[PPT]Liquid Chromatography Fundamentals - Theory · Web viewLiquid Chromatography Fundamentals - Theory Keywords HPLC, LC, HPLC theory, HPLC fundamentals, teaching HPLC, learning

教育目的専用May 9, 2023 5991-8064JAJPアジレント・テクノロジー株式会社 © Agilent Technologies, Inc. 20161

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キャピラリー電気泳動の基礎 :

ハードウェア編


アジレントは教育機関の活動をサポートし、当社が所有する資料の使用機会を積極的に提供しています。

本スライドセットはアジレントによって制作されています。使用目的は教育目的のみに限定されています。

画像、略図、図をその他の目的に使用する場合は、事前にアジレントまでお問い合わせください。

May 9, 2023 5991-8064JAJPアジレント・テクノロジー株式会社 © Agilent Technologies, Inc. 2016

教育目的専用本製品は一般的な実験用途での使用を想定しており、医薬品医療機器等法に基づく登録を行っておりません。

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目次

はじめに• 定義と歴史• CE の用途• CE の汎用性• エレクトロフェログラムの形状

機器• CE システムのコンポーネント • サンプル導入 • オートサンプラ• キャピラリーとカセット • 検出器• バッファ交換システム • 例詳細情報



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はじめに定義と歴史

電気泳動とは、荷電化学種 ( イオン ) が電場内で引力または斥力により特異的に移動する現象です。

分離法としての電気泳動は、 Arne Tiselius ( スウェーデン、 1902 ～ 1971年 ) により 1937 年に発表されました。 Tiselius は、バッファ間をつなぐチューブにタンパク質混合物を入れて電場をかけると、サンプル成分がその電荷とモビリティに応じた方向と速度で泳動することを発見しました。

分離科学における功績が認められ、 Tiselius はノーベル化学賞 (1948 年 ) を受賞しています。

目次

https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1948/tiselius-bio.html



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はじめにCE の用途

キャピラリー電気泳動法 (CE) は、低分子および高分子を定性的・定量的に分析し、検出するための分離法です。一般的に質量分析計と組み合わせて使用されます。

幅広いアプリケーションの例 :• カチオン / アニオン分析• 極性化合物 ( 塩基性薬物など )• 複雑なマトリックス中の天然産物• キラルおよび異性体化合物の分析• タンパク質の特性解析 ( 抗体など )• ペプチド、 DNA 、 RNA 、オリゴヌクレオチドの分析• 分子相互作用 ( タンパク質 -DNA など )

目次



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はじめにCE の用途

キャピラリー電気泳動の汎用性は、多様な分離モードから生まれています。

目次

分離モード

溶出ゾーン速度の違いにもとづく分離• キャピラリーゾーン電気泳動 (CZE)• ミセル動電クロマトグラフィー (MEKC)• キャピラリー電気クロマトグラフィー (CEC)

分子ふるい分子のサイズと形状による固定相 ( ゲル ) 内での移動速度の違いにもとづく分離• キャピラリーゲル電気泳動 (CGE)

キャピラリー等電点電気泳動 (CIEF)バッファ内に形成される固定 pH グラジエントによる分子の移動にもとづく分離

キャピラリー等速電気泳動 (CITP)リーディング電解液とターミナル電解液との間に生じる移動電場グラジエントにもとづく分離で、すべてのサンプル分子が連続したゾーンとして一定濃度と一定速度で移動



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はじめにCE の汎用性

目次

キャピラリーゾーン電気泳動 (CZE)CZE は、最も基本的なモードの CE です。 CZE では、キャピラリーが泳動液 ( バッファ ) で満たされ、入口側から注入されたイオンが異なる速度で移動することにより分離が起こります。

キャピラリー電気クロマトグラフィー (CEC)CEC は、小規模な液体クロマトグラフィーのようなモードです。電場を用いて、 EOF により充填クロマトグラフィーカラム内に液体を流します。きわめて高い段数が得られます。

ミセル動電クロマトグラフィー (MEKC)MEKC ( 電気泳動とクロマトグラフィーのハイブリッド ) は、生物薬剤や低分子の分析に広く用いられています。中性物質と荷電物質の両方の分離に用いる分離モードです。

キャピラリー壁

電気的な二重層

固定相粒子



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はじめにCE の汎用性

目次

キャピラリーゲル電気泳動 (CGE)CGE は、巨大分子 ( タンパク質や核酸 ) をそのサイズによって分離するモードです。荷電物質がポリマー中を移動する際に、大きい物質は小さい物質よりも動きが妨げられます。DNA や SDS 飽和タンパク質は、質量電荷比が一定であるため、ゲルを使わなければ分離できません。

キャピラリー等速電気泳動 (CITP)CITP は「移動境界」電気泳動テクニックです。2 種類のバッファシステムを組み合わせることで、すべての溶質が個別でありながら一連のバンドとして、同じ速度で移動する状態をつくりだします。各ゾーンは、いわゆるリーディング電解液とターミナル電解液の間に挟まれた状態になります。カチオンまたはアニオンの分析が可能です。

キャピラリー等電点電気泳動 (CIEF)CIEF は、等電点 (pI) の違いをもとにペプチドやタンパク質を分離する「高分離能」の電気泳動テクニックです。

ポリマーマトリックス

低 pH pH グラジエント高 pH

サンプルと両性電解質の混合物を充填したキャピラリー



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はじめにエレクトロフェログラムの形状

スラブゲルとは異なり、 CE による分析結果はエレクトロフェログラムとして出力されます。

目次

CZE では、溶質ごとの特異的な泳動に加えて電気浸透流が発生します。溶質のモビリティは、カチオン性成分 (1) が最も高くなり、次いで中性成分 (n) 、 2 種類のアニオン性成分 (2 、 3) の順になります。

注入検出

時間

信号強

度



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機器CE システムのコンポーネント

目次

UV ダイオードアレイ検出器

カートリッジ用カセット

サンプルトレイ

バッファ交換システム

圧力 /真空ポンプ

キャピラリーカートリッジ

オペレーティングシステム



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機器サンプル導入

目次

CE では、サンプルのオーバーロードを防ぐために、微量のサンプル (通常は 1 ～ 50 nL) をキャピラリーに導入します。

一般的な注入方法 :

• 流体力学- キャピラリーの注入側で圧力をかけ、出口側で吸引 - 出口側リザーバより注入側リザーバを高くすることで得られるサイホン

作用を利用• 動電学 ( 電気泳動 )

- 注入側バッファリザーバをサンプルバイアルに置き換えて電圧を印加



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機器オートサンプラ

目次

サンプルおよびバッファバイアル用サーモスタットオートサンプラ

カルーセルを回転させて分析対象のサンプルバイアルを注入位置に移動

バイアルセンサーにより、バイアルがセットされたトレイ位置を読み出し



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機器キャピラリーとカセット

目次

キャピラリーは、検出器のすぐ前に挿入されるカセット内に取り付けられます。

検出ウィンドウが自動的に位置合わせされるアライメントインタフェース

検出器

キャピラリー先端はバイアルへ

巻き付けられたキャピラリー



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機器キャピラリー

アプリケーションに応じて幅広いキャピラリーから選択できます。

目次

特徴

CEP コーティング CEP キャピラリーは、ある種のポリマーをキャピラリー内壁表面に半永久的に結合させたキャピラリーです。• サンプルの吸着を防止• EOF をほぼ排除• DNA の分離、アニオンおよび有機酸の分析に最適

PVA コーティングPVA コーティングキャピラリーはキャピラリーの内壁表面をポリビニルアルコールでコーティングしたキャピラリーです。 • 疎水性および静電性の溶質 / 内壁の相互作用を低減• EOF を排除• タンパク質およびアミン類の分析に最適

µSIL-DB µSIL-WAXµSIL-FC

µSIL キャピラリーは、アジレント独自の架橋コーティングプロセスにより活性シラノール基をマスクし、高い安定性を実現したキャピラリーです。• EOF を低減、 cIEF モード用• PCR 断片、タンパク質、ペプチド、炭水化物などの生体分子の分離に最適未修飾フューズド

シリカ内壁がコーティングされていない標準的な CE キャピラリー



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機器検出器

目次

重水素ランプ

内蔵の UV-Vis ダイオードアレイ検出器 (190 ～ 600 nm)

検出器は温度制御されます



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機器UV-VIS 検出器

紫外可視吸光度は、幅広いアプリケーションに対応でき、オンキャピラリーでの検出が可能なことから、最も広く使用されている検出方法です。

吸光度と濃度の関係はランベルトベールの法則で表されます。

目次

光路

キャピラリー

フェラルアライメント

cbA

吸光係数またはモル吸光係数 (Lmol-1cm-1)

b 光路長 (cm)

c 濃度

短い光路長 (b) は、 CE の感度を制限する主な要因となります。光路長が延長する構造のフローセル ( バブルセルおよび Z 型セル、画像を参照 ) を利用できます。



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機器分光検出器 : 紫外可視吸収検出• 紫外線光線をフローセルに当て、セン

サーがセルを通過した光を測定します。

• キャピラリーから溶出した化合物によってこの光エネルギーが吸収されると、センサーに当たる光エネルギーの量が変化します。

• 結果として生じる電気信号の変化は増幅され、記録装置またはデータシステムに転送されます。

• 吸収スペクトルを同時に取ることも可能で、化合物の同定に役立つ場合があります。

ダイオードアレイ検出器 (DAD) の概略図

目次詳細はノート部分をご覧ください

• その他の検出器 :- 質量選択検出器 (MSD) - レーザー誘起蛍光検出器 (LIF)- 非接触型電気伝導検出器 (CCD)

タングステンランプ重水素ランプアクロマティックレンズ

1024 素子ダイオードアレイ

ホルミウムオキサイドフィルタ

プログラム可能なスリットグレーティング

標準フローセル



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機器バッファ交換システム

目次

バッファ交換システム ( バッファリザーバ ) は、サンプルカルーセルの下にあります。

バッファの交換は、高い泳動時間再現性を保つために不可欠です。溶液の電解によりバッファの pH が変化し、結果的に EOF にも影響がおよぶ可能性があるからです。

バッファ交換システムにより、泳動時間の再現性が高まります。5 回、 10 回、および 15 回の分析で得られたクロマトグラフの重ね表示。 A) 5 回分析するごとにバッファを交換、 B) バッファ交換なし。

分析回数

時間 [ 分 ] 時間 [ 分 ]



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例遊離エストロゲンと複合エストロゲンの包括的プロファイリング

pH 9.5 での 10 μM 添加エストロゲン複合体と 20 μM 遊離エストロゲンの分離能を示す抽出イオンクロマトグラム。 E23G と E217G (m/z 447.2024) 、 E33G と E316G (m/z 463.1974) など、グルクロニド複合体が主な構造異性体を含む硫酸複合体から完全に分離されています。

出典 : Comprehensive Profiling of Free and Conjugated Estrogens by Capillary Electrophoresis-Time of Flight-Mass Spectrometry (キャピラリー電気泳動-飛行時間型質量分析による遊離エストロゲンと複合エストロゲンの包括的プロファイリング)

エストラジオール 17- グルクロニドの TOF/MS スペクトルと実験式にもとづく予測同位体比 (赤いボックス ) 。

目次

カウント vs. 質量電荷比 [m/z]

誤差 = 0.9 ppm分離能

時間 ( 分 )

レス

ポン

ス (

x103 )

遊離

グルクロニド

硫酸塩

http://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-9669EN.pdf







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例モノクローナル抗体の電荷不均一性分析

イソ型群見掛け pI ピーク面積 (%)

平均 SD RSD% 平均 SD RSD%

A 6.546 0.007 0.105 4.29 0.47 10.93

B 6.457 0.004 0.056 23.22 0.58 2.50

C 6.365 0.003 0.042 32.94 0.69 2.08

D 6.290 0.002 0.036 25.66 1.48 5.77

E 6.232 0.002 0.029 13.89 1.76 12.67

モノクローナル抗体イソ型の定量結果。図のエレクトロフェログラムの一部を拡大し、 mIgG1 のピークを 5 つのイソ型群 A ～ E に割り当てています。

出典 : Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity Analysis by Capillary Isoelectric Focusing on the Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System (Agilent 7100 キャピラリー電気泳動システムでのキャピラリー等電点によるモノクローナル抗体の電荷不均一性分析)

Agilent 7100 CE システムによる高分解能 cIEF の中間再現精度。 4 台の CE 機器で 4 日間に渡り機器あたり 6 回分析して得られたデータにもとづいています (n=24) 。

目次

lgG イソ型

時間 ( 分 )







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生体アミン y = a ± bx R2 LOD (ng/mL)

LOQ (ng/mL)

SPM y = 0.0056 ± 0.1177x 0.999 1.9 6.3

SPD y = 0.0144 ± 0.1927x 0.999 2.6 8.6

PUT y = 0.0112 ± 0.0826x 0.999 2.5 8.3

HIS y = 0.0330 ± 0.2254x 0.999 1.1 3.6

CAD y = 0.164 ± 0.1503x 0.999 1.6 5.3

例サケおよびエビ中の生体アミンの分析

バックグラウンド泳動液中に生体アミンをそれぞれ 10 μg/mL 含む混合液の CE-MS/MS エレクトロフェログラム。スペルミン (SPM) 、スペルミジン (SPD) 、プトレシン (PUT) 、ヒスタミン (HIS) 、カダベリン (CAD) 、アグマチン (AGM) 、5 μg/mL の 1,7- ジアミノヘプタン (DIA) ( 内部標準 ) 、フェニルエチルアミン (PHE) 、チラミン (TYR) 、トリプタミン (TRY) 、ウロカニン酸 (URO) 、セロトニン (SER) 。

出典 : Analyze Biogenic Amines in Salmon and Shrimp by Capillary Electrophoresis-Tandem MS (キャピラリー電気泳動-タンデム MS によるサケおよびエビ中の生体アミンの分析)

提案された生体アミン測定メソッドの重要パラメータ。全成分を含む表については、アプリケーションノートをご覧ください

目次

取り込み時間 ( 分 )

10,000 カウント






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詳細情報アジレント製品の詳細については、 www.agilent.com/chem/jp をご覧ください。

本プレゼンテーションに関するご質問やご提案は、[email protected] までお問い合わせください。

文献タイトル ( 日本で表示していないものはすべて英文です ) 資料番号カタログ Agilent CE、CE/MS ソリューション 5991-1511JAJP

ユーザーマニュアル Agilent 7100 Capillary Electrophoresis G7100-9000

アプリケーションノート Comprehensive Profiling of Free and Conjugated Estrogens by Capillary

Electrophoresis-Time of Flight-Mass Spectrometry 5990-9669EN

アプリケーションノート Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity Analysis by Capillary Isoelectric Focusing

on the Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System5991-1141EN

アプリケーションノート Analyze Biogenic Amines in Salmon and Shrimp by Capillary Electrophoresis-Tandem

MS5991-6255EN

Web キャピラリー電気泳動と CE/MS

Web CHROMacademy – 学生および大学関係者はオンラインコースに無償でアクセス可

目次

http://www.agilent.com/chem/jp

http://www.chem-agilent.com/pdf/low_5991-1511JAJP.pdf





http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7100-90000_CE_System_User_ebook.pdf

http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7100-90000_CE_System_User_ebook.pdf












http://www.chem-agilent.com/contents.php?id=387

http://www.chem-agilent.com/contents.php?id=387

http://www.chromacademy.com/Agilent-uni.html


目次

THANK YOU



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省略記号・略語

省略記号・略語定義

b 光路長c 濃度CE キャピラリー電気泳動 CEC キャピラリー電気クロマトグラフィーCEP 架橋ポリエチレンポリマー CGE キャピラリーゲル電気泳動CIEF キャピラリー等電点電気泳動CZE キャピラリーゾーン電気泳動CITP キャピラリー等速電気泳動 EOF 電気浸透流吸光係数または

モル吸光係数 (Lmol-1cm-1)

省略記号・略語定義

MEKC ミセル動電クロマトグラフィー MS 質量分析計nL ナノリットル PVA ポリビニルアルコールTOF 飛行時間型 ( 質量分析計 )

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