Práctica No. 5 Técnica de Tinción de Gram

Karina Zayetzi Aguirre SánchezLiliana Palacios

Carolina Tejocote

¿Qué es tinción?

Es un método utilizado para estudiar microorganismos mejorando el contraste en la imagen vista al microscopio.

En estas tinciones se observa morfología, estructura y agrupamiento de microorganismos.

Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan para resaltar estructuras en tejidos.

Para que se utilizaCon ayuda de los diferentes colorantes

es utilizado para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido, poblaciones celulares o incluso para resaltar organelos dentro de células individuales.

Tipos de TincionesExisten tres tipos de técnicas de tinción:

1. Tinción simple:◦ Se usa un único

colorante, que siempre es de tipo básico.

◦ Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color.

◦ La tinción simple mejora la observación de la célula completa.

Tinción diferencial: Se utilizan para distinguir

entre tipos de microorganismos.

La técnica de tinción diferencial consta de dos etapas: una tinción primaria (siguiendo el mismo método que en una tinción simple) seguida de una tinción de contraste.

En la tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante.

Tinción especifica o de estructuras:

 Incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las que se incluyen los flagelos y las cápsulas.

Tinción de Gram

Es la tinción mas usada en microbiología. Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo

danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Se considera una tinción diferencial Las referencias a la morfología celular bacteriana

(cocos, bacilos, positivos, negativos, etc) se basan justamente en la tinción de Gram.

Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas

Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares.

La pared de la célula Gram-positiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano.

La pared de la célula Gram-negativa contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula Gram-negativa es peptidoglicano.

Clasificación según agrupación

• Agrupación en cadena Ejemplo: streptococcus

• Agrupación en racimosEjemplo: staphylococcus

• Agrupación en empalizadaEjemplo: difteroides

Clasificación según forma y tinción

Cocos Gram positivosa) Genero: staphylococcus• Staphylococcus aureus

b) Genero: Streptococcus Streptococcus grupo A,B,C,G,D Enterococcus Streptococcus pneumoniae

Cocos Gram negativosa) Genero: Neisserias • Neisserias meningiditis• Neisserias gonorrhoeae

b) Genero: Moraxxela

Bacilos Gram positivos-Genero: Listeria Monocytogenes

-Genero: Corynebacterium

-Genero: Bacillus anthrasis

Bacilos Gram negativos• E. coli• Salmonella typhi• Salmonella enterinditis• Shigella• Vibrio cholorae• Campylobacter jejuni• Klebsiella pneumoniae• Proteus• Pseudomonas aeruginosa

Bacilos Gram negativos relacionados principalmente con vías respiratorias

• Haemophilus influenzae

• Bordetella pertussis

Bacilos Gram negativos que causan Zoonosis• Brucella

• Francisella tularensis

• Pasteurella multocida

COLORANTES

Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen moléculas de ácido teicoico.

El ácido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tinción.

Es más difícil decolorar una célula Gram positiva que una Gram negativa.

El cristal violeta es el colorante primario de la coloración de gram que se adhiere a la pared celular bacteriana, por lo tanto como colorante primario cumple como función permitir la identificación de bacterias cuya estructura y composición de pared celular se encuentre mayor proporción y distribución de ácido teicoico.El lugol o mordiente cumple la función de fijar el colorante primario en la preparación, es decir facilita la adhesión del cristal violeta en la muestra.

La safranina es el colorante de contraste, dado que las bacterias con baja composición de ácido teicoico y alta composición lipídica en su pared no absorben el cristal violeta luego de ser removido con el alcohol ácido absorben este colorante color rojizo

El alcohol sirve como decolorante

El colorante violeta y el yodo se combinan en el citoplasma de cada bacteria, y lo colorean de violeta obscuro a purpura. Las bacterias que conservan este color después de agregar el alcohol se clasifican como Grampositivas y las que

pierden el color violeta Gramnegativas.

Las bacterias Gramnegativas son incoloras después del

lavado con alcohol, por ese motivo se les aplica un

colorante básico safranina (colorante de contraste)que

las vuelve rosadas.

En las células Gramnegativas el alcohol altera la capa externa de lipopolisacarido y el complejo CV-1 se elimina de la capa delgada de peptodiglucano, en consecuencia las celulas Gramnegativas son incoloras.

Los bacilos y cocos (violetas) son Grampositivos y los vibriones (rosados) son gramnegativos.

Proporciona información valiosa para el tratamiento de ciertas enfermedades

Las bacterias Grampositivas suelen ser destruidas fácilmente por las penicilinas y las cefalosporinas.

Las bacterias Gramnegativos por lo general son mas resistentes porque los antibióticos no pueden atravesar la capa de lipopolisacarido.

PRACTICAObjetivo: Conocer y manejar la técnica de tinción de Gram de acuerdo con la estructura celular de las bacterias Gram(+) y Gram(-).

Preparación de reactivos1 g. cristal violeta ---- 100 ml alcoholLugol2 g. Kl + 1 g. I metálico -- 300 ml alcoholAlcohol cetona 80 ml alcohol + 20 cetona Safranina1 g. safranina --- 100 ml alcohol

1.- Hacer un frotis de cada uno de los microorganismos y dejarlos secar al aire

2.- Fijar los brotes al calor3.- Cubrir los frotis con cristal

violeta y dejarlos actuar durante un minuto .Escurrir el colorante y lavar.

4.- Cubrir los frotis con lugol, dejarlos un minuto, escurrir y lavar.

5.-Decolora con alcohol- cetona de 5-30 seg., escurrir y lavar.

6.- Cubrir los frotis con safranina y dejarla durante 10 seg., escurrir y lavar

7.-Dejar secar al aire8.- Hacer anotaciones y dibujos

Bibliografíahttp://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/documen/uni_02/56/cap305.htm http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/

5_anio/biotecnologia/practico4.pdfhttp://realisaciondeanalisis.blogspot.mx/2012/06/tinciones-usadas-en-microbiologia.htmlhttp://es.slideshare.net/Prymer/gram-positivos-y-negativoshttp://alquimiayciencias.blogspot.mx/2009/02/dora-este-articulo-es-para-vos.html http://es.slideshare.net/Altajimenez/tabla-de-bacterias-

gram-positivas-y-negativas http://www.ecologia.unam.mx/laboratorios/

evolucionmolecular/images/file/ClaseProcariontes/Alejandra/Pr%C3%A1ctica%203%20Tinci%C3%B3n%20de%20Gram.pdf

Tortora-Funke-CaseIntroduccion a la microbiologia