PRÁCTICA Nº 3

TEMA: “La Coloración Gram” y “Microscopía Directa” OBJETIVO:

Conocer la composición química de las bacterias y su relación con la coloración Gram.

Observar microscópicamente los agentes patógenos de un exudado y de una bacteriuria.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA:

La evolución de la tecnología ha proporcionado desde 1676, con Antonio Van Leevenhoek, espectaculares cambios en los aparatos para visualizar microorganismos; con el microscopio electrónico es posible observar inclusive elementos estructurales, sin embargo, el microscopio de luz ordinaria mantiene su vigencia, importancia y utilidad como herramienta de trabajo diagnóstico.

Existen varios tipos de microscopios:

* PR. Poder de resolución.

El poder de resolución es la propiedad de nitidez de la imagen, depende de la longitud de onda de la luz utilizada y de la característica de apertura numérica que tiene el lente objetivo, la misma que mejora cuando se utiliza un líquido de mayor índice de refracción que el aire, entre el objetivo y el objeto (aceite de inmersión)

1. Campo brillante (luz)

PR* 0,2 mm , no se puede observar virus

2. Campo oscuro Permite observar bacterias muy delgadas. PR 0,02 mm

3. Contraste de fases

Permite análisis detallado de estructuras internas

4. Fluorescencia Tiñe microorganismos con colorantes fluorescentes

5. Electrónico Mejor resolución. Permite observar virus

PROCESOS PARA LA OBSERVACION AL MICROSCOPIO

1. Examen Directo: No se utiliza colorante. Es el sistema más sencillo de preparación de muestras para su examen microscópico. Aunque este método permite visualizar microorganismos y material celular de gran tamaño, con frecuencia resulta difícil analizar detalles internos. La muestra se puede suspender en agua o suero fisiológico (preparación en fresco)2. Tinción Simple: Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno, etc.)3. Tinciones diferenciales. Se utilizan diversas tinciones diferenciales para teñir cada tipo de microorganismo o componente del material celular. La tinción de Gram es la más conocida y utilizada de forma generalizada, y constituye el fundamento de la clasificación fenotípica de las bacterias.

PROCEDIMIENTO:

Examen directo de orina.-.En un frasco estéril se recolecta directamente la primera orina de la mañana, a mitad de la micción, previo lavado de las zonas genitales con agua simple. Luego, con una pipeta Pasteur tomar una gota de dicha muestra y colocar en una placa portaobjetos, tapar con un cubreobjetos y llevar al microscopio para su observación.

RESULTADOS E INTERPRETACIÓN

La coloración de Gram en la muestras de orina permite evaluar el tipo de bacteria, la presencia de piuria y determinar si hubo una adecuada recolección de la muestra.

Al observar con los lentes de menor aumento 10X y 40X, se visualizan células epiteliales, piocitos, fibras mucoides y pequeñas agrupaciones bacterianas de difícil identificación, debido a su transparencia y refringencia. Por lo que su interpretación se realiza con cruces: + Bacterias en el 25 % del

campo+++ Bacterias en el 75 %

del campo++ Bacterias en el 50 % del

campo.++++

Bacterias en el 100 % del campo

COLORACION GRAM

El diagnóstico rápido de microorganismos presentes en fluidos corporales estériles, es de gran importancia para el diagnóstico de infecciones, razón por la cual, la tinción de Gram constituye una herramienta de utilidad en el diagnóstico etiológico; sin embargo, la sensibilidad de esta técnica es variable según el tipo de muestra y la carga bacteriana presente en ella.

Sin embargo este procedimiento es recomendable en el diagnóstico microbiológico por ser accesible, económico, sencillo y fácil en manos expertas.

Esta técnica se fundamenta en la estructura de la pared bacteriana.

En el examen microscópico de orina el método de tinción de Gram suele corresponder según algunas publicaciones a una sensibilidad de 90 a 94% de los casos con resultado positivo en el que aparece un germen por campo. La especificidad es bastante baja.

Las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de peptidoglucano que contiene ácidos teicoico y lipoteicoico, por lo contrario las bacterias Gram negativas poseen una capa de peptidoglucano delgada y una membrana externa que contiene lipopolisacáridos, fosfolípidos y proteínas, además de un espacio periplasmático entre la externa que contiene proteínas de transporte, degradación y síntesis de la pared celular.

Colorante Básico-Catión (+) Bacteria (-) = Si tiñe

Colorante Ácido- Anión (-) Bacteria (-) = No tiñe.

En este caso los colorantes se usan para contrastar el fondo del campo que rodea a la bacteria.

Las tinciones diferenciales, a más de permitir la identificación morfológica de la bacteria, hacen posible observar partes constitutivas de su estructura.

MATERIALES:

Microscopio por dos estudiantes.Placa con bacterias Gram+Placa con Bacterias Gram –Set de tinción GramMechero BunsenAceite de inmersión.Placas coloreadas de Gram+, Gram-

PROCEDIMIENTO

1. Fijación de la placa al calor: con la ayuda de una asa estéril realizar la extensión de la muestra sobre un portaobjetos, posteriormente secar la muestra con la llama de un mechero para fijarla.

2. Coloración con cristal violeta: colorante básico que al reaccionar con la bacteria cargada negativamente reacciona corleándole.

1 min

3. Lavado con agua4. Mordiente con solución yodada: Forma un complejo

insoluble con el cristal violeta, fijando la tinción y aumentando la afinidad entre el colorante y las bacterias

1 min

5. Lavado con agua 6. Decoloración con alcohol-acetona: se usa disolventes

orgánicos. 30 seg

7. Lavado con agua8. Contratincion con safranina: colorante básico de diferente

color que el primero. 30 seg

9. Lavado con agua y secado

En las bacterias Gram +, el cristal violeta es fijado por la solución yodada y atrapado en la gruesa capa de peptidoglucano, por el contrario el decolorante se disemina por la membrana externa gramnegativa y elimina el cristal violeta de la capa delgada del peptidoglucano, así las bacterias Gram - se visualizan mediante el colorante de contraste rojo.

INTERPRETACION

La Tinción Gram además permite la identificación taxonómica de las bacterias, es así que podemos encontrar distintos tipos bacterianos, permitiendo clasificar las bacterias según distintos parámetros.

A. FORMAS BÁSICAS:

1. Esfericas : Cocos2. Cilindricas: Bacilos3. Espirales: Espiroquetas: espiral rígida

Espiroqueta: espiral flexible y ondulada 4. Vibrios En forma de coma 5. Variación de la forma

1.Protoplastos.- Se generan por acción de la lisozima o penicilina sobre las bacterias gram positivas.2. Esferoplastos.- Se generan por acción de EDTA sobre bacterias gramnegativas.3. Formas “L”.- Se generan por acción de la penicilina sobre protoplastos y esferoplastos.

B. POR LA AGRUPACIÓN

Cocos 1. Micrococos: aparecen aislados y dispersos2. Diplococos: aparecen en parejas.3. Estafilococos: similares a racimos de uvas4. Estreptococos: forman cadenas5. Sarcinas: grupos de 8 cocos6. Tetracocos: grupos de 4 cocos.

Bacilos 1.Diplobacilos: dos bacilos juntos2. Estreptobacilos: cadenas de bacilos3. Empalizados: bacilos lado con lado, en V, X o Y

C. POR LA COLORACIÓN

Cocos gram positivos: Streptococos, Stafilococo Cocos gram negativos: Neisserias Bacilos gram negativos: Enterobacterias: E. Coli, etc Bacilos gram positivos:

- Formadores de esporas: Clostridium y Antracis- No formadores de esporas: Corynebacterium, Listeria, Lactobacilos

TEMA DE CONSULTA. Otros tipos de tinciones en Microbiología - Morfología Externa de las bacterias

BIBLIOGRAFÍA MURRAY, Patríck R PhD, Microbiología Médica, quinta

edición, El Sevier, España 2007. CARDONA VILLARROEL, Ninoska, ROJAS AGREDA, Carlos y

ZABALAGA SALCEDO, Lilian. Leucocituria y tinción de gram para el diagnóstico de infección urinaria. Rev. bol. ped., jun. 2008, vol.47, no.2, p.81-85. ISSN 1024-0675.

Carmona O., Gómez M. J., ET. AL., Microbiología médica, de Divo, quinta edición, McGraw – Hill Interamericana, Caracas – Venezuela, 1 997, 7, 18.

Mims, Playfair, Roitt, ET. AL., Microbiología médica, Mosby, Madrid, España, 1 995, 3, 11, 3, 13.

Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual moderno, México, México, 2 002.

Salazar Wilson, Guías de práctica de laboratorio de microbiología, Departamento de publicaciones de la Facultad de Ciencias Médicas, Quito – Ecuador, 2007.

Lynch, Raphael, Mellor, ET. AL., Métodos de laboratorio, Segunda edición, Nueva editorial Interamericana, México - México, 1 972, 924, 925.