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bioquimica basica
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PRACTICA N07CUANTIFICACION DE LA GLUCOSA EN JUGO DE FRUTAS
I. OBJETIVOEl objetivo de la presente prctica es determinar la concentracin de glucosa en jugo de uva, maracuy, naranja, granadilla, manzana, pia, papaya, etc.)
II. FUNDAMENTO TEORICOAunque la glucosa puede determinarse por mtodos qumicos, estos en su mayora carecen de especificidad y no pueden distinguir la glucosa de otros monosacridos. Tanto en anlisis clnicos como en la industria alimentaria se utilizan mtodos enzimticos para la determinacin de glucosa. As la glucosa oxidasa es una flavo protena altamente especfica que cataliza la oxidacin de la glucosa a -D-gluconolactona, sin que ningn otro azcar natural reaccione en extensin apreciable.Esta reaccin en la que se consume oxgeno podra seguirse manomtricamente o mediante un electrodo de oxgeno. Sin embargo, para poder seguir el curso de esta reaccin espectrofotomtricamente es necesario acoplar a la misma una segunda reaccin enzimtica indicadora adecuada. Para la determinacin colorimtrica de glucosa por el mtodo de la oxidasa, se aade al medio peroxidasa de rbano silvestre (HRP), que elimina el perxido de hidrgeno a medida que se forma, a la vez que se genera un colorante adecuado segn el siguiente esquema de reaccin:
Sin embargo, la naturaleza carcinognica de estos compuestos ha impulsado la bsqueda de aceptores alternativos. Uno de estos sistemas es la 4-aminoantipirina que reacciona con el fenol y el perxido de hidrgeno en presencia de HRP para formar un colorante con estructura de quinonaimina, que presenta un mximo de absorcin a 505 nm.El mtodo enzimtico de la determinacin de la glucosa tiene una serie de ventajas en comparacin con otros mtodos. El permite determinar el contenido de la glucosa en lquidos biolgicos despus de eliminar las protenas, en presencia de otros azucares y sustancias reductoras que no sean hidratos de carbono. El mtodo se basa en el hecho de que la glucosa en presencia de oxigeno del aire y con la participacin e una enzima la glucosa oxidasa, se oxida hasta el cido gluconico. El perxido de hidrogeno que se forma en el curso del proceso, se descompone mediante la peroxidasa. El oxgeno atmico que se desprende de esta reaccin, se combina con un cromgeno (o- toluidina) que se colorean al oxidarse. La intensidad de la coloracin del cromgeno oxidado es proporcional a la concentracin de la glucosa.
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Material que debe traer el alumno
Jugo de uva Jugo de naranja Jugo de pia Jugo de papaya Jugo de granadilla Jugo de manzana Jugo de mango Jugo de limn Jugo de mandarina
Reactivos y material biolgico
Standard: solucin de glucosa 100mg/dl. GOD/POD: solucin de glucosa oxidasa (1000U/ml) y peroxidasa (120U/ml). Reactivo 4 AF: solucin de 4 aminofenazona 25 mmol/l en buffer tris 0.92 mol /l. Reactivo fenol: solucin de fenol 55 mmol/l. Concentraciones finales:GOD..3000U/LPOD400U/L4-AF; 1.25MmFenol: 2.75Mm.Ph: 7.4, 0.1
CONDICIONES DE REACCION Longitud de onda; 505 nm en espectrofotmetro o fotocolormetro con filtro verde (490- 530) nm. Temperatura de reaccin: 37C Tiempo de reaccin: 10 minutos Volumen de muestra: 10 ul Volumen de reactivo de trabajo: 1ml Volumen final de reaccin: 1.01 ml. El control del tiempo y la temperatura de incubacin no es crtico, pudiendo oscilar entre 10 y 12 minutos y entre 37 y 2c respectivamente, sin variaciones en los resultados. Volumen de muestra y de reactivos: pueden variarse proporcionalmente.
IV. PROCEDIMIENTO:
Obtener los jugos de frutas En un tubo de ensayo agregado 1 ml de reactivo de trabajo se procede de la siguiente manera:
REACTIVOSGRUPOS
IIIIIIIVVVIVIIVIIIIXXXIXIIXIII
Reactivos de trabajo (ml)1111111111111
Jugo de uva (10 ul)10---------
Maracuy(10 ul)-10--------
Granadilla(10 ul)--10-------
Naranja(10 ul)---10------
Manzana(10 ul)----10------
Pia(10 ul)-----10----
Mango(10 ul)------10---
Meln(10 ul)-------10--
Limn(10 ul)--------10-
Mandarina(10 ul)---------10
Incubar a 37 C por 10 minutos
Incubar 10 minutos en bao de agua a 37C leer el espectrofotmetro a 505 nm o en fotocolormetro con filtro verde (490-530 nm) llevando el aparato a cero con el blanco.
El color de la reaccin final es estable 1 hora, por lo que la absorbancia puede ser leda durante este lapso.
V. CALCULOS:
[GLUCOSA] = F x ABSORVANCIAF = 229 mg/dl
TABLA N 2: absorbancia y concentracin de las muestrasMUESTRAABSORVANCIACONCENTRACION mg/dl
Uva2.404550.516
Maracuy2.480567.920
Granadilla2.408551.432
Naranja2.236512.044
Manzana2.421554.409
Pia2.238512.502
Mango2.264518.456
Meln1.909437.161
Limn1.642376.018
Mandarina1.846422.734
Papaya1.682385.178
Naranja2.177498.533
Granadilla 1.997457.313
VI. CONCLUCIONES
Se logr determinar las concentraciones de glucosa en distintas muestras (jugos de frutas) obtenindose los valores de la TABLA N 2. La uva tiene mayor concentracin de glucosa y el limn tiene la ms baja concentracin de glucosa, segn los valores de la TABLA N2.
VII. ESQUEMAS
Jugo de papaya
ESQUEMA CAMBIO DE COLORACION DE CADA MUESTRA QUE CONTIENE GLUCOSA
Jugo de meln
VIII. ANEXOS
Jugo de manzana
Jugo de papaya
Jugo de maracuy
Jugo de mango
jugo de naranja
jugo de granadilla
jugo de mandarina
jugo de papaya
jugo de meln