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CLC Microbial Genomics Module
株式会社キアゲン グローバルインフォマティクスソリューションズ & サポートアプライドアドバンストゲノミクス宮本 真理 Ph.D.
Filgen WebEx seminar, 2015/07/16 (2015/07/30) 1
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Agenda
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• メタゲノミクス解析• 製品概要• 機能紹介• デモ
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メタゲノム解析: どんな細菌がどのぐらい居るのか?
1. PCR にてバラエティを持つ16S rRNAの遺伝子を増幅
2. 次世代シークエンス
3. 得られたリードの分類.
Operational Taxonomical Units (OTUs) テーブル (abundance tables)
2次解析: α多様性: サンプルの中にどのぐらいの菌がいるのか?
β多様性: サンプル間で、どのぐらい異なるのか?
統計検定により組成の構成量の検定
Microbial community analysis
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16s rRNA gene as a phylogenetic marker for bacterial ID
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16s rRNA gene
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CLC Microbial Genomics Module 1.0
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特長
o すべての操作をグラフィカルなインターフェースでo 大量なサンプル処理を可能にするワークフローo インタラクティブなビジュアライゼーション
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CLC Microbial Genomics Module 1.0
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マイクロバイオーム解析
o 16S rRNA解析、その他アンプリコンデータ対応. .
o OTUクラスタリング（de novo, Reference based）
o Greengenes, Silva, UNITEをOTUクラスタリング用データベースに利用可能.
o 様々な階層でマイクロバイオームの組成を表示。
統計解析
o 多様性の指標、α-多様性、β-多様性を計算
o 主座標分析 (PCoA) 、さらにメタデータの追加表示も可能
o PERMANOVA 解析
o 組成量の検定o OTUの組成量のノーマライズ.
o 統計的有意差の検定.
o Scatter Plotでの比較.
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Microbiome Genomics Module
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モジュールとワークフローがセット
• Microbiome Genomics Module をインストールすると、OTUクラスタリングというツール群とワークフローがインストールされます。
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解析の流れ
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Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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解析フロー
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OTU Clustering
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
解析フロー
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Add Metadata
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解析フロー
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Estimate α, β diversity
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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解析ステップ
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OTU Clustering
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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解析ステップ
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OTU Clustering
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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Merge and trim adaptor
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解析ステップ
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OTU Clustering
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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解析ステップ
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OTU Clustering
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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解析ステップ
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Add Metadata
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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解析ステップ
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Estimate α, β diversity
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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解析ステップ
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Estimate α, β diversity
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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解析ステップ
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Estimate α, β diversity
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
•結果ファイル
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Analysis flow
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Add Metadata
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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OTU table •結果はサンプルごと、メタデータに基づいてまとめるなどインタラクティブに設定可能
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結果
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OTU table
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Results
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Estimate α, β diversity
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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解析ステップ
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Estimate α, β diversity
Import
Merge pair
Trim primer
Length trimming
Remove Low coverage
OTU Clustering
Add Metadata
Estimate α, β diversity
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DEMO：死体発見現場から採取した細菌叢と容疑社宅から押収したブーツ
2626
DNA from soil on suspect 1 boots
DNA from soil alibi site 1
DNA from soil on suspect 2 boots
DNA from soil alibi site 2
DNA from soil at excavation site
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追加での解析
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Heat map
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2次解析
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PREMANOVA analysis
• Input is OTU table
Sample to Insight
2次解析
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PERMANOVA analysis
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2次解析
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PERMANOVA analysis
•グループは分かれているという結果。•しかしながら今回のデータは郡内のレプリケートが少ないため、郡と郡での有意さを出すことが難しかった。
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Dataset: 12 samples with a total of 2.5 Mペアエンド Illumina MiSeqリード（300 bp）
Database: Greengenes 97% OTUs, 100.000 sequences
Laptop: Macbook Pro w. Processor 2,6 GHz; メモリ 4 GB
CLC Microbial Genomics Module benchmarked vs. UCLUST
(Edgar, R.C. (2013) UPARSE: Highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads, Nature Methods[Pubmed:23955772, dx.doi.org/10.1038/nmeth.2604].)
* Purity scores reflect the homogeneity of a cluster. If the majority of the labels in each cluster are the same, the purity score is high.
However, the purity score does not penalize for the creation of multiple clusters that contain the same label(s). The NMI score, in
addition, reflects the mutual information between the clusters and the taxonomic labels; a high NMI score is achieved when high
purity is reached with a minimum number of clusters. Bonder MJ, Abeln S, Zaura E, Brandt BW. (2012) Comparing clustering and
pre-processing in taxonomy analysis. Bioinformatics. 28:2891-7. doi: 10.1093/bioinformatics/bts552.
De novo Open reference
CLC UCLUST CLC UCLUST
Purity* 0,70 0,71 0,84 1,00
NMI* 0,89 0,89 0,92 1,00
OTU count 5.200 4.844 6.738 6.727
Chimeric abundance 43.264 38.493 15.421 8.798
パフォーマンス評価
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ライセンスとサーバーへの拡張
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• CLC Microbial Genomics Module は、CLC Genomics Workbench/Biomedical Genomics Workbench への拡張モジュールです。製品のご利用には、いずれかの製品が必要です。
• ライセンスは、永続ライセンスと、ネットワークライセンスを用意しています。
• アカデミック価格も用意しています。
• Genomics Serverと連携し、大量なデータを処理できるよう、Genomics Server 対応ライセンスも用意しています。詳しくはお問い合わせ下さい。
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ご清聴ありがとうございました。
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Question?
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