Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.Práctica:

Metabolismo microbiano

El metabolismo se puede entender como el conjunto de reacciones o actividades químicas que se suceden en una célula microbiana, que permiten obtener la energía necesaria para las diferentes actividades vitales como la nutrición, síntesis, crecimiento, reproducción etc. Estos procesos están controlados por enzimas codificadas por el material genético.

Los sustratos sobre los cuales las enzimas pueden actuar, se incorporan al medio de cultivo, algunos junto con un sistema indicador que puede detectar ya sea el consumo del substrato o la formación de productos metabólicos específicos. Seleccionando una serie de medios que miden diferentes características metabólicas del microorganismo en estudio, es posible determinar una “huella digital” bioquímica que permite lograr la identificación.

Objetivo: Conocer e identificar los productos formados por los microorganismos durante el metabolismo. Demostrar acciones enzimáticas de los microorganismos sobre carbohidratos, proteínas, grasas, ácidos nucleicos y fuentes inorgánicas.

I. METABOLISMO DE CARBOHIDRATOSLos carbohidratos son la fuente principal de energía y estructuras de carbono para la

síntesis de sustancias celulares. la degradación microbiana de los glúcidos se realiza por diferentes vías metabólicas y para su estudio se puede emplear diferentes medios de cultivos.* La utilización de la glucosa, constituye para los microorganismos la principal fuente de carbono y su degradación se produce por tres vías principales que son: la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), la de Entner-Douderoff (DE) y la de Warburg-Dickins (hexosa monofosfato o HMP). Muchos microorganismos utilizan la glucosa mediante lo que se llama “fermentación ácido mixta” en la cual se produce una variedad de ácidos orgánicos a partir del ácido pirúvico incrementando la acumulación de +H detectable con el indicador Rojo de Metilo. En cambio otros metabolizan el ácido pirúvico principalmente por la vía del butilenglicol, produciendo acetilmetilcarbinol y que se detecta mediante la prueba de Voges Proskauer.* La utilización de disacáridos, tales como la sacarosa y la lactosa deben degradarse en monosacáridos antes de que los microorganismos puedan utilizarlos. Varios microorganismos producen enzimas que facilitan esta desintegración por hidrólisis, detectándose la producción de acidez y gas proveniente de la degradación de la glucosa mediante el uso de un indicador y de pequeños tubos de Durham invertidos.* La utilización de los polisacáridos, como por ejemplo el almidón, glucógeno y la celulosa. Muchas de estas sustancias son tan grandes que no pueden ser incorporadas para su metabolismo por los microorganismos. Solo aquellos microorganismos que producen y excretan enzimas capaces de facilitar la hidrólisis externa parcial de esos polisacáridos, pueden utilizarlos. Un ejemplo de la utilización de los polisacáridos es la prueba de la hidrólisis del almidón.

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S. Ciertos microorganismos producen una amilasa (exoenzima) capaz de hidrolizar el almidón, causando su degradación en maltosa y glucosa, perdiendo la capacidad de dar una reacción de color con la solución de lugol lo que permite su identificación.

Utilización de la glucosaMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Escherichia coli y Enterobacter spp. de 18 a 24 hr.

Material y medio de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Tubos con medio Clark-Lubs (MR-VP) Tubos vacíos estériles. Goteros o pipetasReactivo: Rojo de Metilo al 1% Solución de -naftol al 5% KOH al 40%

Métodos:Determinación de la producción de ácido y Acetil metil carbinolSe utilizan la Prueba de Rojo de metilo (RM) y la prueba de Voges Proskauer (VP)

a) Producción de ácido (Prueba de Rojo de metilo) Se utiliza para medir el grado diferencial de acidez cualitativa entre diferentes microorganismos.Procedimiento:Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesariosInocule (siembre) los microorganismos en los tubos con medio Clark-Lubs (VP-MR)

por la técnica de siembra de inoculación o agitación.Incube a 37ºC por 24 a 48 horasDespués de la incubación, divida el cultivo en dos partes; luego a una de ellasAñadir 5 gotas del reactivo Rojo de metilo y observe la reacción.Interpretación:RM(+): si se observa un color rojo estable en el medio, indicará que la acidez se

encuentra en un pH 4,5 o menosRM(-): si el medio es amarillo o naranja.

b) Producción de Acetil metil carbinol (Prueba de Voges Proskauer) Determina la capacidad de algunos microorganismos de producir un producto final neutro el acetil metil carbinol (acetoína) a partir de la fermentación de la glucosa.Procedimiento:A la segunda parte del cultivo dividido, agregar 0,6 mL ó 12 gotas de -naftol al 5%

y 0,2 mL ó 4 gotas de KOH al 40%Agite y deje en reposo por unos 10’, luego observe la reacción.Interpretación:VP(+): si el medio toma un color rojizo a los 10 ó 15 minutosVP(-): si el color del medio es amarillo lechoso o cobrizo.

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.Utilización de disacáridos: Producción de ácido y GasMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Escherichia coli y Pseudomonas spp. de 18 a 24 hr.

Material y medio de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Tubos con caldo lactosado (o glucosado) con indicador rojo de fenol y campana de

Durham.Procedimiento: Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Inocular cada microorganismo en tubos con caldo lactosado Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas Después de la incubación, observe la reacción en el medio y en el interior de la

campana de Durham.

Interpretación: Acidez (+): se manifiesta por un cambio de color del indicador en el medio de cultivo

de rojo a amarillo Acidez (-): si no se presenta cambio de color en el indicador Gas (+): se manifiesta por la presencia de una burbuja en la campana de Durham

debido a la acumulación de gas en esta Gas (-): no hay presencia de burbuja.

Utilización de polisacáridos: Producción de amilasaMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Bacillus subtilis y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medio de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Placas con Agar Almidón al 1%.

Reactivo: Lugol.

Procedimiento: Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Sembrar por estrías los microorganismos en 2 sectores de la placa con agar almidón Incubar a 37ºC por 24 a 48 horas Después de la incubación, agregar en la superficie de la placa lugol y observar la

reacción.

Interpretación: Amilasa (+): si alrededor del microorganismo se observa zonas o halos claros

(transparente), lo que indica que el almidón ha sido hidrolizado por la presencia de la enzima

Amilasa (-): si no se observa zonas o halos claros alrededor del microorganismo, que indicaría la ausencia de producción de enzima amilasa.

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.II. METABOLISMO DE LAS PROTEÍNAS Los microorganismos son incapaces de ingerir proteínas, pero muchas de las especies producen proteinasas y peptidasas que hidrolizan las proteínas en forma sucesiva hasta péptidos pequeños y aminoácidos que si pueden asimilar las células. Los aminoácidos se pueden utilizar para la síntesis de proteínas o pueden ser metabolizados por diferentes vías que originan productos intermediarios como piruvato, ceto glutarato y oxalacetato que se interrelacionan con las vías del metabolismo de los carbohidratos.* La hidrólisis de la Gelatina, es realizada por ciertos microorganismos; por la capacidad de producir exoenzimas como la gelatinasa que son enzimas proteolíticas capaces de desdoblar la gelatina y otras proteínas a péptidos y aminoácidos. Los microorganismos que secretan gelatinasa en medios de cultivos o substratos que contienen gelatina se pueden detectar observando la licuación de esta.* La producción de Hemolisinas, donde muchas bacterias producen exoenzimas que sirven como mecanismo de agresión en la lucha continua de los procesos infecciosos, es el caso de la producción de exoenzimas con efecto destructivo sobre la hemoglobina de los glóbulos rojos. Tales enzimas se llaman hemolisinas que de acuerdo al grado de hemólisis pueden ser , , .* La producción de Indol, que es un producto de degradación metabólica del aminoácido triptófano. Los microorganismos que sintetizan la enzima triptofanasa son capaces de desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La prueba de indol esta basada en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehido al emplearse el reactivo de Kovac’s o de Ehrlich.* La hidrólisis de la urea, donde los microorganismos pueden hidrolizar urea que es un producto de desecho orgánico importante en el metabolismo animal, en amoníaco y bióxido de carbono (CO2). En los medios de cultivo el amoníaco liberado reacciona para formar carbonato de amonio, produciéndose la alcalinización por el aumento de –OH en el pH del medio.* La producción de sulfuro de hidrógeno, donde ciertos microorganismos que tienen una enzima que liberan el átomo de azufre de los aminoácidos sulfurados presentes en la mayoría de proteínas, el cual es reducido a sulfuro de hidrógeno con hidrógeno de los substratos. En los sistemas de detección de ácido sulfhídrico en la reacción final se forma un precipitado negro insoluble de sulfuro de metal pesado formado en el medio (TSI) o en la tira de papel de filtro colocado en el sistema (Agar peptona con tira de papel embebido con acetato de plomo).

Metabolismo de los aminoácidos Los microorganismos requieren diferentes aminoácidos para su nutrición, crecimiento y actividad vital. Algunos microorganismos tienen la capacidad de catabolizar y transformar los aminoácidos mediante procesos de desaminación, descarboxilación y transaminación.* La desaminación de la fenilalanina, aminoácido que por desaminación forma al ácido fenilpirúvico, el cual se detecta por la formación de un color verde intenso en el medio de cultivo por la adición de una solución de cloruro férrico al 10%.* La descarboxilación de la lisina, realizada por muchas especies que poseen enzimas capaces de descarboxilar aminoácidos específicos del medio con liberación de aminas de reacción alcalina y dióxido de carbono como productos. En el medio agar LIA esta

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.reacción se pone de manifiesto mediante el viraje del indicador púrpura de bromocresol a un color púrpura intenso por la alcalinidad producida.Producción de las HemolisinasMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes de 18-24 hr.

Material y medio de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Placas con Agar Sangre

Procedimiento: Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Sembrar por estrías los microorganismos en 2 sectores de la placa con agar sangre Incubar a 37ºC por 24 a 48 horas Después de la incubación, observe que a ocurrido en el medio de cultivo.

Interpretación: hemólisis: si alrededor del microorganismo se observa zonas o halos traslúcidos,

por una degradación completa de la hemoglobina. hemólisis: si se observan halos verdosos, por una degradación parcial hemólisis: si hay ausencia de halos.

Producción de indolMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Escherichia coli y Citrobacter spp. de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Tubos con Caldo peptonado o triptonado Gotero o pipeta.

Reactivo: Reactivo de Kovac’s o Ehrlich.

Procedimiento: Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Inocular (sembrar) los microorganismos por inoculación o agitación en los tubos con

caldo peptonado o triptonado Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas Después de la incubación, agregar 5 gotas del reactivo de Kovac’s, si se emplea en

reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por la adición de 1 mL de cloroformo; observar la reacción.

Interpretación: Indol (+): si se forma un anillo de color rojo-fucsia o rojo-cereza en la interfase entre

el reactivo y el medio de cultivo.

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S. Indol (-): si no se forma el anillo en la interfase.Producción de UreasaMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Proteus sp. y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Tubos con Agar urea

Procedimiento: Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estrías los microorganismos en los tubos con Agar urea Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas Después de la incubación, observar la reacción o cambios ocurridos.

Interpretación: Ureasa (+): si el color del medio cambia de amarillo a rosado o rojo grosella por el

indicador rojo de fenol, debido a la alcalinización del medio por la hidrólisis de la urea

Ureasa (-): cuando no hay cambio de color.

Producción de hidrógeno sulfuradoMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Proteus sp, Citrobacter sp o Salmonella y Escherichia coli de

18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Tubos con agar TSI o tubos con agar peptona Papel impregnado con acetato de plomo

Procedimiento: Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estrías y puntura los microorganismos en los tubos con Agar TSI o por

estrías en los tubos con agar peptona y simultáneamente colocar en la boca del tubo un papel de filtro impregnado con una solución saturada de acetato de plomo

Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas Después de la incubación, observar la reacción o cambios ocurridos.

Interpretación: H2S (+): cuando se ennegrece el fondo del tubo con agar TSI por la formación de

sulfato ferroso o sulfuro de plomo al ennegrecer el papel en el tubo con agar peptona H2S (-): en ausencia de color negrusco.

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.Producción de descarboxilasasMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Enterobacter aerogenes y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Tubos con agar LIA

Procedimiento: Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estrías y puntura (3 veces) los microorganismos en los tubos con Agar

LIA Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas Después de la incubación, observar la reacción o cambios ocurridos.

Interpretación: Lisina descarboxilasa (+): si aparece de un color púrpura intenso, lo que indica la

alcalinización de todo el medio Lisina descarboxilasa (-): no hay cambio de color.

III. METABOLISMO DE LÍPIDOS A pesar que los lípidos no representan componentes importantes dentro del substrato nutritivo, ellos tienen cierto significado en la actividad vital de los microorganismos, en particular, aportándoles una elevada resistencia contra los factores nocivos del medio ambiente. Los microorganismos con ayuda de las lipasas y otras enzimas lipolíticas firmemente asociadas al citoplasma celular pueden degradar grasas y aceites, y obtener así acetato para el metabolismo de carbohidratos y la síntesis de aminoácidos.

Producción de lipasasMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Bacillus subtilis y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes, Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Placas con agar tributirina o agar mantequilla con indicador rojo neutro.

Procedimiento: Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estrías los microorganismos en 2 sectores en la placa con agar

mantequilla o tributirina con indicador rojo neutro Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas Después de la incubación, observar la reacción o cambios ocurridos.

Interpretación: Lipasa (+): si se evidencia halos trasparente alrededor de la colonia (agar tributirina)

o colonias rojas (agar mantequilla) debido al indicador rojo neutro, por la formación de acidez

Lipasa (-): no hay cambios.

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.IV. METABOLISMO DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Los ácidos nucleicos constituyen una alta proporción del protoplasma bacteriano; así, gran parte de la actividad celular está encaminada a su biosíntesis y catabolismo, más que en la mayoría de otras células. Algunas especies tienen la capacidad de formar diferentes enzimas intra y extracelulares que despolimerizan los ácidos nucleicos, son enzimas hidrolíticas del tipo de la diesterasas que parten los ácidos nucleicos: como las DNAsas y RNAsas, a nivel de las uniones de los nucleótidos y así mismo pueden retornar a las reservas metabólicas de las que provinieron por acciones sucesivas de nucleasas, nucleotidasas y nucleosidasas. Las DNAsas en presencia de iones de magnesio producen la despolimerización del DNA.

Producción de DNAsaMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Staphylococcus aureus y Escherichia coli de 18 a 24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Placas con agar ADN Gotero o pipeta.

Reactivo: Ácido clorhídrico 1 N.

Procedimiento: Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estrías los microorganismos en 2 sectores en la placa con agar ADN Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas Después de la incubación, agregar en la superficie de la placa ácido clorhídrico 1 N y

observar la reacción.

Interpretación: DNAsa (+): si se observar halos blancos alrededor de la colonia si es que se ha

producido DNAsa debido a que los nucleótidos son solubles en ácido mientras que el DNA es insoluble

DNAsa (-): no se observan halos.

V. METABOLISMO DE FUENTES INORGÁNICAS* Utilización del citrato, donde algunos microorganismos pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación de carbohidratos, utilizando citrato como única fuente de carbono detectable por el desarrollo del microorganismo en el medio de cultivo. Las bacterias que utilizan citrato también pueden extraer nitrógeno del fosfato de amonio, con producción de amoníaco alcalinizando el medio de cultivo que es detectado por el cambio de color del indicador utilizado.* Reducción de nitratos, algunos microorganismos pueden reducir los nitratos en nitritos en condiciones anaerobias donde la molécula de nitrato actúa como aceptor de hidrógeno desempeñando la función del oxígeno. La presencia de nitritos en el medio se detecta

Manual de Prácticas de Microbiología Blgo. Luis Cartagena S.añadiendo -naftilamina y ácido sulfanílico con la formación de un color rojo de diazonio, p-sulfobenceno-azo--naftilamina.

Utilización del citratoMuestra Biológica: Cultivo bacteriano de Enterobacter spp, Citrobacter spp y Escherichia coli de 18 a

24 hr.

Material y medios de cultivo: Guantes Mechero con ron de quemar y fósforo Asa bacteriológica o de Kolle Tubos con medio agar Citrato Simmons.

Procedimiento: Protéjase, encienda el mechero, acerque los materiales necesarios Siembre por estrías los microorganismos en los tubos con agar Citrato Simmons Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas Después de la incubación, observar la reacción o cambios ocurridos.

Interpretación: Citrato (+): al observar cambio de color por el indicador azul de bromotimol que

vira (cambia) del verde al azul por la alcalinidad presente en el medio; la prueba también es positiva en ausencia de color azul si existe un desarrollo visible de colonias a lo largo de la estría de inoculación

Citrato (-): cuando no hay cambio de color ni crecimiento observable.

Resultados:* Haga la representación esquemática de lo procesado y los resultados en cada caso.

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Cuestionario: ¿Qué tipos de ácidos se forman en la degradación de los carbohidratos por los

microorganismos bacterianos? ¿qué productos de obtienen de la degradación del almidón, y cómo reaccionan con el

lugol? ¿Cómo se forma el anillo en la prueba de producción de indol? ¿Cuál es otras reacciones se producen en el medio TSI, y cómo se interpreta? ¿Qué obtiene la bacteria al degradar los lípidos? ¿Qué productos se obtienen de la degradación de los lípidos? ¿Por qué no se prefiere utilizar sangre humana para la identificación de hemolisinas? ¿Qué reacción ocurre en el proceso de utilización de citrato? ¿Cuál es la manifestación de color de los indicadores de color: rojo neutro, rojo de

fenol, azul de bromotimol?