Potenzialità dei P Sistemi per la Modellazione

dell’Attività dei Canali Meccanosensibili nei

ProcariotiAnna Anselmo

P SistemaModello di calcolo ispirato alla strutturaed al funzionamento delle cellule.Utilizzato come modello discreto per processi cellulari

Componenti necessari per la descrizione di un processo cellulare tramite P Sistema:

• Struttura cellulare• Sostanze Biochimiche• Reazioni cellulari• Comunicazione di sostanze

CANALI MECCANOSENSIBILI (Msc)

Scoperti nel 1984 in cellule animaliCanali proteici regolati da forze meccaniche

In particolare da cambiamenti di pressione esercitati contro la membrana in cui sono localizzati.

• Condizioni ambientali• Esperimenti di patch clamping

Esperimenti di patch clamping (cattura di membrana)

Viene praticata una suzione che fa si che il vetro aderisca strettamente al doppio strato lipidico.

La resistenza tra l'interno della pipetta e il liquido extracellulare è così elevata da permettere la registrazione delle piccolissime variazioni di resistenza causate dall'apertura o chiusura di un singolo canale.

• Localizzazione nella membrana cellulare

Protezione contro downshifts osmotici

• Funzione principale: permette la rapida uscita di sostanze chimiche e la diminuzione della pressione osmotica all’interno della cellula

La pressione osmotica all’interno dalla cellula avvicina i valori osmotici del mezzo extracellulare

In particolare ci occuperemo degli shock iposmotici =>diminuzione della concentrazione dell’ambiente extracellulare

CELLULA INTEGRA

MODELLIper la descrizione del funzionamento di Msc

in vitroesperimenti di patch clamping

in vivoshock ipotonici

SISTEMA comprende:• ambiente• regione• tensione di membrana• probabilità associate a regole di evoluzione

In questo P sistema gli oggetti non vengono modificati dalle regole di evoluzione, ma solo scambiati tra la regione interna e l’ambiente extra-cellulare

CANALI MECCANOSENSIBILI IN E.COLILa parete di peptoglicano nei batteri bilancia il turgore cellulare che in E.Coli è circa 4 atm.

Shock iposmotici Acqua entra rapidamente nella cellula aumentando la pressione di turgore.

ASSENZA di meccanismi che riducono turgore

Pressione di turgore di E.Coliraggiunge 11atm (0,3 M)

ATTIVAZIONE dei canalimeccanosensibili

Nessun danno alla cellula

Condizioni stazionarie

Il rilascio di soluti aumenta il potenziale osmotico del citoplasma diminuendo quindi la driving force per l’entrata dell’acqua

Risponde a stimoli meccanici (tensione di membrana: non richiede componenti extramembrana x il gating).

Struttura di MscL in E.Coli

Codificata da un gene singolo di 412 bp

136 aa

15 kDa

Struttura Secondaria:

2 domini di α-eliche transmembrana (M1 e M2)Loop divisibile in S1 e S2N-terminale e C-terminale localizzati nel citoplasmaMultimero con 5 subunità

Stretch meccanico

Aumento della tensione di membrana

Conformazioni:C, conformazione chiusaCE, conformazione chiusa espansaSO1, conformazione semi-aperta in cui solo una subunità è apertaSO2, conformazione semi-aperta in cui solo due subunità sono aperteSO3, conformazione semi-aperta in cui solo tre subunità sono aperteSO4, conformazione semi-aperta in cui solo quattro subunità sono

aperteO, conformazione completamente aperta

PROGRESSIONE ATTRAVERSO LE DIVERSE CONFORMAZIONI

Modello di membrana per l’attività di MscL In VitroQualche definizione….

Struttura di membranaStruttura di membrana: insieme di membrane gerarchicamente racchiuse in un’unica membrana. Ogni coppia di parentesi quadrate = 1 membrana. Ciascuna membrana identifica una RegioneRegione.

Regole di evoluzione: Regole di evoluzione: regole di riscrittura con associato un target (determina la regione dove l’oggetto sarà comunicato dopo l’applicazione della regola).

Configurazione: Configurazione: struttura di membrana con tutti i multinsiemi di oggetti associati ad una regione

Computazione: Computazione: sequenza di transizioni attraverso le configurazioni, ottenuta lasciando evolvere gli oggetti in tutte le regioni in maniera non deterministica e parallela.

Simulazione di un Ciclo: Simulazione di un Ciclo: sequenza finita di transizioni che partendo dallaconfigurazione iniziale Co finisce con una configurazione finale Cf.

Modello di membrana per l’attività di MscL In Vitrocorrispondente ad esperimenti di Patch Clamping

•TENSIONE che può assumere valori reali dell’insieme finito

Tension = {tC, tCE, tSO1, tSO2, tSO3, tSO4, tO, tL}

Componente fondamentale:

dove:

• tC = valore iniziale della tensione di membrana

• tCE = valore raggiunto durante l’espansione del canale MscL

• tSO1, tSO2, tSO3, tSO4 = valori di tensioni di membrana quando il canale è parzialmente aperto

• tO = valore corrispondente all’apertura completa di MscL

• tL = valore corrispondente alla soglia litica di membrana

Da esperimenti in vitro si sono potuti osservarei seguenti valori di tensione di membrana (dyne/cm):

1. tC Є [0,10) no aspirazione2. tCE = 10 applicata suzione3. tSO1, tSO2, tSO3, tSO4 Є (10,13) canale parzialmente aperto4. tO = 13 completamente aperto5. tL ≥ 14 lisi membrana

Transizioni attraverso i valori di tensione sono dovuti a cambiamenti nella pressione applicata alla membrana (dipendenza lineare tra la tensione di membrana e la pressione applicata)

Si considera un Ambiente Esterno (Env) ed una Regione Interna (Reg)

1. l’ambiente è fatto di soluti (simboli dell’alfabeto Vchem) e molecole d’acqua (w Vchem );

2. la regione interna consiste di oggetti sullo stesso alfabeto dell’ambiente e si assume che al suo interno non avvenga nessun altro processo

∉

La notazione Env [t Reg indica la membrana (associata al parametro di tensione t) che separa l’ambiente esterno da quello interno.

NB: in esperimenti in vitro l’attivazione di MscL è determinata dalla pressione negativa applicata artificialmente alla membrana

Le soluzioni interne ed esterne nonnon hanno nessun ruolo nel meccanismo di apertura del canale

Regola dell’ambiente in vitro: cambiamento nel parametro di pressione p dovuto ad azione esterna

‹p,apply› [t prob [t'

Transizioni delle tensioni di membrana per il modello in vitro

Azione del parametro p ha conseguenze sulla tensione di membrana ed è applicata con una probabilità associata

Per p Є R, t,t‘ Є Tension, prob Є [0,1] R

Insieme R di regole di evoluzione per il modello in vitro

14 sottoinsiemi di regole

Transizione da un valore fissato di tensione di membrana per un determinato valore di aspirazione

Regole appartenenti allo stesso sottoinsieme hanno associati valori di probabilità la cui somma è 1.

1. [tC prob=1 [tC (no suction applied)

2. ‹p,apply›[tC prob=0.01 [tCE for some p « 403. ‹p,apply›[tC prob=0.99 [tC for some p « 40

Tensione di membrana = tC e la pressione applicata è <<40mmHg

la conformazione di MscL diventa CE con una probabilità molto bassa perché la suzione applicata è insufficiente per l’attivazione del canale

Valori scelti arbitrariamente, ma con stretta attinenza al fenomeno biologico

4. ‹p,apply›[tC prob=0.8 [tCE for some 0< p ≤405. ‹p,apply›[tC prob=0.2 [tC for some 0< p ≤40

6. ‹p,apply›[tCE prob=0.05 [tC for some p ≈ 40 7. ‹p,apply›[tCE prob=0.5 [tSO1 for some p ≈ 40 8. ‹p,apply›[tCE prob=0.20 [tSO2 for some p ≈ 40 9. ‹p,apply›[tCE prob=0.15 [tSO3 for some p ≈ 40 10. ‹p,apply›[tCE prob=0.07 [tSO4 for some p ≈ 40 11. ‹p,apply›[tCE prob=0.03 [tO for some p ≈ 40

12. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.05 [tCE for some p ≈ 40 13. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.5 [tSO1 for some p ≈ 40 14. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.2 [tSO2 for some p ≈ 40 15. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.15 [tSO3 for some p ≈ 40 16. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.07 [tSO4 for some p ≈ 40 17. ‹p,apply›[tSO1 (x,out) prob=0.03 [tO for some p ≈ 40

(x,out) Flusso di sostanze chimiche ed acqua quando il canale è aperto

Transizione dalla CEalle altre conformazioni in risposta ad un’aspirazione di 40 mmHg

18. ‹p,apply›[tSO2 (x,out) prob=0.1 [tSO1 for some p ≈ 40 19. ‹p,apply›[tSO2 (x,out) prob=0.02 [tSO2 for some p ≈ 40 20. ‹p,apply›[tSO2 (x,out) prob=0.5 [tSO3 for some p ≈ 40 21. ‹p,apply›[tSO2 (x,out) prob=0.3 [tSO4 for some p ≈ 40 22. ‹p,apply›[tSO2 (x,out) prob=0.08 [tO for some p ≈ 40

23. ‹p,apply›[tSO3 (x,out) prob=0.02 [tSO1 for some p ≈ 40 24. ‹p,apply›[tSO3 (x,out) prob=0.3 [tSO2 for some p ≈ 40 25. ‹p,apply›[tSO3 (x,out) prob=0.08 [tSO3 for some p ≈ 40 26. ‹p,apply›[tSO3 (x,out) prob=0.5 [tSO4 for some p ≈ 40 27. ‹p,apply›[tSO3 (x,out) prob=0.1 [tO for some p ≈ 40

28. ‹p,apply›[tSO4 (x,out) prob=0.02 [tSO1 for some p ≈ 40 29. ‹p,apply›[tSO4 (x,out) prob=0.08 [tSO2 for some p ≈ 40 30. ‹p,apply›[tSO4 (x,out) prob=0.3 [tSO3 for some p ≈ 40 31. ‹p,apply›[tSO4 (x,out) prob=0.1 [tSO4 for some p ≈ 40 32. ‹p,apply›[tSO4 (x,out) prob=0.5 [tO for some p ≈ 40

36. [tO (x,out) prob=1 [tC (no suction applied)

39. ‹p,apply›[tC (x,out) prob=0.99 [tL for some p >> 40 40. ‹p,apply›[tC (x,out) prob=0.01 [tCE for some p >> 40

41. ‹p,apply›[tCE (x,out) prob=0.9 [tL for some p >> 40 42. ‹p,apply›[tCE (x,out) prob=0.1 [tSO1 for some p >> 40

43. ‹p,apply›[tL prob=1 for all p ≥0

Comunicazione di oggetti dalla regione interna all’ambiente

Distruzione membranaMultiset interni ed esterni mischiati nell’ambiente

37. ‹p,apply›[tO (x,out) prob=P (o l) [tL for some p > 40, x Mreg 38. ‹p,apply›[tO (x,out) prob=1-P (o l) [to for some p > 40, x Mreg

⊆

⊆

33. ‹p,apply›[tO (x,out) prob=0.9 [tC for some p ≈ 40, x Mreg34. ‹p,apply›[tO (x,out) prob=0.01 [to for some p ≈ 40, x Mreg 35. ‹p,apply›[tO (x,out) prob=0.09 [tSO4 for some p ≈ 40, x Mreg ⊆

⊆⊆

Definizione formale del modello in vitro per l’attività MscL

πinvitro = (V, µ, Tension, Menv, Mreg, R)

Dove:

• V = Vchem U {w} Alfabeto del sistema doveVchem= {a1,…,an} è l’insieme finito di simboli corrispondenti ai soluti

• µ Є {[t ]t, } Struttura di membrana: membrana etichettata con il parametro variabile t. Se la membrana non è più presente nel sistema (lisi) si usa la notazione

• Tension = {tC, tCE, tSO1, tSO2, tSO3, tSO4, tO, tL} Insieme di valori per la tensione t di membrana

• Menv, Mreg Multinsiemi presenti nell’ambiente e nella regione (all’inizio Menv = Mreg)

• R Insieme di regole

Valori tipici per buffers simmetrici usati in esperimenti in vitro:

• 200 mM KCl• 40 mM MgCl2

Quindi si può definire:

Menv = Mreg = a1200 a2

40 wN

dove a1 = KCl, a2 = MgCl2, N = valore intero » soluti

Il P sistema definito per la modellazione dei MscL durante esperimenti di patch clamping con buffers simmetrici puòessere utilizzato anche per modellare esperimenti con buffers non simmetrici (Mreg ≠ Menv).

CONFIGURAZIONI:

C è una 4-tupla ( [ ], t, Menv, Mreg) oppure2-tupla ( , Menv)

Configurazione iniziale: Co = ([ ], tc, Menv, Mreg) con Menv = Mreg

Configurazione finale: Cf = { ( [ ], tc, M’env, M’reg), ( , M’’env)}, con M’env, M’reg, M’’env tale che M’env U M’reg = Menv U Mreg eM’’env = Menv U Mreg

C ( [ ], t, Menv, Mreg)

Transizione da una configurazione all’altra può essere descritta come:

P : ({ [ ] } x Tension x Env x Reg) U ({ } x Env)ז({ [ ] } x Tension x Env x Reg) U ({ } x Env)

Con ( [ ], t, Menv, Mreg) → {([ ], t’, M’env, M’reg), ( , M’’env)}( , Menv) → {( , Menv )}

Modello per esperimenti In Vivo

• Viene considerato un numero minore di conformazioni

• Non vengono associati valori di probabilitàalle regole di evoluzione

• Aggiunto un nuovo valore di tensione di membrana raggiungibile dopo un ciclo

• Ulteriori possibili transizioni attraverso valori di tensione di membrana in risposta a differenti condizioni ambientali

Alcune considerazioniAlcune considerazioni

Nei modelli in vivoConfigurazione iniziale del sistema corrisponde all’equilibrio biologico (situazione in cui non c’è attivazione di MscL)

Possibili combinazioni di multinsiemi e concentrazioni:

1. Composizione e concentrazione dei multinsiemi diverseMenv ≠ Mreg, Conc(env) ≠ Conc(reg)

⇨ Corrisponde all’habitat naturale di E.Coli

2. Composizione dei multinsiemi diversa, ma concentrazioni ugualiMenv ≠ Mreg, Conc(env) = Conc(reg)

⇨ Corrisponde all’habitat naturale di Halobacter salinarum

3. Composizione e concentrazione dei multinsiemi ugualiMenv = Mreg, Conc(env) = Conc(reg)

⇨ Corrisponde agli esperimenti di patch clamping considerati nel modello in vitro

Batteri Archea Alofili (Halobacter salinarum, Haloferax volcanii)

No pressione di turgore

La concentrazione di soluti all’interno della cellula è praticamente uguale alla concentrazione all’esterno

La quantità di ciascun soluto però è molto differente all’interno rispetto all’esterno.

Possono vivere in ambienti ipersalini (Mar Morto)

• Strategia nondispendiosa

• Richiede adattamenti del macchinario enzimatico per l’alta concentrazione intracellulare.

• Limitata adattabilità delle cellule

Un’altra strategia…

Escherichia Coli

Presenza all’interno della cellula di alti livelli di molecole organiche (glutammato, zuccheri, ecc.)

Aumentano la pressione osmotica

Diminuisce l’entrata di ioni sodio all’interno della cellula

• Strategia dispendiosa(dipende dal soluto organico sintetizzato)

• Nessuna modificazione del macchinario intracellulare

• Velocità di adattamento delle cellule a cambiamenti della salinità esterna

Occorrenza multipla dei MscL

Esempio:Membrana con due canali

‹p, apply› [tc prob=0.8 [tCE per il canale 1‹p, apply› [tc prob=0.3 [tC per il canale 2 p Є (0,40]

‹p’, apply› [tCE prob=0.7 [tSO1 per il canale 1‹p’, apply› [tCE prob=0.5 [tCE per il canale 2

p’ ≈ 40

e così via…

Per descrivere tutte le reazioni possibili è sufficiente considerare differenti probabilità per ciascun canale.

Considerazioni Finali ed Estensioni FutureConsiderazioni Finali ed Estensioni Future

Studio del parallelismo in Biologia e nei P sistemi

Relazioni tra modelli In Vitro e In Vivo

Occorrenza multipla di MscL

Effetti di Inibitori ed Attivatori

Risposte a breve e lungo termine alla Pressione Osmotica

• Descrizione del funzionamento di altri canali meccanosensibili con diverse conduttività (MscS, MscM in E.Coli)

• Descrizione di altre strutture coinvolte nell’ osmoregolazionein cellule procariotiche

Relazioni tra modelli In Vitro e In Vivo

Il potere intrinseco dei P sistemi per l’elaborazione di modelli sia in vivo che in vitro di processi biologici ha due ragioni:

1. P sistemi sono stati costituiti sull’assunzione che un progetto formale di computazione può essere astratto dal funzionamento delle cellule

2. La matematica discreta potrebbe essere più appropriata che la matematica continua per descrivere eventi molecolari discontinui come l’apertura e la chiusura dei MscL.

per l’integrazione di informazioni note sui MscL nei procarioti

Occorrenza multipla dei MscL

Modelli (in vitro ed in vivo) simulano l’attività di un singolo canale ma in una singola cellula batterica se ne possono trovare 50-100.

Modelli in vitro possono facilmente essere estesi per considerare l’occorrenza multipla di MscL.

Applicazione aspirazione:

CANALI completamente aperti, stati di semi-conduttività completamente chiusi

Condizioni ambientali fissate

non tutti i MscL sono nella stessa conformazione.

Effetti di Inibitori ed Attivatori

Inibitori: ione gadolinium, amiloride antibiotici aminoglicosidiciAttivatori: molecole anfipatiche, molecole con gruppi idrofilici ed idrofobici

per descrivere cambiamenti nell’attivazione dei MscLed il funzionamento della cellula

Esempi:

Gadolinium

Gramicidina

Vantaggio:P sistema adatto alla predizione dell’azione di attivatori ed inibitori (non molto utilizzati in esperimenti biologici)

inibisce il flusso osmotico di soluti da E.Coli e altri microrganismi durante shock iposmotico

forma canali nel bilayer: quando aumenta la tensione nel doppio strato, due molecole di gramicidina si legano e il dimero formato è responsabile della formazione del canale

Bibliografia

• D. Besozzi, I.I. Ardelean, G.Mauri, The Potential of P Systems for Modelling the Activity of Mechanosensitive Channels in Prokaryotes

• S. Sukharev, Mechanosensitive channels in bacteria as membrane tension reporters

• S. Sukharev, M. Betanzos, C. Chiang, R. Guy, The gating mechanism of the large mechanosensitive channel MscL

• M. Betanzos, C. Chiang, R. Guy, S. Sukharev, A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension