BIOQUIMICA PRACTICA DE LABORATORIO ESTUDIO CINETICO DE LA ENZIMA ALFA-AMILASA INTRODUCCION: La cintica enzimtica tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, as como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren. la velocidad de las reacciones enzimticas se puede medir: * Por la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo * Por la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo En esta practica de laboratorio se comprobara la influencia de la concentracin del sustrato (S), del enzima (E), el pH y la temperatura (T) en la cintica del enzima alfa-Amilasa salival en su accin sobre los enlaces alfa 1-4 del almidn. Para ello nos basaremos en la desaparicin del almidn en la unidad de tiempo mediante el seguimiento de la reaccion de color que produce el mismo, as como sus productos de hidrlisis con el Yodo en disolucin de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol). Dado que el almidn esta integrado por dos fracciones, la amilasa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (as como sus respectivos productos de hidrlisis) con el reactivo de Lugol. AMILOSA AMILOPECTINA Amilasa Salival AMILODEXTRINAS (+ IODO color azul violeta) ERITRODEXTRINAS (+IODO color rojo pardo) MALTOSA + GLUCOSA DEXTRINAS LIMITES (+IODO no dan coloracin) Basndose en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la cintica enzimtica la variacin de los factores que en ella influyen: c(S), c(E), pH y T, fundamentalmente. La influencia de la

c(E), manteniendo constante los dems factores. De forma similar se procede con el estudio de la influencia de la c(S). En el caso del estudio de la influencia del pH y la temperatura se ensayara la actividad del enzima a diferentes valores de ambos con la reaccion del Lugol.

REACTIVOS: Solucion de la enzima: Se prepara colectando 1ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada). diluyndolo hasta 20 ml con agua destilada. Disolucin de Lugol: Se prepara disolviendo 1 gr de yodo. y 2 gr de Kl en 200 ml de agua destilada.

Disolucin Tampn de pH 5.0, 6.8, y 8.0 . . MATERIALES: Tubos de ensayo. placa de porcelana con excavaduras vasos de precipitado cuba cronometro.

EXPERIMENTO1 ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE c(E). PROCEDIMIENTO: 1. Tome 4 tubos de ensayo y aada a cada uno 2ml de disolucin de almidn al 0.5 %. 2. Aada a cada tubo 0.1; 0.2; 0.3 y 0.4 ml de disolucin del enzima respectivamente, y complete hasta un volumen de 0.5

ml con agua . Aada primero el agua y luego la disolucin del enzima, pues de lo contrario la reaccin comenzara a verificarse y usted no tendr en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente despus de adicionar la solucin del enzima al ultimo tubo ponga en marcha el cronometro y comience a medir el tiempo del experimento. 3. En cada intervalo de 1 minuto ensaye en la placa con excavadura la reaccion de la solucion experimental con el Lugol: para ello solo tiene que extraer con el gotero pequeas cantidades de cada tubo de ensayo en reaccion a una excavadura de la placa y luego adicionar una gota del reactivo de Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayado.

tubo 1 3

tubo

tubo 2

tubo 4

4. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reaccion alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del Lugol. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solucion de control.

5. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:

TUBOS: Volumen de enzima (ml) Tiempo total de reaccion (min) Velocidad de la reaccion (m1/t)

1 0.1

2 0.2

3 0.3

4 0.4

3

5

6

7

0.0333

.04

.05

0.0571

6. Con esos datos construye un grafico de c(E) en el eje ordenado contra velocidad de reaccion (ml/t) en el eje de abscisas.

amilasa0.45

0.4

0.35

0.3

0.25

concentracion 0.2

0.15

0.1

0.05

0 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

EXPERIMENTO 2: ESTUDIOS DE LA INFLUENCIA DEL pH PROCEDIMIENTO: 1. En 3 tubos de ensayo vierta respectivamente 2ml de las soluciones tampones de pH 5.0; 6.8 y 8.0. 2. Aada a cada tubo 2ml de la solucion de almidn al 0.5% y 2ml de la solucion del enzima. Incube a 40C y ensaye la reaccion con el Lugol segn se indica en el trabajo experimental 1. 3. Con los datos obtenidos extraiga las conclusiones sobre el rango del pH en el cual el enzima muestra su actividad ptica.

EXPERIMENTO 3: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA c(S). PROCEDIMIENTO: 1. Tome 4 tubos de ensayo y aada a cada uno 0.5; 1.0; 1.5 y 2.0ml de solucion de almidn. Complete el volumen de cada tubo hasta 2.0ml con agua destilada. 2. Adicione a cada tubo 0.5ml de disolucin de la enzima alfaamilasa e incbelos a 40C. 3. A intervalos de 1 minuto ensaye la presencia de almidn mediante la reaccion con Lugol de forma similar a como se describe en el trabajo experimental 1.

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

Tubos: Volumen de sustrato (ml) Tiempo total de reaccion (min) Velocidad de reaccion (volumen/tiempo)

1 o.5 5 0.1

2 1 11 0.091

3 1.5 34 .044

4 2 46 .043

4.Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:

4. Con los datos de la tabla construya un grafico de velocidad de reaccion (volumen/tiempo) en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas (que representa concentracin de sustrato creciente en nuestro experimento).

sustrato2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12

EXPERIMENTO 4: ESTUDIO DE LA INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA PROCEDIMIENTO: 1. En 5 tubos de ensayo aada 5ml de disolucin de almidn al 0.5% y 1ml de solucion de enzima.

2. Hierva durante 5 minutos y reponga el volumen del agua perdida por evaporacin en uno de los cubos. Incbelo a 40C y ensaye de la forma estudiada la presencia del almidn en l a diferentes intervalos de tiempo.

3. Incube un segundo tubo a 40C y un tercero a 50C, y ensaye en ellos la reaccion con Lugol a intervalos de 1 minuto. Anote el tiempo que se demora en desaparecer la coloracion azul.

tubo 3 incubado a 50 C

4. Un cuarto tubo incbelo en un bao de hielo y ensaye tambin la reaccion con Lugol.

5. El ultimo tubo djelo a temperatura ambiente del laboratorio y ensaye con el Lugol hasta la desaparicin de la reaccion positiva en intervalos de 1 minuto.

6. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla, y extraiga sus conclusiones:

Color observado a diferentes tiempos (min) Color a 5 minAzul Azul Azul AzulAzul

Tubos 1 2 3 4 5

Color a 10 minAzul Azul Azul Azul fuerte fuerte tenue fuerte

Color a 15 minAzul Azul Azul Azul tenue fuerte dbil dbil

Color a 20 minAzul dbil Azul tenue amarillo Azul dbilAmarillo dbil

fuerte fuerte fuerte fuerte

Azul dbil

Amarillo fuerte

REPORTE DE LABORATORIO:Experimento 1: Estudio de la influencia de la concentracin de la enzima:1. Describa que caractersticas estructurales del almidn permiten su identificacin mediante las disoluciones de Iodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidn. Se produce un compuesto de adsorcin de yodo-almidn de color azul intenso que en solucin queda en suspensin coloidal, es decir cuando la amilasa rompe los enlaces del almidn se une al yodo y produce una coloracin azul.

2. Anexe la tabla y el grafico de la velocidad de reaccin contra c (E), tomando como concentracin de la enzima el volumen de la solucin utilizada en cada tubo. Por qu se puede tomar como velocidad de reaccin el inverso del tiempo? Porque la concentracin de la enzima es directamente proporcional al inverso del tiempo.

3. Plantee las conclusiones a que puede arribar de los resultados del experimento. Que entre mas enzima se le adicione mas rpido ocurre la reaccin.

4. Resuma las dificultades encontradas en el ensayo. Pues en si el ensayo no tiene dificultad alguna mas el tiempo en que las reaccionan pero eso se debe ala concentracin de la amilasa.

Experimento 2: Estudio de la influencia del pH:1. Describa lo observado al realizar el estudio de la influencia del pH en la velocidad de reaccion del enzima alfa-amilasa.

A que conclusin llega acerca del pH optimo de este enzima? Se observo que a pH 4 y 10 la reaccion se hizo lenta en uno y en otro no se pudo llevar acabo y en pH 7 si dio la reaccion. En conclusin el pH ptimo para esta prueba fue la pH 7. 2. Qu efecto tendra la utilizacin del medio con pH muy acido o muy bsico en la reaccion de este ensayo? Podemos decir que a pH extremos, es decir, muy cidos o muy bsicos, la enzima no funciona, o al menos disminuye notablemente su actividad.

Experimento 3: Estudio de la influencia de la concentracin del sustrato:1. Anexe la tabla y el grafico elaborado segn las indicaciones del trabajo prctico, tomando como valor de c(S) el del volumen del mismo medio en cada tubo. Por qu en este caso para calcular la velocidad de la reaccion es necesario dividir el volumen del sustrato entre el tiempo?

2. Analice el grafico y plantee las conclusiones a que pueden llegar en este caso. que la concentracin del sustrato influye mucho en la reaccin ya que cuando hay mucho sustrato la reaccin se hace lenta.

3. Describa las dificultades presentadas en este ensayo. Al igual que el experiment uno no tiene dificultad lo nico es lo tardado de la reaccion pero se debe ala concentracin del sustrato.

SUGERENCIA AL ESTUDIANTE:Responda las siguientes preguntas (si es necesario consulte y busque en la bibliografa): 1. cules son las caractersticas estructurales del almidn?El almidn est compuesto por dos polmeros distintos, ambos de glucosa, la amilasa y la amilo pectina. El almidn presenta en su conjunto una estructura cristalina. Bajo luz polarizada presenta el esquema tpico de "Cruz de Malta". De esta estructura cristalina es responsable la amilopectina debido a que en ella se forman Puentes de hidrgeno entre las ramificaciones dando lugar a una estructura muy estable que se puede considerar como cristalina. Se puede decir que la amilopectina es la parte insoluble mientras que la amilasa es la parte soluble.

2. qu tipo de enzima es la alfa-amilasa salival? Es una amilasa que hidroliza el almidn parcialmente en la boca, comenzando la digestin de los hidratos de carbono. 3. cules son los productos que origina la accin de esta enzima sobre el almidn? Da como productos finales maltosa, algo de glucosa y dextrinas lmites.

4. Explique como influyen en la velocidad de las reacciones enzimticas, una variacin en la concentracin de la enzima presente en la concentracin del sustrato, el pH y la temperatura. Cuando la concentracin de las enzimas es alta la reaccion se hace ms rpida y al contrario cuando hay poca enzima presente. Influye en el echo q la enzima trabaja bien en un medio de 6 - 7 pH ya q si sube o baja el pH la reaccion no sucede correctamente o no sucede. Con la temperatura si se eleva demasiado la enzima se desnaturaliza y no se lleva acabo la reaccion.

BIBLIOGRAFIA Lehninger .Bioquimica. Pgs. 270-272.y notas de clases.