บทท 3

อาหารเลยงเชอและการแยกเชอบรสทธ

(Cultivation Media and

Screening of Pure Culture)

การน าจลนทรยมาศกษานนจ าเปนตองน าจลนทรยจากธรรมชาตมาเพาะเลยงในหองปฏบตการ ท าใหตองทราบถง

สภาพการเลยงทเหมาะสมและสารอาหารทจลนทรยชนดนน ๆ ตองการ จงมการศกษาความตองการสารอาหาร

และมผลใหผลตอาหารเลยงเชอขนมาอยางมากมาย ซงอาหารเลยงเชอจลนทรยมหลายประเภทขนกบชนดของ

จลนทรย เนองจากจลนทรยมความตองการสารอาหารทมองคประกอบแตกตางกน

หลงจากนนจงท าการแยกเชอจลนทรยดวยเทคนคพนฐานทางจลชววทยา และน าเชอจลนทรยมาบมทอณหภมท

เหมาะสมกบจลนทรยชนดนน ๆ เมอครบระยะเวลาการบม สงเกตลกษณะการเจรญของจลนทรยบนอาหารเลยง

เชอ คดเลอกเฉพาะโคโลนเดยวมาท าการศกษา เมอไดจลนทรยทตองการแลวท าการเกบรกษาเชอจลนทรย ซงม

วธการเกบรกษาหลายวธ เพอใหเชอจลนทรยทตองการ เกบรกษาไดเปนระยะเวลานานโดยไมท าใหสมบตของ

เชอจลนทรยเปลยนแปลงไป

ความตองการสารอาหารของสงมชวต สงมชวตทกชนดตองการสารอาหาร เพอใชในการเจรญเตบโตดงตอไปน

สามารถแบงเปน 4 กลม 1. โฟโตโทรฟ (Phototroph) ด ารงชวตโดยอาศยแหลงพลงงานจากแสงและอาศยแหลงคารบอนจากกาซ

คารบอนไดออกไซด ตวอยางสงมชวตกลมนไดแก สาหรายสเขยวแกมน าเงน

(cyanobacteria) และแบคทเรยประเภททสามารถสงเคราะหแสงได

2. เคโมออโตโทรฟ (Chemoautotroph) ด ารงชวตโดยอาศยพลงงานจากการออกซเดชนของสารอนนทรย และอาศยพลงงาน

จากแหลงคารบอนจากกาซคารบอนไดออกไซด ตวอยางไดแก แบคทเรยท

สามารถใชไนไตรทและก ามะถน เปนตน

3. โฟโตออรแกโนโทรฟ (Photoorganotroph) ด ารงชวตโดยอาศยแหลงพลงงานจากแสง และอาศยแหลงคารบอน

จากสารอนทรย ตวอยางสงมชวตในกลมน เชน Purple Non

Sulfur Bacteria

4. เคโมออแกนโนโทรฟ (Chemoorganotroph) ด ารงชวตโดยอาศยแหลงพลงงานจากพลงงานแสง และอาศยแหลง

คารบอนจากสารอนทรย สงมชวตในกลมนไดแกแบคทเรยกลมตาง ๆ

การแบงประเภทของแบคทเรยตามความตองการสารอาหาร

สามารถแบงแบคทเรยออกได 4 ประเภทคอ

1. โฟโตลโธโทรฟ (Photolithotroph) เปนแบคทเรยทไดพลงงานจากแสงสวางโดยอาศยคลอโรฟลลพเศษ และใชกาซคารบอนไดออกไซดเปนแหลงคารบอน ใชสารอนนทรยเปนตว

ใหอเลกตรอนไดแก เพอเพลซลเฟอรแบคทเรย (Purple Sulfur Bacteria) และกรน

ซลเฟอรแบคทเรย (Green Sulfur Bacteria)

2. โฟโตออรแกนโนโทรฟ (Photoorganotroph) เปนแบคทเรยทไดพลงงานจากแสง ไดแหลงคารบอนจากสารอนทรย และใชสารอนทรยเปนแหลงใหอเลกตรอน เชน แอลกอฮอล

กรดไขมน ไดแก เพอเพล นอน ซลเฟอรแบคทเรย (Purple Non Sulfur

Bacteria)

Purple Non Sulfur Bacteria

3. เคโมลโธโทรฟ (Chemolithotroph) เปนแบคทเรยทไดพลงงานจากการออกซเดชนของ

สารเคม แหลงของคารบอนและอเลกตรอนไดจากสารอนนทรย ไดแก ซลเฟอรแบคทเรย (Sulfur

Bacteria) ไฮโดรเจนแบคทเรย (Hydrogen Bacteria)

4. เคโมออรแกนโนโทรฟ (Chemoorganotroph) เปนแบคทเรยทไดพลงงานจากการออกซเดชนสารอนทรยและแหลงคารบอนและอเลกตรอนไดจากสารอนทรยไดแก แบคทเรยสวนใหญ

โดยทวไป

ชนดของอาหารเลยงเชอจลนทรย

1. การแบงชนดของอาหารเลยงเชอตามลกษณะทางกายภาพ

1.1 อาหารเหลว (Liquid Media) หรออาหารกงแขงกเหลว

(Semisolid Media) ปกตบรรจในหลอดหรอขวด ไมมการเตมวน เชน

อาหารเหลว Nutrient Broth

1.2 อาหารแขง (Solid Media) ปกตบรรจในจานเพาะเชอ นอกจากน

ยงสามารถบรรจในหลอดหรอขวดใหอยในสภาพเอยงหรอต งตรงอยางธรรมดาได โดย “วน” เปนสวนประกอบส าคญทใสลงไปเพอท าใหอาหารแขง โดยมการเตมลงไป 1.5 % - 2.0 % ของสวนประกอบ

ของอาหารแขงท งหมด

อาหารกงแขงกงเหลว (Semisolid Media) มการเตมวน 0.5% ตวอยางเชนอาหาร

เลยงเชอ MRSV ทใชทดสอบการเคลอนทของเชอ

การแบงชนดของอาหารเลยงเชอตามลกษณะการเตรยม

2.1 Common Ingredient of Culture Media

สารทกอยางตองชงตามสตรแลวน ามารวมกนตามวธทอธบายในการเตรยมแตละอาหารเลยงเชอ

มขอดคอ ประหยดคาใชจายและสามารถเตรยมอาหารเลยงเชอไดหลายชนดตามตองการ สวนขอเสยคอ

ตองใชเวลาในการเตรยมมากและการชงสารแตละชนดตองถกตองตามสตร มฉะนนจะไมไดผลตามท

ตองการ

2.2 Dehydrated Media เปนอาหารเลยงเชอทผสมสารตาง ๆ ตามสตรมาเรยบรอยแลวเพยงแตตองค านวณวาตองชงสารตาง ๆ มาเทาใดและน ามาผสมกบน าจะได

ปรมาตรตามตองการ ขอดคอประหยดเวลาในการเตรยมเหมาะส าหรบแหลงทตองใชอาหารเลยงเชอนน

ๆ เปนประจ า เชนหองปฏบตการทางจลชววทยา หองปฏบตการในโรงพยาบาล สวนขอเสยคอมราคา

แพง

3. การแบงชนดของอาหารเลยงเชอตามองคประกอบของอาหาร

3.1 อาหารไมสงเคราะห (Non-Synthetic Medium) อาหารเลยงเชอทไมทราบสวนประกอบทางเคมทแนนอน ประกอบดวยเนอเยอพชหรอสตว มสารอนทรยอยมากมายชวยในการเตบโตของ

เชอหลายชนด ทนยมใชในหองปฏบตการเชน Nutrient Agar (NA)

Potato Dextrose Agar (PDA) โดย Beef Extract เปนสารสกดจากเนอทไมมไขมน

ประกอบดวยคารโบไฮเดรต สารประกอบอนทรยไนโตรเจนและวตามนทละลายน า สวนเปปโตน (Peptone)

ไดมาจากการยอยสลายของโปรตน เชนเนอสตว เคซน (โปรตนในนม) ประกอบดวยสารอนทรยไนโตรเจน

คารโบไฮเดรตและวตามนและ อาการ (Agar) คอวนทเปนสารประกอบคารโบไฮเดรตทซบซอน ไดจากสาหรายส

แดงใชท าใหอาหารแขงตว ไมมคณคาทางอาหาร

3.2 อาหารสงเคราะห (Synthetic Media) อาหารสงเคราะหท

ทราบองคประกอบทางเคมทแนนอน เชน MRS Agar ใชเลยงเชอแบคทเรย

กลม Lactobacilli ซงอาหารเลยงเชอหลายชนดนมสวนประกอบหลาย

ชนด แตละชนดทราบปรมาณแนนอน

การแบงชนดของอาหารเลยงเชอตามประโยชนทใช

4.1 เอนรชเมนท มเดย (Enrichment Media) อาหารเลยงเชอทมการเตมสารพเศษลงไปเพอเรงการเตบโตของเชอตวหนงแตยบย งเชออกตวหนง ใชเลยงเชอทเจรญไดยาก เชน

Blood Agar จะกระตนการเจรญของ Salmonella sp. ยบย งการเจรญของ E. coli สารพเศษทเตมลงไปเปนเลอดคนหรอแกะ โดยเตมลงไปในปรมาณรอยละ 5 เพอท าใหแบคทเรย

กอโรคบางชนดเจรญเตบโตได

4.2 ซเลคทฟมเดย (Selective Media) อาหารเลยงเชอทมสารยบย งการเจรญเตบโตของแบคทเรยบางชนด แตสงเสรมแบคทเรยอกชนด ตวอยางเชน MacConkey Agar มการเตม Crystal Violet และ Bile Salt เพอยบย งแกรมบวกแตแกรมลบสามารถเจรญได ถามการยอยแลคโตสจะเปลยนเปนสแดงคอ กลมแบคทเรยทไมกอโรค ถาไมมการยอย

แลคโตสจะใส ไมมสคอกลมแบคทเรยกอโรค

4.3 ดฟเฟอรเรนเชยลมเดย (Differential Media) อาหารเลยงเชอทมการเตมสารบางอยางเพอใชแยกประเภทของเชอโดยอาศยสมบตทแตกตางกน เชน Mac Conkey Agarมการเตมนวตรลเรด (Neutral Red) ใชเปนอนดเคเตอร โดยดวาถาแบคทเรยแกรมลบสามารถจะเจรญไดกจะมการยอยแลคโตสไดเปนกรด ท าใหโคโลนมสแดงเพราะสอนดเคเตอรของ

นวทรล เรดเปลยนไป สวนพวกทไมมการยอยแลคโตสซงโคโลนจะใสไมมส เนองจากพวกทยอยแลค

โตส ไมไดมการท าใหเกดโรค อาหารเลยงเชอประเภทนจงมประโยชนในการแยกแบคทเรยจากล าไสวา

เปนเชอทท าใหเกดโรคและไมท าใหเกดโรค อกตวอยางเชน Blood Agar ยอยเมดเลอดแดงท าใหเกดวงใสของการยบย ง (Clear Zone) รอบโคโลน

4.4 แอสเซมเดย (Assay Media) อาหารเลยงเชอทมองคประกอบพเศษใชวเคราะหหาปรมาณวตามน กรดอะมโน และสารปฏชวนะ และใชตรวจสอบประสทธภาพของสารเคมทใช

ในการยบย งหรอท าลายจลนทรย

4.5 อาหารทใชตรวจนบจ านวนจลนทรย องคประกอบของอาหารตองเหมาะสมกบการเจรญของ

จลนทรยเหลานน เชน การหาจลนทรยในน าหรอนม

4.6 อาหารทใชศกษาสมบตของจลนทรย ใชในการตรวจสอบการเจรญของจลนทรยและศกษา

สมบตทท าใหเกดการเปลยนแปลงทางสรรวทยาและชวเคม

4.7 อาหารทใชเกบรกษาเชอจลนทรย (Maintenance Media) ตองใชเกบรกษาเชอจลนทรยใหมชวตนานทสด โดยทเชอมสมบตคงเดม และตองท าการลดองคประกอบ

บางอยางในอาหารเพอใหเชอมการเจรญเตบโต และปลอยของเสยนอยลง เชน น าตาลกลโคสใน

อาหารเพมขนท าใหเชอมการเจรญเตบโตโดยการสรางกรดไดมาก จลนทรยจะตายเรวจงตองมการลด

ปรมาณกลโคสไดนอยลง

กอนทจะชงสารอาหารเพอเตรยมอาหารเลยงเชอตองมการค านวณใหเรยบรอยกอนท าการชง โดยเฉพาะ

อาหารเลยงเชอประเภทดไฮเดรท (Dehydrate) ซงมกเขยนเขยนไวขางขวดวาชนมาก (Very Hygroscopic) ดงนนจะตองไมเปดขวดไวนานเมอตองการตกสารทจะตกสารมาชง ตองตกอยางรวดเรวและหากตกสารนนมาเกนหามใสกลบคน เพราะสารเหลานดดความชนในอากาศ

แลวจะเสยงาย

การวดคาความเปนกรดดางของอาหารเลยงเชอ อาหารทใชเลยงจลนทรยนอกจากตอง

ค านงถงองคประกอบของอาหารแลว คาความเปนกรดดางของอาหารยอมมผลตอการเจรญเตบโตของ

จลนทรย เนองจากจลนทรยแตละชนดเจรญไดดในคาความเปนกรดดางของอาหารเลยงเชอแตกตางกน

ส าหรบการวดคาความเปนกรดดางของอาหารเลยงเชอแตละชนดจะใชกระดาษวดคาความเปนกรดดาง ถา

จะใหถกตองแนนอนกวดดวยเครองวดความเปนกรดดาง ถาไมถกตองกสามารถปรบดวยการเตม

สารละลายโซเดยมไฮดรอกไซด NaOH หรอ HCl เมอเตมแลวใหคนสารละลายใหท วแลววดคาความเปนกรดดางใหมจนกวาจะไดคาความเปนกรดดางตามทตองการ นอกจากนอาหารเลยงเชอบางชนดม

การใสอนดเคเตอรลงไป เพอบอกสภาพความเปนกรดดางทเกดจากการใชสารตาง ๆ ทมอยในอาหารเลยง

เชอของเชอนน ๆ โดยดจากการเปลยนสของอาหารเลยงเชอตามปกต

การแยกเชอบรสทธและลกษณะการเจรญเตบโตของเชอบรสทธ

เชอบรสทธ (Pure Culture) หมายถงเชอจลนทรยทประกอบดวยสงมชวตชนดเดยวกนทกเซลลมลกษณะเหมอนกนทกประการ การแยกเชอบรสทธ มวธการดงตอไปน

การขดเชอในจานเพาะเชอ (Streak Plate) และท าใหเชอกระจายในจานเพาะเชอ

(Spread Plate)

วธนตองการใหแบคทเรยทมความเขมขนมาก คอย ๆ กระจายออกไป หรอม

ความเจอจางจนพอทจะท าใหเซลลแตละเซลลแยกออกจากกน ดงนนการขดในจานเพาะเชอทดตอง

ใหรอยขดมระยะทางยาวมากทสด เพอเซลลจะไดแยกจากกน และแตละเซลลจะเจรญแบงตวมากขน

จนเปนโคโลนทมองเหนไดดวยตาเปลา จงคาดหวงไดวาแตละโคโลนนาจะเปนเชอบรสทธ ถาไมแนใจ

ใหท าการขดเชอและกระจายเชอซ าอกคร งหนง โดยการขดเชอในจานเพาะเชอสามารถท าไดหลาย

แบบ คอ

1.1 การขดเชอแบบงาย (Simple Streak)

โดยการใชหวงเขยเชอ (Loop) ลนไฟจนรอนแดงและทงใหเยนลงซกครหนง แตะเชอทตองการจะแยกบรสทธ มาขดบนผววนของอาหารเลยงเชอในจานทจดเรมตน เชอ

แบคทเรยจะมเปนจ านวนมาก เมอขดในจานเพาะเชอไปเรอย ๆ จ านวนแบคทเรยจะลดลงเหลอนอยลง

จนอาจแยกออกเปนเซลลเดยว ๆ ได

รปแบบการขดเชอแบบงาย (Simple Streak) แบบตาง ๆ ท

ใชในการแยกเชอจลนทรย

การขดเชอแบบตดกน (Cross Streak)

เปนวธทนยมในหองปฏบตการ โดยใชหวงเขยเชอทเผาไฟ

และรอใหเยน แลวแตะเชอมาขดบนอาหารวนตามแนวท 1-2 ประมาณ 3-4 เสน เผาหวงเขย

เชอจนรอนแดงเพอฆาเชอทมมากเกนไป และรอใหเยน ขดบนอาหารวนตามแนวท 2-3 โดย

ใหรอยขดตดผานตอนปลายของแนว 1-2 เลกนอย ท านองเดยวกน เผาหวงเขยเชอ และขด

ตามแนว 3-4 ดงนนเชอจะหนาแนนมากตามแนวขดในตอนแรก ๆ แตในตอนทายเชอจะเจอ

จางลงและแยกแตละเซลลออกจากกนได เมอน าไปบมทอณหภมทเหมาะสมเปนเวลา 24-48

ชวโมง แตละเซลลจะเจรญเปนโคโลนเดยว ๆ ได ซงสามารถตรวจสอบจลนทรยไดดวยการ

ยอมสแกรม

วธการขดเชอแบบตดกน (Cross Streak)

การท าใหเชอกระจาย (Spread Plate)

มหลกการเดยวกนโดยการใชแทงแกวงอรปสามเหลยมและมดามยน

ออกมาใหจบได กอนใชตองท าใหแทงแกวปราศจากเชอใด ๆ โดยจมในแอลกอฮอลรอยละ 95 และลนไฟ

หลงจากนใชแทงแกวนเกลยเชอปรมาณเลกนอยใหท วผววน เพอใหเซลลตาง ๆ แยกและกระจายออกจาก

กน เมอน าไปบมทอณหภมทเหมาะสมเปนเวลา 24-48 ชวโมงการแยกเชอบรสทธโดยวธนมขอดคอ ใช

เครองมอนอย สะดวก รวดเรว และใชตวอยางเพยงเลกนอยเทานน จงนยมใชวธนในหองปฏบตการ

ขนตอนการท าใหเชอกระจาย (Spread Plate)

การเทเพลท (Pour-Plate Technique)

หลกการเทเพลท คอการท าใหตวอยางเชออยในหลอดอาหารวนท

หลอมเหลวแลวและเทลงในจานเพาะเชอ อาหารวนจะถกหลอมเหลวและทงไวใหอนทอณหภม

ประมาณ 45 องศาเซลเซยส ซงจะผสมตวอยางเชอลงไปและท าใหกระจายอยางสม าเสมอ ตวอยาง

เชออาจจะถกท าใหเจอจางดวยการใชหวงเขยเชอ (Loop) ถายเชอไปยงอาหารวนหลอดตอไป ซงมผลใหจ านวนเซลลแบคทเรยในอาหารวนหลอดหลง ๆ มความเจอจางมากพอจนสามารถแยก

กระจายจากกนและเจรญเปนโคโลนเดยว ๆ ได ซงโคโลนจะเกดท งบนผววนและใตวน หากเชอตง

ตนมเชอจลนทรยในปรมาณมากจ าเปนตองท าการเจอจางกอน ดวยวธการเจอจางแบบ 10 serial dilutions โดยปเปตสารละลายของเชอตงตน 1 มลลลตรใสหลอดทมน าเกลอ (0.9 % NaCl) ทฆาเชอแลวปรมาตร 9 มลลลตร ดวยเทคนคปลอดเชอเขยาใหเขากน จะไดเปนสารละลายของเชอท10-1 ตอมาปเปตสารละลายของเชอทได (10-1) 1 มลลลตร ใสหลอดทมน าเกลอ (0.9 % NaCl) ทฆาเชอแลว ปรมาตร 9 มลลลตร ดวยเทคนคปลอดเชอเขยาใหเขากนจะไดเปนสารละลายของเชอท 10-2 และท าไปเรอย ๆ จนไดความเจอ

จางทตองการ เมอไดระดบการเจอจางทตองการแลวจงเลอกมาท าเทคนคการเพาะเชอแบบเทเพลท

(Pour Plate Technique) ตอไป

เทคนคการเพาะเชอแบบ Pour Plate Technique เปนอกวธการหนงทใชในการแยกเชอใหบรสทธไดเชนกน โดยตวอยางเรมตนจะถกเจอจางใหมความเขมขนหลาย ๆ

ระดบดวยเทคนค Serial Dilution เพอท าใหเชอถกเจอจางมากพอทจะท าใหเกดโคโลนเดยว ๆ บนจานเพาะเชอ โดยน าตวอยางทมความเขมขนทเหมาะสมเตมลงในจานเพาะ

เชอเปลาทผานการฆาเชอแลว แลวท าการเทอาหารวน (Agar Medium) ลงไปในจานเพาะเชอ (โดยอณหภมของอาหารเพาะเชอประมาณ 48-50 องศาเซลเซยส ซงจะไมท าให

เชอแบคทเรยและยสตตายได) ผสมอาหารและเชอใหเขากนและใหเกดการกระจายอยาง

สม าเสมอดวยการหมนจานเพาะเชอ เมอวนเกดการแขงตว เซลลจลนทรยจะถกตรงใหอยดาน

ในของอาหาร และจะเกดโคโลนเดยว ๆ ของเชอขนมา

เทคนคการเพาะเชอแบบเทเพลท

การเกบรกษาเชอบรสทธ

ในการศกษาเชอบรสทธ ตองมวธการเกบรกษาเชอมชวตใหคงอย ซงในหองปฏบตการ

โดยสวนใหญจะมหนวยเกบรกษาเชอบรสทธ การเกบรกษาเชอบรสทธมหลายวธ การทจะ

เลอกใชวธการใดขนกบแรงงาน คาใชจายของการเกบรกษา คณคาและประโยชนของเชอ โดย

วธการเกบรกษาเชอบรสทธมดงตอไปน

การถายเชอไปสอาหารใหม

เชอแบคทเรยจะเกบไวในอาหารระยะเวลาหนง แลวเปลยนอาหารใหม ระยะเวลา

ในการยายเชอไปอาหารใหมนนขนกบชนดของเชอ โดยระยะเวลาอาจเกบไวไดนานหลายสปดาหหรอ

หลายเดอน นอกจากนมกเกบไวทอณหภมต า เพอใหเชองดการเจรญเตบโต ดงนนการเกบรกษาเชอ

บรสทธโดยวธนตองค านงถงอณหภมทเหมาะสมในการเกบชนดของอาหารเลยงเชอ และชวงเวลาใน

การเปลยนอาหารเพราะตองการใชอณหภมและชนดของอาหารทท าใหเชอบรสทธนนเจรญเตบโตอยาง

ชา ๆ มากกวาทจะท าใหเจรญอยางรวดเรว เพอใหระยะเวลาในการยายเชอยาวนานทสด วธการเกบ

รกษาเชอบรสทธโดยการถายเชอไปสอาหารใหม มขอเสยเปรยบทไมอาจปองกนการเปลยนแปลง

ลกษณะของสายพนธไดเพราะอาจเกดการกลายพนธหรอการผาเหลา

การปดทบดวยน ามนแร

แบคทเรยทเจรญอยบนผววนเอยง (Agar Slant) จะถกปดทบดวยน ามนแรทปราศจากเชอหนาประมาณครงนว โดยวธนสามารถเกบรกษาเชอนไวไดเปนป ๆ การเกบ

รกษาเชอโดยวธนมขอดคอ สามารถเขยเชอออกมาใชศกษาหรอน าไปเลยงตอไดโดยใชเขมทปราศจาก

เชอเขยออกมา และยงเกบเชอหลอดเดมไวได

ไลโอฟไลเซชน (Lyophilization)

เปนการท าใหเชอแหงโดยเรวในสภาพเยนจนแขง (Freeze-Dry) วธนท าไดโดยบรรจเชอในหลอดแกวขนาดเลก ท าใหเยนจดจนแขงอยางรวดเรวทอณหภม -60 องศาเซลเซยสถง -78 องศา

เซลเซยส โดยจมหลอดลงในน าแขงแหงทแชอยในแอลกอฮอลและตอเขากบทอดดอากาศ ท าใหเกดสภาพ

สญญากาศขนภายในหลอด น าแขงในหลอดจะระเหดออกไปและจลนทรยจะแหงสนท ปดปากหลอดโดยใชไฟ

ลนใหปากหลอดหลอมตดกน ขอดของวธการนคอ เกบรกษาเชอบรสทธไวไดนานมากโดยทเชอยงมชวตอยและ

ไมเปลยนแปลงลกษณะพนธกรรมและยงใชเนอทในการเกบนอย แตวธการนเสยคาใชจายในการท าสงมากมกจะ

ใชในหองปฏบตการขนาดใหญ

การเกบรกษาเชอไวทอณหภมต ามาก เชนการเกบเชอไวในไนโตรเจนเหลว ซงมอณหภม -196 องศาเซลเซยส เปนวธเกบรกษา

เชอไวไดนาน โดยวธนเซลลจะถกเตรยมไวเปนสารละลายทเขมขนอยในอาหารเลยงเชอทมสารปองกนอนตราย

ใหแกเซลลอนจะเกดจากผลกน าแขงทเกดขน สารนนไดแก กลเซอรอลหรอ ไดเมทลซลฟอกไซด โดยสารละลาย

เซลลดงกลาวจะเกบไวในขวดเลก ๆ ทปดผนก และแชแขงทอณหภม-150 องศาเซลเซยส แลวจงเกบขวดเหลาน

ไวในไนโตรเจนเหลวซงเปนถงขนาดใหญมสภาพเปนสญญากาศ วธใชไนโตรเจนเหลวนใชไดดกบเชอทไม

สามารถใชวธไลโอฟไลเซชนได เชอสวนใหญยงมชวตไดนานตงแต 10-30 ป โดยไมมการเปลยนแปลงลกษณะ

อยางไรกตามวธนมคาใชจายแพงเพราะตองคอยเตมไนโตรเจนเหลวเปนคร งคราว

(Lyophilization)

Liquid nitrogen

ลกษณะการเจรญของเชอแบคทเรยในอาหารเลยงเชอ

ลกษณะการเจรญของแบคทเรยทปรากฏ เชน ลกษณะการเจรญบนอาหารเลยงเชอ ชนดตาง ๆ สท

เกดขน ความมากนอยของการเจรญ กลนของเชอ สามารถใชเปนเกณฑในการจดจ าแนกชนดของ

แบคทเรยได เพราะลกษณะการเจรญบนอาหารชนดตาง ๆ จะเปนลกษณะเฉพาะของเชอแตละชนด

โดยจะสงเกตลกษณะดงน

1. การเจรญเปนโคโลนบนอาหารแขง (Agar Plate Colony)

1.1 ขนาดของโคโลน (Size) ศกษาขนาดของโคโลน จากเสนผาศนยกลางไมถง 1 มลลเมตร จนถงโคโลนขนาดใหญทมเสนผาศนยกลาง 5-10 มลลเมตร แบคทเรยบางชนดมขนาด

ของโคโลนจ ากดแมบมไวนาน หรอแมแตเชอบางชนดโคโลนมลกษณะเปนเมอกและลามไปยงโคโลนอน

1.2 รปรางของโคโลน (Form) โคโลนมรปรางแตกตางกนดงน

Punctiform โคโลนมขนาดเลกมาก แตมองดวยตาเปลาเหน ม

เสนผาศนยกลางนอยกวา 1 มลลเมตร Circular โคโลนมลกษณะกลม Filamentous

โคโลนประกอบดวยเสนสายพนกนแนน Irregular รปรางไมแนนนอน และ Rhizoid ม

การเจรญแตกกงกานสาขาไมแนนอนและมลกษณะคลายราก

1.3 ขอบหรอรมของโคโลน (Margin, Edge)

มหลายรปแบบขนกบชนดของแบคทเรย ลกษณะของขอบมดงน

Entire ขอบเรยบ Undulate ขอบโคโลนเปนคลนโคงเวาเลกนอย Lobate ขอบเปน

คลนโคงเวาและยนมาก Erose ขอบหยกเปนซไมสม าเสมอ Filamentous ขอบเปนเสน

สายยาวไมแนนอน

1.4 ความสงของโคโลน (Elevation)

แตกตางไปตามชนดของแบคทเรย บางชนดโคโลนแบนบาง บางชนด

นนมากเกอบเปนรปครงวงกลมกม ความสงของโคโลนมลกษณะ Flat โคโลนแบนราบตดกบอาหาร

Raised โคโลนมความหนาสงขนจากผวหนาของอาหาร Convex โคโลนมความโคงนน

เลกนอยและ Pulvinate โคโลนมความนนโคงขนมาจากผวอาหารมาก

การเจรญเปนโคโลนบนอาหารแขง

(Agar Plate Colony)

ลกษณะการเจรญของจลนทรยในอาหารเหลว (Broth Culture)

ลกษณะปรมาณการเจรญเตบโตของเชอจลนทรยเมอเจรญในอาหารเหลว อาจมปรมาณ นอย ปานกลาง

หรอมาก นอกจากนยงมชนดของการเจรญและการแพรกระจาย โดยเชอจลนทรยอาจเจรญกระจายทว

อาหารอยางสม าเสมอ ท าใหอาหารขนทวท งหลอดหรอการเจรญอาจเกดมากทผวหนาอาหารเปนแผนบาง

หรอมการเจรญอยางมากทกนหลอด การเจรญในอาหารเหลวมรายละเอยดดงน

2.1 การเจรญทผวหนาอาหารเหลว

None คอ ไมมการเจรญทผวหนา

Ring คอ มการเจรญเปนวงรอบตดอยทขอบหลอดแกว

Pellicle คอ การเจรญเปนแผนลอยทผวหนาอาหาร

Flocculent คอ การเจรญประกอบดวยกลมแบคทเรยเกาะกนเปนกอนท

ผวหนาของอาหาร

2.2 การเจรญทผวหนาอาหาร

None คอ ไมมการเจรญ

Turbid คอ การเจรญมลกษณะขนและมตะกอน

Granular คอ การเจรญประกอบดวยแกรนลเลก ๆ เปนอนมาก

การตกตะกอนกนหลอด

None คอ ไมมการตกตะกอน

Granular คอ ตะกอนเปนแกรนลละเอยด

Flocculent คอ ตะกอนเปนกลมกอน Viscid คอ ตะกอนเปนเยอเหนยว

Flaky คอ ตะกอนเปนแผนแยกออกจากกน

3. ลกษณะการเจรญของเชอจลนทรยในอาหารวนเอยง (Slant)

Slant คอ หลอดอาหารวนทวางเอยงลาด ลกษณะการเจรญมดงน

3.1 ปรมาณเชอ มาก ปานกลาง หรอนอย 3.2 รปรางการเจรญ) โดยแบงเปน

Filiform ลกษณะการเจรญสม าเสมอตามแนวขดเชอ

Echinulate มรอยหยกทขอบคลายฟนเลอย

Beaded การเจรญไมสม าเสมอ แยกกระจายตามแนวทขดเชอ

Arborescent การเจรญแตกกงกานคลายตนไม

Rhizoid การเจรญแตกกงคลายราก

Effuse การเจรญมนอย บาง และกระจดกระจาย

แบบแผนการเจรญของเชอจลนทรยบนอาหารเอยง

(Growth Patterns on Slant)

สรปทายบท

ในการเพาะเลยงจลนทรยในหองปฏบตการท วไป มปจจยตาง ๆ ทตองค านงถง ไดแก ประเภทของ

ความตองการอาหารของแบคทเรยซงแบงเปน 4 ชนดคอ โฟโตโทรฟ (Phototroph)

เคโมออโตโทรฟ (Chemoautotroph) โฟโตออรแกโนโทรฟ (Photoorganotroph) และเคโมออแกนโนโทรฟ (Chemoorganotroph) นอกจากนยงควรค านงถงชนดของอาหารเลยงเชอทใชเพาะเลยง เทคนคการแยกเชอบรสทธไดแก การขดเชอในจานเพาะเชอ (Streak Plate) และท าใหเชอกระจายในจานเพาะเชอ (Spread Plate) ซงเปนเทคนคขนพนฐานทางจลชววทยา เมอเพาะเลยงจลนทรยแลว จะตองพจารณาลกษณะการเจรญเตบโตของเชอบรสทธ ลกษณะการเจรญ

ของเชอแบคทเรยในอาหารเลยงเชอซงมการเจรญทหลากหลาย เมอไดเชอจลนทรยทตองการแลวจงท าการ

เกบรกษาเชอบรสทธ โดยมวธการเกบรกษาไดหลายวธ ซงแตละวธการเกบรกษามขอดและขอเสยแตกตาง

กน วธการเกบรกษาเชอจลนทรยไดแก การถายเชอไปสอาหารใหม การปดทบดวยน ามนแร และการท าไล

โอฟไลเซชน (Lyophilization) เปนตน

แบบฝกหดทายบท

1. สารอาหารเพอใชในการเจรญเตบโตของสงมชวตม 4 กลมมอะไรบาง

2. อาหารทใชในการเลยงเชอจลนทรยแบงออกเปนกชนด มอะไรบาง

3. โคโลนมขนาดเลกมาก แตมองดวยตาเปลาเหน มเสนผาศนยกลางนอยกวา 1 มลลเมตรเรยกวาม

รปรางแบบใด

4. หากตองการเกบเชอจลนทรยไวเปนเวลา 30 ป จะตองใชวธการเกบแบบใด

5. วธการแยกเชอจลนทรยใหบรสทธมวธการใดบาง ยกตวอยางมา 2 วธการ

6. ขอดของการเกบรกษาเชอจลนทรยดวยวธการปดทบดวยน ามนแรคออะไร

7. วธการขดเชอแบบใดเปนวธการทนยมใชมากในหองปฏบตการจลชววทยา

8. ลกษณะความสงของโคโลนมลกษณะ Flat มลกษณะอยางไร

9. ขอเสยของวธการเกบรกษาเชอบรสทธโดยการถายเชอไปสอาหารใหมคออะไร

10. อาหารเลยงเชอแบคทเรย สตรอาหาร Nutrient Agar จดเปนอาหารเลยงเชอประเภทใด

The end