Yessica Iraís Escobedo FloresKevin Francisco Chacón García

Nancy Paola Grajeda NietoYanira Ivonne Sánchez García

Conteo de mesófilos, termófilos, psicrófilos, hongos

y coliformes totales.P R Á C T I C A N O . 1

RESUMEN

Los alimentos aun estando en óptimas condiciones de higiene contienen una carga microbiana ya sea intrínseca, propia del alimento, o externa proveniente de alguna fuente de contaminación, por eso la mayoría de los alimentos se refrigeran para poder conservarlos por mayor tiempo, las bacterias se pueden subdividir en 3 grandes grupos según su rango de crecimiento optimo, psicrofilas, msofilas y termófilas, dentro de estas las más importantes para la salud humana sol las coliformes, que son patógenos causantes de diversas enfermedades. Además los alimentos también pueden contener otro tipo de microorganismos como los hongos y las levaduras, causantes de la formación de micotoxinas que pueden perjudicar al consumidor. En esta práctica se abunda en el tema del conteo en placa de este tipo de microrganismos tomando como parámetros las normas establecidas en México, se realizaron conteos de diferentes tipos de alimentos líquidos y sólidos, (frutos, jugos, comida), comparando los resultados con los límites establecidos.

OBJETIVOS

• Realizar adecuadamente la técnica de cuenta en placa para diversos grupos microbianos de importancia en alimentos.

• Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus implicaciones en la calidad del alimento.

INTRODUCCIÓN

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de

oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de los organismos patógenos requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes. El agar es un elemento solidificarte muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1. disponibilidad de nutrientes adecuados: Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

2. consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

3. presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones amosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4. condiciones adecuadas de humedad: Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas

condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5. Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

6. pH: La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

7. Temperatura: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.

8. Esterilidad del medio: Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

MATERIALES Y MÉTODOS

PREPARACIÓN DE DILUCIONES (NOM-110-SSA1-1994)

Materiales

Fosfato de sodio monobásico 34,0 g Agua destilada 1 L Hidróxido de sodio 1,0 N Pipetas Tubos de 16 x 150 mm con tapón de rosca. Autoclave Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica Homogeneizador peristáltico (Stomacher) Bolsas estériles para homogeneizador peristáltico Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.

Solución buffer de fosfatos.

Se preparó una solución concentrada reguladora de fosfatos con 34,0 g de fosfato de sodio monobásico en un litro de agua, se ajustó el pH a 7.2. Se esterilizó durante 15 minutos a 121° ± 1,0°C. Se conservó en refrigeración. De ésta solución concentrada se tomó una alícuota de 1.25 ml y se aforó a un litro para utilizarla como solución de trabajo.

Preparación de la dilución primaria.

Para muestras líquidas: Se agitó la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Se tomó un 1 ml de la muestra y se diluyó en uno de los tubos con 9 ml del diluyente. (Solución 1x10-1)

Para muestras sólidas o semisólidas: Se pesaron 10 g de la muestra por analizar en un recipiente estéril. Se adicionó un volumen de 90 ml del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra. Se homogenizó en el equipo Stomacher (homogenizador peristáltico) durante 2 minutos para obtener una suspensión completa y homogénea. (Solución 1x10-1)

Preparación de las diluciones decimales adicionales.

A partir de la solución de trabajo se tomaron 9 ml y se depositaron en tubos de tapón de rosca para hacer las diluciones, según la cantidad de muestras y repeticiones. De la solución 1x10 -1 se tomó 1 ml y se transfirió a otro tubo para obtener una dilución 1x10-2, de esta dilución se tomó 1 ml y se depositó en otro tubo para obtener una dilución 1x10 -3, así sucesivamente hasta llegar a la dilución 1x10-5.La solución de trabajo y los tubos con diluyente sin muestra también se esterilizaron a 121° ± 1,0°C durante 15 minutos. (Figura 1)

Figura 1. Preparación de las diluciones decimales.

MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA PARA MESÓFILOS, TERMÓFILOS Y PSICRÓFILOS (NOM-092-SSA1-1994).

La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en e l medio de cultivo. Se reporte como UFC/ unidad de volumen o peso.

Materiales 10 de muestra de naranja y zanahoria Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar) Incubadora con termostato Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal

cuadrículada y lente amplificador. Baño de agua con o sin circulación mecánica con termómetro calibrado Cajas Petri

Preparación del medio de cultivo

Se preparó Agar Triptona-Extracto de Levadura (agar para cuenta estándar). Se pesaron g del agar, y se disolvieron en ml de agua destilada y se hirvieron hasta disolución total. Se esterilizó a 121°C durante 15 min.

Se depositó 1 ml de cada una de las diluciones preparadas en cada caja Petri, luego se añadieron 15 ml del medio preparado. Se mezcló y se dejó solidificar. Se incluyeron cajas sin inóculo como control o testigo de esterilidad. (Figura 2)

Las cajas se incubaron en posición invertida bajo los siguientes parámetros:

Termofílicos aerobios 55 ± 2ºC 48 ± 2 hMesofílicos aerobios* 35 ± 2ºC 48 ± 2 hPsicrotróficos 20 ± 2ºC 3 - 5 díasPsicrofílicos 5 ± 2ºC 7 - 10 días

Posteriormente se contabilizaron las colonias con un equipo contador de colonias.

MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS (NOM-111-SSA1-1994)

Materiales

10 g de muestra de manzana y cáscara de naranja Agar papa – dextrosa Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada) Acido tartárico 10,0 g Agua destilada 100,0 ml Incubadora con termostato Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal

cuadriculada y lente amplificador. Baño de agua con o sin circulación mecánica con termómetro calibrado Cajas Petri Homogeneizador peristáltico (Stomacher) Bolsas estériles para homogeneizador peristáltico Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.

Preparación del medio de cultivo

Se utilizó Agar papa - dextrosa, se pesaron g y se disolvieron en ml de agua destilada. Se esterilizó a 121°C durante 15 min. Se enfrió a baño maría y se acidificó con ácido tartárico (aproximadamente 1,4 ml de ácido tartárico por 100 ml de medio) hasta pH 3.5. Después se colocaron en las cajas Petri 1 ml de la muestra líquida directa o de la dilución primaria, luego las diluciones decimales.

Figura 2. Vaciado en placa

Se vertieron 15 a 20 ml de agar papa dextrosa acidificado y fundido. Se mezcló y se dejó solidificar. Se incluyeron cajas sin inóculo como control o testigo de esterilidad. Las cajas se incubaron en posición invertida a 25 °C durante 5 días. Luego se realizó el conteo de las colonias de cada placa.

MÉTODO PARA LA CUENTA DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA (NOM-113-SSA1-1994)

Materiales 10 g de muestra de manzana y cáscara de naranja Agar-rojo-violeta-bilis-lactosa (RVBA), Solución reguladora de fosfatos (solución concentrada) Acido tartárico 10,0 g Agua destilada 100,0 ml Incubadora con termostato Contador de colonias de campo obscuro, con luz adecuada, placa de cristal

cuadrículada y lente amplificador. Baño de agua con o sin circulación mecánica con termómetro calibrado Cajas Petri Homogeneizador peristáltico (Stomacher) Bolsas estériles para homogeneizador peristáltico Balanza granataria con sensibilidad de 0,1 g.

Preparación del medio de cultivo

Se utilizó Agar-rojo-violeta-bilis-lactosa (RVBA), se pesaron g y se disolvieron en ml de agua destilada. Se esterilizó a 121°C durante 15 min. Se enfrió a baño maría. Después se colocaron en las cajas Petri 1 ml de la muestra líquida directa o dilución primaria, luego las diluciones decimales.

Se vertieron 15 a 20 ml de agar papa dextrosa acidificado y fundido. Se mezcló y se dejó solidificar. Se incluyeron cajas sin inóculo como control o testigo de esterilidad. Las cajas se incubaron en posición invertida a 35 °C durante 24 horas. Luego se realizó el conteo de las colonias de cada placa.

DISCUSIÓN Y RESULTADOS.

MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA PARA MESÓFILOS, TERMÓFILOS Y PSICRÓFILOS (NOM-092-SSA1-1994).

El cuadro 1 contiene los resultados obtenidos de mesófilos en las muestras de agua de melón y jugo de zanahoria, con un promedio de 6,675 UFC/g y 84,420 UFC/g respectivamente. Los mesófilos aerobios son los microorganismos capaces de desarrollarse a 30°C en condiciones establecidas. Este recuento estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Según la NOM-093-SSA1-1994, de Prácticas de higiene y sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos, en el apéndice informativo B.1.2.9 para aguas preparadas y zumos de frutas, la cuenta total permitida de mesofílicos aerobios es 150 000 UFC/g o ml y 100 000 UFC/g respectivamente, por lo que ambas muestras se encuentran en los límites permisibles en donde la salud del consumidos no se ve afectada. Esto refleja la calidad sanitaria del alimento, las condiciones de manipulación y las condiciones higiénicas de la materia prima. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera que un recuento elevado no significa presencia de flora patógena, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, donde no es recomendable recuentos elevados. Pero si es un parámetro a seguir para asegurar la inocuidad alimentaria.

Cuadro 1: Conteo de mesófilos en muestras de agua de melón y jugo de zanahoria (UFC/g)

Dilución Agua de melón Jugo de zanahoria1:10 3,300 19,5001:100 4,400 98,6001:1000 5,000 94,0001:10000 10,000 110,0001:100000 0 100,000Promedio 5,675 84,420

Después de analizar nuestras muestras que se presentan en el cuadro 2, se encontró que si había presencia de bacterias termófilos, por lo que es necesario un tecnología para la destrucción de estos microorganismo, se recomienda aplicar un estricto control de calidad en el manejo higiénico de este tipo de jugo de zanahoria y melón y ser sometidos a esterilización, iniciando desde la cosecha, almacenamiento y manejo previo.

Cuadro 2: Conteo de termófilos en muestras de agua de melón y jugo de zanahoria (UFC/g).

Dilución Agua de melón Jugo de zanahoria1:10 10,400 8,7001:100 10,000 52,2001:1000 23,000 406,0001:10000 80,000 2,900,0001:100000 600,000 5,000,000

Después de analizar nuestras muestras se encontró que no había presencia de bacterias psicrófilas, lo que denota que el almacenamiento y distribución de productos que requieren

refrigeración o congelación se realizó en instalaciones limpias, desde los equipos que tenían contacto directo con los alimentos hasta el encargado de manipular el producto, evitando el crecimiento de microorganismos psicrófilos. Para ello además de mantener en buenas condiciones higiénicas el área, se debió de haber llevado un control de temperatura y humedad en el almacén que permitiera la conservación adecuada del producto después de 5 días a 5°C.

Cuadro 3: Conteo de psicrófilos en muestras de agua de melón y jugo de zanahoria (UFC/g)

Dilución Agua de melón Jugo de zanahoria1:10 0 01:100 0 01:1000 0 01:10000 0 01:100000 0 0

Cuadro 4: Conteo de hongos en muestras de manzana y naranja, resultados en UFC/g.

Dilución Manzana Naranja1:10 220 20

Figura 3. Agar cuenta estandar para la detección de termófilos de las muestras de agua de melón y jugo de zanahoria, incubadas a 55°C durante 48 horas.

Figura 4. Agar cuenta estandar para la detección de mesófilos de las muestras de agua de melón y jugo de zanahoria, incubadas a 55°C durante 48 horas.

1:100 300 01:1000 0 01:10000 0 01:100000 0 0Promedio 260 0

Debido a que no se encontró una norma específica para la fruta fresca sin procesar, se tomó como referencia la norma NMX-F-045-1982. ALIMENTOS. FRUTAS Y DERIVADOS. JUGO DE MANZANA, donde se establece que el límite máximo de campos positivos por cada 100 campos en hongos es de 10. En el cuadro 4 se observa que la muestra de manzana analizada el número de campos positivos era mayor a 10, con 220 UFC/ml, sin embargo este valor no es muy alto considerando que la norma se especifica para jugo pasteurizado, por lo que se puede decir que representa menor riesgo a la salud y refleja un manejo adecuado de este producto. Sin embargo, un recuento bajo no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera que un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. De los microorganismos más frecuentes en la manzana y que disminuye su vida útil, está el hongo del género penicillium, principalmente la especie penicillium expansum. La presencia del moho azul, representa un riesgo para la salud por la producción de un metabolito secundario conocido como patulina. El hongo pencillium expansum contamina tanto en el exterior como en el interior del fruto, siendo en ocasiones difícil identificar que una manzana está contaminada, por lo que los derivados de la manzana, como son los jugos y papillas, también presentan patulina.

Para el caso de la naranja se comparó con la norma NMX-F-464-1984. ALIMENTOS PARA HUMANOS. BEBIDAS NO ALCOHÓLICAS JUGO DE NARANJA CONCENTRADO PARA MANUFACTURA, ya que tampoco se encontró una norma específica para la fruta fresca. Esta norma marca como límite máximo 75 UFC/ml para hongos, por lo que el resultado del conteo está por debajo de este límite, con 20 UFC/ml en la primera dilución, lo que implica que se tuvo un manejo adecuado de este producto.

Figura: Muestra de manzana para la determinación de hongos y levaduras.

Figura: Muestra de tortilla para la determinación de hongos y levaduras.

MÉTODO PARA LA CUENTA DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA (NOM-113-SSA1-1994)

En el cuadro 5 se puede observar el conteo para las coliformes totales en muestras de barbacoa y guisado de carne, donde se muestra un promedio de 5463.63 UFC/gr y 0 respectivamente. La dilución 1:10,000 de la primera muestra fue descartada, ya que se sale del rango de de 4 cifras de las diluciones previas, se sabe que la dilución 1:10 es la más confiable, por esta razón fue nuestro patrón a seguir. Según la NOM-093-SSA1-1994, de Prácticas de higiene y sanidad en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos, en el apéndice informativo B.1.2.4 Para alimentos cocidos, únicamente se permiten < 10 UFC/g, por lo que en la muestra de barbacoa sobrepasa los límites permisibles de coliformes totales, esto puede deberse a un mal manejo de la materia prima o del producto procesado, ya que la presencia de de coliformes totales es un indicador de prácticas higiénicas inadecuadas y que el consumidor podría estar expuesto a patógenos entéricos cuando ingiere el alimento.

Cuadro 5: Conteo de coliformes totales en muestras de barbacoa y burrito (UFC/g)

Dilución Barbacoa Guisado de carne1:10 4590 01:100 4800 01:1000 7000 01:10000 10000 01:100000 0 0Promedio 5463.63 UFC/gr 0

Figura : Agar rojo violeta bilis para la detección de colifomes totales. Diluciones 1:10 y 1:100 de muestra de barbacoa, incubado a 35°C durante 24 horas.

Figura : Agar rojo violeta bilis para la detección de coliformes totales. a. Muestra de barbacoa. b. Muestra de guisado de carne, , incubado a 35°C durante 24 horas.

CONCLUSIÓN.

El control sanitario en la preparación de alimentos que se ofrecen en establecimientos fijos, es el conjunto de acciones de orientación, educación, muestreo y verificación que deben efectuarse con el fin de contribuir a la protección de la salud del consumidor, mediante el establecimiento de las disposiciones sanitarias que se deben cumplir tanto en la preparación de alimentos, como en el personal y los establecimientos, en los puntos críticos presentes durante su proceso; que permitan reducir aquellos factores que influyen durante su preparación en la transmisión de enfermedades por alimentos (ETA). Esta práctica tiene el propósito de conocer la técnica de vaciado en placa, para que con esto podamos asegurar la calidad alimentaria de los productos.

REFERENCIAS

NMX-F-464-1984. ALIMENTOS PARA HUMANOS. BEBIDAS NO ALCOHÓLICAS JUGO DE NARANJA CONCENTRADO PARA MANUFACTURA. FOODS FOR HUMANS. SOFT DRINKS. CONCENTRATED ORANGE JUICE FOR MANUFACTURING. NORMAS MEXICANAS. DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS.

NMX-F-045-1982. ALIMENTOS. FRUTAS Y DERIVADOS. JUGO DE MANZANA. FOODS. FRUITS AND DERIVATIVES. APPLE JUICE NORMAS MEXICANAS. DIRECCIÓN GENERAL DE NORMAS.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-093-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. PRACTICAS DE HIGIENE Y SANIDAD EN LA PREPARACION DE ALIMENTOS QUE SE OFRECEN EN ESTABLECIMIENTOS FIJOS

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-110-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA SU ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-113-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES EN PLACA.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-092-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA CUENTA DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACA.

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-111-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS.

RODRIGUEZ, H.R., CALIDAD INTEGRAL DE LOS ALIMENTOS Y ECOLOGIA MICROBIANA, 2006, ACADEMIA NACIONAL DE AGRONOMIA Y VETERINARIA, UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA PLATA, ARGENTINA.