Upload
myriam-orocollo
View
32
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
CAMARA DE NEUBAUER
I. OBJETIVOS:
Aprender a utilizar la cámara Neubauer, y similares para el recuento de levaduras.
II. FUNDAMENTO:
CAMARA DE NEUBAUER
La Cámara de Neubauer es un instrumento utilizado en
medicina y biología para realizar el recuento de células en un
medio líquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina,
líquido cefalorraquídeo, liquido sinovial, etc.
Esta cámara de contaje está adaptada al microscopio de campo
claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que
tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las
cuales se ha marcado con la ayuda de un diamante una
cuadrícula de dimensiones conocidas. Se cubre la cámara con un
cubrecámaras que se adhiere por simple tensión superficial.
Luego se introduce el líquido a contar, al que generalmente se ha
sometido a una dilución previa con un diluyente, por capilaridad
entre la cámara y el cubrecámara; puesto que tiene dos zonas
esto permite hacer dos recuentos simultáneamente. Para contar
las células se observa el retículo al microscopio con el aumento
adecuado y se cuentan las células.
Con base en la cantidad de células contadas, conociendo el
volumen de líquido que admite el campo del retículo, se calcula
la concentración de células por unidad de volumen de la muestra
líquida inicial.
La fórmula de valoración del número de células (válida
universalmente) es la siguiente: Partículas por μl= (partículas
contadas)/(superficie contada (mm²)∙profundidad de la
cámara(mm)∙ dilución)
Recuento de eritrocitos: ejemplo
Observe que en la grilla de la cámara de Neubauer las áreas de
recuento de eritrocitos y linfocitos son diferentes. Los glóbulos
rojos se cuentan en las áreas coloreadas de rojo, mientras que
los glóbulos blancos se cuentan en las áreas coloreadas de azul.
Ten en cuenta que la grilla central tiene 25 cuadrados de 1mm x
1mm de área y 0.10 mm de profundidad. El factor de dilución es
por tanto de 1:200. Convierte el número de glóbulos rojos
contados en 5 cuadrados a nº glóbulos rojos/µl. (1 µl (micro litro)
= 1 mm3)
La imagen de abajo simula el campo que está viendo al
microscopio con un objetivo de 45x. Solo es visible el centro de
la grilla. Intenta verificar esto al ir moviendo el campo de
derecha-izquierda y de arriba-abajo, como si de una pletina de
microscopio se tratase. Cuenta los glóbulos rojos en los cinco
cuadrados mencionados anteriormente y determina el recuento
de eritrocitos como se ha descrito anteriormente.
Muy importante: Cuando un eritrocito se sitúa en mitad de las
líneas superior y/o de la izquierda, entonces es contabilizado.
Pero no se contabiliza cuando se sitúa en mitad de las líneas
inferior y/o de la derecha.
El rango normal de recuento de glóbulos rojos es el siguiente;
Mujeres:3.9-5.6millones/µl
Hombres: 4.5-6.5 millones/µl
TÉCNICAS DE CONTAJE CELULAR
Una suspensión celular se caracteriza por presentar un número
de partículas microscópicas dispersas en un fluido.
Habitualmente será necesario determinar tanto la densidad de
las células en la suspensión como el porcentaje de éstas que son
viables.
Para determinar la densidad de las células se emplean diferentes
técnicas, desde la relativamente simple cámara de contaje
celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que
empleamos (cámara de Neubauer), hasta equipos automáticos
de
Contaje celular como el "CellCoulter" de la empresa.
El principio del contador celular se basa en la medida de los
cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una
partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa
un pequeño orificio. Como se puede ver en el esquema, una
pequeña abertura entre los electrodos es la zona sensible a
través de la que pasan las partículas que se encuentran en
suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza
su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es
medido como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es
proporcional al volumen de la partícula. Controlando la cantidad
de la suspensión que circula a través del orificio es posible contar
y medir el tamaño de las partículas. Es posible contar y medir
varios miles de partículas por segundo, independientemente de
su forma, color y densidad.
En la unidad de citometria de flujo y microscopia con focal de los
servicios científicos- técnicos de la universidad de Barcelona se
dispone de contadores celulares.Sin embargo, es posible
determinar la densidad celular empleando métodos más
sencillos. Nos basta con una cámara de contaje celular, por ej. La
cámara de Neubauer, y un microscopio. Una cámara de contaje
celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la
suspensión a medir. El dispositivo presenta unas señales que
determinan un volumen conocido (x micro litros). Al contar bajo
el microscopio el número de partículas presentes en ese volumen
se puede determinar la densidad de partículas en la suspensión
de origen.
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata
de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo
de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una
cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3
x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de
0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a
1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está
hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se
cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada
0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y
el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 micro
litro.
Si contamos las cuatro áreas sombreadas (L) observando un total
de x células entre las cuatro áreas, la concentración en la
suspensión celular será:
Concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)
En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones
marcadas como L y que en el microscopio se ven como una
cuadrícula de 16 pequeños cuadrados de 0.25 milímetros de
lado. Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio
invertido de contraste de fases.
Existen numerosos modelos de cámaras de contaje celular
adaptadas a su uso en microscopía. En la imagen puedes
observar una cámara de Neubauer doble, como las que usas en
el laboratorio de prácticas.
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes
métodos. El más común es el de tinción con azul tripán. El azul
tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células
que presentan roturas en la membrana. Así pues las células que
aparecen en la imagen, claramente de color azul, son
consideradas no viables. Asimilar células blancas, por exclusión,
a células viables es un error pues por este método se
sobrevalora la viabilidad de las células en la suspensión,
determinando como inviables sólo aquellas con la membrana
rota. Existen otros métodos de determinación de la viabilidad
celular como el más preciso de la tinción con ioduro de propidio.
1. se aseptiza el dedo con alcohol y luego se seca al aire o con
algodón. Se coge entre el pulgar y el índice y se hace una
punción rápida y penetrante a través de la piel de la punta
del dedo con una lanceta estéril.
2. Se desecha la primera gota de sangre y se aspira la
siguiente con la pipeta de dilución perfectamente limpia y
seca hasta la señal 1 o 0.5 (también puede utilizarse la
pipeta de hemoglobina, de 20 microlitros). Hay que evitar la
entrada de burbujas de aire, pudiendo ayudarnos de un
papel de filtro para conseguir el enrasado.
3. A continuación se toma con la pipeta líquido de Hayem,
isotónico con la sangre, hasta la señal 1; así, la sangre
queda diluida al 1/10, si tomamos sangre hasta la señal 1, o
al 1/20 si tomamos hasta 0.5. Esto es así porque el volumen
de la bola de la pipeta es 100 veces superior al del capilar
de la misma. (Si hemos utilizado la pipeta de hemoglobina
podemos diluir su contenido en 2 o 4 ml de líquido de
Hayem para obtener diluciones 1/100 o 1/200).
4. Se adapta un cubreobjetos sobre una cámara cuenta
glóbulos limpia y seca y se coloca una gota en uno de los
lados del cubre; esta gota penetra por capilaridad y rellena
el retículo de la misma.
5. Una vez preparada la cámara se coloca sobre la platina del
microscopio dejándose unos minutos en reposo para que
sedimenten los glóbulos. Disponemos el condensador bajo y
luz débil; enfocamos primero con el objetivo débil seco y
luego se cambia al fuerte seco para proceder al recuento,
que se lleva a cabo en los cuadrados pequeños del retículo
marcado en color rojo. Finalizado el recuento se procede a la
limpieza de la pipeta con acético 1:3, agua destilada y
alcohol-éter sucesivamente.
7. El volumen de sangre en el cual se han contado las células
resulta de multiplicar la profundidad de la cámara por el
factor de dilución, la superficie de los cuadrados y el número
de cuadrados contadosCon cámara de NEUBAUER:
Superficie de 1 cuadrado grande (1/20 mm de lado):
Volumen de un cuadrado grande (1/10 mm de profundidad):
Si contamos "a" glóbulos rojos en "n" cuadrados pequeños, el
número de glóbulos por cuadrado será a/n.
Si en un volumen 1/4000 mm3 hay a/n glóbulos rojos, en 1 mm3
habrá X. Luego:
Siendo X el número de glóbulos rojos existentes por cada mm3
de sangre diluida.
Si la sangre se diluyó a 1/100 o 1/200, habrá que multiplicar el
valor X por 100 o 200 respectivamente, con lo cual obtendremos
un nuevo valor, Y, que representa el número de glóbulos rojos
existentes por cada mm3 de sangre (sin diluir).
Se utilizan para calcular, mediante el uso del microscopio, el
número de partículas (leucocitos, hematíes, bacterias…) por
unidad de voluimen de un líquido.
La cámara está constituida por una placa base de vidrio especial
pareciso a un porta, su parte central se encuentra separada de
los extremos por unas ranuras. en ella se encuentran las
cuadrículas de recuento. La fórmula de contaje es:
partículas/mm3= partículas contadas.
Clases de cámaras:
Neubauerimproved: Es el más utilizado (9 cuadros grandes,
cada 1 de 1 mm2.)
Neubauer: La diferencia es el cuadro grande central.
Thoma: Se utiliza solo para el recuento de eritrocitos.
Fuchs-Rosenthal: Se utiliza habitualmente para recuento de
células en líquidos orgánicos (LCR, Líquido sinovial…)
III. EQUIPOS Y MATERIALES:
cámara de Neubauer.
Micropipeta.
Tubos de ensayo.
Alcohol de 96º.
Vaso precipitado 50 ml.
Cubreobjetos.
IV. PROCEDIMIENTO:
Conteo en cámara de Neubauer: Esta cámara se utiliza para
conteo celular.
1. Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con
alcohol.
2. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordado
quebrada.
3. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma
vertical, esta debe quedarcentrada.
4. Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y
definitivo en la distribución de las células .Es recomendable
llenar la con micropipeta pequeña.
5. Con la pipeta se coloca ya que la cámara se llena con una
gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.
6. La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en
las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones
secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la
cámara es de líquido abundante en las terminaciones del
recuadro.
7. Conteo: Llévela cámara a el microscopio y enfoque el cuadro
de conteo con el ocular de 4X.Observará lo siguiente.
8. Si las células que va a contar son pequeñas como son las
levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y
pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguiente manera:
9. En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales
se cuentan las células presentes en 5 campos,
generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el
central, lo que garantiza un conteo aleatorio.
10. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se
visualiza cada uno
11. De los campos y con ayuda de el carro del microscopio se
desplaza la cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El
conteo en estos campos de la cámara se conoce como AP
(altopoder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la
siguiente manera:
12. Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un
total. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas
para evitar que se cuenten las células dos veces o que no
se cuenten .Alrededor de cada cuadricula se observa que
hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son
fundamentales en el momento del conteo ya que definen
cuales células son contables o cuales están fuera del
campo de conteo .Las células que no tocan la segunda línea
son contables, si la toca no están encima de ella no se
incluyen .Gráficamente se puede apreciar la forma correcta
de conteo. Las células que tiene una X son las que no se
deben contar.
13. Después de contar las células se procede a calcular al número
de células por unidad de volumen. Para esto se utiliza el área
de cada cuadro, el espacio ocupado por el líquido en el que
están las células que es el mismo espacio que hay entre la
cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo.
14. Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba
con la de abajo, se multiplica por el factor de dilución y por
un factor Figua la 106si se contó el cuadro central o 104 si
se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el valor
X.
Si 1 ml del preinoculo X esporas
Interrogante Esporas a inocular
(Ej.:1*108esporas)
Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de
medio en el que va a Desarrollarse el microorganismo.
V. CONCLUSIONES:
Pudimos repasar y conocer mejor esta técnica y sobre todo la
importancia de conocer bien los procedimientos y de
estudiarlos y comprenderlos correctamente, no solo a la hora
de calificar la materia, sino para poder ponerlos en práctica y
tener un conocimiento general acerca de la sangre, lo cual es
la finalidad de la capacitación de laboratorista clínico-
hematología, formar íntegramente alumnos capaces de
realizar este tipo de análisis.
VI. BIBLIOGRAFÍA:
http://members.tripod.com/~Biorreactores/Definicion.htm
http://2l2m-laboratoristaclinico.blogspot.com/2009/04/camara-
de-neubauer.html
2l2m-laboratoristaclinico.blogspot.com/.../camara-de-neuba
III PRACTICA DE BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS
TEMA: USOS DE LA CAMARA NEUBAUER
OBJETIVO
Aprender a utilizar la cámara Neubauer , y similares para el recuento
de levaduras.
FUNDAMENTO TEORICO
Además del recuento de levaduras en placa el método de recuento
con la cámara Neubauer es bastante útil. Para realizar un buen
recuento, es necesario teñir la muestra para distinguir las células
viables vivas de las muertas . Las muertas son las que se tiñen. Los
colorantes que se pueden utilizar son : azul de tripán, azul de
metileno o rodamina.
La cámara consta de un campo central o fondo de la cámara donde
están grabadas dos cuadrículas de recuento, que están separadas
una de otra por una ranura. El fondo de la cámara del campo central
es de 0,1 mm más bajo esto es la profundidad de la cámara.
PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra:
Lavar la cámara y el cubre con agua destilada y alcohol de 96%.
Secar bien con papel suave.
Poner el cubreobjetos encima de la cámara.
Homogenizar removiendo bien el cultivo en donde residen las
levaduras.
Tomar con pipeta una muestra.
Poner la punta de la pipeta en una de las dos ranuras de la cámara y
por capilaridad, las levaduras se distribuirán en la cámara.
Si se crea una cámara de aire repetir la operación desde el principio.
Fijar la cámara de recuento en la platina del microscopio para realizar
la observación microscópica.
Esperar unos minutos antes de contar para que las levaduras se
depositen en la cámara.
Preparativos del microscopio:
El enfoque del microscopio se empieza con el objetivo de menor
aumento que posteriormente pasaremos a uno de más. Se centra el
objetivo del microscopio a ojo en el centro teórico de la cruz de la
cámara, luego se coloca el objetivo lo más cerca posible del
cubreobjetos pero sin tocarlo y posteriormente se irá alejándolo hasta
que la imagen sea la más clara y nítida posible. Se aconseja trabajar
a 400 aumentos.
Para contabilizar las levaduras totales se aconseja siempre hacer la
media de levaduras contenidas en varios grupos de cuadros.
Las cámaras tienen 400 cuadrados útiles.
RESULTADOS
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
Escuela de Ing. De Industrias Alimentarias
Alumno
Arenaza Mamani, Fredy
(2006-29251)
Chuctaya navarro, David
(1993- )
Docente
MGR. Amelia Castro Gamero
Materia
BIOTECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS
(Practica)
Tipo de trabajo
Informe 01 :CAMARA DE NEUBAUER
Año académico
Quinto año