Upload
others
View
3
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
Praktikum: kvalitativna indirektna ELISA detekcija prisustva protutijela (DNA auto-antitijela) za SLE (sistemski eritematozni lupus, autoimuna bolest)
(DNA)
W – ispiranje E – enzim S – kromogeni supstrat
I – plastična površina
Ag - antigen
Ab – protutijelo specifično za antigen
anti-Ab – protutijelo dobiveno u drugoj vrsti specifično za protutijelo Ab
3
https://www.youtube.com/watch?v=lNxZxJtvB94
ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay [HD Animation]
4
ELISPOT
5
6
7
8
Western blotting
• identifikacija specifičnih proteina u
složenim smjesama proteina
• SDS-PAGE (natrijev dodecil sulfat – poliakrilamid gel elektroforeza)
• SDS denaturira i oblaže proteine svi postaju negativno nabijeni
• SDS-proteini – imaju ujednačenu gustoću naboja
– tijekom elektroforeze migriraju na osnovi molekulskih masa
_
+
9
10
11
Identifikacija specifičnog protutijela metodom Western blot
(npr. identifikacija protutijela na HIV)
-poznati antigen (HIV) se razdvoji SDS-PAGE elektroforezom i prebaci na nitroceluloznu membranu
-membrana se izlaže test-uzorku (eventualno sadrži protutijela specifična za jedan ili više epitopa antigena (HIV)
-prisustvo protutijela iz test-uzorka se detektira sekundarnim protutijelom obilježenim enzimom (ili radioaktivno)
12
Imunoprecipitacija
• za purifikaciju antigena od interesa
• za otkrivanje prisustva određenog
antigena u nekom tipu stanica ili tkiva
• antigen u niskoj konc. mala količina
precipitata, puno vremena
• primarna ili sekundarna protutijela se
vežu za čvrstu fazu – sintetičke kuglice – centrifugiranje
– kuglice magneta
13
Metaboličko označavanje (Janeway) ili
biosintetsko radioizotopsko označavanje (Kuby)
imunoprecipitacija
• imunoprecipitacija + metaboličko označavanje
• jel određena stanica ili tkivo sintetizira antigen od interesa / koliko (scintilacijski brojači analiziraju nastale imunokomplekse)
stanice rastu u mediju za kulturu stanica koji sadrži
radioaktivno označene aminokiseline (npr. 35S-Met)
14
15
Afinitetna kromatografija (pročišćavanje antigena)
• metoda razdvajanja bioloških makromolekula temeljena na njihovu velikom afinitetu prema određenom prirodnom partneru
• stacionarna faza veže (time i zadržava na kromatografskoj koloni) molekule biološki specifičnog partnera
• sve nevezane molekule isperu se s kromatografske kolone
• pročišćena željena molekularna vrsta se eluira
• za purifikaciju proteina (antigena) od interesa iz neke složene otopine (kao i imunoprecipitacija) – protutijelo vezano za kolonu
16
Afinitetna kromatografija (pročišćavanje protutijela)
• ili obrnuto - za purifikaciju specifičnih protutijela iz antiseruma (antigen je tada vezan za kolonu)