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PRACTICA N°07 CUANTIFICACION DE LA GLUCOSA EN JUGO DE FRUTAS I. OBJETIVO El objetivo de la presente práctica es determinar la concentración de glucosa en jugo de uva, maracuyá, naranja, granadilla, manzana, piña, papaya, etc.) II. FUNDAMENTO TEORICO Aunque la glucosa puede determinarse por métodos químicos, estos en su mayoría carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacáridos. Tanto en análisis clínicos como en la industria alimentaria se utilizan métodos enzimáticos para la determinación de glucosa. Así la glucosa oxidasa es una flavo proteína altamente específica que cataliza la oxidación de la glucosa a β-D-gluconolactona, sin que ningún otro azúcar natural reaccione en extensión apreciable. Esta reacción en la que se consume oxígeno podría seguirse manométricamente o mediante un electrodo de oxígeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reacción espectrofotométricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reacción enzimática indicadora adecuada. Para la determinación colorimétrica de glucosa por el método de la oxidasa, se añade al medio peroxidasa de rábano silvestre (HRP), que elimina el peróxido de hidrógeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado según el siguiente esquema de reacción:

Practica n7 Bioquimica

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PRACTICA N07CUANTIFICACION DE LA GLUCOSA EN JUGO DE FRUTAS

I. OBJETIVOEl objetivo de la presente prctica es determinar la concentracin de glucosa en jugo de uva, maracuy, naranja, granadilla, manzana, pia, papaya, etc.)

II. FUNDAMENTO TEORICOAunque la glucosa puede determinarse por mtodos qumicos, estos en su mayora carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacridos. Tanto en anlisis clnicos como en la industria alimentaria se utilizan mtodos enzimticos para la determinacin de glucosa. As la glucosa oxidasa es una flavo protena altamente especfica que cataliza la oxidacin de la glucosa a -D-gluconolactona, sin que ningn otro azcar natural reaccione en extensin apreciable.Esta reaccin en la que se consume oxgeno podra seguirse manomtricamente o mediante un electrodo de oxgeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reaccin espectrofotomtricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reaccin enzimtica indicadora adecuada. Para la determinacin colorimtrica de glucosa por el mtodo de la oxidasa, se aade al medio peroxidasa de rbano silvestre (HRP), que elimina el perxido de hidrgeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado segn el siguiente esquema de reaccin:

Sin embargo, la naturaleza carcinognica de estos compuestos ha impulsado la bsqueda de aceptores alternativos. Uno de estos sistemas es la 4-aminoantipirina que reacciona con el fenol y el perxido de hidrgeno en presencia de HRP para formar un colorante con estructura de quinonaimina, que presenta un mximo de absorcin a 505 nm.El mtodo enzimtico de la determinacin de la glucosa tiene una serie de ventajas en comparacin con otros mtodos. El permite determinar el contenido de la glucosa en lquidos biolgicos despus de eliminar las protenas, en presencia de otros azucares y sustancias reductoras que no sean hidratos de carbono. El mtodo se basa en el hecho de que la glucosa en presencia de oxigeno del aire y con la participacin e una enzima la glucosa oxidasa, se oxida hasta el cido gluconico. El perxido de hidrogeno que se forma en el curso del proceso, se descompone mediante la peroxidasa. El oxgeno atmico que se desprende de esta reaccin, se combina con un cromgeno (o- toluidina) que se colorean al oxidarse. La intensidad de la coloracin del cromgeno oxidado es proporcional a la concentracin de la glucosa.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Material que debe traer el alumno

Jugo de uva Jugo de naranja Jugo de pia Jugo de papaya Jugo de granadilla Jugo de manzana Jugo de mango Jugo de limn Jugo de mandarina

Reactivos y material biolgico

Standard: solucin de glucosa 100mg/dl. GOD/POD: solucin de glucosa oxidasa (1000U/ml) y peroxidasa (120U/ml). Reactivo 4 AF: solucin de 4 aminofenazona 25 mmol/l en buffer tris 0.92 mol /l. Reactivo fenol: solucin de fenol 55 mmol/l. Concentraciones finales:GOD..3000U/LPOD400U/L4-AF; 1.25MmFenol: 2.75Mm.Ph: 7.4, 0.1

CONDICIONES DE REACCION Longitud de onda; 505 nm en espectrofotmetro o fotocolormetro con filtro verde (490- 530) nm. Temperatura de reaccin: 37C Tiempo de reaccin: 10 minutos Volumen de muestra: 10 ul Volumen de reactivo de trabajo: 1ml Volumen final de reaccin: 1.01 ml. El control del tiempo y la temperatura de incubacin no es crtico, pudiendo oscilar entre 10 y 12 minutos y entre 37 y 2c respectivamente, sin variaciones en los resultados. Volumen de muestra y de reactivos: pueden variarse proporcionalmente.

IV. PROCEDIMIENTO:

Obtener los jugos de frutas En un tubo de ensayo agregado 1 ml de reactivo de trabajo se procede de la siguiente manera:

REACTIVOSGRUPOS

IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXXXIXIIXIII

Reactivos de trabajo (ml)1111111111111

Jugo de uva (10 ul)10---------

Maracuy(10 ul)-10--------

Granadilla(10 ul)--10-------

Naranja(10 ul)---10------

Manzana(10 ul)----10------

Pia(10 ul)-----10----

Mango(10 ul)------10---

Meln(10 ul)-------10--

Limn(10 ul)--------10-

Mandarina(10 ul)---------10

Incubar a 37 C por 10 minutos

Incubar 10 minutos en bao de agua a 37C leer el espectrofotmetro a 505 nm o en fotocolormetro con filtro verde (490-530 nm) llevando el aparato a cero con el blanco.

El color de la reaccin final es estable 1 hora, por lo que la absorbancia puede ser leda durante este lapso.

V. CALCULOS:

[GLUCOSA] = F x ABSORVANCIAF = 229 mg/dl

TABLA N 2: absorbancia y concentracin de las muestrasMUESTRAABSORVANCIACONCENTRACION mg/dl

Uva2.404550.516

Maracuy2.480567.920

Granadilla2.408551.432

Naranja2.236512.044

Manzana2.421554.409

Pia2.238512.502

Mango2.264518.456

Meln1.909437.161

Limn1.642376.018

Mandarina1.846422.734

Papaya1.682385.178

Naranja2.177498.533

Granadilla 1.997457.313

VI. CONCLUCIONES

Se logr determinar las concentraciones de glucosa en distintas muestras (jugos de frutas) obtenindose los valores de la TABLA N 2. La uva tiene mayor concentracin de glucosa y el limn tiene la ms baja concentracin de glucosa, segn los valores de la TABLA N2.

VII. ESQUEMAS

Jugo de papaya

ESQUEMA CAMBIO DE COLORACION DE CADA MUESTRA QUE CONTIENE GLUCOSA

Jugo de meln

VIII. ANEXOS

Jugo de manzana

Jugo de papaya

Jugo de maracuy

Jugo de mango

jugo de naranja

jugo de granadilla

jugo de mandarina

jugo de papaya

jugo de meln