Pràctiques de Bioquímica I

Microbiologia Industrial

Curs 2007-2008

2

Pràctica 1: Aïllament de microorganismes amb activitat proteolítica, caracterització i optimització. L’ús de productes microbians en la indústria es molt àmplia (indústria farmacèutica, alimentària...), tant per a la obtenció de metabòlits primaris com a secundaris. Per a obtenir un determinat producte, prèviament s’ha de aïllar del medi ambient el microorganisme d’interès, i posteriorment s’han de optimitzar les condicions del medi, per aquest motiu en el laboratori s’estudia el creixement del microorganisme d’interès amb diferents condicions de pH, temperatura, etc. Per aquest motiu en aquesta pràctica ha consistit en aïllar d’una mostra de sòl una colònia de microorganismes que en les sembres en agar poguéssim observar un halus de degradació proteolítica la qual cosa ens indica que aquest és productor del nostre producte desitjat. Posteriorment en fem un cultiu pur per tal poder seguir treballant amb ell sense perill de contaminacions per altres soques bacterianes. Tot seguit, continuem en caracteritzar les seves condicions òptimes d’activitat i de producció de les proteases. Finalment, intentem millorar la soca a través de mutagènesi amb llum ultraviolada. Per les seves característiques podem distingir diferents tipus de proteases:

• Proteases alcalines: emprades en indústria dels detergents (pH 9-11, elevada Tª) • Proteases neutres: molt emprades en la indústria alimentària (pH 7) • Proteases àcides: molt emprades en la indústria del formatge (pH àcid)

Sovint els microorganismes amb capacitat proteolítica que trobem en aquest tipus de sòls solen ser del gènere Bacillus i produeixen proteases alcalines que treballen a pH molt alcalins i temperatures altes; la qual cosa els fa generalment molt útils per a la indústria. - Materials i Mètodes: S’ha seguit estrictament els mètodes descrits al guió de pràctiques. - Resultats: La soca de bacteris aïllada, després de realitzar-li una tinció de Gram, poguérem observar que es tractava de bacils gram – ja que es tenyeixen amb safranina. Tanmateix, ens va resultar impossible determinar quines eren les condicions de pH (7,5 o 8,5) i temperatura d’actuació òptimes de les proteases produïdes per la nostra soca bacteriana. També es valorà quina era la producció de proteases en funció de la composició del medi de creixement en que es trobessin els bacteris, en un cas TSB i l’altre TSB enriquit amb glucosa. Posteriorment, es repetir aquesta mateixa caracterització de les proteases produïdes així com la producció d’aquestes després d’haver provocat la mutagènesi de la soca amb una exposició a llum ultraviolada durant trenta segons.

3

A continuació es mostra la recta patró feta albúmina sèrica bovina (BSA) i els resultats de la determinació de la quantitat de proteïna produïda a través de la interpolació dins d’aquesta.

Recta Patró BSAy = 0,0858x - 0,0113R2 = 0,9886

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

-1,00 1,00 3,00 5,00 7,00 9,00

BSA µg/ml

Abs

(595

nm

)

Recta Patró BSAy = 0,1004x + 0,4613R2 = 0,958

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 5 10 15 20 25

BSA µg/ml

Abs

(595

nm

)

DO mostra DO medi �DO Concentració de proteïna (�g/ml)

Aïllament TSB Aïllament TSB+ Glc (1/2 do) 1,502 1,278 0,224 2,74 Aïllament Mutagènesi TSB 1,336 1,044 0,332 -

Aïllament Mutagènesi TSB+ Glc 1,378 1,220 0,158 - Pel que fa a la mesura de l’activitat proteolítica en totes les condicions provades ens donaren uns resultats en l’espectofotòmetre ens donaren resultats incongruents tal com absorbàncies negatives o significativament poc diferents respecte el blanc fet amb la

4

cubeta i aigua destil·lada. Aquest fet el discutiré detingudament en les conclusions. Això provoca que no puguem aplicar la formula per cap de les mostres obtingudes en aquesta pràctica:

1 unitat de proteasa = 10 x DO280 (30 minuts incubació) Cal destacar el fet que mesurem l’absorbància a 280 nm perquè aquesta és la longitud d’ona en que absorbeixen els aminoàcids aromàtics i per tant resulten una bona mesura de l’activitat proteolítica. - Discussió i Conclusions: En teoria, el que hauríem d’haver observat en aquesta pràctica és el fet que en la natura es troben gran quantitat de bacteris que per tal d’obtenir nutrients secreten al medi extracel·lular proteases que degradin la matèria orgànica. Així doncs, un medi ric en matèria orgànica com pot ser un sòl és normal que quan el diluïm i en fem sembres en plaques d’agar amb trobem diferents colònies en que s’observa aquesta capacitat. Pel que fa a la nostra indeterminació sobre quines són les condicions òptimes de treball de la nostra proteasa cal tenir el compte la possibilitat que potser el rang de condicions provades no ha estat el correcte, o bé s’ha procedit de forma incorrecta a l’hora de fer l’inòcul en els tubs per a la determinació de l’activitat proteàsica. També, pel que fa al procés de mutagènesi emprat, aquest consisteix en provocar lesions al DNA que varien en funció de la distància a la qual es troba el cultiu de la font i també del temps d’exposició. Cal destacar el fet que potser la mutació indirecta a través del llum ultraviolat no és la més adequada per tal de millorar l’activitat o la producció de la proteasa. Una mutagènesi més eficient consistiria en fer modificacions en el centre actiu de la proteïna i llavors expressar-la en un plàsmid recombinant, amb la qual cosa aconseguiríem l’expressió d’una proteïna més activa i en més quantitat. Tanmateix, cal destacar del mètode la rapidesa d’screening amb que es pot analitzar el resultat de la mutagènesi. Per altra banda, de la determinació de la quantitat de proteïna no en podem observar cap conclusió clara. Tanmateix, seria d’esperar que en el medi ha estat suplementat amb glucosa hi hagués una major producció, de la qual cosa en podríem suposar una major quantitat de proteasa. D’aquestes dades se’n derivaria el fet que segurament en el medi suplementat amb glucosa no hi ha repressió per catabolit. Respecte a la colònia mutagenitzada només destacar el fet que la determinació no ha sortit com seria d’esperar per algun error en la manipulació.

5

Pràctica 2: Incorporació de fàrmacs en liposomes Els liposomes són vesícules membranoses tancades envoltant i envoltades de medi líquid polar. Segons el nombre de bicapes poden ser unilamelars o multilamelars. Els liposomes unilamelars són utilitzats per a administrar fàrmacs. Els multilamelars no són utilitzats per a aquest fi ja que no travessen moltes membranes i solen ser degradats per macròfags. Els liposomes destinats a aquests fins els cal, també una coberta hidrofílica; i fins i tot poden incorporar molècules que siguin reconegudes per receptors específics del teixit diana. Per obtenir liposomes unilamelars poden utilitzar-se ultrasons, o fer passar els liposomes per porus cada vegada més petits. Esmentar que aquests poden tenir aplicacions pràctiques ja sigui en l’àmbit de la recerca com en el de la indústria. Destacar la seva possible utilització en la teràpia del càncer com a marcador d’on dirigir la radioteràpia quan s’incorporen cations paramagnètics o la possible quimioteràpia basada en la producció de radicals lliures d’oxigen (ROS) quan aquests liposomes incorporen porfirines i són irradiades amb llum; així com també el seu ús actual en la indústria cosmètica.

Tanmateix, aquesta pràctica té per objectiu quantificar l’eficiència de la incorporació de porfirines en liposomes multilamelars. Concretament, la porfirina emprada és la 5,10,15,20-tetrafenil-21H, 23H-porfirina de zinc (ZnTPP), i els fosfolipids que formen les membranes són el dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) i el diplamitoilfosfatidilcolina (DPPC). Cal destacar el fet que les porfirines són intermediaris secundaris de la síntesi de grups Hemo i que es caracteritzen per ser altament

hidrofòbics degut a la seva estructura formada per heterocicles, aquesta (ZnTPP) ho es especialment més pel fet que incorpora quatre grups fenil. Aquesta hidrofobicitat facilitarà en gran mesura que aquestes siguin incorporades entre les cues també hidrofòbiques dels fosfolípids emprats. Tanmateix, si es tractés de d’incorporar una substància hidrofílica l’eficiència seria molt menor ja que aquesta quedaria en l’espai aquós intern dels liposomes.

DPPC DMPC

6

- Materials i Mètodes: S’ha seguit estrictament els mètodes descrits al guió de pràctiques. - Resultats:

y = 398,44x + 0,0291R2 = 0,8639

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012

ZnTPP (mg/ml)

DO

Càlcul del Coeficient d’extinció molar

[ ].Abs ZnTPPε=

10,39844 678100 .270

. .l mg ZnTPP

Mmg ZnTPP mol ZnTPP

ε −= =

Resultats d’absorbància dels liposomes

Abs (423nm)

1,152 (fora recta) 0,318 (dó 1/5) 0,000871 (mg/ml )x500 = 0,436 (mg/ml)

Eficiència d’incorporació

[ ][ ]

. 0, 436 /.100 .100 87, 2%

. 0,5 /

ZnTPP incorp mg mlZnTPP inicial mg ml

µ = = =

- Discussió i Conclusions: Podem observar clarament per la concentració de porfirina incorporada que la eficiència de la incorporació d’aquesta als liposomes formats és molt elevada. Aquest fet és degut a la naturalesa especialment hidrofòbica de la porfirina incorporada.

7

Pràctica 3: Immobilització de la �-galactosidasa pel mètode de cross-linking En aquesta pràctica ens proposem observar com varia l’activitat de l’enzim encarregat de d’hidrolitzar la lactosa, anomenat �-galactosidasa, en diferents condicions pel que fa al seu origen com al sistema d’immobilització. Cal destacar que la immobilització dels enzims provoca una pèrdua d’activitat de l’enzim, però té com a avantatge el fet que es pot reutilitzar l’enzim immobilitzat, i per això pot resultar en un estalvi econòmic. Treballarem amb enzim que prové d’Escherichia coli així com d’Aspergilus oryzae; les condicions de treball seran l’enzim lliure i immobilitzat amb gluteraldehid ja sigui per cross-linking amb la resta de proteïnes del plasma bacterià o bé per co-cross-linking amb l’enzim purificat i barrejat amb albúmina bovina. Per facilitar les mesures de l’activitat enzimàtica, el substrat que treballarem no serà lactosa sinó un compost anàleg a aquest (ortonitrofenolgalactopiranosa ONPG) que té la propietat d’alliberar o-nitrofenol que absorveix a 420 nm quan és hidrolitzada. - Materials i Mètodes: S’ha seguit estrictament els mètodes descrits al guió de pràctiques. - Resultats: DO Mostra (M) DO Blanc (B) M-B Enzim lliure (E.coli) 0,727 0,613 0,114 Enzim lliure (E.coli) dil.1/20 0,032 0,027 0,005 Enzim lliure (E.coli) 0,587 0,613 - Enzim lliure (E.coli) dil.1/20 0,032 0,027 0,005 Enzim cross-linking (E.coli) 0,043 0,029 0,014 Enzim cross-linking (E.coli) 0,038 0,029 0,009 Sobrenedant cross-linking (E.coli) 0,019 0,018 - Primer rentat cross-linking (E.coli) 0,018 0,020 - Enzim lliure (A.oryzae) 0,262 0,065 0,197 Enzim lliure (A.oryzae) dil.1/20 0,198 0,222 - Enzim lliure (A.oryzae) 0,258 0,065 0,193 Enzim lliure (A.oryzae) dil.1/20 0,197 0,222 - Enzim co-cross-linking (A.oryzae) 0,252 0,244 0,030 Enzim co-cross-linking (A.oryzae) dil.1/3 0,690 0,234 0,456* Enzim co-cross-linking (A.oryzae) 0,318 0,244 0,074 Enzim co-cross-linking (A.oryzae) dil.1/3 0,924 0,234 0,690* Sobrenedant co-cross-linking (A.oryzae) 0,029 0,023 0,006 Primer rentat co-cross-linking (A.oryzae) 0,045 0,022 0,023 * Valors incoherents

8

-1 -1

E x 50Activitat (LU/ml) =

4,7ml µmol cm x 15min x 0,1mL∆

Activitat (LU/mL) Enzim lliure (E.coli) 0,808 Enzim lliure (E.coli) dil.1/20 0,709 Enzim lliure (E.coli) - Enzim lliure (E.coli) dil.1/20 0,709 Enzim cross-linking (E.coli) 0,099 Enzim cross-linking (E.coli) 0,063 Sobrenedant cross-linking (E.coli) - Primer rentat cross-linking (E.coli) - Enzim lliure (A.oryzae) 1,397 Enzim lliure (A.oryzae) dil.1/20 - Enzim lliure (A.oryzae) 1,369 Enzim lliure (A.oryzae) dil.1/20 - Enzim co-cross-linking (A.oryzae) 0,213 Enzim co-cross-linking (A.oryzae) dil.1/3 - Enzim co-cross-linking (A.oryzae) 0,525 Enzim co-cross-linking (A.oryzae) dil.1/3 - Sobrenedant co-cross-linking (A.oryzae) 0,042 Primer rentat co-cross-linking (A.oryzae) 0,163

- Discussió i Conclusions: Malgrat la precarietat dels resultats obtinguts podem afirmar que:

• La ß-galactosidasa de Escherichia coli és menys activa que la de Aspergillus oryzae (1,7 vegades).

• La immobilització a través de cross-linking en Escherichia coli o co-cross-

linking en Aspergillus oryzae, en deixa una activitat restant d’aproximadament el 12% i el 15% respectivament. Cal destacar doncs, que aquests no han estat uns processos gaire eficaços.

• Els sobrenadedants i productes del primer rentat tenen una activitat molt baixa,

la qual cosa ens indica que allí hi resta relativament molt poc enzim actiu.

Cal destacar que moltes de les mostres diluïdes no han obtingut uns valors coherents amb l’efecte que s’espera de la dilució, ja sigui per mala manipulació o per l’error intrínsec de la mesura. Així doncs, caldria repetir algun cop més l’experiment per tal de constatar els resultats que aquí s’intueixen. La diferència en les activitats segons la procedència dels enzims és explicable pel fet que en un cas es tracta d’una preparació comercial de gran puresa i l’altre simplement és la quantitat d’enzim que fisiològicament pot produir un bacteri amb un plàsmid recombinat dins seu.

9

Pràctica 4: Immobilització de cèl·lules en gels d’alginat de calci En aquesta pràctica ens proposem contrastar l’eficiència de la fermentació alcohòlica en diferents condicions de pH (4 o 7), temperatura (25ºC o 37ºC), substrat (glucosa o lactosa) o la presència de productes inhibitoris com el mateix etanol; així com també l’influencia de l’aplicació dels llevats immobilitzats en una matriu d’alginat de calci.

Per fer les mesures de la producció d’etanol, farem mesures indirectes a través de la quantifiació del volum de diòxid de carboni produït per unitat de temps ja que es poden relacionar fàcilment de forma estequiomètrica:

6 12 6 2 3 2

6 12 6 2 2 2

2. 2.

6. 6. 6.

fermentació

respiració

C H O CO CH CH OH

C H O O CO H O

→ +

+ → +

Es pot comprovar fàcilment que la producció de diòxid de carboni a través de la respiració aeròbia no es gaire significatiu, i que suposant un màxim de respiració en les condicions en que fem l’experiment aquesta producció no suposaria més d’un 26%. En qualsevol cas, cal considerar que aquest efecte és aproximadament homogeni per a tots els experiments realitzats i per tant no influeix significativament en la comparació dels diferents resultats obtinguts en cada condició, encara que si fóssim estrictes hauríem de considerar la diferent difusió de l’oxigen en l’aigua en funció de la temperatura. - Materials i Mètodes: S’ha seguit estrictament els mètodes descrits al guió de pràctiques. - Resultats:

ml CO2 0 4 34 84 104 132 168 Llevat lliure 25ºC, pH 4 mmols CO2 0 0,16 1,39 3,44 4,26 5,40 6,88

ml CO2 0 6 30 52 82 112 156 Immobilitzat 25ºC, pH 4 mmols CO2 0 0,25 1,23 2,13 3,56 4,58 6,38

min 0 10 20 30 40 50 60

Fermentació alcohlica

0

2

4

6

8

0 10 20 30 40 50 60 70

Temps (min)

mm

ols

CO

2

Lliure, 25ºC i pH 4 Immobilitzat, 25ºC i pH 4

10

Fermentació llevats

01234567

89

10

0 10 20 30 40 50 60

Temps (min)

mm

ols

CO

2

Llevat lliure 25ºC, pH 7 Llevat immobilitzat 25ºC, pH 7

Llevat immobilitzat 25ºC, pH 7 Llevat immobilitzat 25ºC, pH 7

Llevat lliure 25ºC, pH 4 Llevat immobilitzat 25ºC, pH 4

Llevat lliure 37ºC, pH 7 Llevat immobilitzat 37ºC, pH 7

Llevat immobilitzat 37ºC, pH 7 Llevat lliure 25ºC, pH 7, 1% EtOH

Llevat immobilitzat 25ºC, pH 7, 1% EtOH Llevat + b-gal immobilitzats 25ºC, pH 7

Llevat + b-gal immobilitzats 25ºC, pH 7 Llevat + b-gal immobilitzats 37ºC, pH 7

- Discussió i Conclusions: A partir d’una observació acurada dels resultats i els gràfics de producció de diòxid de carboni en podem obtenir les següents consideracions o conclusions: Podem comprovar com en tots els casos es dóna una menor producció de diòxid de carboni, i per tant podem deduir que també es dóna una reducció en la producció d’alcohol quan els llevats es troben immobilitzats en la matriu de alginat de calci. Aquest fet és degut a la limitació en la difusió que suposa la matriu, això provoca que la glucosa tingui més dificultats per difondre cap a l’interior de les partícules, també hi ha una

acumulació en el microentorn de productes de rebuig de la cèl·lula en que podem destacar principalment l’etanol que actua com un inhibidor del procés fermentatiu, tal i com es pot observar clarament en l’experiment en que afegim un 10% d’etanol al medi. També es destaca el fet que la temperatura òptima, dins de les dos que hem comprovat, per a la producció de l’etanol es situa al voltant dels 37ºC. Pel que fa al pH, el de 4 ha resultat el més òptim per al procés. Des del punt de vista industrial, s’haurien de considerar aquestes dades també des d’un punt de vista econòmic. La pèrdua de producció amb els llevats immobilitzats es podria veure compensada per la possibilitat de reutilitzar-lo i no haver de fer l’inòcul cada vegada, així com emprar la temperatura ambient podria compensar o no el cost energètic de mantenir el cultiu de forma constant a 37ºC.