J. Mol. Biol. (,1969) 41, 261-276

Polymorphisme des Lipides Polaires et des Galacto-lipides de Chloroplastes de Maik, en Presence d’Eau

E.Rrvmt AND VITTORIO LUZZATI

Centre de G6nktique Moldcuhire, C.N.R.S., 91- Gij--BUT- Yvette, France

(Received 28 November 1968)

The lipid-water phase diagrams of polar- and gala&o-lipids extracted from maize chloroplaats are described and the structures of the various phases are analysed. The general conformation of the parat& chains is found to be liquid-like. One phase is lamellar, formed by identical planar lipid leaflets, filled by the para& chains and separated by layers of water. In the c-e of the polar lipids the thickness of the water layer increases more than 160 A with increasing water concentration, whereas in the case of the gala&o-lipids only a small amount of water can be incorporated between the lipid leaflets (the maximum thickness of the water layer is 20 A) and the water in excess remains as a separate phase. This property, previously observed with other lipids, is related to the presence of net electrical charges in polar lipids. In the “dry” region of the phase diagram other phases are observed: one is a hexagonal array of in&rite stiff rods, tilled by the polar elements of the system, the other is formed by rods of similar structure but of finite length, joined three by three to form two interwoven three-dimensional networks, organized in a body-centred cubic lattice. The hexagonal phase is observed for both the polar- and galacto-lipids and the cubic phase only in galacto- lipids. The structures of the lamellar and of the cubic phases are consistent with the analysis of the intensity of the X-ray reflections. The observations are com- pared to those previously made with other lipid systems, and some conclusions of general interest are drawn.

1. Introduction Les lipides constituent un des composants essentiels d’organites cellulaires (mem- branes, mitochondries, chloroplastes) do& d’une structure particulierement ordonnee ; bien qu’il soit g&Aralement admis que le Ale physiologique des lipides est lie a cette organisation physique, la nature exacte de la correlation entre structure et fonction reste encore bien obscure. On sait, par ailleurs, que les lipides sont suscep- tibles d’adopter plusieurs structures differentes, si on fait varier la quantite d’eau et la temperature. Le probleme que nous nous posons depuis quelque temps est d’etablir dans quelle mesure des transitions polymorphiques analogues a oelles observees dans les systemes lipid-au (et dens d’autres systemes modele de composition plus complexe) pourraient avoir lieu dans des conditions physiologiques, et jouer ainsi un role dans les membranes : nous avons aborde une v&ifioation experimentale de cette hypothese par l’analyse cristallographique d’une variett? de systAmes modele. Des travaux precedents ont port& sur les savons et les detergents (Luzzati, Mustacchi, Skoulios & Hueson, 1960; Husson, Mustacchi & Luzzati, 1960), sur certains lipides biologiques relativement simples (Reiss-Husson, 1967 ; Small, 1967; Bourges, Small & Dervichian, 1967; Luzzati, Gulik-Krzywicki t Tardieu, 1968) et sur des melanges t Adrease actuelle: Centro de Investigaciones Microbiol6gicas, Facultad de Cienciae Exactas y Naturales, Peni 272, Buenos Aires, Argentina.

261

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lipidiques complexes (lipides de cerveau, Luzzati & Husson, 1962; de mitochondries, Gulik-Krzywicki, Rivas & Luzzati, 1967; d’krythrocytes, Rand & Luzzati, 1968). Nous pr&entons ici les Aultats obtenus avec des lipides extraits de chloroplastes de mai’s.

2. Partie Expbrimentale (a) Prgparation des chloroplastes

Le mars cultive en serre est cueilli au moment de la preparation. L’ensemble des opera- tions suivantes est effect& a 4°C environ.

La technique suivie est celle d&rite par de Kouchkovsky (1963). Les feuilles de ma’is, toupees en petits morceaux, sont melangees avec une solution tampon de Tris-maleate 0,l aa-saccharose 0,4 M (pH 6,6, choisi d’apres I’acidite des feuilles) a raison de 126 ml. de tampon par poignee de feuilles (25 g environ). Le melange est ensuite soumis it. un broyage doux pendant 20 set, puis it un broyage puissant pendant 5 sec. L’homogenat ainsi obtenu est filtre sur 4 couches de gaze.

Les chloroplastes sont &pares par centrifugation differentielle. Debris cellulaires, noyaux et agregats de chloroplastes sont &par& dans le premier culot de centrifugation it 200 8 pendant 2 min. Le surnageant, filtre sur 8 couches de gaze, est recentrifuge pendant 10 min it 1000 g. Les morceaux de chloroplastes et les mitochondries sont separes par decantation de ce dew&me surnageant. Les chloroplastes qui restent dans le culot de centrifugation sont repris dans du tampon Tris-maleate-saccharose, pH 6,6, homogeneises et recentrifuges a 1000 g pendant 10 min. Ce culot de centrifugation est utilise pour l’extraction des lipides.

(b) Extraction des lipides totaux Apres l’essai des differentes methodes, nous avons adopt6 la technique d&rite par

Nichols (1963), legerement modifiee. Une premiere extraction est effect&e avec 100 vol. d’isopropanol sous agitation, condition dans laquelle l’activite des lipases est negligeable (Kates, 1960). La solution est centrifugee et le culot, trait6 de la m6me fa+on, est recentri- fug& Le culot de cette deuxieme centrifugation est trait6 par agitation dans 100 vol. d’un melange chloroforme-isopropanol (1 : 1). Tous les extraits sont ensuite melanges et sont evapores sous vide entre 26 et 30°C dans un Bvaporateur rotatif, en condensant les vapeurs de solvant a basse temperature. Le residu est alors extrait par un melange chloroforme- methanol (2 : 1) a raison de 100 a 150 ml. par 26 ml. de culot de centrifugation de depart. La solution lipidique ainsi obtenue est lib&he des contaminants (proteines, saccharose, etc.) par la technique de Folch, Lees & Sloane-Stanley (1957). Une fois sets, les lipides sont utilises saris delai, soit pour l’etude cristallographique, soit pour la separation des lipides polaires et des galactolipides.

(c) Sdparation des lipides polairea

La majorite des pigments et des lipides neutres sont elimines par Ablution chloroformique sur colonne d’acide silicique (Mallinckrodt, 100 mesh, AR). Les lipides polaires sont deplaces par un melange chloroforme-methanol (1 : 1) et par du methanol. GBneralement la colonne est maintenue sous pression d’azote pour proteger les lipides de I’oxydation et pour accelerer la separation. La separation ainsi obtenue n’est toutefois pas totale : 1 y0 environ des pigments restent associes aux lipides polaires.

(d) Siparation dea galactolipides

A partir de l’extrait de lipides totaux, apres Elimination des pigments et des lipides neutres par Ablution au chloroforme, les galactolipides sont Blu& en utilisant des quantites croissantes d’acetone dans du chloroforme, selon la technique d&rite par Vorbeck & Marinetti (1965). Les gdactolipides separes de cette fapon contiennent encore une toute petite quantite de pigments et de phospholipides.

(e) ContrGles analytiques La separation analytique des lipides a 6th effect& par chromatographie sur couche

mince, selon la technique de Stahl (1964). Les couches minces de silica gel G Merk ont Bte

LIPID-WATER PHASE DIAGRAMS “63

appliquees sur des plaques de verre avec l’bquipement Desaga. Les plaques sont a&iv&s pendant 30 min iL 110°C avant usage. Le solvant est le melange chloroforme-methanol-eau (65 : 25 : 4, par vol.). Les analyses sent effect&es sur chaque pr6paration, avant et apr6s la chromatographie sur colonne d’acide silicique. Les galactolipides sent chromatographi& par la technique bidimensionnelle de Gardner (1968). Les pigments (chlorophylles et carot8noides) sent d&ermin& quantitativement dans l’acetone SOo/o selon MacKinney (1941): ce contrble est effect& sur toutes les fractions lipidiques BtudiBes. La teneur en phosphore est d&erminde par la technique de Chen, Toribara & Warner (1956).

(f) Techniques cri8tdographiques

Les techniques exphrimentales, la notation et les formules mathematiques sont celles utilis&s dans nos travaux p&c&dents, et sont d&rites plus specialment dans Gulik- Krzywicki et al., (1967).

(g) v01ums

La composition Bldmentaire d’une mol&ule lipidique moyenne est Btablie it partir de la composition en especes lipidiques et en chafnes paraffiiques don&e en Appendice:

C 44.9 &..l On.3 Po.zs N0,04 So,oe pour les lipides polaires, C,s,I H,5.7 OI1.s pour lea galacto- lipides. La dbtermination du volume spdcifique partiel sera discutde plus loin, dans le cas des lipides polaires: la valeur adoptbe est w -, = 0,958 cm3 g-l it 24°C. Faute de donnees dire&es, nous avons adopt6 le mhme volume apdcifique pour les galactolipides. Le volume specifique de l’eau, B la mbme temp&at,ure, est go = 1 ,OO cm3 g-l. Les valeurs du nombre d’6lectrons et du volume des parties paraffiique et polaire sont donnees dans le Tableau 1; le partage entre lea deux parties est fait entre le premier groupement CH, et le groupe- ment carboxylique.

TABLEAU 1

Volu.ms

M (l.) %H %HZ %I3 npar %w npd VP01 (61.) (A? (61.) (A31

Lipides polaires 803,6 439 8 24 2 255 866 184 146 Galactolipides 814,O 444 12 19 2 254 867 190 428

M est la masse, n le nombre d’&ctrons, v CA, uCRZ, vCH3 le nombre de groupements CH, CH,,

CH3, npar, npolr ‘brf %I le nombre d’8leotrons et les volumes des parties paraBniques et polaires: toutes CBS valeurs sont relatives 8, une mol&ule lipidique moyenne. Les volumes occup~s 8, 25% par un groupement CH, CH2 et CHB sont vCB = 20,5, tiCHZ = 27,0, ‘ucBg = 54,0A3 (Reiss-Huason & Luzzati, 1964).

3. Riisultats L’Btude des lipides totaux a mis en Evidence, L toute concentration en eau, la

presence de plusieurs phases, caract&Aes dans les diagrammes de diffraction des rayons X par un syst&me de raies fines et bandes diffuses. L’identification de ces phases s’est avh5e ddlicate, du fait que les experiences sont peu reproductibles; la cawe de cela semble dtre une variation irr&uli&re des quantitks de pigments, Ii&e A des paramktres Qcologiques ma1 contr616s (saison, Bclairage . . .).

L’Btude des lipides polaires et des galactolipides, au contraire, a fourni des rtkultats clairs et parfaitement reproductibles, dans la mesure oh la qualit des lipides est satisfaisante selon les critires analytiques dtkits plus haut. Nous limitons notre description A ces deux syst&mes lipidiques.

264 E. RIVAS AND V. LUZZATI

, . I.0 0.8 0.6 0.4 02 I.0 0.8 0.6 0.4

C&l C

!b)

FIG. 1. RBgiona des diagrammes des phases des systimes lipide-eeu, explor6es dans ce travail. Les concentrations c sont pond&ales (lipide/lipide + eau). Les r6gions iL une phase sont hachurk: leerS limit+% n’ont pes 6t6 6tablies 8Ve0 p&iSiOn.

(8) Lipides polaires. (b) Gsleatolipides.

(a) Lip&8 pohire8

(i) Diagramme de.s phases du systinw lipide-euu

Le diagramme des phases a BM sommairement explore en fonction de la concentra- tion et de la temp&ature (9, pression atmospherique), A I’interieur de la r&on indiquee dans la Figure 1 (a). On reconnait deux phases, lamellaire (Lcr) et hexagonale (H,,), en plus de la glace (qui n’est pas port& dans la Figure).

La conformation predominante des chames paraffiniques est dt%ordonnee (ou “liquide”), A toute concentration et temp&ature: ceci est indique par la presence, dans Irt region des “grsnds angles” (s > (10 A) -‘) des disgrammes de diffraction des rayons X, de la bande diffuse autour de s = (4,5 A) -l (Luzzeti, 1968). Dans quelques oas, toutefois, on observe & basse temperature une r&e fine, $, 8 = (4,l A)-l, indice d’une amorce d’organisation des paragines ; cette raie reste toujours d’intensitk t&s faible comparee B la bande diffuse.

(ii) Phase hexagon& (HI,)

Cette phase, d&&e pr&Ademment par Luzzati & Husson, (1962) (voir Bgalement Gulik-Krzywicki et al., 1967, et Luzzati, 1968), est caract&Se par des diagrammes de diffraction des rayons X contenant dttns leur region centrale quelques raies Gnes, dont les espacements se suivent selon la progression 1 : d/3 : 1/4 : 2/7 : 2/9, et par la bande diffuse autour de s = (4,6 A) -l. La structure consist0 en un assemblage hexagonal bidimensionnel de cylindres paralkles et de longueur ind&inie; l’interieur des cylindres est occupe par l’eau et par la partie poke des lipides, l’espace entre les cylindres est rempli par les chaines parafIiniques A conformation chaotique. Le domaine d’existence de cette phase est assez Btroit dans ce systeme (Fig. l(a)).

(iii) Pha8e lamellaire (La)

Gette phase est t&s repandue dans les systemes lipid-au (voir par exemple Luzzati & Husson, 1962). Elle est caract&& par quelques raies de diffraction MIX petits angles, fines et Bquidistantes, et par la bande autour de s = (4,5A) -l. La

LIPID-WATER PHASE DIAGRAMS

FIG. 2. Phase La: repr6sentetion achknatique de la structure d’une lamelIe lipidique. Les ronds repr6sentent la pertie poleire, les traits ondul6a les chalnes paraffiniques “liquides”. Dans la, pwtie inf&ieure eat repr&entie la distribution de la densit6 Blectronique adopt& pour lu calcul du faoteur de structure (voir texte).

structure (voir Fig. 2) est form&e par un empilement de feuillets lipidiques identiques et Qquidistants, &par& par des couches d’eau. Les chaines paraf6niques “liquides” remplissent l’intkrieur des feuillets lipidiques, les groupements polaires tapissent l’interface.

La phase lamellaire, dans ce systeme, peut absorber des quantites d’eau variables dans de larges limites: la distance de rept%ition d varie avec la teneur en eau. Dans chaque experience, effectuee 8, concentration c connue, on mesure d; un ensemble de relations simples lient ces parametres, le rapport des volumes specifiques partiels des lipidee (e,) et de l’eau (e,,), et l’epaisseur des couches de lipide (d,) et d’eau (d,) :

d = d, + d,

d = d,[l + (e&Q (1 - c)/c].

Lorsque d, et (fi,/c,) sont independants de la concentration, il existe done une relation lineaire entre d et (1 - c)/c (Vincent & Skoulios, 1966a,b). Lea donnkes experimentales sont portees dans cette representation sur la Figure 3(a) : le fait que lea points s’alig- nent sur une droite est en bon accord avec l’hypothese que l’epaisseur du feuillet lipidique et lea volumes specifiques partiels sont independants de la concentration, ce qui permet de determiner les valeurs de ces parametres (d, = 38,7 A, TT, I&, = 0,968).

La structure est done formee par de8 feuillets lipidiques d’epaisseur constante, &part% par des couches d’eau dont l’epaisseur varie entre 6 et 150 8. Ce cas, analogue a celui des lipides de8 mitochondries (Gulik-Krzywicki et al., 1967) et d’erythrocytes (Rand & Luzzati, 1968), se pr&e a une analyse de la distribution de la densite Blec- tronique. On peut admettre, en effet, qu’a toute concentration les facteurs de struc- ture sont une fonction de s, independante de la concentration :

P(s) = j[p (z) - p,,] cos 2nsz dz

oh OZ est la direction perpendiculaire au plan du feuillet, p(z) eat la distribution de la densite electronique, p,, eat la densite Qectronique de l’eau, qu’on suppose constante et Qgale 8, 0,334 el. A- 3. Dans ce modele le feuillet poss&de un plan de symetrie.

La distribution de8 intensit& des raies de diffraction en fonction de l’angle et de la concentration, eat en bon accord avec ce modele: on remarque notamment (Fig. 4)

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0 05 I.0

IIII 1 I I fi TII 0.9 0.7 0.6 0.5 o-4 0.3 0.9 0.7 0.6 05 0.4

c

(a) (b)

FIG. 3. Phase La: domr%s experimentales. d est la distance de repetition, S est la surface par groupe polaire a l’interface lipide-eau.

(a) Gpidee polaires. Les points d, port& en fonction de (l-c)/ c, sont bien align& sur une droite, en bon accord avec le modele d’un ensemble de feuillets d’epaisseur con&ante, entre lesquels est incorporee toute l’eau du systeme: de cette droite on tire les valeurs de l’epaisseur du feuillet (d, = 38,7 A) et 9,/& = 0,958. S est calculee avec les equations don&es par Gulik-Krzywicki et al. (1967).

(b) UoZactoZipides. Le domaine d’existence de la phase La pure est compris entre les dew traits pointilles vertioaux: pour c <0,65 la phase La la plus hydratee (cercles B traits) se trouve en Bquilibre avec un exoes d’eau. Les Croix representent l’epaisseur dr du feuillet lipidique. d, et S sont oalcules avec 6r /fiO = 0,958.

des regions de s oh l’intensite s’annule, qui oorrespondent aux points oii le facteur de structure du feuillet (equation (3)) change de signe. Le choix du modele de distri- bution de la densite electronique a Bte d&cute par Gulik-Krzywioki et al. (1967) ;l a forme de la distribution de 1s densite Blectronique est representee dans la Figure 2 et les param&res adopt& sont port&s dans le Tableau 2. La courbe F(s) ainsi calculee eat tracQ dans la Figure 4 : l’accord svec les donndes exphimentales, et en particulier la position des points oti F(s) = 0, est excellent.

TABLEAU 2

Donnh relatives ci la phme Lu des lipides polaires (Fig. 3(a))

+24"C 38,7A

0,958 cm3 g-r 0,0302 molecule A-a

66,2ba 26,l A 12,6 A

0,204 electron Ae3 0,442 electron Ae3

d, et Bi sont l’epaisseur et le volume specifique des lame&s lipidiques (voir texte), N, est le nombre de molecules lipidiques par unite de surface de feuillet, S est la surface moyenne disponible tt chaque groupe polaire B, l’interface (voir Gulik-Krzywicki et al., 1967). d,,, d,,,, pPBr, pPol sont l’bpeisseur et la densite Blectronique des couches paraf%niques et polaire (dans la Fig. 2, d,,, = BC. d,,, = AB + CD).

LIPID-WATER PHASE DIAGRAMS 267

0.2’ ; , I 4 6x 10-Z

SC%;‘)

FIQ. 4. Lipides polaires: v&ification cristallographique de la structure de la phase La. Quelques diagranunes de diffraction des rayons X, obtenus B. differentes concentrations, sont rep&ent& schematiquement dans la partie inferieure: la longueur du trait vertical est une mesure gross&w des intensitk Le facteur de structure (P(s); equation (3)) eat calcule avec la distribution de la densite Blectronique indiquee dans la Fig. 2, et lea dimensions port&es dans le Tableau 2. Noter l’excellent accord entre les regions oh les intensites observees sont nulles et les points oti P(s) change de signe.

(i) Diagramme des phuaes (b) ~aluctolipides

On reconnait quatre phases a l’int&ieur de la region exploree (Fig. l(b)) : H,, et Lu, presentes egalement dans le systeme pr&t%lent, une phase cubique (f&J et l’eau. La conformation des ohaines parafiiniques eat partout chaotique, puisque seule la bande autour de s = (4,58)-l eat prtkente dans la region des “grands angles” des diagrammes de diffraction des rayons X.

(ii) Phase hexugonale (HI,)

La structure de cette phase est oelle de la phase de meme nom des lipides polaires (voir ci-deasus). Nous avons d&ermine, dans ce cas-ci, le rayon T du cylindre qui contient la partie polaire de la structure (eau et groupes polaires des molecules lipidiques), parametre auquel now nous refererons ci-dessous, lors de la discussion de la phase cubique.

J 0 r=a Qrpo,- 27r

oii a est le parametre de la maille hexagonale, et aPol est la fraction du volume occupee par la partie polaire

Qpal = 1 - (vUpar - Q, + 0,602) (MC,) -l,

268 E. RIVAS AND V. LUZZATI

@ eat la concentration volumique (Gulik-Krzywicki et aZ., 1967). 1,~s valrurs numeriques sont portbes dens lea Tableaux 1 et 3.

TABLEAU 3

Don&es relatives aux phases QII et H,, des galuctolipides

QU 6,

a (4 110,2 46,7 t (“C) 64 64 *1 (cm3 g-l) 0,986 0,986 0 0,882 0,958 @ 0,877 0,967 @ PO1 0,426 0,375 1 r

I$ 39,0 co 15,6 15,6

Q/V (g2;)

0,112 0,128 s 73,4 72,0 < (4 1,4 CL (Aa) 460

a est le param&re de la maille hexagon& et cubique, @ et OPOl expriment 108 concentrations volumiques respeotivement du lipide et de la partie poleire, r est le rayon des bhtonnets, U/V est le rapport (surface ext&ieure/volume) des bhtonnets, S eat la surface offerte B une pdre de ohames par&lniques & la surface des bAtonnets, l et CL sont deux param&res relatifs & la phase cubique (voir texte).

On admet que le coefficient de dilatation de l’eau et des lipides est 7,48 x 10T4 (Luzzeti, Gulik-Krzywicki & Tardieu, 1968).

TABLEAU 4

Interwiths observe’es et calculdes: phme QI, de+s galuctolipides

211 10,000 1800 220 520 520 321 21 35 400 17 31 420 24 40 332 70 56 422 22 7 431 9 <7 521 2 (7 440 9 <lO 611 532 127 24

620- 0 <12 541 34 20 631 28 20

444 21 543 22

> 30

640 1 <20

Seules sont porMes les r&lections permises par le groupe de sym&rie (Ia3d). L’accord entre especements observ&, et espacements calcul&~ avec la formule 8 = a-l (ha + k* + la)li2 est parf&t. Lea intenait& nont mesur&a selon le pro&de d&-it par Luzzeti, Tardieu & G&k-Krzywicki (1968). et sont norm&s $. I,,, = 10,000. Le c&u1 des intensites est d&it dans le texte.

LIPID-WATER PHASE DIAGRAMS

(iii) Phme m&que (&)

“69

Cette phme est optiquement isotrope; lee diagrammes de difFraction des rayons X p&en&& aux pet&s angles un ensemble de raies fines dont lee eapacements se suivent dans l’ordre 43: 44: 1/7 : l/S: 410: 411: 412 (voir Tableau 4), et aux grand8 angles la bande dea paraffies liquides. Une phase ayant les m6mes carac- t&istiques a Qti observ& pr&&ement dans des savons anbydres de certains cations divalents (Spegt, 1964; Luzzati Q Spegt, 1967), et dans plusieurs Ecithines (Luzzati, Gulik-Krzywicki & Tardieu, 1968) et dans plusieurs syst&mes d&ergent--eau (Luz- zati, Tardieu, Gulik-Krzywicki, Rivas & Reiss-&won, 1968).

La d&ermination de la structure de cette phase eat d&rite ailleurs (Luzzati & Spegt, 1967; Luzzati, Gulik-Krzywicki & Tardieu, 1968). Les espacements de8 raies de diffraction observ&es, et le8 indices des raies absentes, indiquent saris am- bigiiitt5 que la maille est cubique oentrde, et que le groupe de sym&rie eat Ia3d. L’analyse de l’intensitd des rdflexions montre que le contraste de den&d Blectronique se troupe concentrk le long de b&tonnets rigidea de longeur finie, joints trois B trois,

(a) (b)

FIG. 6. Rep&e&&ion soh6matique de la struoture de le phase Qn. Le m&ilk est cubique cent&e, groupe de aym&rie Ia3d. Le structure est form& de bRtonnete rigides, de section circulaire et de longueur tie, toua identiques et cristallographiquement 6quiv&nts, joints trois B trois pour former deux filets tridimensionnels enohev&r&. Les axes des batonnets, reptisentis par des traits Bpeis, ooinaident avec lee axes bin&w du groupe spatial.

(a) Projection sur le plan a b avec. le position de quelques-uns des 616ments de sym6trie. Les traits &era repr&entent lea limites d’une maille 616mentaire; lea fractions indiquent lea oo- ordom&s z des points d’iutereeotion des axes de troia b&onnete.

(b) Vue en perspeative. Lea traits pointilk sont lea projections des traits Bpais sur le plan a 6.

270 E. RIVAS AND V. LUZZATI

(4 (4

FIG. 6. Distribution des regions parafEniquss et polaires dans la phase Qn (voir Fig. 5). (a) Distribution des groupes polaires (ronds noirs), des chaines paraffiniques (lignes sinueuses)

et de l’eau (zones grises) sur les faces d’un cube correspondent 8, une maille Blementaire, coupe par le plan (111) qui passe par un groupe de trois batonnets.

(b) Position des bbtonnets 8. l’int&ieur du m6me volume; cette Figure reprtkente uno partie de la Fig. 5(b). (Ces deux Figures sont tirees d’un travail inedit de Mlle A. Tardieu.)

et formant deux filets tridimensionnels, enchev&r& mais non lies entre eux (Fig. 5). La position de la phase Qn dans le diagramme des phases indique que les batonnets sont analogues aux cylindres de la phase H,, (Fig. 6), c’est-Mire qu’ils contierment l’eau et la partie polaire des lipides, et que les chaines paraffiniques remplissent les interstices (structure du type II, voir Luzzati, Tardieu, Gulik-Krzywicki, Rivas & Reiss-Husson, 1968).

On peut determiner les dimensions des b&onnets. On calcule facilement la longeur 1 et le volume v d’un b&onnet, lorsque le parametre de la maille a et la concentration volumique DPOl sont connus:

1 = a 4214, (6)

v = Qpol a3/24. (7)

Par ailleurs, en tenant compte du fait qu’au point de rencontre de trois batonnets l’extremitk de chaque batonnet est toupee en biseau (voir Fig. 4 dans Luzzati, Gulik-Krzywicki, & Tardieu, 1968), les expressions du volume et de la surface exterieure d’un batonnet, et de la surface S par moltkule, sont les suivantes:

v = nr%? (1 - 0,491 r/Z), (8)

u = 2rrr1 (1 - 0,735 r/l), (9)

S = uvpar (a3/24 - v) -l. (10)

De cet ensemble de relations on tire finalement les valeurs de r et du rapport U/V:

LIPID-WATER PHASE DIAGRAMS 271

ces valeurs sont port&s dans le Tableau 3. On constate que le rayon du bbtonnet, ainsi que la surface S par molecule, sont t&s voisins de ceux de la phase hexagonale.

Une verification ulterieure de la structure est four& par la comparaison des facteurs de structure calcul& et observes. Puisque le calcul exact est delicat, nous avons adopt6 un modele simplifie. Ce modkle est forme de tiges de t&s petit rayon, legkrement plus courtes que les bbtonnets (un petit segment E est retire a chaque extrkmite). Le facteur de structure de ce modele a pour expression :

l/8(1-21/1) F h.k.1 = Ah,kJ @,I/4 -X,1/8) dx (11)

Oh Ah.,,, est le facteur de structure relatif au groupe de symetrie (p. 345 des Inter- national Tables, 1952). Le diametre 6ni des tiges est introduit en modulant par le facteur de forme d’un bbtonnet infiniment long de rayon r

f(s) = J, (2~ #rm.

La formule finale est la suivante:

(12)

I h.k.1 = m8t.k.l f2b) exP (- m2) (13)

oti m est le facteur de multiplicite, et le terme gaussien tient compte de I’agitation thermique. On remarque (Tableau 4) que l’accord entre intensites observees et cal- culees est tout-a-fait satisfaisant, pour lea valeurs des parametres don&es dans le Tableau 3.

(iv) Phase lumellaire (La)

Analogue & celle du systeme precedent. Une difference notable, toutefois, s&pare les deux cas. La phase La des galactolipides ne contient qu’une quantite limitee d’eau; toute eau du systeme en exces sur oette quantite maximale reste s&par&, en Bquilibre avec la phase lamellaire la plus hydratee (Figs l(b) et 3(b)). Dans le cas des lipides polaires, au contraire, le gonflement par l’eau est illimite, 21 l’interieur de la region exploree (Fig. 3(a)). En adoptant pour 8, la valeur d&erminee pour les lipides polaires, on peut calculer d, (equation (2)) et S. On constate dans ce cas (voir Fig. 3(b)) une variation importante des dimensions du feuillet lipidique avec la concentration, bien plus grande, en tout cas, que l’incertitude due au choix de 8,.

4. Discussion et Conclusions

Comme il a Bte observe d&s les premieres etudes cristallographiques des lipides, et amplement confirm& par la suite (voir Luzzati, 1968), il est un fait remarquable que des especes lipidiques aussi heterogenes se melangent en une seule phase dans des regions &endues du diagramme des phases des systemes lipide-eau. Les lipides de chloroplastes de mai’s, apres extraction des pigments, possedent cette propriktd; la presence de pigments, au contraire, entraine la segregation de differentes compo- santes en plusieurs phases.

Dans les deux systemes d&its ici la conformation predominante des chaines paraffiniques est partout “liquide” ; on n’observe, en effet, aucune des phases oh la conformation des chaines est partiellement ordonn&e (L& Ly, L6, P6, C), pr&entes dans les lipides de mitochondries (Gulik-Krzywicki et al., 1967) et dans lea lkcithines (Luzzati, Gulik-Krzywicki & Tardieu, 1968). Ce fait doit dtre mis en rapport avec

18

272 E. RIVAS AND V. LUZZATI

le degre d’insaturation des paraffines, qui est bien plus Bleve dans les lipides de chloro- plastes que dans ceux des mitochondries de coeur de boeuf et dans la lkcithine d’oeuf de poule. On peut rappeler, par ailleurs, que l’introduction dans les couches lipidiques d’elements susceptibles d’augmenter le desordre (par exemple cholesterol dans les lipides de mitochondries, Luzzati, Gulik-Krzywicki, Rivas, Reiss-Husson & Rand, 1968) a pour effet de gener l’organisation des chaines paraffiniques.

Dans les systemes decrits ici la phase predominante, a “haute” temperature et teneur eneau Blevee, est lamellaire (La) : les autres phases (Hi, et QII) ne sont obser- v&es que dans des preparations peu hydratkes. Cette propriete semble &re caracteris- tique des lipides diacyles, d’apres les resultats obtenus avec les lipides de cerveau (Luzzati & Husson, 1962), de mitochondries (Gulik-Krzywicki et al., 1967), d’erythro- cytes (Rand & Luzzati, 1968), ainsi que dans les lecithines (Small, 1967; Reiss- Husson, 1967). Rappelons que la situation est toute differente en ce qui concerne les lipides monoacyles (savons et detergents, Luzzati & Husson, 1962 ; lysolecithine, Reiss-Husson, 1967) (voir dgalement Luzzati, Tardieu, Gulik-Krzywicki, Rivas & Reiss-Husson, 1968).

On peut noter que l’epaisseur du feuillet lipidique et la surface par groupe polaire ont des valeurs t&s voisines dans les lipides polaires de chloroplastes (Fig. 3(a)), dans les lipides de cerveau (Luzzati & Husson, 1962) et de mitochondries (Gulik- Krzywicki et al., 1967) ; par ailleurs dans les galactolipides la variation de ces para- metres avec la concentration (Fig. 3(b)), est analogue a celle observee dans la leci- thine d’oeuf de poule (Reiss-Husson, 1967).

Le fait que dans la phase Lo! des lipides polaires des quantitt5s d’eau apparemment illimitees puissent s’intercaler entre les feuillets lipidiques, tandis que l’epaisseur de la couche d’eau est limitee dans le cas des galactolipides, est lice vraisemblablement 8. la presence, dans les lipides polaires, de molecules comportant une charge Blectrique nette (en particulier les phospholipides et les sulfolipides), qui sont absentes dans les galactolipides. 11 a Bte recemment demontre, en effet (Gulik-Krzywicki, Tardieu & Luzzati, 1969), qu’il existe une correlation directe entre le “gonflement” de la phase LE et la presence de charges Blectriques.

11 est satisfaisant de constater une fois de plus que bien qu’en g&&al le nombre de reflections observees dans chaque diagramme de diffraction soit t&s petit, il est souvent possible de tirer parti d’un ensemble des donnees experimentales obtenues a differentes concentrations, pour confirmer le bien fond6 des structures et meme pour analyser la distribution de la densite Blectronique: ces verifications peuvent devenir sensibles et precises lorsque les valeurs des volumes et des densites Blectroniques des regions paraffiniques et polaires sont connues au prealable. C’est le cas ici de la phase Lu des lipides polaires; il convient de confronter ces rdsultats avec ceux relatifs a la m6me phase des lipides de mitochondries (Gulik-Krzywicki et al., 1967) et d’krythro- cytes (Rand & Luzzati, 1968).

Les galactolipides, melanges de mono- et de digalactosyl diglycerides, presentent le premier exemple de phase &ii dans un systeme comportant des especes lipidiques heterogenes dans leur partie polaire; les cas precedents, en effet, sont ceux des savons anhydres de cations divalents (Spegt, 1964) et les lecithines (Luzzati, Gulik-Krzywicki $ Tardieu, 1968). On a observe recemment une phase cubique semblable, avec un melange de lipides provenant de batteries photosynthetiques (Rivas & Reiss-Husson, texte en preparation).

11 n’est pas opportun de revenir ici sur la discussion des implications biologiques

LIPID-WATER PHASE DIAGRAMS “73

des result&s de ce travail (voir Luzzati, Reiss-Husson, Rivas & Gulik-Krzywicki, 1966; Luzzati, Gulik-Krzywicki, Tardieu, Rivas & Reiss-Husson, 1969). Nous

Bvitons Bgalement d’aborder le proleme de la structure des chloroplastes, et de prendre partie dans lea controverses que ce probleme a suscitees.

Nous devons B l’obligeance de M. R. Deuce la communication de don&es analytiques medites, et it celle de Mlle A. Tardieu la reproduction de la Figure 6. Nous remercions MM. P. Mazliak et J. M. Briantais de precieux conseils techniques, M. T. Gulik-Krzywicki et Mlle A. Tardieu de l’int&bt qu’ils ont port6 a notre travail. Cette etude a ben6fieie de l’aide de la Delegation G&r&ale a la Recherche Scientifique et Technique, Comite de Biologie Moleculaire.

APPENDICE

Composition Chimique des Systbmes Lipidiques de Chloroplastes de Ma%

Lea lipides de chloroplastes de majis appartiennent aux types suivants:

(a) Phosphdipides

Ra.CO.OCH, ( choline

I Rjl.CO.OCH

I r”

X

!

glycerol

CH,-0PO.X

\ OH

my0 inositol

(b) ~aluctolipides

Ra.CO.OCH,

I Rj?.CO.OCH

I CH,-0.X

p-n-galactopyranose

X

:

a-n-galactopyranosyl-( 1+6)-p-~-

-galactopyranose

(c) Sulfolipide ou sulfoglyeolipide

Ra.CO.OCH,

I R/I.CO.OCH

I CH,-O- { sulfo-u-n-quinovopyranose

Nous negligeons ici un glycolipide de structure inconnue, dont la concentration eat certainement inferieure B 3,5%.

Ra et R/3 representent lea chalnes parafiniques des acides gras. La proportion des differenta types de lipides presents dans lea chloroplastes de ma’is

a 6th determinee par Deuce (communication personnelle): elle n’est pas t&s dif- ferente de celle d&rite par Lichtenthaler & Park (1963) pour lea chloroplastes

274 E. RIVAS AND V. LUZZATI

d’epinards. La composition en chaines paraffiniques des lipides de ma’is ne semble pas avoir BtB determike; nous avons adopt& ici les donnees relatives aux lipides de chloroplastes d’epinards, tirees du travail de Allen, Hiroyama & Good (1966).

Dans le Tableau 5 toutes les compositions sont exprimees en moles.

TABLEAU 5

Chaines Phosphatidyl Phosphrttidyl Phosphatidyl Digalactosyl Monogalaetosil Sulfolipide

parafllniques glycerol choline inositol diglyceride diglyceride 1261 y0 4907% 1973% 22,7% 5091% 8,797;

14:o 16:O 16:l 16:2 lf3:3 18:0 18:l 18:2 18:3

1 4 - 11 12 34 3 - 39 32 - - 6 2 4 3 6 25

2 - 2 9 7 2 4 16 15 2 2 6

47 68 27 87 72 52

Total 99 99 98 99 99 97

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LIPID-WATER PHASE DIAGRAMS 275

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