Praktikumsbericht

Praktikum am Bernhard-Nocht-Institut in Hamburg inder Abteilung für Immunologie

vom 16.8. bis zum 10.9.2010

Ute Ho�mann

1

Inhaltsverzeichnis

1 Die Rahmenbedingungen des Praktikums 4

2 Hintergrundwissen 5

2.1 Zu den Themen der Arbeitsgruppe . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2 Zu meinem Projekt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

3 Materialien und Methoden 9

3.1 Transfektion und Handhabung der CHOs . . . . . . . . . . . . 9

3.1.1 Kultivierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3.1.2 Überprüfung der Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3.1.3 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.2 Proteinherstellung mittels der Bakterien . . . . . . . . . . . . 12

3.2.1 Transformation der Bakterien . . . . . . . . . . . . . . 12

3.2.2 Proteingewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.2.3 Proteinaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

4 Ergebnisse 15

4.1 Ergebnisse der Arbeiten mit den CHOs . . . . . . . . . . . . . 15

4.1.1 Überprüfung der Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4.1.2 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.2 Ergebnisse der Arbeiten mit den Bakterien . . . . . . . . . . . 20

4.2.1 Proteingewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.2.2 Proteinaufreinigung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

4.2.3 Western-Blot zur Identi�zierung von TRAP-H . . . . . 24

5 Diskussion 25

5.1 Diskussion der Ergebnisse der Arbeiten mit den CHOs . . . . 25

5.1.1 Überprüfung der Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . 25

5.1.2 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

5.2 Diskussion der Ergebnisse der Arbeiten mit den Bakterien . . 26

2

6 Fazit 28

3

1 Die Rahmenbedingungen des Praktikums

Mein Name ist Ute Ho�mann und ich habe diesen Juni am Gymnasium

Olching, in der Nähe von München, mein Abitur erworben. Ab Oktober 2010

werde ich an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Biologie studieren.

Im Rahmen der 3. Runde des Auswahlwettbewerbs zur Bestimmung des

deutschen Teams für die Internationale Biologieolympiade 2010 wurden auch

dieses Jahr durch den Förderverein der Internationalen Biologieolympiade

e.V. Praktika an verschiedene Teilnehmer des Wettbewerbs vergeben. Aus

diesem Grund bekam ich die Möglichkeit vom 16. August bis zum 10. Sep-

tember 2010 ein vierwöchiges Praktikum am Bernhard-Nocht-Institut für

Tropenmedizin in Hamburg zu absolvieren. Mein Praktikum fand in der Ar-

beitsgruppe von PD Dr. Thomas Jacobs in der Abteilung für Immunologie

statt.

Vor diesem Praktikum konnte ich erst wenige Erfahrungen mit wissen-

schaftlichem Arbeiten sammeln. Einige Einblicke in die Arbeit im Labor

erhielt ich allerdings durch mehrmalige Teilnahme an Ferienprojekten von

�Mädchen machen Technik�, einem Programm zur Förderung von Mädchen

in Wissenschaft und Technik.

Die Arbeitsgruppe von PD Dr. Thomas Jacobs beschäftigt sich mit der

Immunologie der Malaria und als zweiten Forschungsschwerpunkt mit Trypa-

nosoma cruzi, dem Erreger der südamerikanischen Chagas-Krankheit.

Da ich nur vier Wochen in der Arbeitsgruppe verbrachte und mir zu-

dem die nötigen Grundlagen fehlten, beschäftigte ich mich während dieser

Zeit damit chinese hamster ovary cells (CHOs) zu trans�zieren. Weiterhin

stellte ich mit Hilfe von E.coli BL21 pAP lacI ein Ober�ächenprotein des

Malariaerregers, TRAP, her. Die restliche Zeit schaute ich den verschiedenen

Mitgliedern der Arbeitsgruppe über die Schulter und half zum Teil auch mit,

so dass ich verschiedene, vor allem immunologische, Arbeitstechniken kennen

lernen konnte.

4

2 Hintergrundwissen

2.1 Zu den Themen der Arbeitsgruppe

Die Malaria ist in vielen tropischen und subtropischen Gebieten unserer

Erde verbreitet, wobei sie vor allem in den ärmeren Regionen Afrikas ein

groÿes Problem darstellt, da dort keine ausreichende Medikamentenversor-

gung und Infektionsprävention möglich ist. Hier sind vor allem Kinder Opfer

der Krankheit. Die Verbreitung der Malaria ist eng an den Lebensraum und

den Lebenszyklus ihres Endwirts, der Anopheles-Mücke, gebunden, was zum

Beispiel bedeutet, dass das Infektionsrisiko in feuchten Gebieten und wäh-

rend der Regenzeit erhöht ist. Die Erreger der Malaria sind Plasmodien.

Humanpathogen sind Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi, Plasmo-

dium ovale, Plasmodium vivax und Plasmodium falciparum. Der Krankheits-

verlauf kann sich bei Infektionen mit verschiedenen Parasiten unterscheiden,

etwa durch die Zeitintervalle zwischen den wiederkehrenden Fieberschüben

oder die Schwere der Krankheit.

Die sexuelle Vermehrung der Plasmodien �ndet in der Mücke statt. Bei

einem Stich gelangen sie als Sporozoiten in den menschlichen Blutkreislauf

durch den sie innerhalb kurzer Zeit in die Leber gelangen, in der sie Leber-

zellen befallen. In diesen kommt es zur asexuellen Vermehrung, Merogonie

genannt, bei der pro in�zierter Leberzelle innerhalb etwa einer Woche bis

zu 30.000 Merozoiten entstehen. Die Leberphase endet mit einer Freisetzung

der Merozoiten ins Blut, wo sie rote Blutzellen befallen. In ihnen vermehren

sie sich weiterhin asexuell. Je nach Plasmodienart werden die neu entstan-

denen Merozoiten nach verschiedenen Zeitintervallen freigesetzt. Die für alle

Formen der Malaria in der Regel in Anfällen auftretenden Fieberanfälle sind

mit dieser Erythrozytenruptur assoziiert. Sie werden vermutlich als Reaktion

des Immunsystems auf die Abfallprodukte des Parasitensto�wechsels ausge-

löst. Die Parasiten versto�wechseln in den Erythrozyten Hämoglobin, aus

welchem das kristalline Malariapigment Hämozoin, welches als eines der Ma-

5

lariatoxine gilt, entsteht. Bei der Vermehrung innerhalb der roten Blutzellen

entstehen unter anderem auch zur sexuellen Fortp�anzung fähige Plasmodi-

en, Gametozyten. Durch erneute Mückenstiche können diese weitere Mücken

in�zieren, in denen es wieder zur sexuellen Fortp�anzung kommt.

Abb.1: Der Lebenszyklus der Plasmodien

Eine Infektion mit den Parasiten kann in seltenen Fällen, etwa in En-

demiegebieten, durch klinische Immunität ohne Symptome verlaufen, oder

aufbauend auf typischen Symptomen wie Kopf- und Gliederschmerzen mit

Fieber(anfällen) zu Koma und auch zum Tode führen. Schwerere Verlaufs-

formen werden dabei vor allem von Plasmodium falciparum ausgelöst.

In der Regel kommt es bei einer Malariainfektion zu einer Vergröÿerung

der Milz, einer so genannten Splenomegalie, da dort die Plasmodien aus dem

6

Blut ge�ltert werden und phagozytiert werden. P. falciparum entzieht sich

dem, indem auf der Erythrozytenober�äche durch die Einlagerung von para-

sitären Proteinen Vorwölbungen entstehen, mit denen die Erythrozyten an

den Endothelzellen der Blutgefäÿe haften bleiben können. Dies kann zu einer

schlechteren Durchblutung der betre�enden Gewebe führen. Zudem kommt

es in dem betro�enen Gewebe zu einer stärkeren Entzündungsreaktion, was

etwa bei einer Malariainfektion in der Schwangerschaft fatal sein kann, da es

über eine massive Einwanderung von P. falciparum in die Plazenta zu Früh-

oder Fehlgeburten kommen kann.

Durch die häu�gen Fieberanfälle sind die meisten In�zierten dehydriert.

Das, die verschlechterte Durchblutung und die Zerstörung der in�zierten Ery-

throzyten führen zu einer verschlechterten Sauersto�versorgung der Gewebe.

Dies wird durch eine verringerte Erythropoese verstärkt, da diese vermutlich

zu Gunsten der Leukopoese während der Krankheit gedrosselt wird. Die ver-

ringerte Sauersto�versorgung führt zu einer verstärkten Ausschüttung von

Milchsäure. Da die Leber ebenfalls durch die anhaltende allgemeine Entzün-

dungsreaktion in ihrer Funktion beeinträchtigt ist, kommt es in der Regel

so nach kurzer Zeit zu einer Azidose. Der dadurch entstehende metabolische

Stress kann zu weiteren Organschäden führen und spielt unter Umständen

eine Rolle bei der cerebralen Malaria und dem dabei auftretenden Koma.

Die genauen Mechanismen, die hinter den verschiedenen Verlaufsformen

der Malaria stehen, sind noch nicht geklärt. Die verschiedenen Ober�ächen-

proteine der verschiedenen Plasmodien spielen eine wichtige Rolle, da unter

anderem etwa P. falciparum durch verschiedene Ober�ächenproteine mehr

Erythrozyten in�zieren kann als P. vivax und, wie bereits erwähnt, sich die

mit P. falciparum in�zierten Erythrozyten über bestimmte parasitäre Ober-

�ächenproteine an Endothelzellen anlagern können.

Ein weiterer kritischer Punkt des Krankheitsverlaufs ist das überborden-

de Immunsystem. Durch den allgemeinen anhaltenden Entzündungszustand

wird der Körper teilweise mehr geschädigt, als dass die Reaktion bei der

7

Bekämpfung der Krankheit helfen würde.

Mit Hilfe der Forschung kann man vielleicht in Zukunft, beispielsweise

durch die genauere Kenntnis der verschieden Ober�ächenproteine und In-

fektionswege, den Beginn der Blutphase verhindern oder im späteren Krank-

heitsverlauf das Immunsystem so regulieren, dass es nicht mehr mehr schädigt

als hilft. [1, 2]

2.2 Zu meinem Projekt

Während des Praktikums habe ich mich mit der rekombinanten Expressi-

on verschiedener Proteine in eukaryotischen Zellen (CHOs, chinese hamster

ovary cells) und in Bakterien des Stamms E.coli BL21 pAP lacI beschäftigt.

Die CHOs sollten nach der Transfektion, die mittels durch�usszytometri-

schen Messungen überprüft wurde, das murine Zytokin IL-35 produzieren.

Dessen Funktion sollte in vitro und in vivo genauer charakterisiert werden.

In den Bakterien wurde P.berghei TRAP (thrombospondin-related adhe-

sive protein) produziert. Dieses ist ein Ober�ächenprotein der Sporozoiten,

dass eine wichtige Rolle bei der Infektion der Hepatozyten spielt. Es wur-

de auf Grund seiner Gröÿe in zwei getrennten Fragmenten, TRAP-F und

TRAP-H, exprimiert und über die bei der Klonierung angefügten His-Tags

aufgereinigt.

Das aufgereinigte TRAP sollte in immunologischen Tests als Antigen ver-

wendet werden, um so die humorale Immunantwort von Mäusen nach einer

P.berghei -Infektion zu untersuchen.

8

3 Materialien und Methoden

3.1 Transfektion und Handhabung der CHOs

3.1.1 Kultivierung

Bei der Arbeit mit Zellkulturen ist es wichtig Kontaminationen mit Mikroor-

ganismen zu vermeiden. Deswegen wurde mit sterilen Einmal-Plastikwaren

und zuvor durch Autoklavierung sterilisierten Glaswaren und Lösungen un-

ter einer Reinluft-Werkbank gearbeitet. Die Zellen wurden in RPMI1640-

Medium kultiviert, welchem 10 % fötales Kälberserum (FCS), 4 mM L-

Glutamin und 50 mg/ml Gentamycin zugesetzt wurden. Die Kultur der Zel-

len erfolgte bei 37°C im Brutschrank mit einem CO2-Gehalt von 5%. Die

Zellen wurden in 6-Loch-Zellkulturplatten in 5 ml Medium pro Vertiefung

kultiviert. Bei ausreichender Besiedlung des Gefäÿes wurden die Zellen mit

Hilfe von Trypsin-EDTA von der Platte gelöst und neu ausgesät. Im Rahmen

dieses Arbeitsschrittes wurde 500 ml Trypsin-EDTA auf die Zellen gegeben,

etwa 4 Minuten gewartet bis sich diese vom Untergrund gelöst hatten, das

Trypsin-EDTA daraufhin wieder abgenommen und die Zellen verdünnt in

neue Vertiefungen gegeben.

3.1.2 Überprüfung der Plasmide

Polymerase-Kettenreaktion Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion,

kurz PCR, kann man gegebene DNA-Stücke vervielfältigen. Dazu wurde zu-

nächst ein Mastermix, pro zu vervielfältigender Probe bestehend aus je 2,5µl

Vorwärts- und Rückwärts-Primer, 2,5µl 10x Taq-Pu�er, 2,5µl MgCl2, 2,5µl

dNTP-Lösung, 0,2µl Taq-DNA-Polymerase und 11,3µl H2O, angesetzt. Die

eingesetzte DNA-Polymerase stammte aus Thermophilus aquaticus, welche

durch ihre Hitzestabilität für PCRs geeignet ist.

Es wurden nun zwei Reaktionsgefäÿe mit Mastermix und je einmal 1µl der

Templates angesetzt. Als Templates wurden die Probe des Leerplasmids und

9

die des IL-35-Plasmids verwendet. Zusätzlich wurde in einem Reaktionsgefäÿ

zur Kontrolle auf Kontaminationen mit Fremd-DNA 1µl H2O demMastermix

hinzugefügt.

Die PCR wurde in einem Thermocycler durchgeführt. Das Programm be-

gann mit einer 180 Sekunden dauernden initalen Denaturierung bei 95°C, um

die zunächst als Doppelstränge vorliegenden Plasmide in ihre Einzelstränge

zu trennen.

Danach folgten Zyklen bestehend aus der Denaturierung bei 95 °C für 30

Sekunden, gefolgt von dem 60 Sekunden dauernden Annealing, bei dem sich

bei einer Temperatur von 55°C die Primer an die Einzelstränge anlagerten.

Ein Zyklus wurde vollendet durch die Elongation, bei der bei 72°C für 60

Sekunden die Polymerase die dNTPs an die Primer anbaute und somit die

DNA-Stücke duplizierte.

Nach 40 Zyklen folgte ein Zeitraum von 600 Sekunden bei 72°C, in de-

nen der DNA-Polymerase Zeit gegeben wurde unvollständige Ampli�kate zu

vervollständigen. Nach diesem Schritt war die PCR abgeschlossen.

Die Proben wurden daraufhin auf ein Agarosegel aufgetragen.

Restriktionsverdau Für den Restriktionsverdau wurden jeweils 2,5µl Puf-

fer und 1µg Plasmid vermischt. Pro Restriktionsschnittstelle wurden 1µl des

jeweiligen Restriktionsenzyms zugegeben, dem Leerplasmid dementsprechend

1µl Enzym und dem IL-35-Plasmid jeweils 1µl von zwei Enzymen. Diese Ge-

mische wurden mit Wasser auf 25µl aufgefüllt.

Der Verdau braucht bei 37°C etwa 10 bis 15 Minuten. Danach wurden die

Proben auf ein Agarosegel aufgetragen.

Agarose-Gelelektrophorese Mittels der Agarose-Gelelektrophorese kann

man DNA-Moleküle anhand ihrer Gröÿe auftrennen, da diese in einem elek-

trischen Feld wandern. Bedingt durch die verschiedenen Gröÿen werden die

Moleküle unterschiedlich stark von dem Agarose-Gel aufgehalten, wandern

aus diesem Grund verschieden schnell und werden dadurch aufgetrennt. Um

10

die Gröÿen der verschiedenen DNA-Moleküle nachvollziehen zu können, wur-

de der DNA-Marker GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder von Fermentas

verwendet.

Die Gele wurden mit 1% Agarose gegossen. Zudem wurde Ethidiumbro-

mid in einer Endkonzentration von 0,2 µl/ml zugesetzt. Ethidiumbromid

interkaliert in die DNA-Moleküle und macht sie so in UV-Licht sichtbar.

Als Pu�er wurde 1x TBE verwendet. Die Elektrophorese wurde bei 80 V

durchgeführt.

3.1.3 Transfektion

Die zu trans�zierenden Zellen sollten beim Zeitpunkt der Transfektion un-

gefähr zu 90 % kon�uent sein. Zum Trans�zieren wurde zunächst das alte

Medium abgenommen und durch 4 ml frisches Vollmedium ersetzt. Pro Well

wurden nun 400µl Medium mit 4µg DNA und 4µl TurboFect (Fermentas) für

20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dieses Gemisch wurde langsam

in das Well getropft.

TurboFect unterstützt die Aufnahme der DNA, indem es mit der DNA

Polymere bildet, die über Endocytose aufgenommen werden und nach dem

Bersten der Endosomen in den Zellkern gelangen können.

Die Transfektion wurde in zwei Wells mit dem Leerplasmid durchgeführt,

in zwei mit dem IL-35 enthaltenden Plasmid und ein Well wurde als Nega-

tivkontrolle nur mit Medium und TurboFect behandelt.

Das Ergebnis der Transfektion wurde nach jeweils 24 und 48 Stunden

mittels Durch�usszytometrie überprüft.

Durch�usszytometrie Mittels der Durch�usszytometrie kann man Zellen

auf verschiedene Eigenschaften hin untersuchen. Dabei werden einzelne Zellen

an einem Laser vorbeigeleitet und durch die Re�ektion und Streuung des

Lichts auf ihre Eigenschaften geschlossen. Man unterscheidet Forward- und

Sidewards Scatter, entsprechend der Streuung des Lichts nach vorne und der

11

zur Seite. Der Forward Scatter gibt Auskunft über die Gröÿe der Zellen, der

Sidewards Scatter über die Granularität.

Man kann neben Forward und Sidewards Scatter auch Fluoreszenzen mes-

sen. Dazu müssen die Zellen �uoreszieren oder, etwa über Antikörper, mit

Fluoreszenzfarbsto�en verbunden sein. Diese werden durch Laser mit Licht

der entsprechenden Wellenlänge angeregt und die entstehende Lichtemissi-

on über Photodetektoren gemessen. So kann man weitere Aussagen über die

Zellen tre�en.

Auf dem Leerplasmid wurde humanes IgG codiert, auf dem IL-35 wurde

ein Fusionsmolekül aus IgG und IL-35 codiert. Um die Transfektion nach-

zuweisen, wurde mittels eines mit einem Fluoreszenzfarbsto�-gekoppelten-

Antikörper humanes IgG und somit die jeweils exprimierten Proteine nach-

gewiesen. Da diese im Zellplasma vorliegen, mussten die Zellen erst mit Zell-

permeabilisierungsagens behandelt werden. Vor der durch�usszytometrischen

Untersuchung wurden sie anschlieÿend mit den Nachweisantikörpern inku-

biert, mehrmals mit FACS-Pu�er gewaschen und mit 1% PFA in PBS �xiert.

3.2 Proteinherstellung mittels der Bakterien

Die Herstellung des Proteins TRAP mittels E.coli gliederte sich in drei ver-

schiedene Zwischenschritte. Zu Beginn wurden die Bakterien mit den jewei-

ligen Plasmiden transformiert, um danach, zur Proteingewinnung, in gröÿere

Kulturen gegeben zu werden, aus denen dann schlieÿlich über mehrere Schrit-

te das Protein aufgereinigt werden konnte.

3.2.1 Transformation der Bakterien

Für die Transformation wurden jeweils 3µl Plasmid (pJC45-TRAP-F bzw.

pJC45-TRAP-H) mit jeweils 50µl kompetenten Bakterien des Stammes E.coli

Bl21 pAP lacI in Reaktionsgefäÿen vermengt. Die Reaktionsgefäÿe wurden

nun für 30 min. auf Eis gestellt, um sie danach für 45 sek. bei 42°C zu

12

erhitzen. Danach kamen sie wieder für 2 Minuten auf Eis. Nach diesem Pro-

zedere wurde jeweils 1 ml warmes LB-Medium zu den Bakterien gegeben und

die Reaktionsgefäÿe für eine Stunde bei 37°C in den Schüttler gegeben. Im

Anschluss daran wurden jeweils 200µl und 800µl der Bakterien auf Agar-

Platten, die mit Kanamycin und Ampicilin versetzt waren, ausplattiert. Auf

diesen wuchsen die Bakterien über 2 Tage bei Raumtemperatur.

3.2.2 Proteingewinnung

Nach drei Tagen wurden in zwei Reagenzgläsern jeweils 5 ml LB-Medium mit

einer Konzentration von 50µl/ml Kanamycin und Ampicilin mit je einem

Klon der TRAP-F und TRAP-H-Bakterien angeimpft und über Nacht bei

37°C und 200 rpm inkubiert.

Sowohl die TRAP-F- als auch die TRAP-H-Übernachtkultur wurden ge-

nutzt um jeweils zweimal 200 ml LB-Medium mit Kanamycin und Ampicilin

anzuimpfen. Die vier Erlenmeyerkolben mit dem LB-Medium wurden bei

37°C und 200 rpm inkubiert, bis die exponentielle Wachstumsphase erreicht

wurde. Die OD bei 600 nm beträgt dann in etwa 0,5.

Nun wurde durch die Zugabe von IPTG (1mM) die Expression der Protei-

ne induziert. Jeweils eine TRAP-F und eine TRAP-H-Kultur wurden weitere

drei Stunden bei 37°C und 200 rpm inkubiert, die verbleibenden zwei Kultu-

ren wurden über Nacht bei 18°C und ebenfalls 200 rpm inkubiert.

Anschlieÿend wurden die Bakterien mit 4000 rpm bei 4°C für 30 Minu-

ten abzentrifugiert und die Pellets bis zur weiteren Verwendung bei -20°C

aufbewahrt.

Vor und nach der Induktion der Proteinexpression wurden Aliquots ab-

genommen und als Pellets bei -20°C gefroren. Die Menge der in den Aliquots

be�ndlichen Bakterien wurde über die Messung der OD600 abgeglichen.

Vor der Proteinaufreinigung wurde eine Testlyse von jeweils 10 ml der Ex-

pressionskulturen durchgeführt um die Löslichkeit der exprimierten Proteine

zu überprüfen. Die Pellets wurden mittels Ultraschall in PBS mit 1% Triton

13

X-100 lysiert. Pellet und Überstand wurden getrennt und von ihnen und den

vor und nach der Induktion entnommenen Aliquots wurden Coomassie-Gele

angefertigt.

3.2.3 Proteinaufreinigung

Zur Aufreinigung der His-getaggten Proteine wurde das ProBondTM Nickel-

Chelating Resin von Invitrogen genutzt. Die näheren Informationen zu den

Zusammensetzungen der Pu�er und der Vorbereitung der Säule mit der Säu-

lenmatrix sind in der Anleitung des Kits nachlesbar. [1]

Die Aufreinigung wurde unter Hybridbedingungen nach den Angaben des

Herstellers durchgeführt. Um eine bessere Löslichkeit der Proteine zu errei-

chen, wurden die Lyse und die Bindung an die Säulen der Bakterien unter

denaturierenden Bedingungen durchgeführt, die Elution jedoch, um die Pro-

teine zu schonen, unter nativen.

Von den gesammelten 1 ml groÿen Fraktionen des Eluats wurden jeweils

10µl mit 90µl Coomassie-Lösung vermengt. Dieser so genannte Bradford-Test

dient der ungefährem Bestimmung des Proteingehalts.

Die Fraktionen, die Protein enthielten, wurden daraufhin in einem Re-

aktionsgefäÿ vereinigt. Nach der Aufreinigung wurde das eluierte Protein in

PBS umgepu�ert. Dies geschah mit der Hilfe von zwei PD-10-Säulen (GE

Healthcare) nach dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll. Zur Erhö-

hung der Proteinkonzentration wurden die Proteineluate in einer Zentrifuge

mit Hilfe von Vivaspin-2-Säulen (sartorius stedim biotech) ultra�ltriert. Die

erreichte Konzentration wurde über die Messung der OD bei 280 nm mittels

des NanoDrop Spectrophotometer (Thermo Scienti�c) gemessen.

Die Reinheit der Proteine wurde im Anschluss daran mit SDS-Polyacrylamid-

Gelektrophorese und Silberfärbung überprüft.

14

4 Ergebnisse

4.1 Ergebnisse der Arbeiten mit den CHOs

4.1.1 Überprüfung der Plasmide

Abb.2: Agarose-Gel mit dem Ergebnis der PCR, ganz links auf dem Gel

der Marker, in der nächsten Spalte die Probe vom Leerplasmid und ganz

rechts die des Plasmids mit IL-35

15

Abb.3: Agarose-Gel mit dem Ergebnis des Restriktionsverdaus, ganz links

der Marker, in der mittleren Spalte die Probe des Plasmids mit IL-35 nach

dem Verdau und ganz rechts die Probe des Leerplasmids

4.1.2 Transfektion

Bei den Ergebnissen der durch�usszytometrischen Untersuchung ist der Si-

dewards Scatter (SSC-A) jeweils auf der y-Achse aufgetragen. In Abbildung

4 ist auf der x-Achse der Forward Scatter angetragen (FSC-A), bei den dar-

auf folgenden Abbildungen der FL2-Kanal (in der Abbildung: FL2-A, weist

Licht mit Wellenlängen zwischen 546 und 602 nm nach). In Abbildung 4

wird mit P1 auf Zellen gegated. P2 markiert die Zellen, die im Kanal FL2 so-

viel Fluoreszenz zeigen, dass Bindungen durch den verwendeten Fluoreszenz-

gekoppelte Antikörper an den Zellen als nachgewiesen gelten können.

16

Abb.4: Negativkontrolle nach 24 h

Abb.5: Negativkontrolle nach 24 h

17

Abb.6: Mit dem Leerplasmid trans�zierten Zellen nach 24 h

Abb.7: Mit IL-35-Plasmid trans�zierte Zellen nach 24 h

18

Abb.8: Mit dem Leerplasmid trans�zierten Zellen nach 48 h

Abb.9: Mit IL-35-Plasmid trans�zierten Zellen nach 48 h

19

4.2 Ergebnisse der Arbeiten mit den Bakterien

4.2.1 Proteingewinnung

Auf den Gelen ist jeweils ganz links der Marker aufgetragen. ZP 1 steht

für das entnommene Aliquot zum Zeitpunkt 1, also vor der Induktion der

Proteinproduktion, ZP 2 für das Aliquot nach der Proteinproduktion. Die

Abkürzung T steht für Tagkultur, aus ihr wurden auch Pellet und Überstand

1 (P1, ÜS 1) entnommen. N steht für Nachtkultur, dazu gehören Pellet und

Überstand 2 (P2, ÜS 2).

Abb.10: SDS-PAGE-Gel der TRAP-F-Gewinnung, mit Coomassie gefärbt

20

Abb.11: SDS-PAGE-Gel der TRAP-H-Gewinnung, mit Coomassie gefärbt

Abb.12: SDS-PAGE-Gel der TRAP-H-Gewinnung, mit Coomassie gefärbt

21

4.2.2 Proteinaufreinigung

Abb.13: SDS-PAGE-Gel mit Silberfärbung von der TRAP-F-Aufreinigung,

aufgetragen sind das Lysat der Bakterien, der Durchlauf (DL), drei Wasch-

schritte (W1, W2, W3), verschiedene Fraktionen des Eluats (E3, E5, E7,

E10, E13), das Eluat (E-P), das aufkonzentrierte Eluat (E-conc.) und der

Durchlauf der Vivaspin-Säule (DL-V.)

22

Abb.14: SDS-PAGE-Gel mit Silberfärbung von TRAP-H-Aufreinigung, auf-

getragen sind das Lysat der Bakterien, der Durchlauf (DL), drei Waschschrit-

te (W1, W2, W3), verschiedene Fraktionen des Eluats (E3, E5, E7, E10, E13),

das Eluat (E-P) und das aufkonzentrierte Eluat (E-conc.)

23

4.2.3 Western-Blot zur Identi�zierung von TRAP-H

Abb.15: Western Blot mit Proben der nicht induzierten TRAP-H-Bakterien

(n.ind.Bakterien), den Lysaten der TRAP-F und TRAP-H-Bakterien (Lysat

F, Lysat H), dem Durchlauf bei der Proteinaufreinigung (DL F, DL H), dem

jeweils fünften Eluat der Proteinaufreinigungen (E5 F, E5 H) und den auf-

konzentrierten Eluaten (TRAP F conc. und TRAP H conc.)

Die schwachen Banden bei den Proben von TRAP-F rühren daher, dass

der Film beim Entwickeln verrutscht ist.

24

5 Diskussion

5.1 Diskussion der Ergebnisse der Arbeiten mit den CHOs

5.1.1 Überprüfung der Plasmide

Die Banden auf dem Agarose-Gel mit den Ergebnissen der PCR lassen ver-

muten, dass diese nicht erfolgreich war. Es hätten sowohl für das Leerplasmid

als auch für das Plasmid, auf welches zusätzlich das genetische Material für

IL-35 eingefügt worden ist, jeweils drei Banden sichtbar sein müssen.

Auf dem Agarose-Gel mit den Ergebnissen des Restriktionsverdaus sieht

man deutlich, dass das IL-35-Plasmid in zwei DNA-Stücke gespaltet worden

ist, das Leerplasmid jedoch nicht. Die kleinere, weiter gewanderte und somit

leichtere Bande entspricht also der DNA für IL-35, die weniger weit gewan-

derte Bande und somit schwerere dem Leerplasmid. Damit ist bewiesen, dass

sich das Gen für IL-35 tatsächlich noch auf dem Plasmid be�ndet.

5.1.2 Transfektion

Die Negativkontrolle fungiert als Kontrolle um unspezi�sche Bindungen des

verwendeten Nachweisantikörpers zu anderen Strukturen der Zellen anzuzei-

gen. Bei den trans�zierten Zellen wurden nur geringfügig mehr Fluoreszenz

nachgewiesen als bei der Negativkontrolle und somit auch nicht viel mehr

Bindungen des Antikörpers gemessen. Das bedeutet dass entweder der Nach-

weis der Transfektion oder die Transfektion nicht erfolgreich war.

Die niedrige Transfektionsrate kann verschiedene Ursachen habe. Es kön-

nen beispielsweise Fehler bei der Durchführung der Transfektion aufgetreten

sein oder das Transfektionsmedium könnte nicht mehr funktioniert haben.

Die Zellen können auch aus verschiedenen Gründen nicht ausreichend kom-

petent gewesen sein für eine Transfektion.

25

5.2 Diskussion der Ergebnisse der Arbeiten mit den Bak-

terien

Auf dem mit Coomassie gefärbten SDS-PAGE-Gel, auf welches die Aliquots,

die vor und nach der Induzierung der Proteinproduktion in den TRAP-F-

Bakterien genommen worden sind, und die Proben des Probelysats aufgetra-

gen worden sind, ist deutlich die Produktion von TRAP-F nachvollziehbar,

da auf Höhe von 25 kDa sowohl in den Aliquots der Tag- und der Nachtkul-

tur und der Probe des Pellets des Probelysats eine deutliche Zunahme der

Bande sichtbar ist.

Während der Aufreinigung scheint TRAP-F jedoch verloren gegangen zu

sein, da auf dem nach der Aufreinigung hergestellten SDS-PAGE-Gel keine

Banden auf 25 kDa-Höhe zu entdecken sind. Der Verlust kann mit der schwe-

ren Löslichkeit des Proteins zusammenhängen, so dass es bei der Lyse der

Bakterien nicht freigesetzt worden ist. Es wäre interessant zu wissen, welches

Protein stattdessen aufgereinigt worden ist, da im konzentrierten Eluat auf

Höhe von 70 kDa eine deutliche Bande sichtbar ist.

Auf dem SDS-PAGE-Gel mit den Aliquots, die vor und nach der Induzie-

rung der Proteinproduktion in den TRAP-H-Bakterien genommen wurden,

ist nur auf dem zweiten angefertigten Gel im Pellet der Übernachtkultur die

70 kDa schwere Bande, im Verhältnis zu den anderen Banden, dicker ge-

worden. Dies lässt darauf schlieÿen, dass entweder kein TRAP-H hergestellt

wurde oder dieses im Verhältnis zu dem ansonsten in den Bakterienzellen

vorhandenen Protein nicht viel ausmacht.

Da auf dem nach der Proteinaufreinigung hergestellten SDS-PAGE-Gel

in der Probe des konzentrierten Eluats eine deutliche Bande in Höhe von 70

kDa sichtbar ist, könnte man davon ausgehen, dass es sich dabei um TRAP-H

handelt. Da sich allerdings auch auf dem nach der Aufreinigung von TRAP-F

hergestellten SDS-PAGE-Gel eine Bande in Höhe von 70 kDa be�ndet und

diese mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht von TRAP-H stammt, wäre auch

an der Identität des aufgereinigten TRAP-H zu zweifeln.

26

Gewissheit darüber konnte ein nach meiner Abreise angefertigter Western

Blot geben. Es wurde TRAP-spezi�sches Mausserum eingesetzt, welches nur

TRAP-H nachweist. Man sieht, dass TRAP-H bereits vor der Induzierung

der Proteingewinnung in den Bakterien zu �nden ist und dass das aufkon-

zentrierte Protein TRAP-H ist. Es bleibt unklar welches Protein an Stelle

von TRAP-F aufgereinigt wurde.

27

6 Fazit

Durch mein Praktikum habe ich weitere Einblicke in die Arbeit im Labor

und an einem Institut erhalten. Mein Bild eines durchaus interessanten und

abwechslungsreichen Berufs hat sich dadurch bestätigt. Besonders gefällt mir

an der Arbeit, dass es sich nicht um einen reinen Schreibtischjob handelt

und man vielfältige Tätigkeiten auszuführen hat, wie etwa Recherche zum

jeweiligen Thema, die Arbeit im Labor und die Verarbeitung der Ergebnisse.

Zudem wurde mir die Problematik der Verwendung von Mäusen und anderen

Tieren als Modellorganismen bewusster, da sie zwar für viele Experimente

unverzichtbar sind, aber man dennoch nicht vergessen darf dass es sich um

zu respektierende Lebewesen handelt.

In der Arbeitsgruppe wurde ich sehr freundlich aufgenommen und habe

am Anfang vor allem den Anderen über die Schulter geschaut, nach kurzer

Zeit habe ich aber unter der Betreuung von Dr. Susanne Tartz und Marthe

Janÿen mit den oben näher beschriebenen Arbeiten mit den CHOs und den

Bakterien begonnen. Während ich mit den CHOs und den Bakterien gearbei-

tet habe, wurden mir auch weiterhin allgemeine Arbeitstechniken vorgestellt,

die sonst noch in der Gruppe verwendet werden, wie etwa die Herstellung von

Gewebsschnitten mit dem Kryostat und ich konnte jederzeit überall Fragen

stellen, die mir immer mit sehr viel Mühe und Geduld erklärt wurden.

Mein Dank geht an PD Dr. Thomas Jacobs für die Organisation des

Praktikums und die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, sowie an die gesamte

Arbeitsgruppe, speziell Dr. Susanne Tartz und Marthe Janÿen, die sich die

meiste Zeit um mich gekümmert haben. Weiterhin geht mein Dank an den

Förderverein der Bioolympiade e.V. für die Finanzierung und Organisation

des Praktikums und speziell an Dennis Kappei, der von Seiten des Vereins

mein Praktikum und mich betreut hat.

28

Literatur

[1] Löscher, T.; Burchard, G.-D. (Hrsg.), Tropenmedizin in Klinik und Praxis,

Stuttgart, New York: Georg Thieme Verlag 20104.

[2] Wenk, P.; Renz, A., Parasitologie. Biologie der Humanparasiten, Stutt-

gart, New York: Georg Thieme Verlag 20036.

[3] Anleitung zur verwendeten Proteinaufreingungssäule:

tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/xprpur_man.pdf, letzter

Zugri� am 9.9.2010

29