31

Click here to load reader

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Embed Size (px)

DESCRIPTION

bioteknologi

Citation preview

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

BIOTEKNOLOGI2014

A. Pengertian PCRReaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagaiPolymerase Chain Reaction(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetic. Pada awal perkembanganya metode ini hanya digunakan untuk melipat gandakan molekul DNA, tetapi kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitas molekul mRNA.Dengan menggunakan metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Pada setiap siklus PCR akan diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target. Metode PCR dapat dilakukan dengan menggunakan komponen dalam jumlah yang sangat sedikit, misalnya DNA cetakan yang diperlukan hanya sekitar 5g, oligonukliotida yang digunakan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini biasa dilakukan dalam volume 50-100 l. DNA cetakan yang digunakan juga tidak perlu dimurnikan terlebih dahulu sehingga metode PCR dapat digunakan untuk melipatgandakan suatu sekuens DNA dalam genom bakteri.PCR adalah reaksi polimerase berantai, yaitu reaksi yang melibatkan enzim polimerase yang dilakukan secara berulang-ulang. Yang diulang-ulang adalah proses pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal, hibridisasi primer untuk mengawali replikasi DNA dilanjutkan dengan proses penambahan basa pada cetakan DNA oleh enzim polimerase, untuk melakukan kegiatan ini dibutuhkan tabung PCR yang bersifat reponsif dengan perubahan suhu dan mesin thermal cycler, suatu mesin yang mampu menaikkan dan menurunkan suhu dengan cepat, dan bahan-bahan untuk membuat reaksi PCR.PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi)DNAsecaraenzimatiktanpa menggunakanorganisme. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis olehKary Mullispada tahun 1983 dan ia memperolehhadiah Nobelpada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidangbiokimiadanbiologi molekularkarena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil. PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu suatu sekuens oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerasi.B. Komponen Komponen PCRAda beberapa macam komponen utama dalam proses PCR, yaitu antara lain:1.DNA cetakanDNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut mengandung fragmen DNA target yang dituju.Reaksi pelipatgandaan suatu fragmen DNA dimulai dengan melakukan denaturasi DNA template (cetakan) sehingga rantai DNA yang berantai ganda (double stranded) akan terpisah menjadi rantai tunggal (single stranded). Denatirasi DNA dilakukan dengan menggunakan panas selama 1 2 menit, kemudian suhu diturunkan menjadi sekitar sehingga primer akan menempel (annealing) pada cetakan yang telah terpisah menjadi rantai tunggal. Primer akan membentuk jembatan hydrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan dengan sekuen primer. Suhu yang digunakan untuk penempelan primer pada dasarnya merupakan kompromi. Amplifikasi akan lebih efisien jika dilakukan pada suhu yang lebih rendah.2.Oligonukleotida primerOligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen oligonukleotida pendek (15 25 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida yang mempunyai sekuen yang identik dengan salah satu rantai DNA cetakan pada ujung 5-fosfat, dan oligonukleotida yang kedua identik dengan sekuen pada ujung 3OH rantai DNA cetakan yang lain. Proses annealing biasanya dilakukan selama 1 2 menit. Setelah dilakukan annealing oligonukleotida primer dengan DNA cetakan, suhu inkubasi dinaikkan menjadi selama 1,5 menit. Pada suhu ini DNA polymerase akan melakukan proses polimerasi rantai DNA yang baru berdasarkan informasi yang ada pada DNA cetakan. Setelah terjadi polimerasi, rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hydrogen dengan DNA cetakan. DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan hydrogen antara rantai DNA cetakan dengan rantai DNA yang baru hasil polimerasi selanjutnya akan didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu ingkubasi menjadi . Rantai DNA yang baru tersebut selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi berikutnya.Reaksi-reaksi seperti yang sudah dijelaskan tersebut diulangi lagi sapai 25 30 klai (siklus) sehingga pada akhir siklus akan didapatkan molekul-molekul DNA rantai ganda yang baru hasil polimerasi dalam jumlah yang lebih banyak dibandingkan dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. Banyaknya siklus amplifikasi tergantung pada kosentrasi DNA target di dalam campuran reaksi. Paling tidak, diperlukan 25 siklus untuk melipatgandakan satu kopin sekuen DNA target di dalam genom mamalia agar hasilnya dapat dilihat secara langsung, misalnya dengan elektroforosis gel agarose. Akan tetapi, pada umumnya kosentrasi DNA polimerasi Taq menjadi terbatas setelah 25 30 siklus amplikasi.3.Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)Campuran dNTP adalah larutan air pada pH 7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan dTTP, masing-masing pada konsentrasi akhir baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap digunakan merupakan solusi yang dirancang untuk menghemat waktu dan untuk menyediakan reproduktifitas yang lebih tinggi dalam aplikasi PCR dan lainnya.4.DNA PolimerasePada awal perkembangannya, DNA polymerase yang digunakan dalam PCR adalah fragmen Klenow DNA polymerase I yang berasal dari Escherichia coli (Mullis dan Fallona, 1989). Fragmen Klenow adalah DNA polymerase yang telah dihilangkan aktivitas eksonuklease (5 3)-nya. Beberapa kelemahan fragmen Klenow antara lain adalah bahwa enzim ini tidak tahan panas, laju polemerase untuk menggabungkan nukleotida dengan suatu primer secara terus-menerus tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan. Hampir semua DNA polymerase mempunyai prosesivitas yang rendah sehingga akan terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan setelah menggabungkan kurang dari 10 nukleotida. Salah satu perkecualian adalah T7 DNA polymerase yang mampu menggabungkan ribuan nukleotida tanpa terdisosiasi dari komplek primer-DNA cetakan.a.Taq DNA Polimerase Taq DNA polymerase yang beraasal dari bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu strain yang tidak mempunyai endonuklease retriksi TaqI. Taq DNA polymerase tersusun atas satu rantai polipeptida dengan berat molekul kurang lebih 95 kD. Enzim ini mempunyai kemampuan polimerasi DNA yang sangat tinggi, tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3 5. Enzim ini paling aktif pada pH9 (pada suhu 200 C) dan suhu aktivitas optimumnya sekitar750C800C. Kelebihan enzim Taq DNA polimerase adalah bahwa enzim ini tahan terhadap suhu tinggi yang diperlukan untuk memisahkan rantai DNA cetakan. Dengan kelebihan semacam ini maka tidak diperlukan penambahan enzim pada tiap-tiap siklus PCR seperti yang harus dilakukan kalau enzim yang dig unakan adalah fragmen Klenow DNA polymerase I (Gelfand dan White, 1990). Kelebihan lain enzim Taq DNA polymerase adalah laju polimerasinya yang sangat tinggi serta prosesivitasnya yang juga lebih tinggi disbanding dengan fragmen Klenow. Taq DNA polymerase mempunyai suhu optimum yang tinggi untuk sintesis DNA yaitu 75 80 C. aktivitas spesifik enzim ini dalam menggabungkan nukleotida mencapai 150 nukleotida per detik per molekul enzim. Waktu paruh (half-time) Taq DNA polymerase pada suhu 95 C adalah 40 menit (Gelfand dan White, 1990). Deterjen non-ionik Tween 20 (0,5 -1 %) dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi Taq DNA polymerase. Senyawa tambahan lain yang juga dapat meningkatkan efisiensi polimerasi Taq DNA polymerase adalah DMSO, gelatin, gliserol, dan ammonium sulfat.Salah satu kelemahan enzim Taq DNA polymerase adalah bahwa enzim tersebut mempunyai potensi untuk melakukan kesalahan dalam menggabungkan nukleotida sehingga ada kemungkinan terjadi mutasi pada fragmen gen hasil amplifikasi. Meskipun demikian dengan kondisi yang tepat, kesalahan penggabungan nukleotida semacam itu tidak terjadi seperti misalnya hasil amplifikasi fragmen gen HIV-1 (5400 nukleotida) dengan siklus amplifikasi 30 kali. Demikian juga halnya dengan hasil amplifikasi gen -globin (14990 nukleotida). Dengan demikian , rata-rata frekuensi kesalahan penggabungan nukleotida sekitar 5 X kesalahan per nukleotida yang digabungkan per siklus, dengan menggunakan 25 siklus.Taq DNA polymerase mempunyai keunikan yaitu bahwa enzim ini mampu menambahkan satu nukleotida,terutama dATP, pada ujung -3 fragmen DNA hasil polimerasi meskipun tanpa ada cetakanya. Dengan demikian, ujung fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR pada umumnya tidak pepat (blunt-ended), melainkan ada tambahan satu nukleotida pada kedua ujungnya. Kenyataan semacam ini mempunyai implikasi penting karena fragmen DNA hasil polimerasi dengan metode PCR dapet diligase dengan suatu plasmid vector tertentu tanpa menggunakan enzim DNA ligase. Hal ini juga perlu diperhatikan jika frag men DNA hasil PCR akan diligasikan dengan suatu plasmid dengan metode ligasi pepat (blunt-ended ligation). Sebelum dilakukan ligasi , fragmen DNA tersebut harus dibuat pepat/tumpul dengan menggunakan aktivitas polymerase 5 3 fragmen Klenow.Aktivitas Taq DNA polymerase dipengaruhi oleh kosentrasi ion magnesium. Aktivitas Taq DNA polymerase mencapai maksimal pada kosentrasi sebesar 2,0 mM jika kosentrasi dNTP yang digunakan adalah 0,7 0,8 mM. kosentrasi lebih tinggi dari 2,0 mM akan menghambat aktivitas Taq DNA polymerase. Di samping itu, aktivitas enzim polymerase ini juga akan menurun 20-30% jika kosenrasi total dNTP yang digunakan mencapai 4-6 mM.b.Tth DNA polimerseEnzim DNA polimerse lain yang juga dapat digunakan untuk melakukan PCR adalah Tth DNA polimerse. Enzim ini diisolasi dari eubakteri thermofilik Thermus thermophilus HB8. Tth DNA polimerse mempunyai prosesivitas yang tinggi dan tidak mempunyai aktivitas eksonuklease 3 5. Enzim ini menunjukkan aktivitas tertinggi pada pH 9 (pada suhu 25) dan suhu sekitar. Selain aktivitas polymerase, enzim ini juga mempunyai aktiviatas transcriptase balik (reverse transcriptase) intrinsik yang sangat efisien dengan adanya ion mangan. Aktivitas trankriptase balik tersebut jauh lebih tinggi disbanding dengan aktivitas serupa yang dimiliki oleh DNA polymerase I yang ada pada Escherichia coli maupun pada Taq DNA polymerase. Tth DNA polimerse juga dapat menggunakan substrad yang dimodifikasi sehingga juga dapat digunakan untuk melabel fragmen DNA dengan radionukleotida, digoxigenin maupun biotin.Oleh karena enzim Tth DNA polimerse mempunyai aktivitas transkiptase balik yang tinggi pada suhu tinggi maka enzim ini dapat digunakan untuk mengatasi masalah yang timbul akibat adanya struktur skunder pada molekul RNA. Dengan demikian, enzim ini dapat digunakan untuk melakukan RT-PCR (reverse Transkriptase PCR). Molekul cDNA yang diperoleh dari hasil reaksi transkripsi balik dapat sekaligus diamplifikasi dengan menggunakan Tth DNA polimerse dengan adanya ion . Enzim ini dapat dilakukan untuk melakukan RT-PCR molekul RNA sampai ukuran 1000 pasangan basa.c.Pwo DNA polymeraseEnzim Pwo DNA polymerase diisolasi dari archaebacterihiperthermofilik Pyrococcus woesei. Enzim Pwo DNA polymerase mempunyai berat molekul sekitar 90 kD. Enzim ini mempunyai prosesivitas polimerasi 5 3 yang tinggi, mempunyai aktivitas eksonuklease , dan tidak menunjukkan aktivitas eksonuklease . Pwo DNA polymerase mempunyai stabilitas thermal yang lebih tinggi dibandingkan dengan Taq DNA polymerase. Waktu paruh enzim ini lebih dari 2 jam pada suhu , sedangkan Taq DNA polymerase hanya mempunyai waktu paruh 5 menit pada suhu ini. Aktivitas eksonuklease 3 5 (aktivitas proof-reading dalam proses sintesis DNA) yang dimiliki oleh Pwo DNA polymerase meningkatkan ketepatan (fidelity) proses sintesis DNA sepuluh kali lebih tinggi dibandingkan dengan ketepatan yang dimiliki oleh Taq DNA polymerase. Jika Taq DNA polimerse digunakan untuk mengamplikasi sekuen DNA sepanjang 200 bp sebanyak satu juta kali maka kurang lebih 56% produk amplifikasinya akan mangandung satu atau lebih kesalahan. Sebalikya, jika enzim Pwo DNA polymerase yang digunakan untuk amplifikasi maka hanya 10% produk amplifikasinya yang mengandung kesalahan. Ketepatan proses polimerasi DNA secara in vitro merupakan salah satu parameter paling penting dalam PCR. Hal ini terutama sangat penting jika DNA atau RNA cetakan yang digunakan hanya berjumlah sangat sedikit.Hasil amplifikasi menggunakan Pwo DNA polymerase adalah molekul DNA dengan ujung pepat/tumpul (blunt-ended) sehingga dapat digunakan dalam proses ligasi ujung tumpul secara langsung tanpa harus dilakukan modifikasi terhadap ujung-ujung molekul DNA. Oleh karena sifat ketepatanya yang tinggi maka enzim ini sangat berguna untuk aplikasi:1) Cloning produk PCR2) Studi polimorfisme alel dalam transkrip RNA individual3) Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam suatu jaringan4) Karakterisasi status alel suatu sel tunggal atau DNA molekul tunggal5) Karakterisasi populasi sel dalam suatu kulturd.Pfu dan Tli DNA polymeraseDNA polymerase lain yang dapat digunakan untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan Tli DNA polymerase. Pfu DNA polymerase diisolasi dari Pyrococcus furiosis, mempunyai berat molekul 92 kD, aktif pada suhu dan mempunyai aktivitas eksonuklease . Enzim ini diketahui mempunyai laju kesalahan yang paling kecil disbanding dengan enzim DNA polymerase yang lain. Produk amplifikasi dengan menggunakan enzim ini adalah molekul DNA dengan ujung tumpul.Tli DNA polymerase diisolasi dari jasad Thermococcus litoralis, sangat stabil terhadap panas, aktivitas optimum pada suhu dan dapat berfungsi meskipun diinkubasi pada suhu . Berat molekul enzim ini dalah 90 kD. Enzim juga mempunyai aktivitas eksonuklease5.PCR buffer dan konsentrasi Mg2+Buffer standar untuk PCR tersusun atas 50mM KCl, 10mM Tris-Cl (pH8.3) dan 1.5mM MgCl2. Buffer standard ini akan bekerja dengan baik untuk DNA template dan primer dengan kondisi tertentu, tetapi mungkin tidak optimum dengan kombinasi yang lain. Produk PCR buffer ini terkadang dijual dalam bentuk tanpa atau dengan MgCl2.Konsentrasi ion magnesium dalam PCR buffer merupakan faktor yang sangat kritikal, karena kemungkinan dapat mempengaruhi proses annealing primer, temperatur dissosiasi untai DNA template, dan produk PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal ion Mg2+ itu sangat rendah. Hal ini penting untuk preparasi DNA template yang tidak mengandung konsentrasi chelating agent yang tinggi, seperti EDTA atau phosphat. Ion Mg2+yang bebas bila terlalu rendah atau tidak ada, maka biasanya tidak menghasilkan produk akhir PCR, sedang bila terlalu banyak ion Mg2+yang bebas akan menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan.B.Prinsip Kerja PCRPolymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode untuk amplifikasi (perbanyakan) primer oligonukleotida diarahkan secara enzimatik urutan DNA spesifik. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari jumlah nanogram DNA template dalam latar belakang besar pada sequence yang tidak relevan (misalnya dari total DNA genomik). Sebuah prasyarat untuk memperbanyak urutan menggunakan PCR adalah memiliki pengetahuan, urutan segmen unik yang mengapit DNA yang akan diamplifikasi, sehingga oligonucleotides tertentu dapat diperoleh. Produk PCR diamplifikasi dari template DNA menggunakan DNA polimerase stabil-panas dari Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) dan menggunakan pengatur siklus termal otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus denaturasi, anil primer, dan polimerisasi. Setelah amplifikasi dengan PCR, produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung divisualisasikan setelah pewarnaan dengan bromida etidium.PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secarain vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secarain vivoyang bersifat semi konservatif.PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3 dengan gugus 5 fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 53 dan disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat.PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan (extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikaalisis oleh DNA polimerase.C.Kegunaan PCRPolymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk: amplifikasi urutan nukleotida. menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi. melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger print.D.Waktu yang Dibutuhkan 3-6 jam atau semalamPolyacrylamide gel electrophoresis using Mighty-small II gel apparatus: 2.5 hours poliakrilamid gel elektroforesis menggunakan Mighty-small II bahan gel: 2,5 jamEtidium bromide staining dan fotografi: 45 menitE.Reagen Khusus yang DigunakanPasangan primer oligonukleotida sintetik mengapit urutan yang akan diamplifikasiBuffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)Campuran dari empat dNTP (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) masing-masing sebesar 2,5 mM (ultra murni DNTP set, Pharmacia # 27-2035-01). DNTP campuran dibuat dengan volume 10 mM larutan dari masing-masing empat dNTP terpisah yang digabung.Taq DNA Polymerase (AmpliTaqTM, Perkin-Elmer/Cetus)Minyak mineral ringanAkrilamida (grade elektroforesis)N, N-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis, Ultra-Pure/BRL, # 5516UB)Amonium persulfat (Ultra-Pure/BRL, # 5523UA)TEMED (N, N, NN Tetramethylethylenediamine, Ultra-Murni / BRL, # 5524UB)F.Peralatan KhususMighty-small II SE-250 vertical gel electrophoresis unit (Hoefer)Perkin-Elmer/Cetus Thermal CyclerSterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge tubes: (TC-5, Midwest Scientific)G.Tahapan PCRPCR merupakan tehnik amplifikasi DNA selektifin vitroyang meniru fenommena replikasi DNAin vivo. Komponen reaksi yang diperlukan dalam teknik ini adalah untai tunggal DNA sebagai cetakan, primer (sekuens oligonukleotida yang mengkomplementeri akhiran sekuens cetakan DNA yang sudah ditentukan), dNTPs (deoxynucleotide triphosphates), dan enzim TAQ polimerase yaitu enzim dari bakteri Termovilus aquatikus.Sejak ditemukannya struktur DNA untai ganda, kita mulai memahami prinsip replikasi DNA terutama kaitannya dengan mekanisme transfer materi genetik. Seperti yang telah dijelaskan dalam materi Asam Nukleat dalam struktur DNA untai ganda tersebut, basa A dan T , juga C dan G , memiliki ikatan hidgrogen yang mudah dirusak dan mudah dibentuk kembali. Untuk melakukan replikasi, mula-mula ikatan hidrogen tersebut harus dirusak dahulu agar DNA untai ganda berubah menjadi untai tunggal. Kemudian karena A selalu berpasangan dengan T, dan C selalu berpasangan dengan G, maka jika kita memiliki satu untai DNA dengan sequens ACTAG, misalnya, maka kita dapat mencetak untai komplementernya, yaitu TGATC, begitu juga sebaliknya.PCR menggunakan prinsip dari replikasi DNA, namun berbeda dengan replikasi DNA bahwa PCR hanya mengamplifikasi daerah tertentu (sekuens) dari gen spesifik atau gen spesifik tertentu yang dikenali dan dibatasi oleh sepasang primer, yaitu primer forward dan primer reverse. Pada awal-awal perkembangan PCR menggunakan waterbath dengan suhu konstan dan berbeda-beda serta menggunakan enzim DNA polimerasi dariEscherichia coliyaitu fragmen Klenow. Namun setelah ditemukannya enzimTaqpolymerase dari bakteri termofilikThermus aquaticus, proses PCR berjalan pada temperature tinggi dan menggunakan mesin thermal cycler yang dapat diprogram untuk mengatur siklus annealing, elongasi, dan denaturasi. Proses kerja PCR melalui beberapa tahapan perubahan suhu yang bersiklus, antara lain denaturasi DNA templat pada suhu 92-95oC, penempelan primer pada DNA templat (annealing) pada suhu 50-60oC, pemanjangan primer pada temperature 72oC (extension/elongation), keseluruhan proser diperlihatkan pada gambar dibawah ini

Gambar Proses PCRProses pertama yang terjadi adalah denaturasi untai DNA templat. Denaturasi awal terjadi pada suhu 92-95oC selama 5 menit untuk memisahkan untai DNA templat. Proses denaturasi dipengaruhi oleh kandungan GC pada templat. Semakin tinggi kandungannya maka semakin susah kedua untai untuk memisah. Selanjutnya setelah kedua untai DNA templat terpisah, suhu diturunkan hingga 50-60oC untuk proses penempelan primer pada untai templat. Suhu annealing merupakan titik kritis dimana primer harus dapat menempel pada templat agar dapat dilakukan elongasi oleh enzimTaq polymerase. Suhu annealing optimal dipengaruhi oleh panjang primer, kandungan GC, stabilitas primer, konsentrasi ion. Apabila suhu annealing dibawah suhu annealing optimal, maka primer akan terjadi salah pasang (mispriming), dan mampu menempel pada daerah templat lainnya yang tidak berkomplemen, berakibat dihasilkannya produk PCR yang tidak spesifik. Namun jika suhu annealing terlalu tinggi, maka primer tidak dapat menempel pada templat, sehingga Taq polymerase tidak dapat melakukan proses elongasi. Penentuan suhu annealing didasarkan pada nilai Tm primer yang diperoleh dari perhitungan sewaktu mendesain primer. Setelah primer menempel pada templat, suhu kembali naik hingga temperature 72oC. Pada temperature ini, enzim Taq polymerase melakukan proses elongasi dengan menambahkan dNTP pada ujung 3 dengan kecepatan 1000 basa/menit. Lama proses elongasi bergantung dari panjang segmen templat yang akan diamplifikasi, aturan yang sering digunakan adalah 1 menit untuk 1000 pasang basa. Setelah proses elongasi, thermal cycler akan meningkatkan suhunya hingga 92-95oC untuk memisahkan kedua untai produk untuk menjadi templat bagi reaksi polimerisasi siklus selanjutnya. Proses PCR berlangsung hingga 30 siklus dan menghasilkan hingga jutaan kopi segmen DNA templat. Produk PCR yang berukuran sama dengan panjang sekuens target, pertama kali terbentuk pada siklus ke-3Pada prinsipnya, reaksi PCR ( protokol PCR konvensional ) membutuhkan tiga tahap :1)DenaturasiSelama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen. Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus yang sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90oC 95oC.2)Penempelan primerPada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Pada prosesannealingini, ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50oC 60oC. Selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72oC.3)ElongasiElongasi merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA, enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA.Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA target.Ketiga tahap siklus tersebut diulang sesuai dengan jumlah siklus amplifikasi. Pada siklus pertama dua untai tunggal DNA cetakan akan disalin menjadi 2 DNA untai ganda. Pada siklus kedua, 2 DNA cetakan untai ganda masing-masing akan bertindak sebagai cetakan sehingga pada siklus kedua dihasilkan jumlah 4 DNA untai ganda. Pada siklus berikutnya akan dihasilkan jumlah DNA secara eksponensial, dimana pada siklus ketiga DNA akan disalin menjadi 8 kali, siklus ke 10 menjadi 1.024 kali, siklus 30 menjadi 1.073.741.824 dan seterusnya. Pada akhir siklus, DNA cetakan akan digandakan secara eksponensial sehingga dihasilkan DNA dalam jumlah yang berlipat ganda hanya dalam waktu yang relatif singkat sekitar 3-4 jam.Umumnya, reaksi polimerisasi atau perpanjangan rantai ini, terjadi pada suhu 72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda), sehingga mencapai jumlah copy yang dapat dirumuskan dengan (2n)x. Dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA. Jadi, seandainya ada 1 copy DNA sebelum siklus berlangsung, setelah satu siklus, akan menjadi 2 copy, sesudah 2 siklus akan menjadi 4, sesudah 3 siklus akan menjadi 8 kopi dan seterusnya. Sehingga perubahan ini akan berlangsung secara eksponensial. PCR dengan menggunakan enzimTaq DNA polimerasepada akhir dari setiap siklus akan menyebabkan penambahan satu nukleotida A pada ujung 3 dari potongan DNA yang dihasilkan. Sehingga nantinya produk PCR ini dapat di kloning dengan menggunakan vektor yang ditambahkan nukleotida T pada ujung-ujung 5-nya. Proses PCR dilakukan menggunakan suatu alat yang disebutthermocycler.H.Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr)RT-PCR merupakan singkatanReverse Transcription Polymerase Chain Reaction. Seperti namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA (complementaryDNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro menggunakan template RNA.Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, templat yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3, maka oligo dT, random heksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan untuk memulai sintesa cDNA.I.Metoda Deteksi Produk PCRProduk PCR adalah segmen DNA (amplikon) yang berada dalam jumlah jutaan copy, tetapi tidak dapat dilihat dengan mata telanjang. Oleh karena itu PCR perlu diikuti dengan suatu tahap akhir yang bertujuan untuk memvisualisasikan produk PCR serta sekaligus bertujuan untuk mengetahui ukuran produk PCR dan mengetahui apakah produk yang dihasilkan adalah benar seperti yang diinginkan. Salah satu metoda deteksi yang umum dilakukan adalah elektroforesis gen agarosa.J.Aplikasi PCRSaat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:a.Isolasi GenDNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Sebagaimana fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik. Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi. Contoh, sebelumnya mengekstrak insulin langsung dari pankreas sapi atau babi, kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia. Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat memproduksi insulin juga. Hasilnya insulin yang sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus mengorbankan sapi atau babi. Untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.b.DNA SequencingUrutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.c.Forensikd.Diagnosa PenyakitPenyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat dan akurat. PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk lainnya.Berdasarkan uraian diatas penemuan dan manfaat teknik PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum yaitu antara lain sebagai berikut: Memperkuat gen spesifik sebelum diklon. Membuat fragmen gen DNA secara berlimpah Dapat mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk dideteksi Dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA sel embrionik yang mengalami kelainan Bidang

K.Kelebihan dan Kelemahan PCRKelebihan Memiliki spesifisitas tinggi Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama Dapat membedakan varian mikroorganisme Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup Mudah di set upKelemahan Sangat mudah terkontaminasi Biaya peralatan dan reagen mahal Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi (misalnya infeksi pasif atau laten) Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian khusus untuk melakukannya.L. Kesimpulan Mengenai PCRReaksi Polimerase Berantai atau dikenal sebagaiPolymerase Chain Reaction(PCR), merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi)DNAsecaraenzimatiktanpa menggunakanorganisme. Adapun komponen dari PCR yaitu DNA cetakan, Oligonukleutida primer, DNA polymerase, Larutan Buffer, dan Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP). Prinsip dasar dari proses PCR yaitu Tahap pertama Denaturasi. Tahap 2 penempelan. Tahap 3 elongasi. Ketiga tahap siklus tersebut diulang sesuai dengan jumlah siklus amplifikasi. Pada siklus pertama dua untai tunggal DNA cetakan akan disalin menjadi 2 DNA untai ganda. Pada siklus kedua, 2 DNA cetakan untai ganda masing-masing akan bertindak sebagai cetakan sehingga pada siklus kedua dihasilkan jumlah 4 DNA untai ganda. Pada siklus berikutnya akan dihasilkan jumlah DNA secara eksponensial, dimana pada siklus ketiga DNA akan disalin menjadi 8 kali, siklus ke 10 menjadi 1.024 kali, siklus 30 menjadi 1.073.741.824 dan seterusnya.Contoh aplikasi PCR antara lain yaitu proses Isolasi Gen, DNA Sequencing, Forensik dan Diagnosa penyakit.