie 0.7-0.9 wskazuje na słaby synergizm,

wartości CI poniżej 0.7 wskazują na istnienie synergizmu.

13

Rycina III.2. Przeżycie klonogenne komórek linii DU145 po ekspozycji na genisteinę

lub jej pochodne pojedynczo lub w kombinacji z promieniowaniem. Komórkom podawano związki i/lub

promieniowanie jonizujące w stężeniach/dawkach o stałym współczynniku proporcjonalności. Komórki były

eksponowane na pochodne genisteiny przez 24 h przed napromienianiem. Ramkami zaznaczono najlepsze

osiągnięte efekty kombinacji.

Wartości CI wyznaczane są w programie CalcuSyn dla poszczególnych efektów ED50, ED75,

ED90, czyli dla efektu wywołującego obniżenie potencjału klonogennego o kolejno 50%, 75% oraz

90%. Wyniki analizy efektu kombinacji dla komórek HCT116 przedstawiono w Tabeli III-3,

a dla komórek DU145 w Tabeli III-4.

Wartości indeksu kombinacji przedstawione w poniższych tabelach pokazują,

że synergistyczne, cytotoksyczne działanie promieniowania jonizującego i badanych związków

częściej występowało w odniesieniu do komórek raka gruczołu krokowego DU145 niż komórek raka

jelita grubego HCT116.

W przypadku komórek DU145 synergizm występował dla większości badanych związków

(wyjątkiem była genisteina i pochodna G21) przy wartościach dawki efektywnej ED75 i ED90.

Dla pochodnych RAM-5, RAM-2’, RAM-3’ i RAM-5’ synergizm można określić jako silny –

wartości indeksu kombinacji CI w zakresie od 0.15 (przy ED90) dla RAM-3’ do 0.36 (przy ED50)

dla RAM-5.

14

Tabela III-3. Wartości indeksu kombinacji (CI) dla interakcji związek-promieniowanie przy różnych efektach: ED50,

ED75, ED90 wyznaczone dla komórek nowotworowych linii HCT116. W tabeli przedstawiono średnie z co najmniej

trzech niezależnych eksperymentów wraz z odchyleniami standardowymi. Kolorem czerwonym zaznaczono

wartości wskazujące na synergizm, natomiast kolorem czarnym wartości wskazujące umiarkowany efekt

synergistyczny.

HCT116 CI ED50 ED75 ED90

GENISTEINA 1.4 ± 0.2 1.1 ± 0.1 0.9 ± 0.1

G21 0.7 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.6 ± 0.18

RAM-3 1.0 ± 0.6 0.9 ± 0.5 0.8 ± 0.5

RAM-5 0.8 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.5 ± 0.2

RAM-C-4α 1.2 ± 0.04 0.8 ± 0.1 0.6 ± 0.1

RAM-C-5α 1.2 ± 0.1 0.8 ± 0.1 0.6 ± 0.1

RAM-2' 1.1 ± 0.3 0.9 ± 0.2 0.7 ± 0.2

RAM-3' 1.2 ± 0.2 0.9 ± 0.1 0.7 ± 0.1

RAM-5' 1.5 ± 0.1 1.3 ± 0.1 1.1 ± 0.1

Tabela III-4. Wartości indeksu kombinacji (CI) dla interakcji związek-promieniowanie przy różnych efektach: ED50,

ED75, ED90 wyznaczone dla komórek nowotworowych linii DU145. W tabeli przedstawiono dane uzyskane

na podstawie obliczeń w programie CalcuSyn wraz z odchyleniami standardowymi. Wartości obliczone

na podstawie danych z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Kolorem zielonym zaznaczono wartości

wskazujące na silny synergizm, kolorem czerwonym synergizm.

DU145 CI ED50 ED75 ED90

GENISTEINA 1.2 ± 0.5 0.9 ± 0.3 0.8 ± 0.3

G21 1.1 ± 0.2 0.9 ± 0.2 0.8 ± 0.3

RAM-3 1.0 ± 0.5 0.6 ± 0.1 0.4 ± 0.1

RAM-5 0.7 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.0

RAM-C-4α 0.9 ± 0.2 0.7 ± 0.2 0.7 ± 0.3

RAM-C-5α 0.9 ± 0.2 0.6 ± 0.3 0.5 ± 0.3

RAM-2' 0.5 ± 0.1 0.3 ± 0.1 0.2 ± 0.0

RAM-3' 0.9 ± 0.3 0.3 ± 0.1 0.5 ± 0.1

RAM-5' 1.1 ± 0.1 0.4 ± 0.1 0.2 ± 0.1

Należy zauważyć, że w linii HCT116 (ale nie w DU145) zastosowanie kombinacji

testowanych związków z promieniowaniem jonizującym w większości przypadków powodowało

powstawanie antagonizmu przy ED50. Trzeba tutaj podkreślić, że, w przeciwieństwie to powyższej

tendencji, dwie pochodne, RAM-5 oraz G21, w niskich stężeniach nie działały antagonistycznie

w kombinacji z niskimi dawkami promieniowania, ale powodowały powstawanie efektów

addytywnych bądź słabo synergistycznych. Podkreślenia wymaga, że znaczący efekt synergistyczny

obserwowano także przy ED50 dla pochodnych RAM-2’ (CI = 0.5) i RAM-5 (CI = 0.7) w linii

DU145.

15

III.3. Hamowanie aktywności EGFR przez genisteinę i jej pochodne

Badania wstępne [47] wskazywały, że niektóre glikozydowe pochodne genisteiny mogą

hamować, w stopniu znacznie bardziej nasilonym niż genisteina, aktywność kinaz tyrozynowych,

w tym kinazy będącej przedmiotem badań niniejszej pracy doktorskiej, a mianowicie receptora

naskórkowego czynnika wzrostu, EGFR. Ponieważ najważniejszym mechanizmem aktywującym

tę kinazę, jest spowodowana jej oddziaływaniem z ligandem autofosforylacja [21], zatem kolejnym

etapem pracy doktorskiej było zbadanie czy i w jakim stopniu pochodne genisteiny mogą blokować

fosforylację EGFR.

Poziom fosforylacji EGFR badano z użyciem metody „western blot”. Otrzymane obrazy

poddano analizie densytometrycznej z zastosowaniem programu ImageJ (NIH, program pobrany

ze strony http://imagej.nih.gov/ij/, na podanej stronie internetowej znajduje się również opis

metodyki oraz zastosowania programu). Wartość intensywności sygnału odczytywano

z densytogramów, a wyniki z trzech niezależnych doświadczeń uśredniano. Wyniki analizy

przedstawione w postaci wykresów słupkowych znajdują się na rycinach III.3 i III.4.

Rycina III.3. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji przez 24 godziny

na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów

z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie

oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli

nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR = 100%). Ramkami zaznaczono najsilniejsze efekty

(spadek zawartości pEGFR o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej.

Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr 1173.

16

Rycina III.4. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach DU145 poddanych ekspozycji przez 24 godziny

na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów

z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie

oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli

nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR = 100%). Wszystkie stężenia podano w μM. Ramkami

zaznaczono najsilniejsze efekty (spadek zawartości pEGFR II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną

zaznaczono związek działający najwydajniej. Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr 1173.

Dwa spośród badanych związków, a mianowicie RAM-2’ oraz RAM-3’ nie hamowały

fosforylacji EGFR przy Tyr 1068 i Tyr 1173 w linii HCT116, a genisteina i pochodna

RAM-5’ hamowały fosforylację w stopniu umiarkowanym.

Związkiem o zdecydowanie najsilniejszej zdolności hamowania aktywności EGFR okazał

się RAM-5 wywołujący w obu liniach komórkowych spadek poziomu fosforylacji białka

przy obu badanych tyrozynach o połowę w najniższym zastosowanym stężeniu (100 nM). RAM-5

szczególnie silnie obniżał poziom fosforylacji EGFR przy tyrozynie 1173 – w stężeniu 20 µM o ok.

90% (w porównaniu do komórek kontrolnych). Należy podkreślić, że efekt hamowania fosforylacji

EGFR przez RAM-5 ujawniał się w stężeniach znacznie niższych od wartości IC50.

Pozostałe związki, a mianowicie RAM-3, RAM-C-4α, RAM-C-5α oraz G21 można uznać

za hamujące fosforylację EGFR w stopniu obiecującym. Pochodne te stosowane w stężeniach

przekraczających 2-4 krotnie wartość IC50 ograniczały poziom fosforylacji Tyr 1068 oraz Tyr 1173

w zakresie od około 50% do około 20% całkowitej aktywności. Należy podkreślić, że wszystkie

badane pochodne hamowały silniej fosforylację Tyr 1173 niż Tyr 1068, przeciwnie niż związek

macierzysty, genisteina. Związkiem o zdecydowanie najsilniejszej zdolności hamowania aktywności

17

EGFR w komórkach DU145 okazała się, tak jak w przypadku komórek HCT116, pochodna RAM-5,

przy czym pochodna ta w linii DU145 hamowała fosforylację Tyr 1068 i Tyr 1173 w równym stopniu.

Stosunkowo silne zahamowanie fosforylacji EGFR obserwowano po zastosowaniu pochodnej

RAM-3, dla której efekt hamowania ujawniał się, podobnie jak w przypadku pochodnej RAM-5,

już w stężeniach niższych od wartości IC50.

W badaniach równoległych pokazano, że żaden ze związków nie zmieniał w sposób istotny

poziomu ekspresji receptora (poziomu EGFR) w żadnej z badanych linii komórkowych. Tym samym

można założyć, że najbardziej prawdopodobną przyczyną zmniejszania się poziomu pEGFR

w komórkach traktowanych pochodnymi genisteiny jest hamowanie przez te pochodne aktywności

kinazowej związanej z tym receptorem.

III.4. Hamowanie indukowanej promieniowaniem jonizującym aktywacji EGFR

Porównanie wyników uzyskanych w doświadczeniach opisanych powyżej wskazywało

na to, że pochodna RAM-5 wywołująca najsilniejszy cytotoksyczny efekt synergistyczny

w kombinacji z IR, to związek, który został wcześniej wskazany jako najwydajniej hamujący poziom

fosforylacji EGFR. Z danych z piśmiennictwa wiadomo, że promieniowanie jonizujące może być

czynnikiem zwiększającym poziom aktywności EGFR [21-23]. Można było zatem sądzić, że jednym

z elementów mechanizmu uwrażliwiania badanych komórek na działanie IR może być hamowanie

aktywności EGFR. W świetle tych danych istotne było ustalenie czy te pochodne genisteiny, które

wykazują właściwość silnego uczulania komórek na działanie IR równocześnie powodują znaczące

obniżanie poziomu fosforylacji EGFR indukowanej IR. Aby to wyjaśnić wykonałam analizę „western

blot”, której celem było oznaczenie poziomu fosforylowanych form Tyr 1173 oraz Tyr 1068 EGFR

w komórkach traktowanych przez 24 h pochodnymi genisteiny, a napromienianych. Wyniki

przedstawiono w formie wykresów słupkowych na rycinach III.5 i III.6

W komórkach HCT116 poddanych działaniu promieniowania jonizującego w dawce

2 Gy, ale nietraktowanych badanymi związkami wzrasta poziom obu fosforylowanych form EGFR

w zakresie do około 30%, a w komórkach DU145 traktowanych IR w dawce 4 Gy nawet do około

50% w porównaniu do komórek nieeksponowanych na działanie promieniowania. Otrzymane wyniki

pokazują, że tak jak opisano w literaturze dla innych linii komórek nowotworowych,

i w tym przypadku zachodzi indukowana promieniowaniem aktywacja EGFR. Jeśli jednak przed

ekspozycją na IR komórki traktowane są genisteiną lub jej pochodnymi, wtedy, w zależności od linii

komórkowej i stosowanych dawek związku, poziom fosforylowanych form EGFR ulega obniżeniu

co najmniej do poziomu występującego w komórkach nietaktownych, a w przypadku kilku

pochodnych do poziomu poniżej 50% poziomu występującego w komórkach kontrolnych.

Porównując dane pokazane na rycinach III.3 z III.5 (komórki HCT116) oraz rycinach

III.4 z III.6 (komórki DU145) można zauważyć, że te same związki, które najefektywniej obniżały

poziom form Tyr 1173 oraz Tyr 1068 EGFR w komórkach HCT116 i DU145 w doświadczalnym

wariancie, w którym nie stosowano promieniowania jonizującego, były także skuteczne

w hamowaniu aktywności EGFR w komórkach napromienianych.

Jako związki najskuteczniej hamujące fosforylację EGFR w linii HCT116 wytypowano

RAM-5, G21 oraz RAM-3, które nie tylko zmniejszały zawartość fosforylowanej formy EGFR

(pEGFR) do poziomu komórek kontrolnych (nietraktowanych), ale powodowały jego spadek

18

do połowy tej wartości w zakresie stosowanych stężeń. Podobne efekty obserwowano w linii DU145

po zastosowaniu RAM-5, przy czym należy zaznaczyć, że po 24-godzinnej ekspozycji komórek

DU145 na tę pochodną, a następnie ich napromienianiu poziom pEGFR-Tyr 1068 spadał jedynie

do poziomu komórek nienapromienianych. Spośród pozostałych pochodnych jedynie RAM-C-5α

w najwyższych zastosowanych stężeniach wywoływał obniżenie zawartości pEGFR poniżej poziomu

komórek kontrolnych. Jedynym spośród badanych związków, który efektywnie obniżał indukowaną

promieniowaniem aktywność EGFR zarówno w komórkach HCT116 jak i DU145 był RAM-5.

Wyniki omawianego doświadczenia pokazują, że jednym z mechanizmów odpowiadającym

za właściwości radiouczulające pochodnej RAM-5 może być hamowanie aktywności kinazy EGFR

w komórkach HCT116 oraz DU145.

Rycina III.5. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach HCT116 poddanych ekspozycji

na genisteinę i jej pochodne przez 24 h, a następnie napromienionych (2 Gy). Przedstawiono wyniki analiz

densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych

eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane

do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR

= 100%). Wszystkie stężenia podano w μM. Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym

aktywność EGFR (spadek zawartości pEGFR o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek

działający najwydajniej. Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr 1173.

19

Rycina III.6. Analiza poziomu fosforylacji EGFR w komórkach DU145 poddanych ekspozycji

na genisteinę i jej pochodne przez 24 h, a następnie napromienionych (4 Gy). Przedstawiono wyniki analiz

densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot”. Z przynajmniej trzech niezależnych

eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane

do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pEGFR

= 100%). Wszystkie stężenia podano w μM. Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym

aktywność EGFR (spadek zawartości Pegfr o przynajmniej połowę). Legenda: pEGFR-Tyr 1068, pEGFR-Tyr

1173.

III.5. Hamowanie aktywności ścieżek przekazu sygnału zależnych od EGFR przez genisteinę

i jej pochodne

Oddziaływanie EGFR z ligandem aktywuje kilka cytoplazmatycznych szlaków sygnałowych

stymulujących procesy związane z proliferacją komórek, różnicowaniem, potencjałem migracyjnym

i przeżyciem. Szlakami sygnałowymi aktywowanymi w wyniku fosforylacji EGFR są między innymi

ścieżki sygnałowe RAS-RAF-MAPK oraz PI3K-AKT [24, 48, 49]. Jak pokazują dane literaturowe

konstytutywna aktywność ścieżek RAS-RAF-MAPK oraz PI3K-AKT spowodowana mutacjami w

genach K-RAS oraz PI3KCA może być przyczyną niepowodzenia w leczeniu z zastosowaniem

inhibitorów EGFR [50, 51]. Pożądaną właściwością pochodnych genisteiny, w kontekście ich

potencjalnego zastosowania jako inhibitorów EGFR, byłaby ich zdolność do hamowania kinaz

znajdujących się poniżej w szlaku przekazywania sygnału, w tym kinaz AKT i ERK 1/2. Należy przy

tym zauważyć, że wspomniane szlaki przekazu sygnału stanowią skomplikowaną sieć oddziaływań

20

pomiędzy ich poszczególnymi elementami, a zahamowanie aktywności EGFR jest tylko jednym

z wielu możliwych czynników modulujących aktywność kinaz AKT czy ERK 1/2.

W celu określenia czy zahamowanie fosforylacji EGFR przez testowane pochodne zmniejsza

aktywność szlaków zależnych od EGFR, zbadano poziom fosforylacji kinaz AKT oraz ERK 1/2

w komórkach inkubowanych przez 24 godziny z analizowanymi związkami. Jak w poprzednich

doświadczeniach posłużono się metodą „western blot” oraz densytometrii w programie ImageJ.

Wyniki analizy przedstawione w postaci wykresów słupkowych znajdują się na rycinach III.7

dla pAKT oraz III.8 dla pERK 1/2.

Rycina III.7. Analiza poziomu fosforylacji AKT w komórkach HCT116 oraz DU145 poddanych ekspozycji przez

24 godziny na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych wykonanych

na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów. Poszczególne słupki

obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek kontrolnych

w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pAKT = 100%). Ramkami zaznaczono

związki o najskuteczniejszym działaniu (obniżające aktywność AKT o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną

zaznaczono związek najefektywniejszy. Wszystkie stężenia podano w μM.

W przypadku komórek HCT116 tylko pochodna RAM-5 w zdecydowany sposób obniżała

poziom fosforylowanej formy kinazy AKT. Inną pochodną, która hamowała aktywację AKT, jednak

znacznie słabiej niż RAM-5, był związek G21. Spośród innych związków, które obniżały zawartość

pEGFR (RAM-C4α oraz RAM-C5α), żaden nie powodował istotnych zmian w poziomie

fosforylowanej (aktywnej) formy AKT. Inne związki, które nie hamowały aktywacji EGFR,

21

nie powodowały także zmian w poziomie aktywnej formy kinazy AKT. Interesujące jest,

że w przypadku traktowania komórek HCT116 pochodną RAM-5’ dochodziło do pobudzenia

aktywności kinazy AKT.

W przypadku komórek DU145, również tylko pochodna RAM-5 w zdecydowany sposób

obniżała poziom fosforylowanej formy kinazy AKT. Spośród innych związków, które

we wcześniejszych badaniach hamowały fosforylację EGFR (RAM-3, RAM-C-4α oraz RAM-C-5α)

jedynie RAM-3 i RAM-C4α hamowały aktywację kinazy AKT. Można także zauważyć, że inaczej

niż w przypadku komórek HCT116, również pochodna G21, jakkolwiek w stosunkowo wysokim

stężeniu, znacznie obniżała zawartość pAKT.

Rycina III.8. Analiza poziomu fosforylacji kinazy ERK 1/2 w komórkach HCT116 oraz DU145 poddanych

ekspozycji przez 24 godziny na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz densytometrycznych

wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych eksperymentów.

Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do poziomu białek

kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form pAKT = 100%). Ramkami

zaznaczono związki o najskuteczniejszym działaniu (obniżające aktywność ERK 1/2 o przynajmniej połowę).

Ramką czerwoną zaznaczono związek najefektywniejszy.

Jak wynika z danych zamieszczonych na rycinie III.8 badane pochodne zasadniczo

w podobny sposób hamują aktywność kinazy ERK 1/2 (pERK 1/2) i kinazy AKT (pAKT).

I w tym przypadku związkiem najwydajniej blokującym fosforylację ERK 1/2 okazała

22

się pochodna RAM-5. Pochodna RAM-5’, która niespodziewanie zwiększała poziom fosforylowanej

formy AKT w komórkach HCT116, nie wykazywała takiego efektu w stosunku do kinazy ERK 1/2.

Otrzymane dane wskazują także, że niektóre z pochodnych zwiększają aktywność kinazy ERK 1/2.

W przypadku komórek HCT116 obserwowałam wzrost zawartości pERK 1/2 po zastosowaniu

RAM-C-4α oraz RAM-5’, w przypadku DU145: RAM-C-4α, RAM-2’ oraz w mniejszym stopniu

RAM-5’. Związek RAM-5’ powodował również wzrost zawartości pAKT w linii HCT116.

III.6. Hamowanie aktywności topoizomerazy II przez genisteinę i jej pochodne

Genisteina, jako związek o działaniu plejotropowym oddziałuje z wieloma celami

molekularnymi. Do najważniejszych celów molekularnych w kontekście blokowania proliferacji

komórek nowotworowych należy, oprócz kinaz tyrozynowych, topoizomeraza II. Genisteina,

podobnie jak etopozyd, zaliczana jest do związków określanych jako „trucizny” topoizomerazy II.

Rycina III.9. Analiza zawartości niezwiązanej z DNA frakcji topoizomerazy II α oraz II β

w komórkach linii HCT116 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz

densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych

eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane

do poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form

topoizmoerazy II = 100%). Związki referencyjne użyte w doświadczeniu to etopozyd, genisteina oraz G21.

Ramkami zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym aktywność TOPO II (spadek zawartości niezwiązanej z DNA topoizomerazy II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający

najwydajniej.

23

Rycina III.10. Analiza zawartości niezwiązanej z DNA frakcji topoizomerazy II α oraz II β

w komórkach linii DU145 poddanych ekspozycji na genisteinę i jej pochodne. Przedstawiono wyniki analiz

densytometrycznych wykonanych na podstawie obrazów z „western blot” z przynajmniej trzech niezależnych

eksperymentów. Poszczególne słupki obrazują wartości średnie oraz odchylenia standardowe normalizowane do

poziomu białek kontrolnych w odniesieniu do kontroli nietraktowanej (dla której poziom badanych form

topoizomerazy = 100%). Związki referencyjne użyte w doświadczeniu to etopozyd, genisteina oraz G21. Ramkami

zaznaczono związki o najlepszym efekcie hamującym aktywność TOPO II (spadek zawartości niezwiązanej z DNA

topoizomerazy II o przynajmniej połowę). Ramką czerwoną zaznaczono związek działający najwydajniej.

Genisteina podana komórkom przyłącza się do związanej kowalencyjnie z DNA

topoizomerazy II tworząc potrójny kompleks (ang. ternary complex). W ten sposób genisteina

blokuje etap łączenia przeciętych nici DNA (faza ligacji) prowadząc do powstania podwójnych

pęknięć w nici DNA, a to z kolei może prowadzić do śmierci komórek [52, 53].

We wcześniejszych badaniach wykazano, że pochodna G21 wykazuje właściwość inhibitora

TOPO II (Gogler-Pigłowska et al., 2012). Można było zatem oczekiwać, że także inne pochodne

badane w niniejszej pracy również mogą wykazywać właściwość trucizn topoizomerazy.

W celu określenia wpływu wprowadzonych do cząsteczki genisteiny modyfikacji

na jej zdolność do hamowania aktywności TOPO II zastosowano test „immunoband depletion”,

a otrzymane obrazy poddawano densytometrii. Wyniki opracowane jak poprzednio przedstawiono

24

na rycinach III.9 (komórki HCT116) oraz III.10 (komórki DU145). Jak wykazałam wpływ badanych

związków na aktywność TOPO II α i TOPO II β jest w komórkach HCT116 i DU145 podobny.

W obu liniach spośród związków referencyjnych najsilniejsze działanie hamujące aktywność

topoizomerazy II wykazał etopozyd, lek rutynowo stosowany w leczeniu przeciwnowotworowym.

Genisteina i G21 hamowały aktywność topoizomerazy II, jednak istotny efekt pojawiał się jedynie,

jeśli związki te były stosowane w najwyższych badanych stężeniach. Spośród testowanych

pochodnych genisteiny jedynie RAM-5 wykazywał silny efekt hamujący aktywność TOPO II, przy

czym silniejszy w odniesieniu do formy β. Stosunkowo niskie stężenia RAM-5 (5 μM), przy których

zahamowanie aktywności TOPOII jest znaczące wskazują, że pochodna ta może być rozważana jako

interesujący obiekt dalszych badań przedklinicznych. Inne badane pochodne genisteiny nie wpływały

na aktywność żadnej z form topoizomerazy II lub obserwowany efekt hamujący był nieznaczny.

III.7. Podsumowanie wyników badań

Pochodnymi najsłabiej działającymi na wybrane do badań cele molekularne była grupa

związków O-glikozydowych podstawionych grupą ramnalową przy węglu C-4’. W przypadku

związków tej serii obserwowano ponadto pogarszanie się właściwości cytotoksycznych wraz z

wydłużaniem łącznika węglowego w cząsteczce. Pochodne te nie hamowały aktywności ani EGFR,

ani zależnych od niego szlaków sygnałowych, jak również TOPO II. Mimo to w przypadku komórek

linii DU145 działały synergistyczne z promieniowaniem jonizującym. Efekt ten musiał zatem zależeć

od działania tych pochodnych na inne cele molekularne niż badane w niniejszej pracy doktorskiej.

Pochodne O-glikozydowe podstawione przy węglu C-7 modulowały aktywność EGFR

zarówno samodzielnie, jaki i w kombinacji z IR znacząco efektywniej w komórkach linii HCT116

niż w komórkach linii DU145. Z drugiej strony to w linii DU145 po zastosowaniu pochodnych

genisteiny osiągnięto efekty silnie synergistyczne, podczas gdy w linii HCT116 jedynie

synergistyczne. Efekt działania pochodnych C-glikozydowych (RAM-C-4α, RAM-C-5α) można

ocenić jako umiarkowany, jednak słabszy niż ich analogów O-glikozydowych (RAM-3, RAM-5).

Spośród pochodnych obniżających aktywność EGFR w obu liniach komórkowych (RAM-3, RAM-

5, RAM-C-4α, RAM-C-5α) jednie RAM-5 hamował także aktywność kinaz znajdujących się poniżej

w szlaku sygnałowym zależnym od EGFR, również w linii HCT116, w której szlaki sygnałowe AKT

oraz MAPK są konstytutywnie aktywne ze względu na występowanie mutacji w genach K-RAS oraz

PI3KCA. Najważniejsze wyniki badań prowadzonych w ramach niniejszej pracy doktorskiej zostały

podsumowane w tabelach IV-5 (komórki HCT116) oraz IV-6 (komórki DU145).

Szczególnie ważnym wynikiem niniejszej pracy jest informacja, że RAM-5 pozwala na

uzyskanie istotnego efektu synergistycznego w kombinacji z promieniowaniem jonizującym już w

stężeniu 5 μM, które jest możliwe do osiągnięcia w osoczu krwi, przy założeniu, że cząsteczka RAM-

5 jest stabilna i nie ulega degradacji podczas obiegu w układzie krążenia. Dane literaturowe pokazują,

że cytotoksyczność związków radiouczulających wobec komórek nowotworowych in vitro jest

zróżnicowana i ujawnia się w zakresie stężeń od nanomolarnych do mikromolarnych [54-59].

Stężenia efektywne RAM-5 mieszczą się w zakresie stężeń mikromolarnych, co pozwala

zaklasyfikować związek do kandydatów na leki o umiarkowanych właściwościach cytotoksycznych.

25

Tabela III-1. Tabela podsumowuje dane uzyskane ze wszystkich eksperymentów dla komórek HCT116. Dla efektu wywoływanego przez pochodne na białka

zastosowano następujący opis: - oznaczał stymulację, 0 brak efektu, + inhibicję aktywności białka bądź obniżanie jego poziomu (pożądany efekt), większa ilość

plusów bądź minusów określała arbitralnie siłę efektu. Dla białek badanych w kombinacji z promieniowaniem zastosowano odniesienie do komórek

napromienionych oraz komórek kontrolnych nietraktowanych*”. Efekty kombinacji opisano w następujący sposób: - antagonizm, 0 efekt addytywny, + słaby

synergizm, + + synergizm, + + + silny synergizm (wartości liczbowe CI podane w „Materiałach i Metodach”, podrozdział III.8, tabela III-4).

*( 0 / - oznacza, że związek nie obniżał poziomu białka w porównaniu do komórek napromienionych („0”) / poziom białka był większy niż w komórkach

nietraktowanych (brak efektu „-”))

+ / 0 oznacza, że związek obniżał poziom białka w porównaniu do komórek napromienionych (efekt „+”) / do poziomu białka odpowiadającego jego zawartości

w komórkach kontrolnych „0”)

ZWIĄZEK IC50 EGFR pEGFR-

Tyr 1068 pEGFR-

Tyr 1173 pEGFR-Tyr

1068 + IR pEGFR-Tyr

1173 + IR pAKT pERK 1/2 TOPO II α TOPO II β

EFEKT Z IR

ED50/ED75/ED90

GENISTEIN 31.30 ± 5.47 0 + 0 + / 0 + / 0 0 0 + + + - / 0 / 0

G21 1.24 ± 0.34 0 + + + + + + /

+ + +

+ + + /

+ + + + + + + + + + + + + / + + / + +

RAM-3 2.63 ± 1.52 0 + + + + + + + + + /

+ + +

+ + + /

+ + 0 0 0 słaby + 0 / 0 / +

RAM-5 5.89 ± 0.07 0 + + + + + + + + + + + + /

+ + +

+ + + + /

+ + + + + + + + + + + + + + 0 / + + / + +

RAM-2’ 3.32 ± 0.88 0 0 0 0 / - 0 / - 0 0 0 0 0 / 0 / + +

RAM-3’ 13.17 ± 0.94 0 0 0 0 / - + / 0 0 0 0 0 - / 0 / +

RAM-5’ 7.00 ± 0.06 0 0 0 0 / - 0 / - - 0 - 0 - / - / 0

RAM-C-4α 6.52 ± 0.79 0 + + + + / słaby + +/słaby + 0 + 0 0 - / + / + +

RAM-C-5α 12.54 ± 3.16 0 + + + + + + / słaby + +/słaby + 0 0 - 0 - / + / + +

26

Tabela III-2. Tabela podsumowuje dane uzyskane ze wszystkich eksperymentów dla komórek DU145. Dla efektu wywoływanego przez pochodne na białka

zastosowano następujący opis: - oznaczał stymulację, 0 brak efektu, + inhibicję aktywności białka bądź obniżanie jego poziomu (pożądany efekt), większa ilość

plusów bądź minusów określała arbitralnie siłę efektu. Dla białek badanych w kombinacji z promieniowaniem zastosowano odniesienie do komórek

napromienionych oraz komórek kontrolnych nietraktowanych*”. Efekty kombinacji opisano w następujący sposób: - antagonizm, 0 efekt addytywny, + słaby

synergizm, + + synergizm, + + + silny synergizm (wartości liczbowe CI podane w „Materiałach i Metodach”, podrozdział III.8, tabela III-4).

*( 0 / - oznacza, że związek nie obniżał poziomu białka w porównaniu do komórek napromienionych („0”) / poziom białka był większy niż w komórkach

nietraktowanych (brak efektu „-”))

+ / 0 oznacza, że związek obniżał poziom białka w porównaniu do komórek napromienionych (efekt „+”) / do poziomu białka odpowiadającego jego zawartości

w komórkach kontrolnych „0”)

ZWIĄZEK IC50 EGFR pEGFR-

Tyr 1068 pEGFR-

Tyr 1173 pEGFR-Tyr

1068 + IR pEGFR-Tyr

1173 + IR pAKT pERK ½ TOPO II α TOPO II β

EFEKT Z IR

ED50/ED75/ED90

GENISTEINA 35.02 ± 8.77 0 0 Słaby + + / 0 * + / 0 0 0 + + + + - / 0 /+

G21 2.96 ± 0.28 0 + + Słaby + 0 / - * + / 0 + + + + + + - / 0 / +

RAM-3 10.97 ± 5.92 0 + + + + + + 0 / - + + / + + 0 0 słaby + 0 / + + / + +

RAM-5 10.95 ± 2.03 0 + + + + + + + + + / 0 + + / + + + + + + + + + + + + + / + + + / + + +

RAM-2’ 5.08 ± 0.45 0 0 - + / 0 0 / - 0 - 0 0 + + / + + + / + + +

RAM-3’ 18.86 ± 5.14 0 0 0 0 / - + / 0 0 0 0 0 0 / + + + / + + +

RAM-5’ 6.70 ± 0.81 0 0 0 0 / - 0 / - - 0 - 0 0 / + + + / + + +

RAM-C-4α 3.82 ± 1.00 0 + + + + / 0 + + / + + - 0 0 + / + + / + +

RAM-C-5α 11.49 ± 4.27 0 + + + + / 0 + / 0 0 0 - 0 0 / + / + +

27

Jeśli brak toksyczności ogólnoustrojowej zostanie potwierdzony w badaniach in vivo,

pochodna ta może być brana pod uwagę jako związek korzystniejszy niż większość stosowanych

chemoterapeutyków o wysokiej toksyczności systemowej, których aplikowanie odbywa

się z przerwami, co wydłuża okres terapii. Podkreślenia wymaga, że równolegle prowadzone

badania w Katedrze Chemii Organicznej, Bioorganicznej i Biotechnologii Wydziału Chemicznego

Politechniki Śląskiej pozwoliły na opracowanie nowej, prostszej syntezy związku RAM-5

(prof. Wiesław Szeja, dr Piotr Świerk, informacja ustna).

W podsumowaniu należy podkreślić, że w przypadku pochodnych testowanych w niniejszej

pracy nie udało się dotychczas określić zależności struktura-aktywność, czyli przypisać

określonych właściwości biologicznych konkretnemu, pojedynczemu parametrowi w strukturze

chemicznej związków. Nawet niewielkie różnice w budowie związku, na przykład długość

łącznika, czy wystąpienie różnych atomów mogą powodować powstanie odmiennych efektów

biologicznych o różnym nasileniu. Złożoność problemu rośnie również w wyniku obserwacji,

że efekt biologiczny wywoływany przez pochodne jest specyficzny względem linii komórkowych.

Podobne trudności w określeniu SAR zdarzały się już uprzednio dla rozmaitych związków [60, 61].

Jednak, pomimo powyższych trudności, badania poniższej pracy pozwoliły na wytypowanie

związku o potencjalnej przydatności klinicznej. Powyżej przedstawione wyniki badań dają również

podstawy do rozpoczęcia badań in vivo pochodnej RAM-5.

IV. WNIOSKI

1. Stosowanie pochodnych genisteiny w kombinacji z promieniowaniem jonizującym jest strategią

racjonalną umożliwiającą osiągnięcie efektów synergistycznych w liniach komórkowych

HCT116 i DU145.

2. Pochodna RAM-5 jest najskuteczniejszym związkiem promieniouwrażliwiającym komórki

nowotworowe linii HCT116 oraz linii DU145. RAM-5 działa plejotropowo, wywołuje

zahamowanie aktywności EGFR, kinazy AKT, kinazy ERK1/2, oraz topoizomerazy II.

Wszystkie obserwowane efekty RAM-5 wywołuje przy najniższych wartościach stężeń

w porównaniu do pozostałych pochodnych: 5 μM.

3. Dla pochodnych podstawionych przy węglu C-7 istnieje zależność pomiędzy zdolnością

do hamowania aktywności EGFR a zwiększaniem cytotoksycznego wpływu promieniowania

jonizującego na komórki nowotworowe w komórkach linii HCT116. Silniejszy synergizm

obserwuje się dla związków wydajniej hamujących fosforylację EGFR. Podobnej korelacji nie

obserwuje się w komórkach linii DU145.

4. Dla pochodnych cukrowych podstawionych przy węglu C-4’ nie obserwuje się zdolności

do hamowania aktywności EGFR. Uzyskane efekty silnie synergistyczne w kombinacji

z promieniowaniem jonizującym w komórkach linii DU145 muszą zależeć od innych

mechanizmów.

5. Tylko dwie pochodne hamują aktywność topoizomerazy II indukując kowalencyjne kompleksy

enzymu z DNA: G21 oraz RAM-5 w obu badanych liniach komórkowych.

6. Pochodna wytypowana do dalszych badań in vivo jako najskuteczniejsza substancje

o potencjalnym zastosowaniu jak lek radiouwrażliwiający to RAM-5.

28

V. BIBLIOGRAFIA

1. Seiwert, T.Y., J.K. Salama, and E.E. Vokes, The concurrent chemoradiation paradigm--general principles. Nat Clin Pract

Oncol, 2007. 4(2): p. 86-100.

2. Li, F., C. Zhao, and L. Wang, Molecular-targeted agents combination therapy for cancer: developments and potentials. Int J

Cancer, 2014. 134(6): p. 1257-69.

3. Ravaud, A., M. Gross-Goupil, and J. Bellmunt, Combination therapy in metastatic renal cell cancer. Semin Oncol, 2013.

40(4): p. 472-81.

4. Uzoigwe, J. and E.R. Sauter, Cancer prevention and treatment using combination therapy with plant- and animal-derived

compounds. Expert Rev Clin Pharmacol, 2012. 5(6): p. 701-9.

5. Hao, F., et al., Neem components as potential agents for cancer prevention and treatment. Biochim Biophys Acta, 2014.

1846(1): p. 247-257.

6. Hazra, B., et al., The prospective role of plant products in radiotherapy of cancer: a current overview. Front Pharmacol, 2011.

2: p. 94.

7. Gupta, C. and D. Prakash, Phytonutrients as therapeutic agents. J Complement Integr Med, 2014.

8. Vinod, B.S., T.T. Maliekal, and R.J. Anto, Phytochemicals as chemosensitizers: from molecular mechanism to clinical

significance. Antioxid Redox Signal, 2013. 18(11): p. 1307-48.

9. Eke, I., et al., EGFR/JIP-4/JNK2 signaling attenuates cetuximab-mediated radiosensitization of squamous cell carcinoma

cells. Cancer Res, 2013. 73(1): p. 297-306.

10. Perri, F., et al., Radioresistance in head and neck squamous cell carcinoma: Biological bases and therapeutic implications.

Head Neck, 2014.

11. Miura, K., et al., The combination of olaparib and camptothecin for effective radiosensitization. Radiat Oncol, 2012. 7: p. 62.

12. Zhang, Y., et al., Synergistic effect of combination topotecan and chronomodulated radiation therapy on xenografted human

nasopharyngeal carcinoma. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 2013. 87(2): p. 356-62.

13. Messing, E., et al., A phase 2 cancer chemoprevention biomarker trial of isoflavone G-2535 (genistein) in presurgical bladder

cancer patients. Cancer Prev Res (Phila), 2012. 5(4): p. 621-30.

14. Bandele, O.J. and N. Osheroff, The efficacy of topoisomerase II-targeted anticancer agents reflects the persistence of drug-

induced cleavage complexes in cells. Biochemistry, 2008. 47(45): p. 11900-8.

15. Mizushina, Y., et al., Inhibitory effects of a major soy isoflavone, genistein, on human DNA topoisomerase II activity and

cancer cell proliferation. Int J Oncol, 2013. 43(4): p. 1117-24.

16. Cui, S., N. Wienhoefer, and U. Bilitewski, Genistein induces morphology change and G2/M cell cycle arrest by inducing p38

MAPK activation in macrophages. Int Immunopharmacol, 2014. 18(1): p. 142-50.

17. Liu, X., et al., Genistein enhances the radiosensitivity of breast cancer cells via G(2)/M cell cycle arrest and apoptosis.

Molecules, 2013. 18(11): p. 13200-17.

18. Hillman, G.G., et al., Differential effect of soy isoflavones in enhancing high intensity radiotherapy and protecting lung tissue

in a pre-clinical model of lung carcinoma. Radiother Oncol, 2013. 109(1): p. 117-25.

19. Aravindan, S., et al., Molecular basis of 'hypoxic' breast cancer cell radio-sensitization: phytochemicals converge on radiation

induced Rel signaling. Radiat Oncol, 2013. 8: p. 46.

20. Hwangbo, W., et al., EGFR Gene Amplification and Protein Expression in Invasive Ductal Carcinoma of the Breast. Korean

J Pathol, 2013. 47(2): p. 107-15.

21. Nijkamp, M.M., et al., Interaction of EGFR with the tumour microenvironment: implications for radiation treatment.

Radiother Oncol, 2013. 108(1): p. 17-23.

22. Bai, J., X.G. Guo, and X.P. Bai, Epidermal growth factor receptor-related DNA repair and radiation-resistance regulatory

mechanisms: a mini-review. Asian Pac J Cancer Prev, 2012. 13(10): p. 4879-81.

23. Baumann, M., et al., EGFR-targeted anti-cancer drugs in radiotherapy: preclinical evaluation of mechanisms. Radiother

Oncol, 2007. 83(3): p. 238-48.

24. Roskoski, R., Jr., ErbB/HER protein-tyrosine kinases: Structures and small molecule inhibitors. Pharmacol Res, 2014. 87c:

p. 42-59.

25. Baldwin, E.L. and N. Osheroff, Etoposide, topoisomerase II and cancer. Curr Med Chem Anticancer Agents, 2005. 5(4): p.

363-72.

26. Chikamori, K., et al., DNA topoisomerase II enzymes as molecular targets for cancer chemotherapy. Curr Cancer Drug

Targets, 2010. 10(7): p. 758-71.

27. Fortune, J.M. and N. Osheroff, Topoisomerase II as a target for anticancer drugs: when enzymes stop being nice. Prog Nucleic

Acid Res Mol Biol, 2000. 64: p. 221-53.

28. McClendon, A.K. and N. Osheroff, DNA topoisomerase II, genotoxicity, and cancer. Mutat Res, 2007. 623(1-2): p. 83-97.

29. Bailly, C., Contemporary challenges in the design of topoisomerase II inhibitors for cancer chemotherapy. Chem Rev, 2012.

112(7): p. 3611-40.

30. Pogorelcnik, B., A. Perdih, and T. Solmajer, Recent developments of DNA poisons--human DNA topoisomerase IIalpha

inhibitors--as anticancer agents. Curr Pharm Des, 2013. 19(13): p. 2474-88.

31. Pogorelcnik, B., A. Perdih, and T. Solmajer, Recent advances in the development of catalytic inhibitors of human DNA

topoisomerase IIalpha as novel anticancer agents. Curr Med Chem, 2013. 20(5): p. 694-709.

29

32. Simons, A.L., et al., Greater apparent absorption of flavonoids is associated with lesser human fecal flavonoid disappearance

rates. J Agric Food Chem, 2010. 58(1): p. 141-147. .

33. Rusin, A. and Z. Krawczyk, Genistein Derivatization - From a Dietary Supplement to a Pharmaceutical Agent. 2011: INTECH

Open Access Publisher.

34. Rusin, A., et al., Unsaturated genistein disaccharide glycoside as a novel agent affecting microtubules. Bioorg Med Chem

Lett, 2009. 19(17): p. 4939-43.

35. Gogler-Piglowska, A., et al., Aneugenic effects of the genistein glycosidic derivative substituted at C7 with the unsaturated

disaccharide. Cell Biol Toxicol, 2012. 28(5): p. 331-42.

36. Jhawer, M., et al., PIK3CA Mutation/PTEN Expression Status Predicts Response of Colon Cancer Cells to the Epidermal

Growth Factor Receptor Inhibitor Cetuximab. Cancer Research, 2008. 68(6): p. 1953-1961.

37. Sahlberg, S.H., et al., Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and

radiation resistance in colon cancer cells. PLoS One, 2014. 9(4): p. e94621.

38. Pignon, J.-C., et al., Androgen Receptor Controls EGFR and ERBB2 Gene Expression at Different Levels in Prostate Cancer

Cell Lines. Cancer Research, 2009. 69(7): p. 2941-2949.

39. Kobunai, T., T. Watanabe, and T. Fukusato, REG4, NEIL2, and BIRC5 gene expression correlates with gamma-radiation

sensitivity in patients with rectal cancer receiving radiotherapy. Anticancer Res, 2011. 31(12): p. 4147-53.

40. Jayakumar, S., et al., Differential response of DU145 and PC3 prostate cancer cells to ionizing radiation: role of reactive

oxygen species, GSH and Nrf2 in radiosensitivity. Biochim Biophys Acta, 2014. 1840(1): p. 485-94.

41. Antonarakis, E.S., M.A. Carducci, and M.A. Eisenberger, Novel targeted therapeutics for metastatic castration-resistant

prostate cancer. Cancer Lett, 2010. 291(1): p. 1-13.

42. Glynne-Jones, R., S. Mawdsley, and M. Harrison, Cetuximab and chemoradiation for rectal cancer--is the water getting

muddy? Acta Oncol, 2010. 49(3): p. 278-86.

43. Li, Z., et al., Heterogeneity in primary colorectal cancer and its corresponding metastases: a potential reason of EGFR-

targeted therapy failure? Hepatogastroenterology, 2011. 58(106): p. 411-6.

44. Chou, T.C., Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Res, 2010.

70(2): p. 440-6.

45. Chou, T.C. and P. Talalay, Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme

inhibitors. Adv Enzyme Regul, 1984. 22: p. 27-55.

46. Duffy, C., K. Perez, and A. Partridge, Implications of phytoestrogen intake for breast cancer. CA Cancer J Clin, 2007. 57(5):

p. 260-77.

47. Gruca, A., Zmiana poziomu fosforylacji kinazy tyrozynowej EGFR w komórkach nowotworowych poddanych działaniu

pochodnych genisteiny i promieniowania jonizującego. Uniwersytet Śląski. Wydział Biologii i Ochrony Środowiska. Praca

magisterska, 2009.

48. Kalman, B., et al., Epidermal growth factor receptor as a therapeutic target in glioblastoma. Neuromolecular Med, 2013.

15(2): p. 420-34.

49. Okamoto, I., Epidermal growth factor receptor in relation to tumor development: EGFR-targeted anticancer therapy. Febs j,

2010. 277(2): p. 309-15.

50. Sartore-Bianchi, A., et al., Frattini M, Siena S, Bardelli A. PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical

resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies. Cancer Res, 2009. 69(5): p. 1851-1857.

51. Berg, M. and K. Soreide, EGFR and downstream genetic alterations in KRAS/BRAF and PI3K/AKT pathways in colorectal

cancer: implications for targeted therapy. Discov Med, 2012. 14(76): p. 207-214.

52. Pommier, Y., et al., DNA Topoisomerases and Their Poisoning by Anticancer and Antibacterial Drugs. Chemistry & Biology.

17(5): p. 421-433.

53. Ketron, A. and N. Osheroff, Phytochemicals as anticancer and chemopreventive topoisomerase II poisons. Phytochemistry

Reviews, 2014. 13(1): p. 19-35.

54. Brassesco, M.S., et al., Activator Protein-1 Inhibition by 3-[(Dodecylthiocarbonyl)Methyl]-Glutamaride Impairs Invasion and

Radiosensitizes Osteosarcoma Cells In Vitro. Cancer Biother Radiopharm, 2013.

55. Bridges, K.A., et al., Niraparib (MK-4827), a novel poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitor, radiosensitizes human lung and

breast cancer cells. Oncotarget, 2014. 5(13): p. 5076-86.

56. Merle, P., et al., Telomere targeting with a new G4 ligand enhances radiation-induced killing of human glioblastoma cells.

Mol Cancer Ther, 2011. 10(10): p. 1784-95.

57. Song, C.W., et al., Metformin kills and radiosensitizes cancer cells and preferentially kills cancer stem cells. Sci Rep, 2012.

2: p. 362.

58. Zaidi, S., et al., The HSP90 inhibitor NVP-AUY922 radiosensitizes by abrogation of homologous recombination resulting in

mitotic entry with unresolved DNA damage. PLoS One, 2012. 7(4): p. e35436.

59. Zhou, Y., et al., Histone deacetylase inhibitor, valproic acid, radiosensitizes the C6 glioma cell line. Oncol Lett, 2014. 7(1):

p. 203-208.

60. Soobrattee, M.A., et al., Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: mechanism and actions. Mutat Res, 2005.

579(1-2): p. 200-13.

61. Romier, B., et al., Modulation of signalling nuclear factor-kappaB activation pathway by polyphenols in human intestinal

Caco-2 cells. Br J Nutr, 2008. 100(3): p. 542-51.

30

VI. DOROBEK NAUKOWY

Publikacje

1. Gruca A, Krawczyk Z, Szeja, W, Grynkiewicz G, Rusin A. 2014. Synthetic genistein glycosides inhibiting EGFR

phosphorylation enhance the effect of radiation in HCT 116 colon cancer cells. Molecules, 19(11):18558-73.

2. Byczek A, Zawisza-Puchalka J, Gruca A, Papaj K, Grynkiewicz G, Rusin M, Szeja W, Rusin A. 2013. Genistein

derivatives regioisomerically substituted at 7-O- and 4-O- have different effect on the cell cycle. Journal of Chemistry,

2013, ID 191563.

3. Rusin A, Zawisza-Puchałka J, Kujawa K, Gogler-Pigłowska A, Wietrzyk J, Switalska M, Głowala-Kosińska M,

Gruca A, Szeja W, Krawczyk Z, Grynkiewicz G. 2011. Synthetic conjugates of genistein affecting proliferation and

mitosis

of cancer cells. Bioorg Med Chem 19: 295-305.

4. Rusin A, Gogler A, Głowala-Kosińska M, Bochenek D, Gruca A, Grynkiewicz G, Zawisza J, Szeja W, Krawczyk Z.

2009. Unsaturated genistein disaccharide glycoside as a novel agent affecting microtubules. Bioorg Med Chem Lett

19: 4939-43.

Doniesienia konferencyjne

1. Gruca A. Genistein derivatives as radiosensitizers of tumor cells. Projekt „Śląska BIO-FARMA. Centrum

Biotechnologii, Bioinżynierii i Bioinformatyki”. Szczyrk, Poland, March, October 17-19, 2014.

2. Gruca A, Mucha A, Miczka A, Szeja W, Krawczyk Z, Aleksandra Rusin. Genistein derivative RAM-5 acts

as radiosensitizer in cancer cel lines through EGFR and topoisomerase II activation inhibition. 16th Gliwice Scientific

Meetings, Gliwice, Poland, November 15-17, 2013.

3. Mucha A, Gruca A, Szeja W, Krawczyk Z, Rusin A. The influence of genistein glycoconjugates

on signalling pathawys dependent on EGFR. 17th Gliwice Scientific Meetings, Gliwice, Poland, November 15-16,

2013

4. Gruca A. Analysis of the modulation of intracellular pathways by genistein and its derivatives. Projekt „Śląska

BIO-FARMA. Centrum Biotechnologii, Bioinżynierii i Bioinformatyki” Bochnia, Poland, March, 8-10, 2013.

5. Gruca A, Zawisza-Puchalka J, Szeja W, Krawczyk Z, Rusin A. Genistein derivatives decrease EGFR

autophosphorylation elicited by ionizing irradiation. 15th Gliwice Scientific Meetings, Gliwice, Poland, November

18-19, 2011.

6. Byczek A, Zawisza-Puchalka J, Gruca A, Siepetowska K, Ludwik K, Szeja W, Krawczyk Z, Rusin A. Substitution

of genistein at C4’ vs. C7 position renders different effect on cell cycle. 15th Gliwice Scientific Meetings, Gliwice,

Poland, November 18-19, 2011.

7. Gruca A, Rusin A, Gogler-Pigłowska A, Zawisza-Puchałka J, Szeja W, Krawczyk Z. Prevention

of EGFR autophosphorylation by new genistein derivatives in HCT 116 and DU 145 cells treated with ionizing

radiation. 14th International Congress of Radiation Research, Warsaw, Poland, August-September 28-1, 2011.

8. Gogler A, Rusin A, , Głowala-Kosińska M, Kędzior K., Gruca A, Zawisza J, Szeja W, Grynkiewicz G, Krawczyk Z.

In vitro antiproliferative activity of a series of novel genistein glycoconjugates against humar cancer cell lines. 34th

FEBS Congress, Prague, Czech Republic July 4-9, 2009.

9. Rusin A, Gogler A, Gruca A, Bochenek D, Zawisza J, Szeja W, Grynkiewicz G, Krawczyk Z. Genistein derivatives

potentiate inhibition of cancer cells growth by irradiation. 34th FEBS Congress Prague, Czech Republic, July 4-9,

2009.

10. Rusin A, Gogler A, Głowala-Kosińska M, Kędzior K, Gruca A, Grynkiewicz G, Zawisza J, Szeja W, Krawczyk Z.

Synthesis and antitumor potential of glycoconiugates. XLIV Annual Meeting of the Polish Biochemical Society, Lodz,

Poland, September 16-19, 2009.

Udział w grantach

1. Wykonawca w grancie PBZ MNiL-/1/2005.

Nagrody i wyróżnienia

1. Stypendium finansowane z funduszy European Union under European Social Fund - "DoktoRIS – Program

stypendialny na rzecz innowacyjnego Śląska".

2. Stypendium kofinansowane z European Union under European Social Fund - UDA-POKL.04.01.01-00-114/09-01.