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DOCUMENTACIÓN

200713104

TERMALISMO Y ACTIVIDAD FÍSICA

Análisis de biomarcadores del estrés oxidativo del deportista

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ÁNGELA CASADO MORAGÓN Jefa del Grupo de Biomarcadores de Estrés Oxidativo y Procesos de Envejecimiento,

Departamento de Fisiopatología Celular y Molecular Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC)

Pechina (Almería) 23 de noviembre de 2007

ANÁLISIS DE BIOMARCADORES DEL ESTRÉS OXIDATIVO DEL DEPORTISTA

INTRODUCCIÓN

Aunque son ampliamente conocidos los beneficios que se derivan del ejercicio

físico (aumento del tono muscular, pérdida de peso, mejoría funcional del aparato cardiovascular, aumento del metabolismo energético y de las defensas antioxidantes, aumento de la fuerza y de la resistencia y disminución de la osteoporosis), también existe considerable evidencia de que, durante su práctica, aumenta la producción de radicales libres que producen daño oxidativo en el tejido muscular, hígado, sangre y, posiblemente, en otras estructuras. Desde hace más de una década, se ha incrementado sustancialmente el interés en este tópico, así como en los efectos de las terapias antioxidantes1-3.

RADICALES LIBRES Un radical libre es una especie química que posee un electrón desapareado en su orbital más externo. El electrón desapareado en el orbital externo confiere a la molécula una reactividad elevada, debido a la tendencia a adquirir un segundo electrón en su orbital, con objeto de conseguir una configuración electrónica estable. Los radicales libres se caracterizan por iniciar reacciones en cadena, reacciones autopropagadoras, en las cuales un radical reactivo origina un producto que también es un radical y que a su vez reacciona y origina otro radical. Esta etapa se conoce como propagación y una última fase, terminación, es aquella en la que reaccionan dos radicales dando un compuesto no radical. Por tanto, las reacciones originadas por radicales libres constan de tres etapas perfectamente definidas: iniciación, propagación y terminación. Los radicales libres de oxígeno incluyen radicales cuyo componente es el oxígeno, por ej. el radical superóxido o anión superóxido (O2

•-), el radical hidroxilo (OH•), el radical alcoxilo (RO•), el radical peroxilo (ROO•), y el radical hidroperoxilo (RHOO•). El peróxido de hidrógeno (H2O2) no es un radical libre sino una especie reactiva de oxígeno porque no tiene un electrón desapareado en su órbital más externo y es químicamente estable, pero en sistemas biológicos puede romperse, por acción de metales de transición tales como el Fe2+ y Cu+, para dar origen al radical hidroxilo que es el más potente de todos. La mayoría de los radicales que se producen in vivo son originados tanto a partir de las especie reactivas de oxígeno como de especies reactivas de nitrógeno. Las especies reactivas de nitrógeno incluyen los radicales libres óxido nítrico (NO•), dióxido de nitrógeno (NO2

•) y el potente oxidante peroxinitrito (ONOO-). Los radicales libres tienen la propiedad de reaccionar con una gran variedad de especies químicas, ya que participan en un amplio rango de funciones biológicas como en la señalización celular (NO•) y en la enzimología (unidos a proteínas en el mecanismo de una variedad de reductasas, peroxidasas, catalasas y oxidasas). La mayoría de los radicales libres producidos in vivo son oxidantes, capaces de oxidar una amplia gama de moléculas biológicas, incluyendo carbohidratos, aminoácidos, ácidos grasos y nucleótidos, pudiendo producirse la peroxidación de las membranas lipídicas, la hidroxilación de las bases de los ácidos nucleicos y la oxidación de grupos sulfhidrilos y de otros puntos sensibles de las proteínas.

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POSIBLES MECANISMOS DE PRODUCCIÓN DE RADICALES LIBRES DURANTE EL EJERCICIO FÍSICO

Existen diversas fuentes de producción de RL durante el ejercicio:

• Una de ellas sería por un "escape" de electrones, en la cadena mitocondrial de transporte de electrones con producción de anión superóxido (O2

•-)4-7. Considerando que durante el ejercicio el consumo total de O2 aumenta entre 10 y 20 veces8 y que a nivel del músculo el flujo es aun 10 veces mayor9, es razonable suponer que la producción mitocondrial de O2

•- se halla igualmente incrementada.

• Otro mecanismo posible es el de isquemia-reperfusión. Durante el ejercicio, el flujo sanguíneo es restringido en numerosos órganos y tejidos para aumentar el aporte a los músculos activos. Por ello, las regiones privadas temporalmente del flujo adecuado ingresan en un estado de hipoxia, que es tanto mayor cuanto más intenso es el ejercicio, y más aún si se supera la capacidad aeróbica máxima. Incluso el propio músculo activo entra en un estado de hipoxia por insuficiente aporte energético. Al finalizar la actividad intensa, todas las áreas afectadas son reoxigenadas, produciéndose el fenómeno de isquemia-reperfusión con la conocida producción de RL que la acompaña10-11.

• Un tercer posible mecanismo de generación de RL es la autooxidación de catecolaminas, cuyos niveles suelen estar aumentados durante el ejercicio12.

DEFENSAS ANTIOXIDANTES

Como es imposible prevenir la producción “in vivo” de todos los radicales libres, no es sorprendente que los organismos hayan desarrollado una amplia variedad de defensas antioxidantes. Se conocen como antioxidantes todas aquellas sustancias capaces de impedir la acción de los radicales libres neutralizando el efecto pernicioso de estos. Son moléculas capaces de captar el electrón desapareado del orbital externo y desactivar los radicales libres. Guterridge y Mitchell13 las clasifican según su mecanismo de acción en:

• Defensas primarias, que previenen la formación de RL • Defensas secundarias, que inactivan o “barren” los RL ya formados • Defensas terciaras, que retiran o reparan el daño oxidativo, particularmente el

DNA.

Según su estructura molecular se clasifican en enzimáticos y no enzimáticos. El control enzimático se produce por la acción de enzimas dependientes de iones y metales (Cu, Mn, Se y Zn) como superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa (GPx), y glutatión redutasa (GR), en tanto que el control no enzimático incluye a antioxidantes como glutation, ácido ascorbico y ácido úrico como compuestos hidrosolubles y la vitamina E y los carotenos como liposolubles.

A lo largo de su evolución, el organismo humano ha desarrollado mecanismos de defensa antioxidante que se encuentran ampliamente distribuidos en distintos orgánulos celulares y subcelulares (Tabla 1).

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Tabla 1. Antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos (modificado de Powers y Lennon, 199914)

Antioxidantes enzimáticos

Ubicación celular Propiedades antioxidantes

Mn superóxido dismutasa Mitocondria Dismutasa radicales peróxido

Cu-Zn superóxido dismutasa

Citosol Dismutasa radicales superóxido

GHS peroxidasa Citosol y mitocondria Descompone H2O2 e hidroperóxidos orgánicos

Catalasa Citosol y mitocondria Descompone H2O2Antioxidantes no enzimáticos

Vitamina E Compuestos fenólicos solubles en lípidos; localizada en membranas

Principal antioxidante que disrumpe la cadena de peroxidación lipídica

Vitamina C (ácido ascórbico)

Soluble en agua; localizada en citosol

Neutraliza una amplia variedad de ROS en fase acuosa; regenera vitamina E

GSH Citosol y mitocondria Ácido lipoico Tiol endógeno; localizado

tanto en fase acuosa como en la lipídica

Interviene en el reciclado de vitamina C; puede ser buen sustituto de GSH

Ubiquinonas Derivados de quinona soluble en lípidos; localizadas en membrana

Las formas reducidas son antioxidantes eficientes

Carotenoides Soluble en lípidos; localizados principalmente en membranas

Antioxidantes; reduden la peroxidación lipídica

El ácido úrico (AU) es el producto final del metabolismo de las purinas en humanos y se encuentra en la sangre en forma de urato monosódico, en concentraciones muy superiores a las del resto de primates por carecer el ser humano de la enzima urato oxidasa. El AU es considerado un potente antioxidante extracelular, ya que elimina radicales solubles en agua tales como ácido hipocloroso, peroxinitrito y oxigeno singlete15-18. Algunos estudios demuestran que el AU representa una gran parte (>50%) de la capacidad antioxidante plasmática19. Así, el AU ayuda a proteger las membranas celulares, a los eritrocitos, el ácido hialurónico y el ADN de la oxidación por RL. Otra propiedad antioxidante importante del AU es la capacidad para formar complejos estables con iones de hierro. Este proceso inhibe Fe3+, que cataliza la oxidación del la vitamina C y la peroxidación lipídica. Por lo tanto, el AU es un protector de la vitamina C19. El ejercicio físico intenso incrementa la concentración plasmática del AU, el cual puede difundir en los músculos para protegerlos de la oxidación por los RL. Así, el AU es uno de los antioxidantes más importantes en plasma y músculo, si bien el incremento en sus niveles plasmáticos durante el ejercicio podría ser debido al aumento de la actividad de la xantina oxidasa (XO).

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EJERCICIO FÍSICO Y ESTRÉS OXIDATIVO

Durante la actividad física, aun en individuos entrenados, se incrementa notablemente la producción de radicales libres y, por lo tanto, es mayor el requerimiento de mecanismos de defensa antioxidante. Algunas de las defensas antioxidantes se adecuan con el entrenamiento, pero pueden ser superadas cuando se excede el nivel de ejercicio al cual se han adaptado, generando una situación de estrés oxidativo. El término estrés oxidativo fue definido por Sies20 como una alteración del balance entre agentes oxidantes y antioxidantes en la célula, a favor de los primeros. El estrés oxidativo depende no sólo de la agresividad química del propio oxidante, sino también de la cantidad de estos y del tiempo de exposición, así como del tipo de tejido que sufra el efecto y de la eficacia de las defensas antioxidantes disponibles21,22.

Pero no sólo las especies reactivas del oxígeno (ROS) son las causantes del estrés oxidativo en el organismo. También ejercen un importante papel las especies reactivas del nitrógeno, que son las causantes del llamado estrés nitrosativo, y entre ellas el óxido nítrico (NO) y el peroxinitrito generado por la reacción del NO con el radical superóxido

En 1978 se demostró por primera vez que el ejercicio físico podía conducir a un incremento en la peroxidación lipídica. Dillard y col.23 observaron un aumento de 1,8 veces en el nivel de pentano exhalado, un subproducto de la peroxidación lipídica, después de 60 minutos de bicicleta. Desde entonces se han acumulado crecientes evidencias que sostienen la hipótesis de que la actividad física tiene el potencial de aumentar la producción de radicales libres y conducir al estrés oxidativo.

Figura 1. Esquema de la peroxidación lipídica Oxidación protéica. La modificación oxidativa de las proteínas in vivo es una consecuencia de la vida

aerobia. Las especies reactivas de oxígeno y otros radicales, que se generan como subproductos del metabolismo celular causan la oxidación en los aminoácidos integrantes de las proteínas lo que conlleva la pérdida de la función proteica y/o actividad enzimática.

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El grado de alteración de los aminoácidos y las proteínas causado por estrés oxidativo depende de muchos factores, entre los que cabe destacar la naturaleza y localización relativa de la fuente del oxidante o radical libre, la proximidad del radical/oxidante a las proteínas y de la naturaleza y concentración de enzimas y compuestos antioxidantes disponibles.

Ciertos componentes aminoácidos de las proteínas (histidina, arginina, lisina y prolina) son sensibles a la oxidación catalizada por metales, formando grupos carbonilos en las cadenas laterales de las proteínas24,25. El ejercicio intenso y prolongado puede inducir la formación de grupos carbonilos.

Figura 2. Productos de oxidación de aminoácidos

El contenido de proteínas carboniladas generadas por la ruptura y oxidación de

la cadena polipeptídica principal o por la oxidación de las cadenas laterales en los aminoácidos como arginina, lisina, prolina y treonina es utilizado como marcadora de estrés oxidativo26.

Otro marcador de daño oxidativo a proteínas es la 3-Nitrotirosina, derivado del NO y que, además de ser utilizado como marcador de la producción del mismo, también está considerada como un marcador de la inflamación tisular.

El grado de aumento del contenido de proteínas oxidadas en tejidos depende del grado de producción de radicales libres, de la eficacia de su eliminación por las defensas antioxidantes, y de la capacidad de renovación de las proteínas dañadas. La disminución a los valores normales del contenido de grupos carbonilos del músculo esquelético, indica que el proceso de remoción funciona adecuadamente, y de que existe mucha evidencia de que el entrenamiento físico aumenta las defensas antioxidantes. Existe por lo tanto una fuerte evidencia de que los radicales libres aumentan con el ejercicio y de que, aun el incremento en las defensas antioxidantes por el entrenamiento, resulta inadecuado para contrarrestarlos. Por otra parte, existen evidencias de que el ejercicio físico también incrementa los niveles del aminoácido sulfurado homocisteína (Hcy)27-29, el cual es derivado del metabolismo de la metionina. La homocisteína plasmática total (tHcy) es un factor independiente de riesgo cardiovascular, incluyendo arteriosclerosis, enfermedad arterial coronaria, enfermedad cerebrovascular e infarto de miocardio30. Estudios previos

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muestran que la Hcy contribuye a la patogénesis de la arterioesclerosis causando disfunción endotelial y promoviendo el crecimiento de las células vasculares del músculo liso, patología que forma parte del proceso aterogénico. Se piensa que estos efectos adversos son debidos a su estrecha relación con el proceso de oxidación celular. Así, la Hcy genera ROS (superóxidos y peróxido de hidrógeno), los cuales están asociados a lesiones de los endotelios de los vasos arteriales, y/o a la disminución de la biodisponibilidad del óxido nítrico (NO) endotelial. Daño oxidativo al DNA.

Los ácidos nucleicos son igualmente blanco del ataque oxidativo y constituyen

un componente del daño celular que puede tener efectos considerables en el largo plazo. Existe información de la presencia de bases de ADN oxidadas en tejido pulmonar después del ejercicio.

El radical hidroxilo (OH•) reacciona con todos los componentes de la molécula

de DNA: el esqueleto de la desoxiribosa y las bases púricas y pirimidicas. La agresión del radical hidroxilo (OH•) del DNA da como resultado una serie de productos finales tales como: (FDP-Ade) 5-formamido-4,6diamino-pirimidina; (8-OH-Gua) 8-hidroxi-guanina; (5,6-OH-Tim) timina glicol y (5-OH-Cit) 5,6-dihidroxi citosina. Las alteraciones en la hélice del DNA incluyen distorsión, rotura de una o de las dos cadenas, cruzamientos entre cadenas y aberraciones cromosómicas.

Figura 3. Productos finales de la agresión al DNA por radicales libres. El daño oxidativo a los ácidos nucleicos se determina midiendo la concentración

de 8-hidroxiguanosina (8-OHG) en orina, un marcador de la oxidación del ARN, sirviendo de muestra basal la orina recolectada antes del ejercicio. Se ha demostrado que el entrenamiento reduce el daño oxidativo derivado del ejercicio31,32.

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Cambios en el estatus antioxidante durante el ejercicio

La determinación del status antioxidante constituye un signo directo de estrés oxidativo. La mejor respuesta se ha observado con el glutatión, que se encuentra en sus formas reducida (GSH) y oxidada (GSSG). Existe coincidencia en afirmar que el ejercicio produce oxidación del glutatión en sangre. La única explicación de la importante y rápida disminución del GSH en el ejercicio radicaría en un aumento de formación de metahemoglobina. Un aumento de la frecuencia en la desoxigenación y reoxigenación de la hemoglobina durante el ejercicio conduce a la formación de metahemoglobina; el 3% de la hemoglobina total se encuentra en la forma oxidada33. La formación de metahemoglobina va acompañada de producción de radical superóxido (O2

•-) que es rápidamente dismutado a H2O2 por la SOD. El H2O2 es eliminado por acción de la glutatión peroxidasa en los eritrocitos, causando una marcada pérdida de GSH y acumulación de GSSG. El ejercicio intenso y prolongado aumenta de forma significativa el estrés oxidativo lo que se ve reflejado en grandes respuestas del sistema glutatión. EJERCICIO FÍSICO Y ESTRÉS NITROSATIVO

Las especies reactivas del nitrógeno (RNS), son las causantes del llamado estrés nitrosativo, y entre ellas el óxido nítrico (NO) y el peroxinitrito generado por la reacción del NO con el radical superóxido.

El óxido nítrico (NO), además de una alta reactividad, tiene un tiempo de vida media muy efímero, de ahí que su determinación resulta difícil y costosa. Por ello, se utiliza frecuentemente la determinación de metabolitos estables, como nitratos (NO3¯) y nitritos (NO2¯). Habitualmente, se expresan los niveles de la suma de los 2 metabolitos (NOx), lo que da una idea general de la producción de NO en el organismo. El NO desempeña un papel crucial en la regulación del tono vascular basal, y se piensa que un aumento en la producción de NO está relacionada con el descenso de la presión sanguínea observada en la realización de ejercicio de manera regular, actuando como mecanismo de adaptación34. BIOMARCADORES DE ESTRÉS OXIDATIVO

Los deportistas que, regularmente, se someten a ejercicios físicos extenuantes, a lo largo de los años pueden acumular productos de daño molecular especialmente en: músculo esquelético, hueso, cartílago, hígado e inflamación generalizada. Por ello, la utilización de sustancias antioxidantes, que disminuyen dicha acumulación, podría contribuir a mejorar la salud a largo plazo de los atletas, de ahí la importancia de desarrollar estrategias que permitan no sólo mejorar sino también prevenir sus lesiones. Powers et al35., encontraron, que el ejercicio físico llevado a cabo de forma habitual, produce una elevación significativa de los enzimas antioxidantes y como consecuencia el deportista ve retrasada la parición de cansancio. Si el ejercicio aumenta la producción de RL, dicho aumento debe, también, evidenciarse. Medir la producción de radicales libres directamente es difícil, principalmente, por la corta vida de éstas especies reactivas. Por ello lo más común es la determinación indirecta de su presencia cuantificando el daño producido a los lípidos

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(peroxidación lipídica) o a las proteínas (formación de grupos carbonilos) o al DNA (concentración de 8-hidroxiguanosina). Estas determinaciones pueden realizarse en: muestras de sangre entera, en plasma, suero y orina. Respecto a la metodología utilizada es habitual utilizar determinaciones espectrofotométricas, colorimétricas, Enzimoinmunoensayos, ELISAS, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases (CG) entre otros.

1. Determinación de antioxidantes a) valoración de antioxidantes enzimáticos

Incluye la determinación de la actividad enzimática de: superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutation peroxidasa (GPx) y glutation reductasa (GR).

b) valoración de antioxidantes no enzimáticos Incluye la determinación de ácido úrico, vitamina C, vitamina E, etc.

c) valoración del poder antioxidante total d) valoración de peróxido de hidrógeno (H2O2)

2. Determinación de peroxidación lipídica

Incluye la determinación de los productos finales de la fragmentación de los ácidos grasos poliinsaturados de las membranas lipídicas. a) Determinación de Malondialdehído (MDA) b) Determinación de 4-Hidroxinonenal (HNE) c) Determinación de pentano y otros hidrocarburos

3. Determinación de oxidación proteica

Incluye la determinación del contenido de: a) Proteínas carboniladas b) Aminoácidos oxidados

4. Determinación del daño oxidativo al DNA

Se determina midiendo la concentración de (8-OHdguanosina) 8- hidroxideoxiguanosina

BIOMARCADORES DE ESTRÉS NITROXATIVO

1. Determinación de óxido nítrico (NO) Se determina midiendo la concentración de Nitritos y Nitratos.

CONCLUSIONES

Los beneficios del ejercicio regular son bien conocidos, incluyendo la mejoría funcional del aparato cardiovascular, aumento del metabolismo energético y las defensas antioxidantes, mayor fuerza y resistencia muscular y disminución de la osteoporosis.

Existen, no obstante, ciertas desventajas tales como el aumento del consumo de antioxidantes titulares y cambios en su estado redox, además el estrés inducido por el ejercicio está incrementado por un estado deficitario en antioxidantes.

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Los individuos que, regularmente, se someten a ejercicios físicos extenuantes, a lo largo de los años pueden acumular productos de daño molecular. Por ello, los suplementos antioxidantes, que disminuyen dicha acumulación, podrían contribuir a mejorar la salud a largo plazo de los atletas.

El conocimiento del modo como interactúan los antioxidantes ofrece la posibilidad de desarrollar estrategias nutricionales que permitan prevenir tanto el progreso de las afecciones degenerativas del envejecimiento, como las situaciones clínicas agudas que se generan por el estrés oxidativo. Para lograr una comprensión efectiva de la protección que brindan, es esencial evaluar todas las sustancias y enzimas antioxidantes.

RESUMEN El ejercicio físico extenuante eleva la producción de radicales libres de oxígeno ocasionando estrés oxidativo, tanto durante el tiempo que dura la actividad como durante el periodo de recuperación. Existen diversas fuentes para este mecanismo, que incluyen la producción de anión superóxido por la mitocondria, el fenómeno de isquemia-reperfusión, y la autooxidación de las catecolaminas. Un ejercicio intenso o prolongado puede superar las defensas antioxidantes, entre las que se encuentran las vitaminas C y E, y los tioles, así como las enzimas antioxidantes. La evidencia de un estrés oxidativo durante el ejercicio se demuestra midiendo el daño a las biomoléculas y el estado de defensas antioxidante. Existe escasa evidencia de que los antioxidantes aumenten el rendimiento en los deportistas, pero un número extenso de trabajos indican que aquellos pueden disminuir el estrés oxidativo. Esto sugiere que el beneficio secundario a la administración de antioxidantes debe ser esperado en el largo plazo. BIBLIOGRAFÍA 1. Ji LL: Oxidative stress during excercise: Implications of antioxidant nutrients. Free Rad Biol Med 1995; 18: 1079-1086. 2. Sjodin B, Westing H, Apple FS: Biochemical mechanisms for oxygen free radical formation during excercise. Sports Med 1990; 10: 236-254. 3. Sen CK, Rankinen T, Vaisanen S, Rauramaa R: Oxidative stress after human excercise: effect after N-acetylcysteine supplementation. J Appl Physiol 1994; 76: 2570-2577. 4. Boveris A, Chance B: The mitochondrial generation of hydrogen peroxide: general properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J 1973; 134: 707-716. 5. Boveris A, Cadenas E: Mitochondrial production of superoxide anions and its relationship to the antimycin insensitive respiration. FEBS Lett 1975; 54: 311-314. 6. Cadenas E, Boveris A, Ragan CI, Stoppani OM: Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone redcutase and ubiquinol-cytochrome c reductase from beef heart mitochondria. Arch Biochem Biophys 1977; 180: 248-257. 7. Sjodin B, Hellsten Westing Y, Apple FS: Biochemical mechanisms for oxygen free radical formation during excercise. Sports Med 1990; 10: 236-254. 8. Astrand PO, Rodhal K: Textbook of work physiology. New York, McGraw Hill 1986. 9. Keul J, Doll E, Koppler D: Energy metabolism of human muscle. Basel S. Karger 1972.

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