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Prática 7: Caracterização da -glicosidase (Km e Vmax)

Prática 8: Inibição por maltose (Ki)

Execução e recolhimento dos exercícios 11 a 13

Prática 7: Caracterização da -glicosidase (Km e Vmax) Prática 8: Inibição por maltose (Ki)

Cinética Enzimática e Inibição da Atividade Enzimática

Objetivos:

1. Estudar o efeito da [S] na velocidade da reação da -glicosidase contida no lisado de Saccharomyces cerevisiae.

2. Repetir o experimento 1 na presença de duas concentrações de um inibidor (maltose).

Cuidados com as concentrações das soluções e com os volumes pipetados!!!

O

O

CH2OH

NO2

O

CH2OH

O

O

CH2OH

-glicosidase Glicose + HO NO2

p-nitro-fenol

Abs em 420 nm em meio alcalino

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Cinética Enzimática

Ferramenta para a compreensão do mecanismo de ação de enzimas

Qual o principal parâmetro avaliado em uma cinética enzimática ???

VELOCIDADE da REAÇÃO

“Cinética enzimática estuda a velocidade da reação enzimática e como ela se altera em função de mudanças

nos parâmetros experimentais”

O primeiro passo é determinar a VELOCIDADE INICIAL (V0)

Inclinação = P/ t = V0

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Velocidade da reação de muitas enzimas varia em funçao da concentração de substrato, [S], segundo uma hipérbole

(semelhante à curva de saturação de O2 da mioglobina)

V0

[S]

Vmáx

Mantendo-se a [E] fixa e aumentando [S]:

ES E S

k1

k-1

k2

k-2

E + S ES E + P

Passo determinante da velocidade

Como explicar esse comportamento matematicamente??

[S]>>>Km

Ordem zero em

relação ao substrato

[S]<<<Km

Primeira ordem em

relação ao substrato

Mista

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Dedução da Equação de Michaelis & Mentem Pág. 196, Lenhinger, 5 ed.

Vo: velocidade no tempo inicial quando a [S] >>> [E] Vmax: V máximo [S]: concentração do substrato Km: constante de Michaelis

Simplificações para a dedução da Equação de Michaelis & Mentem

1. Com relação às velocidade de formação e quebra do complexo ES

- E + S ⇌ ES: a etapa de formação do complexo é reversível e relativamente rápida

- ES ⇌ E + P: a etapa de quebra do complexo ES é LENTA!(etapa determinante da velocidade da reação)

2. Com relação à concentração de E, S, ES e P.

- A enzima pode existir em duas formas, livre ou complexada ao substrato. Portanto: [ETotal]=[ELivre]+[ES]

- Normalmente [S]>>>[ETotal], portanto a quantidade de S ligada à enzima é insignificante: [SLivre]=[STotal]

- Para baixo consumo de S (menos que 5 %) a [P] (produto) é muito baixa. Assim, as etapas reversas a partir de P podem ser ignoradas (k-2 pode ser ignorado!)

- Com exceção à fase inicial da reação (estado pré-estacionário, alguns microsegundos após a mistura de E+S), a [ES] se mantém constante até que todo o substrato seja consumido (estado estacionário). No estado estacionário, a velocidade de formação de ES deve ser igual à velocidade de quebra de ES.

k1

k-1

k2

k-2

E + S ES E + P

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Quando a enzima é misturada com um grande excesso de substrato, há um período inicial chamado de pré-estacionário em que a concentração de ES aumenta. Normalmente este período é muito curto (microsegundos) e a reação atinge um estado chamado de ESTADO ESTACIONÁRIO no qual [ES] permanece constante ao longo do tempo. A determinação de vo (velocidade inicial) reflete esse estado estacionário. A análise de vo é denominada Cinética do Estado Estacionário.

Cinética do Estado Estacionário é a base para a dedução da equação de Michaelis e Menten

Dedução da Equação de Michaelis & Mentem Pág. 196, Lenhinger, 5 ed.

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V 0

[S]

[E]

2[E]

0.5[E]

Velocidade varia proporcionalmente com a concentração de enzima. Em qualquer concentração de S, v0=c[E] (dobrando-se E, dobra-se v0)

Equação de Michaelis-Menten

Somente quando k2 muito pequeno o valor de Km indica a afinidade da enzima pelo substrato

[S] <<< Km V0= Vmax [S] Km

[S] >>>Km V0= Vmax

(Reação de 1ª ordem em S)

(Reação de ordem Zero em S)

V0= Vmax

2

Vmax = Vmax[S]

2 Km + [S]

Km=[S] Km= k-1 + k2

k1

Km= k-1 = KES

k1

KES ou Ks =

constante de

dissociação de

ES

Se k2 muito pequeno:

k1

k-1

k2

E + S ES E + P

vmax= k2 [ETotal] No Vmax “toda” a enzima está saturada com S. Portanto [ETotal]=[ES]

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LINEARIZAÇÃO da Equação de Michaelis-Menten para determinação de Km e Vmax

Vo: velocidade no tempo inicial quando a [S] >>> [E] Vmax: V máximo [S]: concentração do substrato Km: constante de Michaelis

Transformação da equação de Michaelis e Mentem

Gráfico do Duplo-Recíproco (Equação de Lineweaver- Burk)

y = a·x + b

Km

• KM = [S] quando vo = 1/2 Vmax .

• Em geral, quanto menor o KM, mais forte é ligação do substrato pela enzima.

• KM é usado como uma medida da “afinidade” da enzima pelo substrato

Lembrar que: Km= k-1 + k2

k1

Km= k-1 = KES

k1

Portanto, somente quando k2 muito pequeno:

(unidade: Molar, mM, M, etc.)

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Turnover Number (número de renovação)

“ No de moléculas de substrato convertidos em produto em uma unidade de tempo por uma única enzima saturada com o substrato”.

kcat = k da etapa limitante kcat = k quando a enzima está saturada com substrato kcat = velocidade máxima de conversão de substrato kcat = Vmax/[E]t

kcat

Obs.: kcat não é a melhor maneira de comparar a eficiência catalítica pois essas constantes são válidas para concentrações saturantes de substrato (não fisiológica). Em geral as enzimas trabalham em condições não saturantes de substrato (importante para a regulação)

(S-1)

kcat/Km

Medida da Eficiência Catalítica (“Perfeição Catalítica”)

Existe um limite máximo para esta constante que é determinada pelo limite de difusão max. 108-109 . Enzimas com kcat/Km>108 diz-se que a enzima atingiu a perfeição catalítica.

(Constante de Especificidade)

(M-1S-1)

Quando S<<Km:

Kcat/Km: É uma medida do quão rápido 2 moléculas (E + S) podem reagir.

Quanto maior o valor melhor é a eficiência catalítica da enzima

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INIBIÇÃO ENZIMÁTICA

Enzimas estão sujeitas à inibição

1. Importância Farmacêutica do estudo da inibição enzimática

Inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catálise, diminuindo ou acelerando a velocidade da reação… esse é o mecanismo de ação da grande maioria de agentes farmacêuticos.

2. Classificação:

1) Inibição Reversível: Inibição Competitiva

Inibição Acompetitiva

Inibicação Não-Competitiva

Inibição Mista

2) Inibição Irreversível

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Medicamentos que são inibidores de enzimas:

-Viagra (sildenafil), Pfizer -Cialis, Eli Lily -Levitra, Bayer e Glaxo-Smith

[Ca2+]

Relaxamento da células musculares lisas

Inibidores da Fosfodiesterase

(PDE5)

Medicamentos que são inibidores de enzimas:

-Vioxx , Merck (tirado do mercado em 2004 devido a incidência de problemas cardiovasculares; causando a morte de app. 60000 pessoas no mundo)

-Celebra, Pfizer

Inibidores específicos da

COX-2

Anti-inflamatórios não-esteroidais:

Rofecoxib (Vioxx) Celecoxib (Celebra)

Fonte: http://publications.nigms.nih.gov/structlife/chapter4.html

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Medicamentos que são inibidores de enzimas:

Inibidores da síntese do colesterol:

-Estatinas

Atorvastatin (Liptor)

Lovastatin (Mevacor)

Inibidores da HMG-CoA Redutase

Fonte: Science 11 May 2001: Vol. 292 no. 5519 pp. 1160-1164 DOI: 10.1126/science.1059344

Enzimas estão sujeitas à inibição

1. Importância Farmacêutica do estudo da inibição enzimática

Inibidores enzimáticos são agentes moleculares que interferem na catálise, diminuindo ou acelerando a velocidade da reação… esse é o mecanismo de ação da grande maioria de agentes farmacêuticos.

2. Classificação:

1) Inibição Reversível: Inibição Competitiva

Inibição Acompetitiva

Inibicação Não-Competitiva

Inibição Mista

2) Inibição Irreversível

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Inibidorse liga no

mesmo sítio ativo

que o substrato

Sítios diferentes de ligação

“ reação para”

Inibidor liga-se a enzima em um sítio diferente a do sítio ativo do substrato.

Inibição Competitiva

Inibição Acompetitiva

Ki: constante de dissociação do inibidor Qto < Ki, mais potente é a inibição.

Ki=Ki’ KEI=KESI

Inibição Não-Competitiva

Ki≠Ki’ KEI ≠ KESI

Inibição Mista

Ki KEI

[E][I]

[EI]==

Ki’ KESI

[ES][I]

[ESI]==

Inibição competitiva

Inibidor compete com o substrato pelo sítio ativo e portanto o aumento da concentração do substrato pode deslocar o inibidor. Portanto Vmax não se altera.

Assim em concentrações crescentes de [I]: 1. Vmax → não se altera 2. Km aparente → aumenta 3. Slope → aumenta

Ex.: Metanol/Etanol (Semelhança estrutural!)

= 1 + [I]

Ki

Vo = Vmax [S]

Km + [S]

Ki=KEI

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Inibição Acompetitiva

Inibidor se liga-se ao complexo ES, em um sítio diferente a do sítio ativo do substrato.

Portanto um aumento na [S] não reverte a inibição. A ligação do inibidor remove uma fração de ES.

I diminui Vmax aparente (aparentemente diminui [Et]) e Km aparente (aparentemente aumenta a afinidade de E e S)

Assim em concentrações crescentes de [I]: 1. Vmax aparente → diminui 2. Km aparente → diminui 3. Slope → não altera

‘= 1 + [I]

Ki’

Vo = Vmax [S]

Km + ’[S]

Ki’=KESI

Inibição Mista

Inibidor liga-se a um sítio diferente do sítio ativo, bloqueando tanto E como ES.

Portanto afeta tanto o Km como Vmax. Assim em concentrações crescentes de [I]: 1. Vmax aparente→ diminui 2. Km aparente → aumenta ou diminui 3. Slope → aumenta ou diminui

‘= 1 + [I]

Ki’

Vo = Vmax [S]

Km + ’[S]

= 1 + [I]

Ki

Ki≠Ki` KEI ≠ KESI

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Inibição Não-competitiva

Inibidor liga-se a um sítio diferente do sítio ativo, bloqueando tanto E como ES.

Portanto afeta tanto o Km como Vmax. Assim em concentrações crescentes de [I]: 1. Vmax aparente → diminui 2. Km aparente → não altera 3. Slope → aumenta

‘= 1 + [I]

Ki’

Vo = Vmax [S]

Km + ’[S]

= 1 + [I]

Ki

Ki=Ki` KEI=KESI

Km’

[I]

ou

Slope

-Ki

Competitivo

[I]

1/Vmax’

-Ki

Acompetitivo

[I]

1/Vmax’

-Ki ou -KEI (se y =inclinação)

Mista

[I]

1/Vmax’

-Ki = - KEI=-KESI

Não competitiva

ou

Slope

ou

Slope

Determinação do Ki

-Ki’ ou -KESI (se y =slope)

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Inibição Irreversível Inibidores irreversíveis combinam-se com um grupo funcional na molécula da enzima ou o destroem ou ainda formam uma associação covalente bastante estável. (INATIVADOR SUICIDA)

São úteis como ferramentas no estudo de mecanismo de reação, principalmente para a identificação de aminoácidos importantes para a catálise no sítio ativo.

Quimotripsina

Diisopropylfluorophosphate Forma permanentemente inativa

Cinética de inibição similar ao inibidor não-competitivo (Vmáx diminui, Km não se altera). O Inibidor diminui a concentração efetiva de enzima livre.