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III - TESTES PARA A IDENTIFICAO DE AMINOCIDOS E PROTENAS
INTRODUO
Os -aminocidos fundamentais utilizados pelas clulas para a
biosntese das protenas apresentam caractersticas estruturais
diferentes. Em parte so essas diferenas que permitem que as
protenas desempenhem papis muito variados nos seres vivos.
Todos os -aminocidos fundamentais contm na sua estrutura um
grupo funcional amino e um grupo funcional cido carboxlico ligados
a um mesmo tomo de carbono, conhecido por carbono . Esses grupos
funcionais deixam de existir nesta forma quando os aminocidos so
ligados uns aos outros para originarem a molcula de uma protena
(ficando apenas um grupo amino na extremidade inicial da cadeia
polipeptdica e um grupo cido carboxlico na extremidade final). De
facto so substitudos pelos grupos peptdicos, que resultam do
estabelecimento das ligaes entre os resduos dos aminocidos, ou
seja, entre o que resta dos aminocidos na estrutura da protena.
Frmula geral de um aminocido
Ligao peptdica Exemplo de um tripeptdeo (AlaAlaAla), em que L =
-CH3
Os resduos dos -aminocidos diferem uns dos outros apenas na sua
cadeia lateral (L), tambm ligada ao carbono . As diferenas de
estrutura dessa cadeia lateral resultam em diferenas de certas
propriedades fsico-qumicas, que podem ser testadas de uma forma
simples. Como exemplos, podem referir-se os seguintes: (i) a
solubilidade em gua est relacionada com a hidrofilicidade e a
capacidade de estabelecimento de ligaes de hidrognio; (ii) a
deslocalizao electrnica, como a que se verifica nos anis aromticos
da tirosina e do triptofano, conduzem existncia de um mximo de
absoro da radiao electromagntica na regio do ultravioleta prximo
(mx ~ 280 nm) para estes aminocidos e para as protenas que os
contm; (iii) os grupos funcionais de natureza distinta que existem
nas cadeias laterais (por exemplo, grupo tiol na cistena ou grupo
indole no triptofano) permitem a sua identificao por meio de reaces
caractersticas que conduzam ao aparecimento de precipitados ou de
produtos corados.
OBJECTIVO DO TRABALHO O trabalho consiste na realizao de um
conjunto de testes simples de natureza variada,
que exploram as diferenas existentes entre as caractersticas
estruturais dos aminocidos, das protenas e de outras substncias.
Alguns destes testes tm aplicao na determinao quantitativa de
protenas em soluo aquosa.
Para concretizar o trabalho ser feita a identificao de um
conjunto de substncias slidas que so apresentadas em tubos
rotulados com as letras A, B, C, D, E, F, G, H, I e J e que
correspondem aos seguintes compostos biolgicos, no necessariamente
pela ordem indicada: glucose, glicina, cistena, cido asprtico,
lisina, arginina, tirosina, triptofano, prolina e albumina
srica.
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REAGENTES
Reagente para o teste do biureto (dissoluo de 1,5 g de CuSO45H2O
+ 6 g de NaKC4H4O64H2O tartarato duplo de sdio e potssio, sal de
Rochelle em cerca de 500 mL de gua, adio com agitao de 300 mL de
soluo de NaOH a 10% (p/v) e diluio a 1 L com gua destilada);
Reagente de Coomassie (dissoluo de 0,1 g de Azul Brilhante de
Coomassie G250 em 47,0 g de etanol, adio de 85,0 g de cido fosfrico
e diluio a 1 L com gua destilada);
Soluo de ninidrina a 2 % (p/v) em etanol a 95 % (v/v); cido
ntrico concentrado; Reagente de Millon (dissoluo de 15 g de sulfato
de mercrio (II) em 100 mL de cido
sulfrico a 15 % (v/v)); Soluo aquosa de nitrito de sdio a 1 %
(p/v) Reagente de Hopkin-Cole (colocao de 10 g de Mg em p num
Erlenmeyer, adio de
gua at cobrir o metal, adio com agitao de 250 mL de soluo aquosa
saturada de cido oxlico, filtrao, acidificao com cido actico diludo
e diluio a 1 L com gua destilada);
cido sulfrico concentrado; Soluo aquosa de acetato de chumbo 2
M; Soluo aquosa de hidrxido de sdio a 40 % (p/v); Soluo de -naftol
a 1 % (p/v) em etanol; gua de bromo. MATERIAL
tubos de ensaio 18 180 mm tubos de ensaio 16 160 mm banho de gua
a 100 C banho de gua-gelo cronmetro buretas e pipetas de diversos
volumes espectrofotmetro UV-Vis medidor de pH e elctrodos
TCNICA (resumo) 1) Escrever na folha de resultados as frmulas
qumicas estruturais para os aminocidos
glicina, cistena, cido asprtico, lisina, arginina, tirosina,
triptofano e prolina (para a forma predominante em soluo aquosa a
pH 7),
2) Realizar os ensaios descritos a seguir para as amostras A, B,
, J. Logo que identificar inequivocamente uma amostra, no realizar
mais ensaios para essa amostra,
3) Preencher uma tabela com os resultados dos ensaios,
4) Concluir sobre a identidade de cada uma das amostras A, B, ,
J.
ENSAIOS Observao prvia Alguns dos ensaios que envolvem adio de
cidos ou bases fortes, ou aquecimentos em banho de gua tm riscos de
projeco de lquidos que podem provocar queimaduras graves. Deve ter
cuidados adicionais na realizao desses ensaios (normalmente so
feitos nas hotes), usar sempre culos de proteco e confirmar que
algum prximo no corre tambm o risco de sofrer as consequncias de um
acidente.
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I Solubilidade em gua 1) Cada uma das amostras A, B,, J
apresentada num tubo contendo cerca de 10 mg da
substncia slida. 2) Transferir o contedo de cada tubo para um
tubo de ensaio 18 180 mm (seco),
previamente marcado com a letra correspondente amostra e
adicionar 15 mL de gua destilada.
3) Tentar dissolver o slido agitando suavemente.
4) Tomar nota do resultado de cada tentativa: dissoluo rpida
(+), dissoluo mais difcil () ou impossibilidade de dissoluo
(0).
5) Pipetar 0,5 mL de cada soluo para cada um de dez tubos de
ensaio 16 x 160 mm marcados com a letra correspondente amostra e
adicionar a cada um deles 9,5 mL de gua destilada. Homogeneizar
cada soluo por agitao. Estas novas solues, obtidas por diluio 1:20
a partir das solues anteriores, sero designadas por solues diludas
na descrio dos ensaios que se segue.
II pH da soluo aquosa As cadeias laterais de alguns aminocidos
possuem grupos funcionais com caractersticas
cidas (por exemplo, cidos asprtico e glutmico), isto , tm
tendncia para doar protes a molculas de gua em soluo aquosa; para
outros aminocidos (por exemplo, lisina e arginina) os grupos
funcionais das cadeias laterais comportam-se como bases, isto ,
captam protes fazendo com que o pH da soluo seja superior ao da
gua.
1) Medir o pH de cada uma das solues preparadas em I 2). Lavar o
elctrodo depois de cada medida;
2) Tomar nota do valor de pH medido para cada soluo.
III Absoro da radiao electromagntica a 280 nm O espectro de
absoro da radiao electromagntica para a tirosina, o triptofano e,
de uma forma geral as protenas (que contm estes aminocidos)
apresenta um mximo ao comprimento de onda de ~ 280 nm.
1) Ler a absorvncia da soluo amostra diluda ao comprimento de
onda de 280 nm.
2) Tomar nota do valor de absorvncia lido.
IV Teste do biureto As solues aquosas de compostos contendo duas
ou mais ligaes peptdicas (por
exemplo, protenas) do origem ao aparecimento de uma cor violeta
caracterstica quando tratadas com uma soluo diluda de sulfato de
cobre em meio alcalino. O nome do teste vem do composto biureto que
d uma reaco tipicamente positiva. A cor devida formao de um
complexo em que o io cobre se coordena a quatro tomos de azoto das
ligaes peptdicas.
O mtodo do biureto, um dos que se usam para a determinao
quantitativa de protenas (para concentraes finais de protena entre
0,1 e 2 gL1), tem como base o desenvolvimento de uma cor violeta em
soluo aquosa resultante da reaco da protena com o reagente
mencionado.
1) Colocar 1 mL da soluo amostra num tubo de ensaio, adicionar 1
mL do reagente para o teste do biureto e misturar bem.
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2) Observar o eventual aparecimento de uma cor distinta da cor
do reagente.
3) Caso no observe mudana, junte mais 1 mL do reagente para o
teste do biureto e voltar a misturar bem a soluo e a observar a
cor.
POSITIVO: Cor violeta.
H2NCNHCNH2 O O Biureto
| | O C C O \ / N(H) N(H) / \ CH CH | Cu2+ | O C C O \ / N(H)
N(H) / \ CH CH | |
V Teste de Bradford
A existncia de substncias corantes que mudam de cor por ligao a
determinados tipos de compostos em soluo aquosa permite, em certos
casos, a sua deteco e at mesmo a sua quantificao. O Azul Brilhante
de Coomassie G-250 um destes corantes; a sua ligao a uma protena em
meio cido conduz a uma variao no comprimento de onda do mximo de
absoro do corante de 465 nm para 595 nm com o consequente
aparecimento de um tom azulado na soluo avermelhada.
O mtodo de Bradford muito utilizado para a determinao
quantitativa de protenas em soluo aquosa numa gama de concentraes
cerca de cem vezes mais baixas do que o mtodo do biureto. 1)
Colocar num tubo de ensaio 2 mL de reagente de Coomassie. 2)
Adicionar 50 L da soluo amostra diluda ao tubo de ensaio que
contiver o reagente de
Coomassie e agitar suavemente. 3) Observar a eventual mudana de
cor da soluo.
POSITIVO: Aparecimento de uma tonalidade azulada.
VI Teste da ninidrina O teste da ninidrina um teste geral para
aminocidos, podendo ser usado de uma forma
qualitativa, em geral para detectar a presena de aminocidos em
meios de suporte para cromatografia ou electroforese (ver
Electroforese de Aminocidos), ou de uma forma quantitativa (por
exemplo, para dosear aminocidos aps separao cromatogrfica de
hidrolisados proteicos, na determinao da composio em aminocidos de
protenas). A reaco dos aminocidos com a ninidrina origina um
composto de cor azulada para todos eles com excepo da prolina, que
d origem a um composto de cor amarela.
Colocar 2 mL da soluo amostra num tubo de ensaio.
Adicionar 1 mL da soluo de ninidrina e agitar suavemente.
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No caso de no verificar a formao de um composto corado, aquecer
fervura num banho de gua durante 10 segundos (cuidado).
Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor.
POSITIVO: Cor azulada para aminocidos em geral; cor amarela para
prolina.
VII Reaco xantoproteica um teste para a tirosina e triptofano,
ou protenas que contenham estes aminocidos
baseado na reaco de nitrao dos anis aromticos pelo cido ntrico
concentrado. Colocar 2 mL da soluo amostra num tubo de ensaio.
Adicionar cuidadosamente 1 mL de cido ntrico concentrado. No caso
de no verificar a formao de um composto corado, aquecer fervura num
banho
de gua durante 2 minutos. Tomar nota do eventual aparecimento de
uma cor.
POSITIVO: Cor amarelada.
VIII Teste de Millon um teste para compostos contendo
monohidroxibenzeno (ou seja, com grupos fenlicos, como o caso da
tirosina).
Colocar 1 mL da soluo amostra num tubo de ensaio.
Adicionar 5 gotas do reagente de Millon e agitar com
cuidado.
Aquecer fervura num banho de gua durante 10 minutos
(cuidado!).
Arrefecer o tubo em gua corrente e adicionar 5 gotas da soluo de
nitrito de sdio.
Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor.
POSITIVO: Cor avermelhada.
IX Teste de Hopkin-Cole um teste para compostos contendo o grupo
indole (ex. triptofano), em que o reagente o cido glioxlico
(CHOCOOH) em cido sulfrico concentrado.
Colocar 3 mL da soluo amostra num tubo de ensaio.
Adicionar 1 mL do reagente de Hopkin-Cole e agitar (ateno, o
reagente contm H2SO4 bastante concentrado).
Adicionar cuidadosamente e lentamente uma pequena quantidade de
cido sulfrico concentrado, deixando-o escorrer pela parede interna
do tubo (que dever estar inclinado a 45), de modo que se formem
duas fases.
Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor na zona de juno
dos dois lquidos.
POSITIVO: Anel azulado.
X Teste de Sakaguchi um teste para compostos contendo o grupo
guanidilo (arginina).
Colocar 3 mL da soluo amostra num tubo de ensaio.
Adicionar 1 mL da soluo de hidrxido a 40 % (p/v) e agitar com
cuidado.
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Adicionar 2 gotas da soluo de -naftol e agitar com cuidado.
Adicionar 5 gotas de gua de bromo (na hote, o bromo txico).
Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor.
POSITIVO: Cor vermelha.
XI Teste do sulfureto de chumbo um teste para aminocidos
sulfurados (cistena) ou protenas que os contenham. Colocar 2 mL da
soluo amostra num tubo de ensaio. Adicionar 2 mL da soluo de
hidrxido de sdio a 40 % (p/v) e agitar com cuidado. Ferver em banho
de gua durante 2 minutos (cuidado com as projeces). Arrefecer o
tubo em gua corrente e depois num banho de gua e gelo. Adicionar 2
gotas da soluo de acetato de chumbo e agitar com cuidado. Tomar
nota do eventual aparecimento de um precipitado tnue.
POSITIVO: Cor acastanhada ou precipidato castanho tnue.
BIBLIOGRAFIA R.L.. Shriner, R.C. Fuson, D.Y. Curtin, T.C.
Morrill, The Systematic Identification of Organic Compounds A
Laboratory Manual, 6 ed. (ou outra) John Wiley & Sons, New
York, 1980. A.I. Vogel, A Text-Book of Practical Organic Chemistry,
including Qualitative Organic Analysis, 3 Ed., Longmans, London,
1966. C. Dickson, Medicinal Chemistry Laboratory Manual, CRC Press,
London, 1999
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TESTES PARA A IDENTIFICAO DE AMINOCIDOS E PROTENAS
FOLHA DE RESULTADOS
GRUPO: DATA: .............................. TURMA:
.................... Nome
....................................................................................
N ............................... Nome
....................................................................................
N ............................... Nome
....................................................................................
N ...............................
Escreva as frmulas qumicas estruturais para os aminocidos
utilizados como amostras (para a forma predominante em soluo aquosa
a pH 7). Glicina (Gly) Cistena (Cys) cido Asprtico (Asp) Lisina
(Lis) Arginina (Arg) Tirosina (Tyr) Triptofano (Trp) Prolina
(Pro)
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RESULTADOS DOS ENSAIOS
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
8
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Amostra
Identificao
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
Comentrios:
9
INTRODUOOBJECTIVO DO TRABALHOREAGENTESMATERIALTCNICA
(resumo)ENSAIOSII pH da soluo aquosa
III Absoro da radiao electromagntica a 280 nm
H2NCNHCNH2VII Reaco xantoproteicaBIBLIOGRAFIAGlicina (Gly)
Cistena (Cys) cido Asprtico (Asp) Lisina (Arginina (Arg) Tirosina
(Tyr) Triptofano (Trp) Prolina (Pro
RESULTADOS DOS ENSAIOS
ABCDEFGHIJIIIIIIIV
AmostraIdentificaoAB
