Polymerase Chain Reaction

Biovetenskap och teknik

Ht-10

Annica Nordvall Bodell

Annica.Nordvall@ki.se

Polymerase Chain Reaction

• Kary Mullis f.1944

• Presenterade PCR i Science 1985

• Nobelpriset i kemi 1993

Vad är PCR?

• Kopieringsmaskin för DNA?

• Kan påvisa att ett prov innehåller en viss gen

Varför var PCR revolutionerande?

• Kan kopiera EN SPECIFIK DNA-sekvens bland tusen andra gener

• Snabb (jämfört med genkloning)

• Känslig kan detektera DNA från enstaka celler

• Robust kan detektera DNA från fossila prover

Repetition: syntes av ny sträng

• Templat: ssDNA som fungerar som mall för den nya strängen

• Primer: för att starta DNA-syntesen

• Nukleotider(dNTP´s): utgör ”byggstenar” i DNA

• DNA-polymeras: enzym som bildar fosfodiesterbindning mellan 5´P och 3´OH

Vad behöver man i röret?

• Templat (prov med DNA)

• Forward primer (startsekvens)

• Reverse primer (startsekvens)

• dNTP´s (byggstenar)

• Taq DNA polymeras

• Buffert, salter

Nukleotider

Primers

Polymeras

Buffer

SaltDNA

Vad händer i röret?

Tre steg:

• Denaturering95oC

• Annealing av primers55-70oC

• Syntes av ny sträng72oC

Detta upprepas 20-30 ggrwww.ib.usp.br/evolucao/QTL/pcr.GIF

Två primers behövs

TaqTaq TaqTaq

Riktning på extension

Riktning på extension3’ reverse Primer

5’ forward Primer

DNA templat

• Forward primer– Hybridiserar uppströms om genen

• Reverse primer– Hybridiserar nedströms om genen

• Syntes ”in mot genen”

5’

3’

3’

5’

5’

5’

Taq DNA polymeras

• Värmestabilt• Optimalt vid 72 °C• Adderar nukleotider

komplementära till templatsträngen

• Dubbelsträngad DNA bildas

• Syntes från 5´till 3´

http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/taq.polymerase.jpg

http://www.cinnagen.com/images/smar%20taq%20dna%20polymerase.jpg

Amplifiering av målsekvens!

http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

Resultat

• Området mellan primrarna; målområdet, ”target” amplifieras exponentiellt

• x2 x2 x2 x2 osv….

• Efter 30 cykler har man fått ca 1 x 109 kopior av målområdet

Detektion av PCR-produkt

• Gelelektrofores– Separation av

DNA

• Färgning av DNA

• Alt: Realtids- PCR

Vad betyder ett band i gelen

• Det har bildats DNA-molekyler vid PCR-reaktionen.

• Primrarna måste ha bundit till DNA i provet

• Det finns sekvenser som är komplementära till primrarna

• Slutsats: Vi har påvisat att vårt mål-DNA fanns i provet

Tillämpningar

• Diagnos av bakt/virusinfektion

• Rättskemiska analyser

• Diagnos av ärftliga sjukdomar

• Sekvensering• Kloning • Kvantifiering av

genuttryck (RT-PCR)• Med

mera!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Begränsningar?

• Man måste känna till sekvensen på båda sidor om den DNA-sekvens man vill amplifiera

• Kan ej amplifiera långa gener

Problem vid PCR

• Ospecifika produkter

• Kontamination

• Inhibition

Optimering av PCR-reaktion

• Val av primerpar

• Annealingtemperaturen (beror på primers)

• Mg2+-koncentration

Ospecifika produkter

• Vad har hänt?

• Hur kan det bildas flera produkter?

Primerlängd

• 8-mer ger statistiskt 46000 möjliga sekvenser att hybridisera till i humana genomet

• 17-mer har 1 chans på 17179869184 bp att slumpmässigt hitta en komplementär sekvens

Fig. 11.5 Brown Gene Cloning

Kontamination• ”Carry-over”

kontamination från ett amplifierat positivt prov till ett nytt prov

• En aerosoldroppe kan innehålla 500 kopior av målområdet

• Efter amplifiering har man fått miljoner kopior; falskt positivt prov

• För att upptäcka ev. kontaminering körs en negativ kontroll (utan templat DNA)

Positivt prov

Negativt prov kontamination

Separata rum

• DNA extraktion

• prePCR rum (renrum)

• PCR rum

Inhibering

• Rester från prov eller DNA-extraktion kan inhibera PCR-reaktionen

• Risk för falskt negativa prov• Intern kontroll tillsätts, om den inte

amplifieras tyder det på inhibering

PCR-film

Brister med traditionell PCR

• Separata steg för amplifiering och detektion; risk för kontaminering

• Långsam, svår att automatisera• Mäter vid slutpunkt; osäker

kvantif.• Svårt att jämföra effektivitet vid

olika PCR-reaktioner

Realtids-PCR• Mha fluorescerande molekyler kan

man detektera PCR-produkter varje cykel

• Mätning av PCR-produkter under den exponentiella fasen ger ett säkrare värde än mätning efter att alla cykler körts (end point)

End point/Real time

• Konventionell PCR – Analyserar produkten

vid slutpunkt

• Realtidsmätning– Bildad produkt

detekteras med fluorimeter

– Mäter PCR-produkt vid varje cykel

http://www.lightcycler-online.com/lc_principles/lc_principles_ind.htm

CT = Cykel vid tröskelvärde

• Exponentiell fas. Varje cykel: 2x DNA Vid ett visst antal cykler har signalen nått över bakgrunden

• CT=den cykel när signalen passerar ”tröskeln”

• Ju mer mål-DNA desto lägre CT

(BioRad)

Realtidsmätning ger säkrare kvantifiering

96 replikat av identisk reaktion

Slutlig mängd varierar

Tröskelvärde (CT) varierar inte

•(Fig från BioRad)

VARFÖR?

Realtids-PCR

iCycler BioRad, mikrotiterplattor

LightCycler Roche, kapillärer

ABI Prism 7000 Applied Biosystemmikrotiterplattor

Realtids-PCR

Fördelar– Lättare att undvika kontamination

• Behöver ej öppna röret för detektion

– Säkrare kvantifiering av mål-DNA

Realtids-PCRTillämpningar

– Kvantitativ analys (Q-PCR)• Ex. jmf mRNA i olika celler

– Multiplex PCR (flera primerpar ger flera olika PCR-produkter)

• Ex. detektera flera virustyper i samma prov

– Detektion av mutationer (med FRETprober och smältkurvsanalys)

Spel

• http://nobelprize.org/educational_games/chemistry/pcr/index.html

Länkar

Gör en virtuell PCR: Gå in på nedanstående länk,

http://www.biointeractive.org/vlabs/index.htmlVälj The Bacterial Identification Lab,

Öppna dörren till labbet och kör en PCR!