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CONSEJO DE REDACCIÓN

EDITOR:Marta Eulalia García Sá[email protected]

VOCALES:Gorka Adúriz RekaldeCarlos ÁlvarezRamón JustePere Busquets RelatsConcepción Caballero GalvánJosep Carrera MauriLourdes PorquetCarmina Nogareda BurchJosé Marín Sánchez

REDACCIÓN:Secretaría de AVEDILA Parque Tecnológico de Bizkaia, 812Berreaga, 148160 DerioBizkaiaPágina web: http://www.avedila.com

EDITA:PRODIVE, S.A. para AVEDILA

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DISEÑO Y MAQUETACIÓN:PRODIVE, S.A.

FOTO PORTADA:Cartel anunciador del Simposio de AVEDILAque tendrá lugar en Zaragoza.

PUBLICACIÓN DE LA ASOCIACIÓN DEVETERINARIOS ESPECIALISTAS ENDIAGNÓSTICO LABORATORIAL

Dep. Legal: M-42157-1997ISSN 1697 – 8099

Estamos viviendo unos tiempos en los que se habla reiterativamente

de crisis, sobretodo de crisis económica. Afecta a todos los sectores

de la sociedad y de la economía. También a los laboratorios de

diagnóstico, centros de investigación, universidades, y tanto a los

centros oficiales como a los privados.

A pesar de todo ello, creemos que no debemos caer en fatalismos.

Quien atribuye a la crisis sus fracasos y penurias, violenta su propio

talento y respeta más los problemas que a las soluciones.

Debemos enfrentarnos a la crisis y pensar que éstas traen progresos

siempre. De la crisis debe surgir la creatividad, la inventiva, el

ingenio, los descubrimientos, las grandes estrategias. Quien supera

las crisis, se supera a si mismo sin quedar superado. Debemos pensar

que sin crisis no hay desafios, sin crisis no hay méritos y que en

tiempos de crisis es cuando aflora lo mejor de cada uno.

Hablar de crisis es promoverla, y callar en la crisis es exaltar el

conformismo. En vez de esto, trabajemos duro, trabajemos en

equipo, invirtamos más recursos en nuestro día a día, apliquemos

mejores prácticas comerciales, seamos más competitivos, que no

significa ser más resistentes.

Como dijo Albert Einstein, acabemos de una vez con la única

crisis amenazadora, que es la tragedia de no querer luchar por

superarla.

Hecho este comentario estimulador y optimista, y cambiando a

temas propios de nuestra asociación, comunicaros que ya tenemos

acabado el programa definitivo del XV Simposio anual de AVEDILA

a celebrar en Zaragoza los dias 18 y 19 del próximo mes de

noviembre, que esperemos y deseamos de todo corazón sea el inicio

de una nueva etapa, después de haber llevado a cabo con éxito la

organización del Congreso Mundial en Madrid y de haber renovado

la Junta Directiva con sabia nueva.

También comunicaros que está a punto de estrenarse la nueva

página web de AVEDILA, con nuevos contenidos actualizados,

modernizada en sus funciones y adaptada a los medios actuales de

comunicación. Os invitamos a entrar en ella tan pronto esté a punto,

así como a inscribiros y a participar en el próximo Simposio.

La Junta Directiva

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RESUMEN

Las técnicas moleculares se han convertido enuna herramienta esencial para la investigación mi-cológica básica y aplicada. Para poder sacar el má-ximo partido a las posibilidades que ofrecen estastécnicas, resulta esencial el desarrollo de métodosde aislamiento de ADN fúngico que sean simples,de bajo coste, rápidos y repetibles.

En este trabajo se compara un sistema semiau-tomático de aislamiento de ácidos nucleicos convarios protocolos manuales de extracción deADN de hongos a partir de distintos tipos demuestra: cultivos en placa de hongos filamento-sos y levaduras, conidias, micelio seco y mues-tras de pelo experimentalmente infectado pordermatofitos. La comparación entre los procedi-mientos manuales y semiautomático se realizó a

tres niveles: rendimiento, pureza de los extractosde ADN y tiempo empleado. La calidad del ADNaislado fue también comprobada en reaccionesde PCR.

El procedimiento semiautomático de extracciónde ADN fúngico descrito en este trabajo presentaclaras ventajas con respecto a los métodos manua-les convencionales: reduce considerablemente eltiempo de manejo, evita el uso de sustancias quí-micas nocivas, minimiza el riesgo de contamina-ción cruzada y mejora la repetibilidad del proceso.Estas múltiples ventajas hacen que este procedi-miento sea adecuado para su aplicación a las técni-cas moleculares utilizadas en los laboratorios dediagnóstico e investigación.

Palabras clave: ADN; dermatofitos; hongos fila-mentosos; levaduras; PCR.


AISLAMIENTO DE ADN DE HONGOS:COMPARACIÓN DE MÉTODOS MANUALES CON UN NUEVO

PROCEDIMIENTO SEMIAUTOMÁTICO

Sergio Álvarez-Pérez, José L. Blanco *, Patricia Alba y Marta E. García

Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense. 28040 Madrid. España.

* AUTOR PARA LA CORRESPONDENCIA: Dr. José L. Blanco. Departamento Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. UCM. 28040 Madrid. España.Teléfono: +34 91 394 3717 - Fax: +34 91 394 3908E-mail: [email protected]

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ABSTRACT

Molecular techniques have become an essentialtool for basic and applied mycological research. Totake maximum advantage of the possibilities thatthese techniques offer, the development of simple,low cost, fast and repeatable methods for fungalDNA isolation is essential.

In this work, a semiautomated system for isola-tion of nucleic acids was compared with manualprotocols for DNA extraction from fungi usingdifferent types of sample: plate cultures ofmoulds and yeasts, conidia, dry mycelium andhair samples infected by dermatophytes. Thecomparison between manual and semiautomatedsystems was made at three levels: yield, purity ofthe DNA extract and time required for the proto-col. The quality of the isolated DNA was also tes-ted in PCR reactions.

The semi-automated procedure for fungal DNAextraction described in this work presents clear ad-vantages with respect to conventional manual me-thods: it reduces the handling time considerably,prevents the use of noxious chemicals, minimizesthe risk of cross-contamination and improves therepeatability of the process. These multiple advan-tages make this procedure suitable for applicationto the molecular techniques used in diagnostic andresearch laboratories.

Key words: DNA; dermatophytes; moulds; ye-asts; PCR.

INTRODUCCIÓN

En los últimos años se vienen aplicando conéxito distintas técnicas moleculares tanto aldiagnóstico de enfermedades fúngicas como altipado de cepas, el esclarecimiento de las rela-ciones filogenéticas entre distintas especies dehongos y el estudio de diversos factores relacio-nados con su patogenicidad [2-4,10,18,21-24,26]. Para aprovechar al máximo las posibili-dades que ofrecen estas técnicas, se hace im-prescindible el desarrollo de métodos deextracción de ácidos nucleicos que sean rápidos,sencillos y repetitivos.

A pesar de los intentos por encontrar metodolo-gías de extracción de ADN aplicables a todo tipode organismos [1,8], a día de hoy no se dispone nisiquiera de un procedimiento válido para todas lasespecies fúngicas [19]. La principal dificultad quepresentan los hongos respecto a otros organismos ala hora de extraer su ADN se debe a la existenciade una gruesa pared celular [12,14,33], la cual estácompuesta por capas de quitina, glucanos, lípidosy péptidos [19]. Además, en algunos casos, estacompleja pared incluye melaninas, las cuales sonaltamente resistentes a la digestión enzimática y ala ruptura química [19]. Finalmente, ciertas espe-cies fúngicas poseen cápsulas de naturaleza polisa-carídica, como es el caso de algunas especies delgénero Cryptococcus [9].

La mayoría de los protocolos de extracción deADN fúngico existentes incluyen la ruptura mecá-nica de la pared del hongo, ya sea por liofilizacióno congelación en nitrógeno líquido, seguida delhomogeneizado del micelio en un mortero, la dis-rupción del mismo mediante perlas de vidrio u otromaterial, o su sonicación [1,6,7,11,12,18,19,33].Estos tratamientos físicos suelen funcionar mejorque los tratamientos químicos o enzimáticos alter-nativos [6,19,33], pero son lentos y laboriosos, porlo que resultan inadecuados cuando hay que proce-sar un elevado número de muestras [11,12,15].

En función de todo lo apuntado, resulta de graninterés el desarrollo y estandarización de nuevastécnicas que permitan mejorar el rendimiento en laextracción de ADN fúngico. En este sentido, laaparición de procedimientos automáticos o se-miautomáticos se presenta como una alternativaatractiva, que, además, permite maximizar la efi-ciencia cuando se procesa un elevado número demuestras.

En el presente trabajo se compara un sistema se-miautomático de extracción de ADN con diferen-tes procedimientos de extracción manual de ADNfúngico a partir de diferentes tipos de muestra: cul-tivos en placa de hongos filamentosos y levaduras,conidias, micelio seco, y muestras de pelo experi-mentalmente infectadas por hongos dermatofitos.Dicha comparación se hizo a tres niveles: i) rendi-miento; ii) pureza del ADN obtenido; y iii) tiempoempleado en el procedimiento de extracción. Por

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otro lado, se comprobó la calidad de los extractosde ADN obtenidos a través de su comportamientoen distintas técnicas de amplificación de ácidos nu-cleicos por PCR.

MATERIAL Y MÉTODOS

Preparación de las muestras

Se partió de cuatro tipos de muestras:

i) Cultivos en placa de siete cepas de hongosfilamentosos (Alternaria alternata, Asper-gillus fumigatus, A. niger, A. parasiticus,Microsporum canis, Trichophyton menta-grophytes y Rhizopus stolonifer) y cuatrocepas de levaduras (Candida albicans, C.parapsilosis, Cryptococcus laurentii yRhodotorula mucilaginosa) (Tabla 1). To-das estas cepas fueron cultivadas en agarSabouraud (bioMérieux, Marcy l’Etoile,Francia) a 30°C. Los cultivos de levadurasfueron incubados durante 48 h, mientrasque en el caso de los hongos filamentososla incubación de los cultivos se prolongóhasta que se obtuvo crecimiento abundan-te. Para extraer el ADN, setomó un pequeño inóculo(aproximadamente 5 mg)de cada uno de los culti-vos con el asa de siem-bra y se depositó en unmicrotubo de 1’5 ml devolumen.

ii) Conidias de A. fumigatus:Se preparó una suspen-sión de conidias de A. fu-migatus en tampón fosfa-to salino-Tween 20 al0’1% (PBS-T). A conti-nuación, se tomaron alí-cuotas de 500 µl de lasuspensión preparada y setransfirieron a microtubosde 1’5 ml de volumen,los cuales fueron centri-fugados durante 5 min a8000 g para depositar lasconidias en el fondo y

poder descartar el sobrenadante. Este proce-dimiento fue repetido hasta que se obtuvie-ron aproximadamente 5 mg de conidias portubo.

iii) Micelio seco de A. fumigatus: A partir deuna suspensión de conidias de A. fumigatusen PBS-T, se inocularon 100 conidias en unmatraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía100 ml de caldo Czapek-Dox (Pronadisa,Madrid, España). El matraz fue incubado enun agitador orbital a 37°C y en agitación(140 rpm) durante 72 h, tiempo en el cual elhongo no llegó a esporular. Tras la incuba-ción, el contenido del matraz se filtró a tra-vés de un papel de filtro sin cenizas y este-rilizado en el autoclave (Albet n° 140, 15cm de diámetro; Barcelona, España) y selavó dos veces con PBS frío para eliminarel resto de caldo de cultivo que hubiera po-dido quedar. El micelio lavado se secó en laestufa a 37°C durante 1 h. Por último, se to-maron varios fragmentos de aproximada-mente 5 mg de micelio seco, los cuales seintrodujeron en microtubos de 1’5 ml devolumen.

iv) Muestras de pelo canino procedentes de unindividuo sano e infectadas experimental-


Especie Cepa Origen

Hongos filamentosos

Alternaria alternata C-2662 CECTa

Aspergillus fumigatus AF-103 Clínico: AI en un paciente humano

Aspergillus niger C-2089 CECT

Aspegillus parasiticus C-2681 CECT

Microsporum canis D-1002 Clínico: dermatofitosis animal

Rhizopus stolonifer C-2344 CECT

Trichophyton mentagrophytes D-9999 Clínico: dermatofitosis animal

Levaduras

Candida albicans C-1001 CECT

Candida parapsilosis A-8L Clínico: otitis animal

Cryptococcus laurentii C-1077 CECT

Rhodotorula mucilaginosa A-56A Clínico: tráquea de un ave salvaje

Tabla 1: Cepas fúngicas utilizadas en las técnicas de extracción de ADN comparadas en este trabajo.

a CECT: Colección Española de Cultivos Tipo (Burjassot, Valencia).

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mente por hongos dermatofitos. La infecciónexperimental se realizó insertando con ayudade unas pinzas esterilizadas a la llama unapequeña cantidad de pelo en los cultivos enplaca de M. canis y T. mentagrophytes, loscuales habían sido crecidos previamente du-rante 12 días a 30°C en medio Sabouraudadicionado con 0’5 g · l-1 de cloranfenicol(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EstadosUnidos) y 0’5 g · l-1 de cicloheximida (Sig-ma-Aldrich). Tras incubar a 30°C durante 72h, se tomaron muestras de aproximadamente5 mg de pelo infectado y se introdujeron enmicrotubos de 1’5 ml de volumen.

Procedimiento manual para la extracción deADN a partir de cultivos en placa, conidias ymicelio seco

Para llevar a cabo la extracción del ADN a par-tir de estos tres tipos de muestra se utilizó unamodificación de la metodología descrita por Liuet al. [25-26]. Brevemente, a los microtubos quecontenían el inóculo (5 mg de cultivo en placa, 5mg de conidias ó 5 mg de micelio seco) se aña-dieron 500 µl de un tampón de lisis compuestopor 400 mM de Tris-HCl (pH 8’0), 60 mM deEDTA (pH 8’0; Sigma-Aldrich), 150 mM deNaCl (Panreac, Barcelona, España) y un 1% (p/v)de SDS (Sigma-Aldrich). A continuación, los tu-bos fueron agitados en un agitador vórtex e incu-bados a 65°C durante 2 h. Tras el tiempo de lisa-do, se añadieron a cada microtubo 150 µl de solu-ción de acetato de potasio (pH 4’8), preparado apartir de 6 ml de acetato de potasio 5 M, 1’15 mlde ácido acético glacial (Panreac) y 2’85 ml deagua destilada. Los microtubos fueron agitadosde nuevo en el agitador vórtex y centrifugados a8000 g durante 5 min. Finalizada la centrifuga-ción, los sobrenadantes de cada microtubo fuerontransferidos a nuevos microtubos y centrifugadosde nuevo bajo las mismas condiciones. Tras la se-gunda centrifugación, cada sobrenadante fuetransferido a un nuevo microtubo, añadiéndose acada uno de ellos un volumen de 2-isopropanol(Sigma-Aldrich) igual al volumen de sobrenadan-te recuperado en cada caso. Los microtubos fue-ron posteriormente agitados por inversión y cen-trifugados a 16000 g durante 15 min para precipi-tar el ADN, eliminando luego el sobrenadante. El

precipitado de ADN contenido en cada microtubofue lavado con 300 µl de etanol frío al 70% (v/v)(Panreac) y centrifugado a 16000 g durante 10min para eliminar el sobrenadante. Finalmente,los precipitados de ADN fueron secados a 37°Cpara eliminar todas las trazas de etanol y resus-pendidos en 150 µl de agua destilada estéril.

Procedimiento manual para la extracción deADN a partir de muestras de pelo infectadoexperimentalmente por dermatofitos

La extracción del ADN de dermatofitos a partirde muestras de pelo canino infectadas experi-mentalmente se realizó mediante el método delfenol-cloroformo. Brevemente, las muestras (5mg de pelo infectado por dermatofitos) fueronincubadas a 37°C durante toda la noche (~16 h)en 500 µl de tampón de lisis (0’1 mM de EDTA,1% (p/v) de SDS, 10 mM de Tris-HCl [pH 8’0] y0’3% 2-mercaptoetanol [Sigma-Aldrich]) [16],añadiendo además 25 µg de proteinasa K (Sigma-Aldrich) y 0’5 mg de enzima de lisis procedentede Trichoderma harzianum (Sigma-Aldrich).Tras la incubación, a cada microtubo se le aña-dieron 500 µl de una mezcla de fenol (Sigma-Al-drich), cloroformo (Scharlau, Barcelona, España)y alcohol isoamílico (Sigma-Aldrich) en la pro-porción 25:24:1. Los tubos fueron agitados bre-vemente en un agitador vórtex y centrifugados a16000 g durante 10 min, transfiriendo despuéscada sobrenadante a un nuevo microtubo. Trasañadir un volumen de una mezcla de cloroformoy alcohol isoamílico (24:1) igual al volumen delsobrenadante transferido a cada microtubo, sevolvió a agitar en el agitador vórtex y a centrifu-gar bajo las mismas condiciones que en el pasoanterior. A partir de los sobrenadantes recupera-dos y transferidos a un nuevo microtubo, se pro-cedió a precipitar el ADN añadiendo 1/10 de vo-lumen de acetato de sodio 2 M (Sigma-Aldrich)y 2 volúmenes de etanol absoluto (Panreac) frío.Tras incubar las muestras durante toda la noche a–20°C, los precipitados de ADN fueron lavadoscon etanol al 70% (v/v) frío, precipitados me-diante centrifugación a 16000 g durante 5 min ylavados de nuevo. Finalmente, los precipitados deADN fueron secados a 37°C para eliminar todaslas trazas de etanol y resuspendidos en 150 µl deagua destilada estéril.


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Procedimiento semiautomático de extracciónde ADN

El procedimiento semiautomático para la extrac-ción de ADN fue el mismo en cada caso, indepen-dientemente del tipo de muestra de partida (5 mgde cultivo en placa, conidias, micelio seco o peloinfectado experimentalmente por dermatofitos). Laextracción de ADN fue llevada a cabo utilizando elsistema semiautomático QuickGene-810 NucleicAcid Isolation System (Fujifilm, Tokio, Japón).

El protocolo estándar recomendado por el fabri-cante del kit fue adaptado a las condiciones denuestro laboratorio. Brevemente, se añadieron 180µl del tampón de lisis MDT (Fujifilm) y 20 µl deproteinasa K (Fujifilm) a cada uno de los microtu-bos que contenían las muestras. Tras incubar a55°C toda una noche, se centrifugaron los lisados a8000 g durante 5 min, con objeto de precipitar to-dos los restos no digeridos. Los sobrenadantes fue-ron transferidos a nuevos microtubos y se añadie-ron 180 µl del tampón LDT (Fujifilm), incubándo-se luego a 70°C durante 10 min. Tras añadir 240 µlde etanol absoluto (Panreac), los microtubos fue-ron agitados en un agitador vórtex y los lisadosfueron cargados en los cartuchos incluidos en elkit. Finalmente, el sistema semiautomático fue pre-parado para la extracción de ADN siguiendo lasindicaciones del fabricante, incluyéndose las canti-dades recomendadas de tampón de elución (CDT,Fujifilm) y tampón de lavado (WDT, Fujifilm).

Comparación de métodos de extracción deADN

La cuantificación de los extractos de ADN obte-nidos por los procedimientos manuales o el proce-dimiento semiautomático fue llevada a cabo porespectrofotometría UV utilizando una cubeta decuarzo de 10 mm de paso óptico (Ultrospec;Amersham Pharmacia Biotech, Barcelona, Es-paña). La cantidad de ADN fue estimada asumien-do que una unidad de absorbancia o densidad ópti-ca a 260 nm (DO260 = 1) equivale a 50 ng · µl-1 deADN bicatenario [13,20,34]. Para evaluar la pure-za del ADN se determinó el cociente entre las ab-sorbancias a 260 y 280 nm (DO260/DO280). Se consi-deró que la pureza del ADN era adecuada cuandoeste cociente presentó un valor en el rango de 1’7 a2’0 [20,30].

En el análisis de los resultados, se realizó unacomparación de los valores medios y las desviacio-nes estándar para el rendimiento y el cocienteDO260/DO280 utilizando un software estadístico(Statgraphics Plus 5.0 for Windows; StatisticalGraphics Corp., Warrenton, Virginia, Estados Uni-dos). Las diferencias fueron consideradas signifi-cativas cuando el valor p fue inferior a 0’05.

Por otro lado, la integridad del ADN obtenidofue evaluada sometiendo 10 µl de cada extractode ADN a electroforesis en geles de agarosa al1% (p/v) (Agarosa D-1, Baja EEO; Pronadisa) ytiñendo los geles con bromuro de etidio (Sigma-Aldrich).

Utilización de los extractos de ADN en ensa-yos de PCR

La calidad de los extractos de ADN obtenidos eneste trabajo fue evaluada mediante dos ensayos dePCR diferentes:

• Una muestra de 26 extractos de ADN, obte-nidos a partir de cultivos en placa, conidiaso micelio seco, fue utilizada en una reac-ción de PCR que amplifica de manera espe-cífica los dominios D1/D2 del gen que codi-fica para el ARN ribosomal 26S, en el casode las levaduras, o 28S, en el caso de loshongos filamentosos (en lo sucesivo, genARNr 26S/28S). Trece de estos extractos deADN habían sido obtenidos mediante losprocedimientos manuales descritos en apar-tados anteriores, mientras que el resto ha-bían sido obtenidos mediante nuestro proce-dimiento semiautomático. Para cada mues-tra, se añadió un microlitro de extracto deADN a una mezcla de PCR que contenía 10mM de Tris-HCl (pH 8’3), 50 mM de KCl,1’5 mM de MgCl2, 200 M de cada dNTP,1’5 U AmpliTaq ADN polimerasa (AppliedBiosystems, Madrid, España) y 20 pmol decada cebador: NL-1 (5’-GCATATCAA-TAAGCGGAGGAAAAG-3’) y NL-4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) (IsogenLife Science, Maarssen, Países Bajos) [22-23]. En todos los casos, el volumen final fueajustado a 50 µl. Las reacciones de amplifi-cación fueron llevadas a cabo en un termoci-


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clador GeneAmp PCR System 9700 (Ap-plied Biosystems, Foster City, California,Estados Unidos) y consistieron en un primerpaso de desnaturalización a 94°C durante 5min, seguido de 35 ciclos de 30 s a 94°C, 30s a 51°C y 1 min a 72°C, y una extensión fi-nal a 72°C durante 10 min.

• En un segundo ensayo, 12 de los 20 extrac-tos de ADN obtenidos de muestras de pelocanino infectadas experimentalmente porhongos dermatofitos fueron utilizados enuna modificación de la PCR descrita porKano et al. [17]. Esta PCR utiliza un parde cebadores que tiene como secuenciadiana el gen que codifica para la enzimaquitina sintasa 1 (CHS1) de los hongosdermatofitos: CHS1 1S (5’-CATCGAGTA-CATGTGCTCGC-3’) y CHS1 1R (5’-CTCGAGGTCAAAAGCACGCC-3’). Seañadieron 10 µl de extracto de ADN a lasmezclas de reacción, que contenían 10 mMde Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM de KCl, 3 mMde MgCl2, 300 pmol de cada cebador (Iso-gen Life Science), 250 µM de cada dNTP y2 U AmpliTaq Gold ADN polimerasa (Ap-plied Biosystems), en un volumen total de50 µl. Las condiciones de amplificaciónconsistieron en un primer paso de desnatura-lización a 95°C durante 10 min, seguido de35 ciclos de 1 min a 94°C, 2 min a 63 °C y 2min a 72°C.

En ambos casos, 10 l de cada producto de PCRfueron sometidos a electroforesis en geles de aga-rosa (Agarosa D-1, Baja EEO; Pronadisa) al 1’6%(p/v). Los geles fueron teñidos con bromuro de eti-dio (Sigma-Aldrich) y visualizados bajo luz UV,obteniéndose además imágenes digitalizadas de losmismos mediante el sistema Gelprinter imageanalyser (TDI, Madrid, España).

RESULTADOS

Extracción de ADN a partir de cultivos enplaca de hongos filamentosos

Los resultados de la extracción de ADN fúngicose presentan en la Tabla 2. Como puede verse en

dicha tabla, en el caso de la extracción de ADN apartir de cultivos en placa de hongos filamentosos,el mayor rendimiento (expresado en µg ADN/mgpeso fresco) fue obtenido tanto en el procedimien-to manual como en el semiautomático a partir delas dos cepas de hongos dermatofitos (T. menta-grophytes y M. canis), mientras que el menor ren-dimiento, también cuando se utilizaron los dos ti-pos de procedimiento de extracción, se obtuvo paraA. alternata. Aunque el rendimiento del procedi-miento semiautomático fue siempre menor, sólo seobservaron diferencias significativas respecto alprocedimiento manual en la extracción de ADN apartir de cultivos en placa de M. canis y T. menta-grophytes.

Respecto a la pureza del ADN, se observó granvariabilidad en los valores del DO260/DO280. El ma-yor rango de valores para este cociente fue obteni-do en la extracción semiautomática de ADN a par-tir de M. canis, mientras que el menor rango se ob-tuvo en el caso de la extracción semiautomática deADN a partir de R. stolonifer. El ADN de mayorpureza fue obtenido cuando ambos tipos de proce-dimiento (manual y semiautomático) fueron utili-zados para extraer ADN de dermatofitos crecidosen cultivos en placa. No se observaron diferenciasestadísticamente significativas entre los dos tiposde procedimientos de extracción de ADN en cuan-to al valor medio del cociente DO260/DO280 paraninguna de las siete cepas de hongos filamentososutilizadas.

Extracción de ADN a partir de cultivos enplaca de levaduras

Como puede verse en la Tabla 2, en general seobtuvieron mayores rendimientos y mayores pu-rezas de ADN a partir de los cultivos de levadu-ras que de hongos filamentosos. En el caso deC. albicans, se obtuvo un mayor rendimiento enel procedimiento semiautomático, aunque la di-ferencia entre tratamientos no fue significativa.Por el contrario, para las otras tres cepas de le-vaduras (C. parapsilosis, Cr. laurentii y R. mu-cilaginosa) la utilización del sistema semiauto-mático resultó en un menor rendimiento en laextracción de ADN. El rango para el cocienteDO260/DO280 fue menor en la extracción de ADNa partir de levaduras que en el caso de los hon-


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gos filamentosos. Por otro lado, el valor mediode dicho cociente fue significativamente mayorpara las cuatro cepas de levaduras cuando seutilizó el procedimiento semiautomático.

Extracción de ADN a partir de pelo infectadoexperimentalmente por dermatofitos

En la extracción de ADN a partir de muestras depelo experimentalmente infectadas por dermatofi-tos, el rendimiento fue de nuevo significativamentemenor al utilizar el procedimiento semiautomático,tal y como se muestra en la Tabla 2. Además, losvalores medios de pureza se encontraron por deba-jo del rango óptimo (DO260/DO280 < 1’7) en el pro-cedimiento manual; sin embargo, sólo se observa-

ron diferencias significativas en la extracción deADN a partir de pelos infectados por M. canis. Losextractos de ADN obtenidos por el procedimientosemiautomático a partir de pelos infectados porT. mentagrophytes mostraron un amplio rango devalores de pureza.

Extracción de ADN a partir de conidias ymicelio seco de A. fumigatus

Como puede verse en la Tabla 2, en la extracciónde ADN a partir de micelio seco de A. fumigatus seobtuvo un rendimiento casi cuatro veces superioren el procedimiento manual que en el procedi-miento semiautomático. Del mismo modo, la pure-za del ADN fue también superior en el procedi-


Muestra Procedimiento manual Procedimiento semiautomático

n Rendimiento a Pureza b n Rendimiento a Pureza b

( g ADN/mg muestra) (DO260/DO280) ( g ADN/mg muestra) (DO260/DO280)

Cultivos de hongos filamentosos

Alternaria alternata 5 1.26·10-2 ± 0.40·10-2 1.34 (1.06-1.66) 4 0.80·10-2 ± 0.08·10-2 1.23 (0.92-1.59)

Aspergillus fumigatus 5 0.40 ± 0.14 1.51 (1.37-1.72) 4 0.35 ± 0.04 1.62 (1.48-1.75)

Aspergillus niger 5 0.36 ± 0.40 1.02 (0.94-1.08) 4 0.06 ± 0.01 1.30 (1.13-1.75)

Aspergillus parasiticus 5 0.09 ± 0.03 1.22 (1.15-1.40) 4 0.07 ± 0.02 1.52 (1.21-1.90)

Microsporum canis 5 3.93 ± 1.54 1.77 (1.55-1.86) 4 0.52 ± 0.40 c 2.00 (1.35-2.65)

Rhizopus stolonifer 5 0.94 ± 0.48 1.49 (1.34-1.62) 4 0.37 ± 0.11 1.52 (1.48-1.55)

Trichophyton mentagrophytes 5 3.03 ± 0.82 1.88 (1.85-1.91) 4 1.38 ± 0.69 c 2.00 (1.81-2.09)

Cultivos de levaduras

Candida albicans 5 6.66 ± 1.64 1.84 (1.75-1.90) 4 8.44 ± 0.82 2.18c (2.14-2.19)

Candida parapsilosis 5 5.54 ± 1.14 1.90 (1.80-2.04) 4 3.56 ± 1.08 c 2.11c (2.08-2.16)

Cryptococcus laurentii 5 2.96 ± 0.40 1.62 (1.52-1.70) 4 0.31 ± 0.06 c 2.08c (2.01-2.15)

Rhodotorula mucilaginosa 5 8.67 ± 2.98 1.51 (1.44-1.59) 4 1.81 ± 0.26 c 2.02c (1.95-2.05)

Pelo canino infectado experimentalmente

Pelo infectado con M. canis 5 0.90 ± 0.27 1.46 (1.39-1.54) 5 0.08 ± 0.03 c 2.27c (2.00-2.57)

Pelo infectado con

T. mentagrophytes 5 0.40 ± 0.15 1.50 (1.36-1.57) 5 0.19 ± 0.08 c 1.82 (1.17-2.40)

Otras muestras

Micelio seco de A. fumigatus 4 3.46 ± 1.00 2.02 (1.98-2.06) 4 0.91 ± 0.44 c 2.12c (2.08-2.17)

Conidias de A. fumigatus 4 0.02 ± 0.01 1.48 (1.14-1.71) 4 0.12 ± 0.06 c 1.38 (1.26-1.50)

Tabla 2: Comparación de los procedimientos de extracción de ADN utilizados en este trabajo.

a Media ± desviación estándar.b Media (rango).c Diferencia significativa (p<0.05) entre procedimientos de extracción.

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miento manual. Por el contra-rio, cuando se partió de coni-dias de la misma cepa de A. fu-migatus, se obtuvo un rendi-miento seis veces superior en elprocedimiento semiautomático.Además, en este último caso nose observaron diferencias entretratamientos en cuanto a la pu-reza del ADN.

Duración de los procedi-mientos de extracción deADN

La duración de los distintosprocedimientos de extracciónde ADN fúngico utilizados eneste trabajo se presenta en la Tabla 3. En dichatabla se muestra tanto el tiempo total empleadocomo el tiempo que requiere la intervención di-recta de un técnico (es decir, descontando eltiempo requerido en los pasos de incubación,centrifugación y secado de los precipitados deADN).

El tiempo de procesado dependió no sólo delprotocolo llevado a cabo, sino también del tipode muestra utilizada. Por ejemplo, el procedi-miento semiautomático incluye en todos los ca-sos una incubación nocturna, mientras que en elprocedimiento manual de extracción de ADN apartir de cultivos en placa, micelio seco o coni-dias, sólo se requiere un paso de incubación a65°C durante 2h; esto contribuye a la menor du-ración total del procedimiento manual en compa-ración con el procedimiento semiautomático. Sinembargo, cuando se parte de muestras de pelo in-fectadas por dermatofitos, ambos procedimientosde extracción de ADN incluyen una incubaciónnocturna, pudiendo ser comparados en las mis-mas condiciones. En este caso particular, el pro-cedimiento semiautomático supone un ahorroconsiderable de tiempo respecto al procedimien-to manual.

Por otro lado, si se tiene en cuenta exclusivamen-te el tiempo que requiere la intervención directa deun técnico, puede observarse que, para cualquierade los cuatro tipos de muestras utilizadas, el proce-

dimiento semiautomático fue completado en untiempo menor. Este ahorro de tiempo fue especial-mente notorio en la extracción de ADN a partir demuestras de pelo infectadas por dermatofitos. Eneste caso particular, el procedimiento semiautomá-tico supuso un ahorro de 22’5 minutos por muestrarespecto al procedimiento manual.

Utilización de los extractos de ADN en ensa-yos de PCR

Como puede verse en la Figura 1, 24 de los 26extractos de ADN utilizados en el ensayo de PCRespecífico para los dominios D1/D2 del gen quecodifica el ARNr 26S/28S dieron como resultadouna única banda de amplificación de unos 600-650pb. Por el contrario, no se observó banda de ampli-ficación alguna cuando se utilizaron los extractosde ADN obtenidos utilizando el procedimientomanual a partir de cultivos en placa de A. parasiti-cus y R. stolonifer. Este resultado era esperable, yaque no se habían observado bandas de ADN deelevado peso molecular cuando se evaluó la inte-gridad de estos dos extractos de ADN en geles deagarosa.

Finalmente, cuando se utilizaron los extractos deADN obtenidos de muestras de pelo canino infec-tado experimentalmente con M. canis o T. menta-grophytes en la PCR que tiene como diana el genCSH1 de los hongos dermatofitos, se observó laamplificación del fragmento específico de aproxi-


Procedimiento manual Procedimiento semiautomático

Tta Top

b Incubación Tt Top Incubación

Tipo de muestra nocturna nocturna

Cultivos en placa 195 10 NO 21 6 SÍ

Micelio 296 51 NO 121.5 46’5 SÍ

Conidias 215 13 NO 41 8’5 SÍ

Muestras clínicas 265 30 SÍ 22.5 7’5 SÍ

(pelos infectados)

Tabla 3: Duración aproximada de los diferentes procedimientos de extracción de ADN utilizados en este trabajo.

a Tt: tiempo total empleado (sin incluir las incubaciones nocturnas).b Top: tiempo que requiere la intervención directa de un técnico. Los diferentes tiempos están expresados en minutos por muestra.

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madamente 450 pb en todos los casos, indepen-dientemente del procedimiento utilizado en la ex-tracción del ADN (Figura 2).

DISCUSIÓN

El sistema semiautomático de extracción de áci-dos nucleicos utilizado en este trabajo (QuickGe-ne-810) se basa en la tecnología de filtración a pre-sión a través de una membrana porosa (50 m), lacual es capaz de inmovilizar los ácidos nucleicosdebido a su naturaleza hidrofílica. Por otro lado, elkit empleado (QuickGene DNA, Tissue Kit S) estádiseñado inicialmente para la extracción de ADN apartir de muestras de tejido de todo tipo, habiéndo-se mostrado útil en el presente trabajo para su utili-zación en la obtención de ADN fúngico.

Una característica deseable para cualquier proce-dimiento de extracción de ADN es que pueda seraplicado a diferentes tipos de muestra. En este tra-bajo, se utilizaron dos procedimientos manuales deextracción de ADN fúngico. El primero de ellos,que no requiere el uso de fenol ni cloroformo, fueutilizado para la extracción de ADN a partir decultivos en placa de hongos filamentosos y levadu-ras, micelio seco y conidias. El segundo procedi-miento manual, que incluye un paso de extracción

con fenol, fue utilizado exclusivamente cuando separtió de muestras de pelo infectadas con dermato-fitos. Por el contrario, el procedimiento semiauto-mático presentado en este trabajo es claramenteventajoso, ya que puede ser aplicado no sólo a laextracción de ADN a partir de muestras clínicas,sino también cuando se dispone de otro tipo demuestras (cultivos, micelio seco o conidias).

Por otro lado, cualquier procedimiento de extrac-ción de ácidos nucleicos debería ser altamente efi-ciente. Esta característica es particularmente impor-tante en las aplicaciones diagnósticas de la PCR, don-de la cantidad de ADN fúngico en los tejidosanimales puede ser limitada [19]. En nuestro caso, alrealizar la extracción de ADN de dermatofitos a partirde muestras de pelo infectadas obtuvimos un menorrendimiento con el procedimiento semiautomáticoque con el procedimiento manual. Esto no es óbicepara considerar que tanto la cantidad como la calidaddel ADN obtenido son adecuadas para su aplicacióna las técnicas de PCR, incluyendo el ensayo molecu-lar utilizado habitualmente en nuestro laboratoriopara el diagnóstico de las dermatofitosis animales.Además, los extractos de ADN obtenidos por el pro-cedimiento semiautomático dieron un mejor resulta-do que los extractos obtenidos por el procedimientomanual en la PCR que amplifica los dominios D1/D2del gen que codifica el ARNr 26S/28S.


Figura 1: Amplificación por PCR de un fragmento de 600-650 pb del gen que codifica el ARNr 26S/28S. L: marcador de tamañomolecular (GeneRuler 100bp DNA Ladder, Fermentas Life Science). Líneas 1 a 22: ADN extraído de cultivos en placa de hongosfilamentosos y levaduras: Alternaria alternata (1 y 2); Aspergillus fumigatus (3 y 4); A. niger (5 y 6); A. parasiticus (7 y 8); Micros-porum canis (9 y 10); Rhizopus stolonifer (11 y 12); Trichophyton mentagrophytes (13 y 14); Candida albicans (15 y 16); C. parapsi-losis (17 y 18); Cryptococcus laurentii (19 y 20); Rhodotorula mucilaginosa (21 y 22). Líneas 23 y 24: ADN extraído a partir demicelio seco de A. fumigatus. Líneas 25 y 26: ADN extraído de conidias de A. fumigatus. Línea 27: control negativo (agua destiladaestéril). Desde la línea 1 a la 26, las líneas impares corresponden a ADN extraído mediante procedimientos manuales, mientras quelas líneas pares corresponden a ADN extraído mediante el procedimiento semiautomático.

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Una de las principales dificultades en la extrac-ción de ADN fúngico es la necesidad de romper lapared celular, la cual varía en estructura y comple-jidad en las distintas especies. Esta característicaha resultado en el hecho de que, a día de hoy, noexista un procedimiento adecuado para la extrac-ción eficiente de ADN de todas las especies fúngi-cas [19]. El rendimiento obtenido en este trabajoen la extracción de ADN mostró una gran variabi-lidad en función de la especie fúngica utilizada y,en general, fue mayor para las levaduras que paralos hongos filamentosos.

La presencia de pigmentos en la pared celular re-presenta una complicación adicional en la extrac-ción de ADN a partir de las esporas de algunoshongos [32]. Esta característica podría explicar, almenos en parte, las diferencias interespecíficas enel rendimiento en la extracción de ADN observa-das en este trabajo. La producción de pigmentosestá bien documentada en algunos hongos como A.fumigatus, cuyas conidias están cubiertas por unacapa continua de sustancias del tipo de la melani-na. Youngchim et al. [36] han observado que labiosíntesis de melaninas en A. fumigatus está aso-ciada con la conidiación, y que cuando las conidiasempiezan a germinar ocurre una degradación con-trolada de las melaninas de su pared. El resultadode este proceso es la ausencia total de melaninasen las hifas de A. fumigatus hasta que vuelva a pro-

ducirse la conidiación [36]. De este modo, el me-nor rendimiento en la extracción de ADN a partirde conidias de A. fumigatus, en comparación conel rendimiento obtenido al utilizar micelio no espo-rulado, podría deberse a la presencia de melaninasen la pared de dichos propágulos. Un razonamien-to similar podría aplicarse al caso de la extracciónde ADN a partir de cultivos en placa esporuladosde este hongo filamentoso. A pesar de estas difi-cultades, la extracción de ADN a partir de conidiasde A. fumigatus fue el único caso en el que se ob-tuvo un rendimiento significativamente mayor enel procedimiento semiautomático que en el proce-dimiento manual.

También se comparó la pureza de los extractosde ADN obtenidos a partir de distintos tipos demuestra mediante diferentes procedimientos deextracción. La presencia de contaminantes deri-vados de los procedimientos extracción de ácidosnucleicos puede reducir la sensibilidad de lastécnicas basadas en la PCR [19,28], inhibir cier-tas enzimas de restricción [20] e incluso afectar ala reproducibilidad de las técnicas de tipado mo-lecular que utilizan cebadores arbitrarios [31].En general, la pureza de una solución de ADN esconsiderada aceptable cuando el cocienteDO260/DO280 se encuentra en el rango de 1’7 a 2’0[20,30]; los valores inferiores a 1’7 para este co-ciente sugieren la presencia de proteínas u otros


Figura 2: Amplificación por PCR de un fragmento de aproximadamente 450 pb del gen CHS1 de los hongos dermatofitos. L: marca-dor de tamaño molecular (GeneRuler 100bp DNA Ladder, Fermentas Life Science). Líneas 1 y 2: controles positivos (ADN extraídode cultivos en placa de Microsporum canis y Trichophyton mentagrophytes, respectivamente). Líneas 3 a 8: ADN extraído de pelos

caninos infectados experimentalmente con M. canis utilizando el procedimiento manual (3-5) o semiautomático (6-8). Líneas 9 a 14:ADN extraído de pelos caninos infectados experimentalmente con T. mentagrophytes utilizando el procedimiento manual (9-11) o

semiautomático (12-14). Línea 15: control negativo (agua destilada estéril).

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contaminantes, mientras que los valores superio-res a 2’0 indican la presencia de ARN. En estetrabajo, el cociente DO260/DO280 no siempre se si-tuó dentro de este rango, tanto en la extracciónde ADN por el procedimiento manual comocuando se utilizó el procedimiento semiautomáti-co. El cociente de absorbancias a 260 y 280 nmpuede verse afectado por diferentes factores,como son la contaminación por fenol [5] o lapresencia de sales en los tampones de elución[30]. Además, la cuantificación de ácidos nuclei-cos por espectrofotometría UV es menos sensibleque otras técnicas disponibles, de modo que losresultados son adecuados sólo para detectar con-centraciones de ADN en el rango de los micro-gramos por mililitro [5]. A pesar de estas limita-ciones, la determinación de la pureza de los ex-tractos de ADN mediante espectrofotometría UVes ampliamente utilizada en muchos laboratorios,ya que es más fácil de llevar a cabo y menos cos-tosa que los métodos alternativos [13,34].

Aunque el sistema semiautomático de extrac-ción de ADN probado en este trabajo compartecon otros métodos de extracción de ADN fúngicosu bajo rendimiento, una ventaja importante esque minimiza el uso de sustancias químicas noci-vas, incrementando así la seguridad de los traba-jadores en el laboratorio. Esta característica esespecialmente importante en el caso de aquelloslaboratorios que no están equipados para manejarsustancias tóxicas orgánicas [29]. Una ventajaadicional de los procedimientos automáticos osemiautomáticos de extracción de ADN es queminimizan el riesgo de contaminaciones cruza-das [27], lo que se debe en parte a que tienden areducir considerablemente el número de pasosrequeridos para la extracción del ADN.

Finalmente, algunos investigadores han compa-rado diferentes procedimientos de extracción deADN fúngico en cuanto al tiempo empleado y/osu coste económico [12,28,33,35]. El procedi-miento semiautomático utilizado en este trabajoresulta en un considerable ahorro de tiempo, es-pecialmente cuando se procesan muestras clíni-cas. Además, este procedimiento reduce el tiem-po que requiere la intervención directa de un téc-nico, lo cual podría compensar la inversióninicial necesaria para la adquisición del aparato y

el coste de los kits de extracción de ADN. Tam-poco debería pasarse por alto la estandarizaciónque se logra en el protocolo de extracción deADN fúngico al utilizar el procedimiento se-miautomático, una característica que es deseableen cualquier laboratorio.

En conclusión, las principales ventajas del proce-dimiento semiautomático que aquí se presentanson: la reducción del tiempo de procesamiento quesupone su utilización, la reducción del uso de sus-tancias químicas nocivas y la minimización delriesgo de contaminaciones cruzadas. Estas tres ca-racterísticas son esenciales para cualquier aplica-ción de las técnicas moleculares en los laboratoriosde diagnóstico.

AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo fue posible graciasa la financiación recibida a través del Proyecto04/0795 del Fondo de Investigación Sanitaria delMinisterio de Sanidad. Sergio Álvarez-Pérez es be-neficiario de una beca predoctoral del ProgramaFPU del Ministerio de Educación y Ciencia (Ref.AP2005-1034).

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RESUMEN

En el marco y el respeto de los compromisos queal aprobar el Cuarto Plan Estratégico de la OlE(Organización Mundial de Sanidad Animal) para2006-2010 se han contraído en materia de des-arrollo de competencias de los Servicios Veterina-rios, notificación de enfermedades y elaboraciónde normas basadas en criterios científicos, la redde Laboratorios de Referencia y Centros Colabo-radores de la OIE desempeña un papel primordial.

El análisis de las respuestas a un cuestionarioenviado a los Países Miembros revela que los La-boratorios de Referencia y Centros Colaboradoresde la OlE tienen muchas oportunidades de ofrecermás asistencia y transferir más competencias paraayudar a subsanar las deficiencias e inconsisten-cias de la capacidad mundial de atención veterina-ria. Los aspectos evaluados son el acceso a losmercados, la sanidad animal, la salud pública enrelación con las zoonosis, la seguridad sanitariade los alimentos y las enfermedades emergentes.

Por lo general, las actividades que requieren asis-tencia y el grado de asistencia requerida varían enfunción de la situación geográfica y del nivel dedesarrollo de los Países Miembros.

Los planes de la OlE de hermanar laboratoriosdeberían contribuir al desarrollo de competencias ya mejorar la prestación de servicios en los países endesarrollo, pero, por muy bienvenidos que sean, re-quieren una gestión y una financiación estratégicaspara ser eficaces y sostenibles en todas las regiones.

La desigual distribución geográfica de los Labo-ratorios de Referencia y Centros Colaboradores dela OlE no facilita en la actualidad el acceso a susservicios ni su plena utilización por todos los paí-ses. Se necesitan resolver también problemas gene-rales relacionados con el conocimiento, la comuni-cación y los recursos de los Laboratorios de Refe-rencia y Centros Colaboradores. Por otro lado, senecesita reforzar y ampliar la red para cubrir ma-yor número de enfermedades y problemas emergen-tes y reforzar la integridad científica del proceso de


PAPEL DE LOS LABORATORIOS DE REFERENCIA Y CENTROS COLABORADORES

EN EL APOYO PERMANENTE A LOS OBJETIVOS Y MANDATOS DE LA OIE. (PARTE I)

A. A. Gajadhar

Dirección General de Ciencias, Agencia de Inspección Alimentaria de Canadá

Trabajo publicado previamente en: Conf. OlE 2007, 81-97Reproducido con permiso de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE)

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evolución de las normas internacionales. Las difi-cultades de comunicación, transporte, prioridad yfinanciación son los principales obstáculos a la uti-lización de los Laboratorios de Referencia y Cen-tros Colaboradores de la OlE por los Países Miem-bros, que, por otro lado, subrayan la necesidad degarantizar la calidad de todos sus servicios paraobtener resultados y productos fidedignos.

El refuerzo y la ampliación de la red de Labora-torios de Referencia y Centros Colaboradores dela OlE requieren la definición de una estrategia yde un proceso para asegurarse de su capacidad decubrir las necesidades presentes y futuras de laOlE y sus Países Miembros. Se somete a la consi-deración del Comité Internacional de la OlE, en su75" Sesión General de mayo de 2007, un proyectode resolución en el que se resumen estas necesida-des y se formulan recomendaciones.

Palabras clave: Organización Mundial de Sani-dad Animal (OlE) - Laboratorio de ReferenciaCentro Colaborador - competencia - servicio de la-boratorio - red - tutoría técnica entre laboratorios -creación de capacidad veterinaria

INTRODUCCIÓN

Las redes mundiales de Laboratorios de Referen-cia y Centros Colaboradores contribuyen a mejorarla salud y a la prosperidad de la sociedad poniendoa su servicio sus competencias científicas y susservicios de laboratorio. Estas redes forman partede numerosas organizaciones nacionales, regiona-les e internacionales. Aunque los Laboratorios deReferencia y Centros Colaboradores internaciona-les estén situados en determinados países y regio-nes, sus prestaciones son reconocídas más allá delas jurisdícciones nacionales y regionales y su mi-sión es ofrecer sus servicios a la comunidad inter-nacional y local.

Cada Laboratorio de Referencia y Centro Cola-borador está especializado en una enfermedad o untema particular que constituye el eje de sus activi-dades científicas. Los servicios más comúnmenteprestados son la realización de pruebas de confir-mación de enfermedades, la tipificación de agentespatógenos y la formación técnica. El seguimiento,

la investigación y la difusión de información sobrelas enfermedades son también actividades frecuen-tes. El campo de actividad de los Laboratorios deReferencia y Centros Colaboradores ha cambiadomucho últimamente como consecuencia de la evo-lución y de las apremiantes necesidades de la so-ciedad y del medio ambiente. Ante las numerosasdificultades planteadas por la globalización, elcambio climático, las enfermedades emergentes yreemergentes y los sistemas actuales de explotací-ón agraria y de intercambios comerciales, la OlE(Organización Mundial de Sanidad Animal) sepropone reforzar su red de Laboratorios de Refe-rencia y Centros Colaboradores para atender a susnecesidades y a las de sus Países Miembros.

La red de Laboratorios de Referencia y CentrosColaboradores de la OlE debe ser para la OlE y susPaíses Míembros una fuente de asistencia y de infor-mación especializada. La OlE necesita apoyo y ase-soramíento para, en función de criterios científicos,elaborar normas, recomendacíones y directrices in-ternacionales para la prevención, la detección y elcontrol de enfermedades animales y zoonosis, asícomo para la seguridad del comercio de animales yproductos de origen animal. La misión de los Labo-ratorios de Referencia y Centros Colaboradores de laOlE consiste también en ofrecer a los Países Miem-bros competencias y servicios de laboratorio de no-toriedad mundial que les ayuden a desarrollar susServicios Veterinarios, a diagnosticar las enfermeda-des de los animales y las zoonosis que puedan ame-nazar la salud humana, a reforzar la seguridad de losintercambios comerciales, a solventar diferenciasgracias a su mediación científica y a preservar, en re-sumidas cuentas, su papel de bien público mundial.

La OlE se ha propuesto reforzar su red de Labora-torios de Referencia y Centros Colaboradores y ha-cerle desempeñar un papel esencial y permanente enla consecución de sus objetivos y misiones. Dichosobjetivos se describen en el Cuarto Plan Estratégicode la OlE para 2006-2010. Los principales son:

a) apoyo a la gestión y al desarrollo de compe-tencias de los Servicios Veterinarios de los PaísesMiembros, b) consolidación de las bases científi-cas en los ámbitos de competencia para que la OlEinfluya en la definición de estrategias, la investiga-ción y la gestión de la sanidad y bienestar animal,

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y c) aumentar la transparencia de la situación delas enfermedades animales en el mundo [4].

2. CONTEXTO

2.1. Redes mundiales de Laboratorios deReferencia y Centros Colaboradores

Además de la OlE, numerosas organizacionesnacionales e internacionales han establecido Labo-ratorios de Referencia y Centros Colaboradores endistintos países para que ayuden a detectar y con-trolar las enfermedades. La capacidad de los Labo-ratorios de Referencia y Centros Colaboradores deadquirir competencia y experiencia científica y deutilizarla y mantenerla mediante una interacción yuna colaboración a todos los niveles es fundamen-tal para el éxito de su misión. Entre las organiza-ciones que cuentan con redes avanzadas de Labo-ratorios de Referencia y Centros Colaboradorescuyos mandatos están relacionados con la detec-ción y el control de enfermedades figuran la OlE,la FAO (Organización de las Naciones Unidas parala Agricultura y la Alimentación) y la OMS (Orga-nización Mundial de la Salud).

La OMS cuenta con Centros Colaboradores quebrindan asistencia a los programas que lleva a caboen determinados países, determinadas regiones o aescala mundial. Hace poco, la Red Mundial de laOMS para la Vigilancia de la Gripe estableció unaRed de Laboratorios de Referencia para el virus H5.

La FAO cuenta con Centros Colaboradores y La-boratorios de Referencia. Los 44 Centros Colabo-radores de la FAO "proporcionan asesoramientotécnico, competencia técnica y consulta sobre te-mas específicos a la sede de la FAO, los proyectosde campo y los países miembros y colaboran en laorganización y ejecución de actividades de capaci-tación". Los 19 Laboratorios de Referencia de la

FAO, especializados en enfermedades, "ofrecenasesoramiento, ayudan a hacer diagnósticos y creancapacidad de diagnóstico, mantienen colecciones dereferencia de los agentes patógenos, producen y es-tandarizan reactivos, contribuyen a la caracteriza-ción de los agentes etiológicos y participan en acti-vidades de capacitación" [2].

Se solicita cada vez más que se establezcan rela-ciones oficiales de colaboración entre las redes deLaboratorios de Referencia y Centros Colaboradoresen vista de las numerosas posibilidades de interac-ción y cooperación que existen en las redes y entreellas. Un ejemplo reciente de ese tipo de cooperaciónentre organizaciones es la Red OIE/FAO sobre la In-fluenza Aviar (OFFLU), creada conjuntamente porla FAO y la OlE y que funciona en colaboración conla Red de la OMS para la Gripe Animal [5].

Algunas de las relaciones más fructíferas se hanestablecido a través de redes extraoficiales de cientí-ficos [2]. Esas redes informales son fruto de la posi-bilidad ofrecida inicialmente a científicos de distin-tos países y regiones de encontrarse e intercambiaropiniones sobre temas, problemas y objetivos cientí-ficos. Estos intercambios son a menudo el preámbu-lo de una asistencia mutua para aprender, compartir,colaborar en estudios y, a veces, proponer la crea-ción de redes más estructuradas o formales con unaburocracia y unos costes mínimos.

2.2. La red de Laboratorios de Referencia yCentros Colaboradores de la DIE

La OlE cuenta actualmente con la asistencia deuna red de 160 Laboratorios de Referencia y 20Centros Colaboradores, muchos de los cuales seencuentran sobre todo en países en desarrollo.

Las actividades de los Laboratorios de Referenciade la OlE relacionadas con las enfermedades consis-ten esencialmente en realizar pruebas de diagnóstico,producir y distribuir reactivos, buscar y elaborar mé-todos de diagnóstico, armonizar los métodos a nivelinternacional, preparar material de referencia inter-nacional, organizar consultas, impartir formación,dar conferencias y publicar documentos.

Los Centros Colaboradores de la OlE brindanasistencia técnica sobre temas particulares median-te investigaciones, dictámenes periciales, laboresde armonización, consultas, cursos de formación,difusión de información, coordinación de estudiosy organización de reuniones.

Los Laboratorios de Referencia y Centros Cola-boradores de la OlE son también una fuente impor-tante de expertos para la constitución de grupos ad


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hoc y de trabajo, de importancia decisiva para laelaboración y actualización de normas internacio-nales de la OlE para los animales terrestres y acuá-ticos, la producción de productos biológicos, losmétodos de diagnóstico y la evaluación de la situa-ción de los Países Miembros respecto de determi-nadas enfermedades.

Los Laboratorios de Referencia y Centros Cola-boradores de la OlE tienen mandatos específicosque se pueden consultar en el sitio web de la OIEI.Cada Laboratorio de Referencia y Centro Colabo-rador debe presentar todos los años un informe so-bre sus actividades y los servicios prestados a laOlE y a sus Países Miembros. La OlE analiza losinformes y los publica.

El estudio de candidaturas y de recomendacionespara la designación de nuevos Laboratorios de Re-ferencia y Centros Colaboradores así como la eva-luación del trabajo realizado son responsabilidadde la Comisión de Normas Biológicas (en lo querespecta los animales terrestres) y de la Comisiónde Normas Sanitarias para los Animales Acuáticos(en el campo de los animales acuáticos).

Los 180 Laboratorios de Referencia y Centros Co-laboradores de la OlE abarcan 83 grupos de enfer-medades o temas. La red de Laboratorios de Refe-rencia únicos por enfermedad debe asumir el papelde autoridad en cada una de sus especialidades cuan-do interactúa con laboratorios de referencia naciona-les en otros países, aunque suele tenerse muy pocanoción de la presencia del laboratorio nacional de re-ferencia. La red de varios Laboratorios de Referenciapor enfermedad funciona como una red de pares uhomólogos, pero su mayor desventaja es la falta deliderazgo para la coordinación del grupo.

Mandato de los Laboratorios de Referencia de laOlE: www.oie.intlesp/OIE/organisation/es_mandatLR.htm

Mandato de los Centros Colaboradores de la OlE:www.oie.intlesp/OIE/organisation/es_mandatCC.htm

En 2006 se hizo una encuesta para evaluar el gra-do de interacción y las prestaciones de los Laborato-rios de Referencia y Centros Colaboradores de laOlE. Los resultados de la encuesta se presentaron en

la Primera Conferencia de Laboratorios de Referen-cia y Centros Colaboradores de la OlEI y se ha pre-parado un informe al respecto [1]. Un 79% de Labo-ratorios de Referencia y un 95% de Centros Colabo-radores respondieron al cuestionario.

Los resultados indican que en la AdministraciónVeterinaria de los países anfitriones se conoce bien elpapel de los Centros Colaboradores de la OlE, peromuy poco en los demás Países Miembros de la OlE.Esa falta de conocimiento y la falta de fondos son lasprincipales razones evocadas en las respuestas paraexplicar el aún demasiado bajo nivel de serviciosprestados por los Laboratorios de Referencia y Cen-tros Colaboradores de la OlE a los Países Miembros.El nivel general de colaboración e intercambio esbajo. Además, el número de Laboratorios de Refe-rencia que declaran utilizar pruebas validadas varíaconsiderablemente: pese a que el 77% de los Labora-torios de Referencia utiliza pruebas validadas, en lospaíses en desarrollo sólo las utiliza el 40% de los La-boratorios de Referencia y, para las enfermedades delos animales acuáticos, el 23% de los Laboratoriosde Referencia. Todos los Laboratorios de Referenciay Centros Colaboradores que respondieron al cues-tionario subrayaron la necesidad y su deseo de unacolaboración más estrecha, especialmente sobre de-terminadas enfermedades. En resumen, las respues-tas reconocían unánimemente la necesidad de mejo-ras en materia de comunicación, colaboración, inter-cambios y financiación.

3. Consulta de los Países Miembros (encuestamediante cuestionario)

La principal fuente de datos para la redacción deeste informe ha sido una encuesta realizada entrediciembre de 2006 y febrero de 2007 por medio deun cuestionario enviado a todos los Países Miem-bros de la OlE para obtener información sobre sucapacidad veterinaria actual y su necesidad de re-forzada. Por medio del cuestionario se procurabanidentificar los factores que obstaculizan o posibili-tan el fortalecimiento de la red de Laboratorios deReferencia y Centros Colaboradores de la OlE y elacceso a sus servicios.

De los 168 Países Miembros de la OlE, 110 res-pondieron al cuestionario (65,5%), con el siguientenivel de participación en cada región: Europa


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(86,1%), Américas (71,4%), Oriente Medio (65,0%),Asia (61,5%) y África (47,1%) (Véase Anexo 1).

Se han hecho varias clasificacionesde los datos obtenidos, así como unanálisis estadístico de las respues-tas a cada una de las preguntas y laconsiguiente correlación de lasmismas. Los resultados de las pre-guntas a las que responden todoslos Países Miembros participantestienen un margen de error de±5,5% y el nivel de confianza es deun 95%. Las categorías utilizadaspara los análisis incluyen las regio-nes según su definición por la OlE(África, Américas, Asia y Oceanía,Europa, Oriente Medio) y la situa-ción económica de los PaísesMiembros según la clasificación dela OMS (países "desarrollados","en transición" y "en desarrollo").

3.1. Capacidad de los PaísesMiembros

Se pidieron detalles a los PaísesMiembros sobre la disponibilidadde los servicios de laboratorio y so-bre la capacidad de las infraestruc-turas veterinarias de sus países desatisfacer las necesidades en mate-ria de acceso al mercado, salud ani-mal, salud pública (zoonosis), se-guridad de los alimentos y enfer-medades emergentes.

Los resultados de la encuesta indi-can que el nivel de satisfacción delos Países Miembros es similar encada uno de los ámbitos considera-dos. La salud animal es el ámbitoque los respondientes consideranmás satisfactorio (79,8%), mientrasque una minoría de respondientes(68,5%) se declara satisfecha de lacapacidad de respuesta a las enfer-medades emergentes. De los 110 pa-íses respondientes, 25 tienen Labora-torios de Referencia o Centros Cola-

boradores de la OlE y la presencia de éstos no guar-da necesariamente relación con las respuestas de sa-tisfacción o insatisfacción de los países anfitriones.


l. Albania 38. Eslovaquia 75. Nepal

2. Alemania 39. Eslovenia 76. Nicaragua

3. Andorra 40. Estados Unidos de América 77. Nigeria

4. Arabia Saudí 4l. Estonia 78. Noruega

5. Argelia 42. Filipinas 79. Nueva Caledonia

6. Argentina 43. Finlandia 80. Nueva Zelanda

7. Armenia 44. Francia 81. Omán

8. Australia 45. Georgia 82. Países Bajos

9. Austria 46. Ghana 83. Pakistán

10. Azerbaiyán 47. Grecia 84. Paraguay

1I. Bahrein 48. Guinea Bissau 85. Perú

12. Bangladesh 49. Haití 86. Portugal

13. Belarrús 50. Honduras 87. Reino Unido

14. Bélgica SI. Hungría 88. Rumania

15. Belice 52. Indonesia 89. Senegal

16. Benin 53. Irlanda 90. Serbia

17. Bosnia Herzegovina 54. Islandia 91. Singapur

18. Botsuana 55. Israel 92. Siria

19. Brasil 56. Italia 93. Sri Lanka

20. Bulgaria 57. Jamaica 94. Suazilandia

2I. Burkina Faso 58. Japón 95. Sudáfrica

22. Burundi 59. Jordania 96. Sudán

23. Camerún 60. Kazajstán 97. Suecia

24. Canadá 61. Kenia 98. Suiza

25. Colombia 62. Kirguistán 99. Suriname

26. Congo (Rep. del ~) 63. Kuwait 100. Tailandia

27. Costa Rica 64. Lesoto 101. Taipei China

28. Cote d'lvoire 65. Letonia 102. Tayikistán

29. Cuba 66. Lituania 103. Túnez

30. Checa (Rep. ~) 67. Luxemburgo 104. Turquía

31. Chile 68. Macedonia 105. Ucrania

32. Chipre 69. Marruecos 106. Uruguay

33. Dinamarca 70. México 107. Uzbekistán

34. Dominicana (Rep. ~) 71. Mongolia 108. Vietnam

35. El Salvador 72. Mozambique 109. Zambia

36. Emiratos Árabes Un. 73. Myanmar 110. Zimbabue

37. Eritrea 74. Namibia

Anexo 1: Miembros de la DIE que respondieron al cues-tionario sobre "El papel de los Laboratorios de Referencia yde los Centros Colaboradores de la DIE en la facilitación deun apoyo permanente a los objetivos y mandatos de la DIE"

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Primera Conferencia Internacional de Centros Co-laboradores y Laboratorios de Referencia de la OlE.Florianópolis, Brasil, 3-5 de diciembre de 2006.

a. Acceso al mercado Pese a la necesidad de aumentar la capacidad de ac-

ceso al mercado, el 67,6% de los respondientes laconsidera "satisfactoria" o "muy satisfactoria". Ochorespondientes (7,4%) la consideran "insatisfactoria".

Aunque ningún encuestado de África considera"insatisfactoria" la capacidad de acceso al merca-do, la mayoría no la considera plenamente satisfac-toria y la juzga "regular". Los encuestados del con-tinente europeo son, en general, los más satisfe-chos del acceso al mercado.

Interesa señalar que el 36% de los respondien-tes que tienen Laboratorios de Referencia o Cen-tros Colaboradores considera que el acceso de supaís al mercado es "muy satisfactorio", en com-paración con tan sólo el 12% de países que notienen Laboratorios de Referencia ni Centros Co-laboradores y que también lo considera "muy sa-tisfactorio".

El 45,2% de las respuestas de países en desarro-llo indican que el acceso al mercado es "insatisfac-torio" o "regular".

b. Salud animal La inmensa mayoría de los respondientes (80%)

responde que la situación de la sanidad animal ensu país o la capacidad de su país en este aspecto es"satisfactoria" o "muy satisfactoria". Sólo uno con-sidera "insatisfactoria" esa capacidad o situación.

En general, los encuestados de África son los me-nos satisfechos y los de Europa los más satisfechos.

De los respondientes que tienen Laboratorios deReferencia o Centros Colaboradores en su país, el40% se declara muy satisfecho de la situación de lasanidad animal o de la capacidad de su país en la ma-teria, en comparación con el 14,3% de países que notienen Laboratorios de Referencia ni Centros Colabo-radores y que también se declara muy satisfecho.

El 30,6% de las respuestas de países en des-arrollo indican que la situación de la sanidad ani-

mal o la capacidad de los países en la materia es"insatisfactoria" o "regular".

c. Sanidad pública (zoonosis)Según la mayoría de los respondientes (76,4%),

la mayoría de los Países Miembros están satisfe-chos o muy satisfechos de la situación de la saludpública (zoonosis) en sus países. Seis respondien-tes (5,7%) la juzgan "insatisfactoria".

Los encuestados de Europa son, en general, losmás satisfechos en este aspecto.

De los respondientes que tienen Laboratorios deReferencia o Centros Colaboradores en su país, el37,5% se declara muy satisfecho de la situación dela salud pública en su país, en comparación con el14,6% de países que no tienen Laboratorios de Re-ferencia ni Centros Colaboradores y que tambiénse declara muy satisfecho.

El 35,6% de las respuestas de países en desarro-llo indica que la situación de la salud pública es"insatisfactoria" o "regular".

d. Seguridad de los alimentos La mayoría de los respondientes (74,3%) responde

que la capacidad de su país en los aspectos relaciona-dos con la seguridad sanitaria de los alimentos es "sa-tisfactoria" o "muy satisfactoria". Siete (6,4%) respon-den que la capacidad de su país es "insatisfactoria".

En general, los encuestados de África son los me-nos satisfechos y los de Europa los más satisfechos.

Algo más de un tercio (37,1%) del número to-tal de respuestas de países en desarrollo indicaque la seguridad sanitaria de los alimentos es "in-satisfactoria" o "regular".

e. Enfermedades emergentes Cerca de dos tercios (67,9%) de los respondien-

tes consideran que la situación de su país en rela-ción con las enfermedades emergentes es "satisfac-toria" o "muy satisfactoria". Siete respondientes(6,4%) la consideran insatisfactoria.

Las encuestados de Oriente Medio son los menossatisfechos en este aspecto y los de Europa los mássatisfechos.


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El 38,7% de las respuestas de países en desarrolloindican que su preparación a la lucha contra las enfer-medades emergentes es "insatisfactoria" o "regular".

3.2. Satisfacción por la posibilidad de acceso alos Laboratorios de Referencia y CentrosColaboradores de la DIE y por la utilizaciónde sus servicios

3.2.1. Situación geográfica de los Laboratorios deReferencia y Centros Colaboradores y dificultades

De los 110 Países Miembros respondientes, 25tienen Laboratorios de Referencia o Centros Cola-boradores, cuya distribución varía según las regio-nes: 13 en Europa, 4 en África, 4 en las Américas,3 en Asia y 1 en Oriente Medio.

De los 25 Países Miembros desarrollados queparticipan en la encuesta, 17 (68%) tienen Labora-torios de Referencia o Centros Colaboradores,mientras que de los 63 países en desarrollo queparticipan sólo los tienen 7 (11,1 %) Y de los 22países en transición tan sólo 1 (4,5%).

Los países que tienen Laboratorios de Referenciao Centros Colaboradores indican que el aspecto fi-nanciero es el mayor impedimento para la presta-ción de servicios. Otros impedimentos son "la can-tidad doméstica/nacional de trabajo", las "restric-ciones de bioseguridad para las importaciones depatógenos", el "coste de los reactivos/antígenos" yel "nivel de pericia".

3.2.2. Utilización de los Laboratorios de Refe-rencia y Centros Colaboradores de la OIE por losPaíses Miembros

Los Países Miembros han utilizado ampliamentelos servicios prestados por los Laboratorios de Refe-rencia y Centros Colaboradores de la OlE, pero la uti-lización de esos servicios varía de una región a otra.

Cerca de dos tercios (65,3%) de los respondien-tes han utilizado un Laboratorio de Referencia oCentro Colaborador de su región. Los PaísesMiembros europeos (78,8%) son los que más hanutilizado un Laboratorio de Referencia o CentroColaborador de su región y los Países Miembrosde Oriente Medio (27,3%) los que menos.

En total, el 71,2% de los respondientes ha utilizadoun Laboratorio de Referencia o Centro Colaboradorde otra región. Los Países Miembros de Asia(92,9%) son los que más han utilizado un Laborato-rio de Referencia o Centro Colaborador de otra re-gión y los de Europa (57,1 %) los que menos.

La presencia de Laboratorios de Referencia oCentros Colaboradores en un país o una región noinfluye en la utilización de servicios prestados fue-ra de la región. Cerca de dos tercios (67,2%) de losrespondientes que han utilizado un Laboratorio deReferencia o Centro Colaborador de su región tam-bién han utilizado uno de otra región, mientras queel 82,8% de los que no han utilizado uno de su re-gión han utilizado uno de otra región.

Cinco países respondientes no han utilizado losservicios de ningún Laboratorio de Referencia nide ningún Centro Colaborador.

En total, 24 de los 25 respondientes que tienenun Laboratorio de Referencia o Centro Colabora-dor en su país también han utilizado uno de otropaís o de otra región.

El 44,7% de los que no tienen Laboratorios deReferencia ni Centros Colaboradores en su paíshan utilizado uno de otro país de su región. Dostercios de estos últimos también han utilizado La-boratorios de Referencia o Centros Colaboradoresde otras regiones.

El 26,2% del número total de respondientes noha utilizado ningún Laboratorio de Referencia niCentro Colaborador de su propia región pero síuno de otra región.

3.2.3. Utilización de los servicios prestados

Todos los servicios prestados por los Laborato-rios de Referencia y Centros Colaboradores de laOIE han sido utilizados, pero la utilización varíasegún la frecuencia, la región y el servicio.

Las "pruebas de diagnóstico" son el servicio másutilizado: el 62,7% de los respondientes indica quesu país lo ha utilizado al menos una vez en los últi-mos cinco años. El segundo servicio más utilizadoes la "confirmación e identificación del agente": el


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61,8% de los respondientes lo ha utilizado al me-nos una vez en los últimos cinco años. Más de untercio de Países Miembros respondientes no utili-zaron las prestaciones de los Laboratorios de Refe-rencia o Centros Colaboradores de la OIE para es-tos servicios.

Los Países Miembros han utilizado mucho losservicios de "formación", "reactivos", "consejoscientíficos" y "muestras de verificación de lacompetencia".

A nivel de regiones, África es la región con el por-centaje más alto de encuestados que declaran haberutilizado los servicios de diagnóstico de los Labora-torios de Referencia y Centros Colaboradores de laOlE (83,3%), seguida de Oriente Medio (76,9%).Las regiones con los porcentajes más bajos de res-pondientes que declaran haber utilizado ese servicioson las Américas (45,0%) y Europa (52,9%).

Los respondientes que tienen Laboratorios deReferencia o Centros Colaboradores de la OIE ensu país indican más que los que no los tienen ha-ber utilizado al menos una vez cada uno de losservicios, con excepción del servicio de pruebasde diagnóstico.

3.2.4. Satisfacción de los Países Miembros

De los 97 Países Miembros que han utilizado unLaboratorio de Referencia o Centro Colaboradorde la OIE, el 86,6% se declara satisfecho de la ca-lidad de los servicios prestados. Más del 80% delos participantes en la encuesta se declaran satisfe-chos de la calidad del servicio prestado, indepen-dientemente del lugar en que esté situado el Labo-ratorio de Referencia o Centro Colaborador.

Por una razón o por varias razones, 13 encuestadosse declararon insatisfechos de la calidad del servicioprestado, 7 indican que es por "el tiempo necesariopor el servicio", 6 por "la mala comunicación" y 6con "los requisitos de transporte para las muestras".

3.2.5. Obstáculos a la utilización de los Laboratoriosde Referencia o Centros Colaboradores de la OlE

El 68,8% de los respondientes indica que el obstá-culo que más ha reducido o impedido su utilización

de los servicios de la OIE es el "transporte de mues-tras". Cerca de la mitad de los respondientes tambiénindica que "el coste" y las "barreras reguladoras ex-ternas" les impiden utilizar los servicios de la OIE.

Los países que no tienen Laboratorios de Refe-rencia ni Centros Colaboradores indican que lasbarreras que más les impiden utilizar los serviciosde la OIE son el "transporte de muestras", la "faltade conocimiento de los servicios", "el coste" y las"barreras reguladoras externas", mientras que losque tienen Laboratorios de Referencia o CentrosColaboradores indican que las mayores barrerasson la "burocracia interna" y la "confidencialidad(control de la información)".

A nivel de regiones, los países europeos son losque declaran encontrar menos obstáculos y los paí-ses de las Américas los que declaran encontrar más.

3.2.6. Fuentes alternativas de servicios a losPaíses Miembros

Aunque el 90,9% de los respondientes declara ha-ber obtenido alguno de los servicios prestados por losLaboratorios de Referencia y Centros Colaboradoresde la OlE en su región o fuera de ella, muchos PaísesMiembros han obtenido esos servicios de institucio-nes que no son de la OlE. Las organizaciones guber-namentales, las universidades, los Laboratorios deReferencia de la FAO y la OMS y laboratorios priva-dos son, además de la OlE, los principales organis-mos que prestan esos servicios. En total, 61 paísesparticipantes (55,5%) indican haber obtenido esosservicios de departamentos del gobierno, 47 (42, 7%)de universidades, 41 (37,3%) de la FAO, 39 (35,5%)de la OMS y 24 (21,8%) de laboratorios privados.

Los servicios de la OlE, la FAO y la OMS hansido prestados a la mayoría de los respondientes(74%) fuera de su región, mientras que los servi-cios del gobierno y de los laboratorios universita-rios han sido prestados en el País Miembro en lamayoría de los casos.


En la próxima edición de LaboratorioVeterinario AVEDILA, se publicará lasegunda parte de este trabajo.

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RESUMEN

Las infecciones por Coronavirus Bovino(BCV) y Virus Syncytial Bovino (BRSV) afec-tan a los rebaños bovinos mundialmente. El pa-trón epidemiológico de estas enfermedades aúnes desconocido. Con el propósito de estudiarsobre estas enfermedades se realizó una tesisdoctoral en Suecia en el año 2006. Esta publi-cación pretende resumir los hallazgos encontra-dos hasta el momento en dicho proyecto de in-vestigación.

INTRODUCCIÓN

Las infecciones por Coronavirus Bovino(BCV) y Virus Syncytial Bovino (BRSV) afec-tan a los rebaños bovinos mundialmente [1, 2].La prevalencia de anticuerpos a BCV y BRSVen leche de tanque fue de 100% según un estu-dio nacional en Inglaterra y Wales [3]. La infec-ción con BCV causa disentería en adultos, dia-

rrea en terneros y varios grados de enfermedadrespiratoria [4-7]. BRSV puede causar síntomasrespiratorios, fiebre, enfisema, infecciones bac-terianas secundarias neumonía y muerte [8, 9].En áreas endémicas las infecciones afectan aanimales jóvenes, mientras que en áreas no en-démicas los animales adultos pueden estar afec-tados [7, 10]. Una vez que estos virus son intro-ducidos en animales susceptibles la transmisiónsuele ser muy rápida [7, 8, 11]. Se ha demos-trado que los anticuerpos se mantienen detecta-bles por años incluso sin reinfección [7, 10],mientras que anticuerpos maternales son detec-tables por pocos meses.

El proyecto de investigación se inició en Sue-cia en el año 2006, “Factores de riesgos por latransmisión de BCV y BRSV en rebaños, efec-tos sobre la salud, producción y opciones deprevención”. El grupo de investigación consisteen un estudiante de dotorado Anna Ohlson, losprofesores Stefan Alenius, Ulf Emanuelson yDr. Madelein Tråvén. El propósito de este artí-


INFECCIÓN POR CORONAVIRUS BOVINO Y VIRUS SYNCYTIAL

RESPIRATORIO BOVINO EN SUECIA

A. Ohlson*, U. Emanuelson, M. Tråvén, S. Alenius

Department of Clinical Sciences, Swedish University of Agricultural Sciences, P.O. Box 7054, SE-750 07 Uppsala, Sweden

*Corresponding author. Tel.: +46 18 67 26 84; fax: +46 18 67 35 45. E-mail: [email protected] (A. Ohlson)

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culo es resumir los resultados encontrados hastael momento en el proyecto de investigación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio de la población y muestreo

Hemos incluido 280 rebaños en total distribui-dos en siete áreas geográficas; Västerbotten yJämtland (norte), Uppland (centro-este), Go-tland, Kalmar and Öland (sur-este) y Halland(sur-oeste). Todos los rebaños estaban libres delVirus de la Diarrea Vírica Bovina (BVDV) esta-blecido por el programa sueco de erradicación[12]. Los rebaños fueron muestreados antes ydespués de las estaciones durante 3 años conse-cutivos 2006/2007, 2007/2008 y 2008/2009. Seobtuvieron pooles de muestras de leche de cincovacas primíparas que eran de crianza interna decada rebaño para cada ocasión de muestreo. Elmuestreo lo realizaron veterinarios y técnicosde la asociación ganadera local. Se emplearontubos de 10ml conteniendo 1.5 mg de preser-vante Bronopol (2-bromo-2-nitropropane-1.3-diol). Las muestras no fueron diluidas o centri-fugadas y mantenidas a -20°C hasta el análisis.También recogimos muestras al azar de diezmuestras individuales de leches por rebaño dellos registros de ordeños de la zona Uppland. Es-tas muestras fueron analizadas individualmentecon los pooles de muestras de leche de las cincovacas primíparas. Durante el muestreo corres-pondiente a la primavera los ganaderos cumpli-mentaron un cuestionario de posibles brotes du-rante la temporada de invierno. En primaveradel 2007 los ganaderos también cumplimenta-ron un cuestionario sobre procedimientos de ru-tina en el ganado.

Detección de anticuerpos

Las muestras de leche fueron analizadas por lapresencia de inmunoglobulina G a BCV [7] yBRSV [13] por un ELISA indirecto (SvanovirBCV-ab/BRSV-ab, Svanova Biotech AB, Upp-sala, Suecia). Las densidades ópticas (DO) a450 nm fueron corregidas por la sustracción delcontrol de antígeno negativo. Con la finalidadde ajustar variaciones entre día a día calculamosel porcentaje de positividad (PP) tal como se

describe a continuación (corregida DO/controlpositivo corregido DO) ×100. Los valores decorte (cut off) se establecieron PP ≤ 20 paramuestras de leche.

RESULTADOS

Evaluación de los pooles de muestras de leche

Las muestras de leche individuales fueron usa-das para evaluar y relacionar resultados entre lospooles de leche y las muestras individuales usan-do los respectivos valores PP de BCV y BRSV[14]. La media del valor PP para los anticuerposnegativos de las muestras individuales fue 1.0(95% CI 0.4-1.9) para BCV y 0.9 (95% CI 0.5-1.5) para BRSV. Para los anticuerpos positivos lamedia fue PP 74.8 (95% CI 71.2-78.8) y 105.6(95% CI 99.1-109.3) para BCV y BRSV respec-tivamente. En rebaños donde estaban presentesanticuerpos negativos y positivos se encontró unarelación entre la presencia o ausencia de anti-cuerpos según la edad de los animales, es decir,que vacas jóvenes resultaron negativas mientraslas vacas viejas resultaron positivas para BCV yBRSV. Con los pooles de las vacas primíparas decada rebaños (15/16 para BCV y 6/10 paraBRSV) la mayoría consistía sólo en una muestranegativa. Los pooles remanentes entre 33 y 80porcentajes de positividad de muestra individua-les. La mayoría de los pooles positivos (39/48para BCV y 42/54 para BRSV) consistía sólo deuna muestra individual positiva y en otros poolespositivos tenían entre 33 a 80 porcentajes de po-sitividad de muestras individuales. La distribu-ción se muestra en las figuras 1a y 1b.

Factores de riesgos en la transmisión de BCV yBRSV

Investigamos la asociación entre el estado de an-ticuerpos para BCV y BRSV con las rutinas demanejo [15]. Se incluyeron todos los rebaños delproyecto realizando cuestionarios. Se encontróuna asociación entre el uso de botas con anticuer-pos negativos en el rebaño para BCV y BRSV.Mientras que para rebaños positivos no se pudo en-contrar ninguna correlación. Ciertas áreas de Jäm-tland y Västerbotten en el norte de Suecia tienen

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una baja prevalencia de anticuerpos positivos BCVy BRSV comparadas con otras áreas de centro ysur de los grupos incluidos en el estudio.

DISCUSIÓN

Encontramos una buena relación entre las mues-tras individuales y los pooles de leche. Un poolde muestras de vacas primíparas es un buen indi-cador para seguir el historial de infección en losrebaños por al menos dos años. Es importante in-cluir vacas lo más jóvenes posibles y que hayannacido en la granja. La técnica de ELISA trabajabien para la monitorización de muestras negativascon valores medios bajos de PP y con un estrechointervalo de confianza.

Los rebaños no fueron agrupados en áreas negati-vas y positivas. Esto indica que la difusión por lasvisitas diarias, camiones, animales salvajes y trans-misión por aerosol no tienen una gran importancialos rebaños negativos se mantienen negativos aun-que el virus pueda estar circulando en el área.

Creemos que visitantes que recientemente hanestado en contacto con rebaños infectados y la in-

troducción de nuevos animales en el rebaño son lasprincipales vías de transmisión BCV y BRSV. Enestudio de Bidokhti et al [16] mostró una correla-ción entre anticuerpos negativos para BCV yBRSV con el uso IA. Esto indica que rebaños quetienen implementados sistemas de bioseguridad re-duce el riesgo de introducir estas enfermedades yotras enfermedades contagiosas.

Un programa de control voluntario en el áreanorte de Suecia está utilizando pooles de muestrasde leche para determinar el estado de infección enlos rebaños. En estudios futuros resumiremos ladinámica de BCV y BRSV para evaluar su efectoen la salud de los rebaños durante período de tresaños de estudio.

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Figura 1. Distribución de porcentajes de positividad (pp) para a) coronavirus bovino (BCV) y b) respiratory syncytial virus bovino (BRSV)en pooles de muestras de leche de 2-5 vacas primíparas y su correspondiente porcentaje de positividad de muestra individuales incluidas enel pool. Las líneas segmentadas se corresponden a los puntos de corte (cut of) y valores PP de 20. De Ohlson et al[14].

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FICHA DE INSCRIPCIÓN

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