PRAVEGA KOSTANJA (Castanea sativa Mill.) · Pravi kostanj (Castanea sativa) je lesnata rastlina, ki se težje razmnožuje tako generativno s semenom kot vegetativno s cepljenjem ali

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE

Marko VIHER

MOŽNOSTI MIKROPROPAGACIJE

PRAVEGA KOSTANJA (Castanea sativa Mill.)

DIPLOMSKO DELO

Maribor 2016

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KMETIJSTVO IN BIOSISTEMSKE VEDE

KMETIJSTVO

Marko VIHER

MOŽNOSTI MIKROPROPAGACIJE

PRAVEGA KOSTANJA (Castanea sativa Mill.)

DIPLOMSKO DELO

Maribor 2016

POPRAVKI:

Viher M. Možnosti mikropropagacije pravega kostanja (Castanea sativa Mill.).

Dipl. delo. Maribor, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kmetijstvo in biosistemske vede, 2016

III

Komisijo za zagovor in oceno diplomskega dela sestavljajo:

Predsednik: red. prof. dr. Anton Ivančič

Mentorica: izr. prof. dr. Metka Šiško

Član: doc. dr. Andrej Šušek

Lektor: Bernardka Viher prof.

Diplomsko delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Datum zagovora: 2016



IV

Možnosti mikropropagacije pravega kostanja (Castanea sativa Mill.)

UDK:

Pravi kostanj (Castanea sativa) je lesnata rastlina, ki se težje razmnožuje tako generativno s semenom kot

vegetativno s cepljenjem ali potaknjenci. Uspešno razmnoževanje v in vitro razmerah pa je odvisno od

matičnih rastlin, sterilizacije, sestave gojišč, natančnosti in pogojev gojenja. V poskus mikropropagacije so bili

vključeni 3 genotipi (G1, G2 in G3) iz območja Kozjaka. Za sterilizacijo brstov smo uporabili 6 metod, od

katerih se je kot najboljša izkazala sterilizacija s 3 % dikloroizocinaurično kislino (DICA) (72 % sterilnih in

vitalnih brstov). Primerjava sterilizacije odprtih in zaprtih brstov je pokazala, da so se bolje sterilizirali zaprti

brsti, medtem ko so po uspešni sterilizaciji bolje odgnali odprti brsti. Genotip ni imel večjega vpliva na

uspešnost sterilizacije. Dodatek askorbinske kisline v gojišče ni imel pozitivnega učinka na rast kulture.

Najuspešnejše gojišče za rast poganjkov pa je bilo MS-NO3 i.

Ključne besede: mikropropagacija/ pravi kostanj/ Castanea sativa/ tkivne kulture/ in vitro

OP: VII, 54 s., 5 pregl., 7 graf., 57 ref.

In vitro propagation of european chesnut (Castanea sativa Mill.)

Chestnut is a woody plant, known by its difficulties to propagate either generatively with seeds or vegetatively

with cuttings or grafting. Successful in vitro propagation depends on mother plants, sterilization, media

composition, precision of the propagator and growing conditions. We in vitro propagated 3 genotypes (G1, G2

and G3) from Kozjak area. We tested 6 different methods of bud sterilization to determine the optimal process

which was sterilization with 3% dichloroisocyanuric acid (DICA) (72% sterile and vital buds). When we

compared sterilization of opened and closed buds, the latter proved to be more successful whereas subsequent

growth was better on opened buds. Genotype did not have any significant influence on sterilization. Addition

of ascorbic acid in medium did not have any positive influence on the growth of the culture. The best medium

for shoot growth was MS-NO3 i.

Key words: micropropagation/ European chestnut/ Castanea sativa/ tissue culture/ in vitro

propagation

NO: VII, 54 P., 5 Tab., 7 Graph, 57 Ref.



V

Kazalo vsebine

1 UVOD ............................................................................................................................ 1

1.1 Namen in cilj diplomskega dela .............................................................................. 3

2 PREGLED OBJAV ..................................................................................................... 5

2.1 Botanična klasifikacija ............................................................................................ 5

2.2 Kultivarji pravega kostanja, ki so selekcionirani v okrasne namene .............. 7

2.3 Opisi nekaterih kultivarjev pravega kostanja, selekcioniranih zaradi uporabe

plodov (debelo plodne sorte) ........................................................................................... 9

2.4 Razširjenost ........................................................................................................... 9

2.5 Uporaba kostanjev .............................................................................................. 10

2.6 Razmnoževanje pravega kostanja ..................................................................... 12

2.6.1 Setev kostanja ................................................................................................ 12

2.6.2 Razmnoževanje s potaknjenci ....................................................................... 13

2.6.3 Cepljenje ........................................................................................................ 14

2.6.4 Vegetativno razmnoževanje in vitro .............................................................. 16

2.6.5 Razmnoževanje pravega kostanja v tkivni kulturi – mikropropagacija ........ 22

3 MATERIALI IN METODE DELA ......................................................................... 27

3.1 Izvorni rastlinski material .................................................................................. 27

3.2 Potek raziskave ................................................................................................... 27

3.3 Priprava brstov in poganjkov ............................................................................ 28

3.4 Sterilizacija brstov .............................................................................................. 28

3.4.1 Sterilizacija z dikloroizocinaurično kislino ................................................... 30

3.4.2 Sterilizacija z alkoholom in natrijevim hipokloritom .................................... 30



VI

3.4.3 Sterilizacija s Spitadermom in natrijevim hipokloritom ............................... 30

3.4.4 Sterilizacija s kalcijevim hipokloritom .......................................................... 31

3.4.5 Sterilizacija z OXYL-PRO™ ........................................................................ 31

3.5 Sestava gojišč in priprava gojišč ........................................................................ 31

3.6 Inokulacija brstov in poganjkov ........................................................................ 34

3.7 Subkultivacija poganjkov ................................................................................... 34

3.8 Negativni pojavi .................................................................................................. 35

3.9 Gojenje ................................................................................................................. 36

3.10 Bonitiranje in obdelava podatkov ..................................................................... 36

4 REZULTATI Z RAZPRAVO .................................................................................. 37

4.1 Vpliv različnih načinov razkuževanja na uspešno vzpostavljeno kulturo ..... 37

4.2 Vpliv genotipa na uspešno vzpostavljeno kulturo ........................................... 38

4.3 Vpliv sestave gojišča na uspešno vzpostavljeno kulturo izsečkov .................. 40

4.4 Vpliv tipa brstov na uspešnost sterilizacije ...................................................... 41

4.5 Vpliv tipa brstov na uspešnost rasti .................................................................. 42

4.6 Vpliv različnih gojišč in tipa brstov na uspešnost mikropropagacije ............ 43

5 SKLEPI ...................................................................................................................... 46

6 VIRI ............................................................................................................................ 48

7 ZAHVALA ................................................................................................................... 1

8 PRILOGE ..................................................................................................................... 2



VII

Kazalo preglednic

Preglednica 1: Poimenovanja vrst kostanjev ......................................................................... 6

Preglednica 2: Načini sterilizacije in uporabljena sredstva, ki smo jih preizkusili. ............ 29

Preglednica 3: Sestava gojišč uporabljenih v raziskavi. ...................................................... 32

Preglednica 4: Odstotek uspešno steriliziranih izsečkov treh genotipov kostanja glede na

uporabljeno metodo sterilizacije .......................................................................................... 37

Preglednica 5: Pregled deležev izsečkov na posameznih gojiščih. ..................................... 45

Kazalo grafikonov

Grafikon 1: Odstotki preživelih izsečkov pri različnih sterilizacijah. ................................. 38

Grafikon 2: Odstotek okuženih, odmrlih in preživelih izsečkov pri posameznih genotipih.

............................................................................................................................................. 39

Grafikon 3: Uspešno sterilizirane rastline treh genotipov po šestih metodah sterilizacije. . 40

Grafikon 4: Vpliv dodane askorbinske kisline na uspešnost preživetja izsečkov pri treh

obravnavanjih. ..................................................................................................................... 41

Grafikon 5: Odprti in zaprti brsti različnih genotipov pri različnih metodah sterilizacije .. 42

Grafikon 6: Odprti in zaprti brsti pri različnih genotipih in različnih sterilizacijah. Odstotek

odgnanih izsečkov v primerjavi z neodgnanimi. ................................................................. 43

Grafikon 7: Deleži odgnanih, okuženih ter živih in mrtvih neodgnanih izsečkov pri različnih

gojiščih in odprtih ali zaprtih brstih. .................................................................................... 44



1

1 UVOD

Pravi kostanj (Castanea sativa Mill.) spada v družino bukovk (Fagaceae). Ime Castanea je

povzeto po grškem kraju z imenom Castania (Roloff 1996 in Stearn 2002).

Predstavlja pomembno drevesno vrsto, ki jo cenimo in uporabljamo zaradi kvalitetnega lesa,

cvetenja in kostanjevega medu, ki je zelo zdravilen. Predvsem v preteklosti, kakor tudi

danes, pa je pravi kostanj pomemben zaradi semena, ki ga imenujemo kostanj. V preteklosti

je nadomeščal krompir, saj ima visoko hranilno vrednost in se dobro skladišči vse do aprila

(de Belder 1997). Tako tudi v naših krajih najdemo obilo receptov za uporabo kostanjev v

kulinariki (Kerler 1984). Nekoč so kostanje nabirali v naravi, danes pa se sadijo nasadi

vegetativno razmnoženih sort z debelimi plodovi.

V višino zraste do 35 m visoko in ima lahko 3 m debelo deblo. Je listopadno drevo z

mogočno in široko krošnjo. Na prostem rastoča drevesa so vejnata skoraj do tal in so lahko

večdebelna. Skorja ne deblu je v mladosti gladka, pozneje se v njej pojavijo globoke,

spiralno potekajoče vzdolžne razpoke. Mladi poganjki so goli, rjavkasti ali rdečkasti in

posuti z lenticelami; pri prečno prerezani vejici opazimo značilen peterokoten stržen. Brsti

so jajčasti, rdečkasti in bleščeči. Značilni so enostavni listi, ki so premenjalno razporejeni,

10-30 cm dolgi, zgoraj temno zeleni in gladki, spodaj svetlejši, jajčasto suličasti. Bočne žile

so vtisnjene v listno ploskev in se končujejo z izrazito konico na listnem robu. Cvetovi obeh

spolov rastejo na skupni, 10-30 cm dolgi pokončni osi; moški cvetovi so v skupinah po 3 ali

več razporejeni skoraj po vsej njeni dolžini, ženski pa le v spodnjem delu. Pri moškem cvetu

je najbolj opaznih 8-12 rumeno belih prašnikov, ženski cvetovi so razviti posamezno ali

največ trije skupaj v ovoju oz. kapsuli, iz katere se pozneje razvije bodeča ježica. Vsak cvet

ima tridelno, redko do šestdelno plodnico. Bleščeče rjavi orehi, imenovani kostanji, imajo

na koncu značilen repek, ki je ostanek cvetnega odevala. Soplodje kostanja je obdano z



2

bodečo ježico, ki se odpre s štirimi loputami; v ježici najdemo od enega do tri kostanje.

Plodovi dozorijo in odpadejo oktobra.

Kostanj je enodomna, večinoma žužkocvetna vrsta, vendar se oprašuje tudi z vetrom. Cveti

pozno, šele konec junija ali v začetku julija.

Za rast potrebuje globoka, rahla, zmerno vlažna, humozna, s kalijem bogata, peščeno glinena

tla. Je ena najbolj kislo ljubih drevesnih vrst in uspeva na nekarbonatni matični podlagi. Na

apnencu raste le, kadar je ta prekrit s plastjo kisle prsti. Potrebuje veliko toplote. Rad ima

topla, a ne preveč sušna poletja in za zorenje plodov toplo, suho jesen. Slano slabo prenaša,

ustreza mu mila zima, enakomerno razporejene padavine, zmerna zračna vlaga in tople

zavetne lege na višini med 300 in 700 m nad morjem. Na toplih rastiščih prenese polsenco,

na hladnejših pa potrebuje več svetlobe.

Gliva (Cryphonectria parasitica (Murrill) Barr), ki povzroča kostanjev rak, je zelo nevarna.

Prvotno je bila razširjena kot parazit na Kitajskem in Japonskem na sorodnikih evropskega

pravega kostanja in ni povzročala velike škode. Leta 1904 se je pojavila na

severnoameriškem kostanju (Castanea dentata Borkh.) in je tam uničila velike površine

kostanjevih gozdov. V Italiji so bolezen opazili leta 1938, od tam se je razširila po vsej

Evropi in leta 1950 zajela tudi Slovenijo. Površine kostanjevih gozdov pri nas so se

zmanjšale za več kot polovico. V novejšem času so odkrili pojav hipovirulence ˗ virus

povzroča, da postane gliva, ki povzroča kostanjev rak, nenevarna (Kotar in Brus 1999, Allen

in sod. 2004, Bazzigher in sod. 1982, Bazzigher 1981, Bissegger in sod. 1997). Upanje je,

da se bo trend upadanja kostanjeve populacije zmanjšal in se bo v gozdovih in gajih ponovno

pojavil v večjem številu. Gliva (Phytophthroa cambivora (Petri) Buisman) povzroča

črnilovko, ki je razširjena v južni Evropi. Ta bolezen povzroča trohnenje debel, krošnje,

rjavenje mladih poganjkov in listov.



3

Kostanjeva šiškarica (Dryocosmus kuriphilus Yasumatsu) je škodljivec, ki prihaja iz

Kitajske in so ga v Sloveniji prvič opazili leta 2004. Škodljivec ogroža zlasti mlada drevesa

kostanja, ki lahko na močneje infestiranem območju propadejo, veliko škodo pa dela v

gojenih nasadih za pridelavo plodov kostanja (maronov). Povzroča tvorbo šišk na poganjkih,

pri osnovi moških socvetjih in na debelejših listnih žilah različnih vrst pravega kostanja.

Razmnožuje se partenogenetsko, se pravi brez oploditve, pri čemer je vse potomstvo

ženskega spola (Seljak 2016). Kemično zatiranje škodljivca z insekticidi je precej

neuspešno. Poganjke in veje s šiškami porežemo in jih čim prej uničimo še preden začnejo

izletavati osice. Ko se škodljivec ustali in ga z fitosanitarnimi ukrepi ni več mogoče

obvladovati, je mogoče zmanjševati škodo z vnosom naravnih sovražnikov kostanjeve

šiškarice. Za zdaj se je pri tem najbolje obnesla parazitoidna osica Torymus sinensis

(Hymenoptera: Torymidae). Samica parazitoida paralizira gostiteljsko ličinko med

odlaganjem jajčec (Murakami in Tokuhisa, 1985).

1.1 Namen in cilj diplomskega dela

Pravi kostanj spada med lesnate vrste, ki jih težje razmnožujemo tako generativno kot

vegetativno s potaknjenci ali cepljenjem. Z vegetativnim razmnoževanjem ohranjamo želeni

genotip, zato je ta način uveljavljen pri vzgoji sort. Vegetativno razmnožujemo

selekcionirane sorte, ki so namenjene proizvodnji lesa ali plodov, ali pa jih na vrtove in parke

sadimo zaradi okrasne vrednosti. Potaknjenci pravega kostanja v naravnih razmerah zelo

težko koreninijo. Kljub temu, da so potaknjenci morfološko mladi (običajno enoletni oz.

dvoletni les) so fiziološko stari in je koreninjenje zato oteženo. S tehnikami tkivnih kultur

lahko fiziološko stari material zelo uspešno pomladimo.

Cilj naloge je bil rastlinski material, nabran v naravi, uspešno sterilizirati in prenesti in vitro

razmere. Ugotoviti smo želeli najuspešnejše metode površinske sterilizacije ter optimizirati

gojišča za iniciacijo tkivnih kultur. Pri nekaterih lesnatih vrstah, katerih drevesa so stara več

deset let, lahko razmnoževanje predstavlja velik problem. Med temi vrstami je tudi kostanj.



4

Rastline razmnožene v tkivni kulturi so po starosti enake generativnim potomcem. Ker pa je

kostanj tujeprašna rastlina, preko semena ne moremo popolnoma ohraniti želenega genotipa.

Uspešna mikropropagacija kostanja bi bila lahko ena od metod vegetativnega

razmnoževanja želenih genotipov. V in vitro razmerah je mogoče ohranjati zanimive

genotipe za namene ohranjanja genetske pestrosti. Mikropropagacija lahko predstavlja

uspešen in hiter način razmnoževanja genotipov, ki bi bili namenjeni za proizvodnjo.

Uspešne metode mikropropagacije pa lahko predstavljajo tudi osnovo za raziskave

genotipov s potencialno odpornostjo oz. tolerantnostjo na kostanjev rak.



5

2 PREGLED OBJAV

2.1 Botanična klasifikacija

Botanična klasifikacija pravega kostanja po Barrett (1995) je sledeča:

Cesarstvo: Eucaryota – evkarionti

Kraljestvo: Plantae – rastline

Podkraljestvo: Tracheobionta

Deblo: Spermatophyta – semenke

Poddeblo: Magnoliophyta (Angiospermae) – kritosemenke

Razred: Magnoliopsida (Dicotyledoneae) – dvokaličnice

Podrazred: Hamamelididae

Nadred: Trochodendranae

Red: Fagales – bukovci

Družina: Fagaceae – bukovke

Rod: Castanea Mill.



6

Preglednica 1: Poimenovanja vrst kostanjev (Hieke 1994, Erhardt in sod. 2002,

Anagnostakis 2016)

Botanično ime Sinonimi Slovensko ime Angleško ime

SEKCIJA Castanea (3 kostanji v ježici)

C. alnifolia Nutt. C. nana Ell.,

C. nana Muhl.

jelševo listni

kostanj

Bush Chinquapin

C. crenata Sieb.et Zucc. C. japonica Bl. japonski kostanj Japanese Chestnut

C. dentata (Marsh.) Borkh. C. americana (Michx.) Raf. ameriški kostanj American Chestnut

C. molissima Bl. C. bungeana Bl.

C. duclouxii Dode

C. hupehensis Dode

kitajski kostanj Chinese Chestnut

C. sativa Mill. C. vesca Gaertn.

C. vulgaris Lam.

pravi kostanj European Chestnut,

Spanish Chestnut,

Sweet Chestnut

C. seguinii Dode C. davidii Dode kitajski pritlikavi

kostanj

Chinese Dwarf

Chestnut

SEKCIJA Balanocastanon (1 kostanj v ježici)

C. pumila (L.) Mill. C. floridana (Sarg) Ashe.

C. ashei (Sudw.) Sudw.

Allegheny Chinquapin

C. ozarkensis Ashe. C. arkansana Ashe Ozark Chinquapin

SEKCIJA Hypocastanon (1 kostanj v ježici)

C. henryi (Skan) Rehd. et. Wils C. fargesii Dode

C. vilmoriniana Dode

Henrijev kostanj Chinese Timber

Chinquapin, Henry

Chinquapin



7

2.2 Kultivarji pravega kostanja, ki so selekcionirani v okrasne namene

'Albomarginata' ima bleščeče temno zelene liste, ki so belo obrobljeni in se jeseni obarvajo

rumeno (RHS 2016). Sinonima 'Argenteomarginata' in 'Argenteovariegata' (Hoffman 2000).

'Anny's Summer Red' je rdečelistni pravi kostanj, ki je selekcija Andréje van Nijnatten iz

Nizozemske in je bila najdena kot sejanec in bila uvedena na tržišče leta 1991. Sorta ima

izstopajoče rdečkasto rjavo obarvane mlade liste (Praskac 2015). Zraste v manjše drevo

(Nijnatten 1997).

'Argenteovariegata' je pisanolistna sorta, ki je bila odkrita leta 1864. Listi so nekoliko

deformirani in ob robu enakomerno, belo rumeno pisani v intenzivni rumeni barvi. Občasno

v celoti beli ali pa se povrnejo v zeleno barvo (Ilsing 1994). Zelo dekorativna sorta, ki je

pogosto zastopana na tržišču.

'Asplenifolia' (sin. 'Comptoniifolia', 'Heterophylla', 'Laciniata', 'Salicifolia') je bila odkrita

še pred letom 1838. Značilnost sorte so različno oblikovani listi, ki imajo globlje narezani

listni rob ali pa so listi ozki, le 12 mm široki, kakršni se pojavijo na poletnih poganjkih. Sorta

je verjetno nastala kot mutacija. Od tod tudi izvira, da se vrača v prvotno obliko z normalno

razvitimi listi kot navaja Hillier (1994).

'Aureomaculata' se od cv. Argenteovariegata razlikuje po obarvanosti listov, ki imajo po

sredini širše rumene proge, sicer pa so še rumeno ali zelenkasto belo pisani (Krüssmann

1976). Poznana je od leta 1862.

'Cochleata' je kultivar pritlikave rasti in manjših listov. Listi so na poganjku bolj gosto

skupaj rastoči in školjkasto izbočeni ali valoviti. Listni rob je neenakomeren. Sinonima sta

'Bullata' in 'Monstrosa'.

'Crispa' je listna forma, ki ima globoko narezan listni rob (Michielsen 2002).

'Fastigiata' je ozko stebričasta sorta.

'Glabra' je leta 1836 uvedena sorta z velikimi, bleščečimi, temno zeleno obarvanimi listi.

Zraste v veliko drevo s široko krošnjo. Že kot mlada rastline začne obilno roditi (Ilsink

1994).



8

'Horizontalis' je sorta s horizontalno rastočimi poganjki.

'Laciniata' ima listni rob bolj globoko nazobčan, tako da izgledajo zobci kot niti. Z ozkimi

listi zgleda povsem drugače od vrste. Razlikuje se od cv. Asplenifolia (de Belder 1994).

'Pendula' ima poganjke dežnikasto upognjene in povešene navzdol. Obstajata dva klona s

tem imenom. Na Nizozemskem je bil odkrit okrog leta 1943, na Japonskem pa okrog leta

1919.

'Pendulifolia' ima liste viseče navpično navzdol. Listi so daljši kot pri osnovni vrsti in

zrastejo od 20 do 30 cm.

'Prolifera' je običajne rasti. Listi pa so veliki, dolgi in ozki. Na zgornji strani so bleščeči,

nekoliko robati. Mladi listi so na spodnji strani gosto sivo belo dlakavi. Uvedena je bila pred

letom 1872. Sinonim 'Discolor'.

'Purpurea' ima zelo velike liste, ki so 15 cm široki in ob odganjanju purpurni. Jeseni se

obarvajo bakrenasto rdeče. Uvedena je bila pred 1909.

'Pyramidalis' je ozke, stožčaste rasti. Sinonim 'Holdtii'. Razlikuje se od cv. Fastigiata. Na

tržišče je bila uvedena pred letom 1914.

'Variegata' ima rumeno pisani listni rob. Listi so delno tudi lisasti. Uvedena je bila pred

letom 1755. Sinonima 'Aureovariegata' in 'Aureomarginata' (Hart 1997).

'Vincent van Gogh' je selekcija družine Bömer iz Nizozemskega Zunderta, kjer je bil rojen

tudi Vincent van Gogh. Značilnost sorte je posebna rast spomladanskih poganjkov, ki so

zaviti. Ob spomladanski rasti se razvijejo tudi manjši in nekoliko zaviti listi. Poletna rast je

normalna.



9

2.3 Opisi nekaterih kultivarjev pravega kostanja, selekcioniranih zaradi uporabe

plodov (debelo plodne sorte)

'Canby Black' zraste v široko drevo. Je zelo prijetne arome. Kostanji se tudi lažje lupijo. V

Oregonu v ZDA daje posamezno drevo 180-200 kg kostanjev.

(http://www.pfaf.org/database/plants.php?Castanea+sativa).

'Doré de Lyon' je šibkejše rasti in doseže 20 m višine.

(http://www.garden-

shopping.de/shop/customer/product.php?productid=127&cat=14&page=1)

'Glaberrima' zraste v drevo, ki je nekoliko manjše od osnovne vrste in v 50 letih zraste 10

m visoko. Plodovi so primerljivi s cv. Marron de Lyon.

'Paragon' ima debelejše kostanje. V ježici se razvije le en debelejši kostanj.

'Marron de Lyon' (syn. 'Macrocarpa') je ena boljših sort selekcioniranih zaradi plodov, ki

so debelejši in tudi izrazito okusni. Je sorta, ki tudi zelo zgodaj zarodi (Kelly in sod. 1997),

lahko že po 2-3 letih po sajenju. Značilno zanjo je, da namesto 2-4 drobnejših kostanjev v

ježici razvije le enega, ki je debelejši in tako je ta sorta primerna tudi za komercialno

proizvodnjo. Njena značilnost je tudi samofertilnost.

2.4 Razširjenost

Pravi kostanj izvira iz Sredozemlja, a so ga po Evropi razširili ljudje in mu je težko ugotoviti

njegovo naravno razširjenost. Domnevna severna meja naravne razširjenosti se sklada z

mejo 7-mesečne vegetacijske dobe (Brus 2004) in poteka nekako od Črnega morja po

bolgarsko-grški meji in preko Srbije, Hrvaške in Slovenije, po južnem robu Alp čez južno

Francijo do južnega dela Pirenejskega polotoka. Pogosteje se pojavlja v gozdovih na zakisani

podlagi.



10

2.5 Uporaba kostanjev

Kostanji so cenjena hrana in so se že v preteklosti uporabljali tudi kot krma za pitanje svinj,

praženi pa kot kavni nadomestek (Petauer 1993).

V prehrani se kostanji lahko uporabljajo kot samostojne jedi, še bolj pogosto pa so sestavni

del različnih jedi. Kot samostojna jed se lahko pripravi kostanjeva kremna juha s smetano,

kruh iz kostanjeve moke, kostanjevi piškoti, kostanjevi žganci in polenta, kostanjevi štruklji

in zavitek, kostanjeva marmelada, kostanjeva kaša ali pire, kostanjeva strnjenka in zmrzlina,

lahko pa tudi kot sladoled (Verovnik 2007). Zelo pogosto pa so kostanji le sestavni del jedi.

Uporabljajo se kot nadevi pri hladnih predjedeh kot so npr. nadevana jajca, piščančji galantin

s kostanjevim nadevom, divjačina terina s kostanji, sadno-zelenjavni koktajl ali solata s

kostanji. Kostanje dodajamo zelenjavnim enolončnicam, z njimi lahko juhe in omake tudi

gostimo. Nadvse uporabni so za nadeve v mesnih ruladah pri goseh, puranih in drugi

perutnini. S kostanji lahko polnimo še sadje, ki ga postrežemo k mesnim jedem, dodajamo

jih k dušeni zelenjavi, predvsem k zelju in kolerabi. Kot prilogo namesto krompirja lahko

pripravimo tudi slani kostanjev nadev in kipnik. Kerler (1984) še navaja recepte za pripravo

kitajskega zelja z maroni, kostanjevo polnilo z brinjevcem, kostanjev golaž itd. Večina pa

kostanje pozna kot pečene na odprtem ognju.

Kostanj (kuhan ali pečen) vsebuje 49 % škroba. V prehrani so dobrodošli tudi zaradi velike

vsebnosti vlaknin, ki jih je 5 g na 100 g kostanjev (Zittlau 2000). Kostanj vsebuje nekaj

enostavnih sladkorjev, zato so ga uporabljali tudi za pridobivanje sladkorja

(http://www.pfaf.org/database/plants.php?Castanea+sativa). Na 100 g kostanjev vsebuje še

do 3 g beljakovin, do 2 g maščob, 46 g kalcija, 33 g magnezija, 1,3 g železa. Vsebuje pa tudi

precej vitaminov A, C in B kompleksa (Verovnik 2007).

http://www.pfaf.org/database/plants.php?Castanea+sativa



11

Kostanjev med čebele nabirajo v času cvetenja kostanjev. Hektarski donos medu je pri

kostanju 30-100 kg (Warda 2001). V primerjavi z ostalimi medovi je nekoliko temnejši in

grenkljatega okusa. V kulinariki ga uporabljamo za pripravo omake vinaigrette in

začinjenega mesa, ujema pa se tudi s siri in sladicami močnejših okusov (de Belder 1994).

Slovenska potica tradicionalno na nekaterih območjih vsebuje kostanjev med

(http://www.medex.si/shop/kostanjev-med/).

Izvlečki iz listov in lupine plodov se dodajajo šamponom za lase in telo. Pri laseh z njimi

dosežemo večji sijaj (http://www.ibiblio.org/pfaf/cgi-bin/).

Kostanjevi listi in lubje so dober vir taninov, ki delujejo kot astingenti in se uporabljajo ob

zaustavitvi krvavitev, ob zdravljenju driske itd. Listi se nabirajo junija in julija, uporabljajo

se lahko sveži ali posušeni. Poparek listov se lahko uporablja ob zdravljenju vročine,

mrzlice, najpogosteje pa je uporabljen ob blaženju močnega kašlja kot tudi oslovskega kašlja

in ostalih težavah dihal (http://www.pfaf.org/database/plants.php?Castanea+sativa).

Oslovski kašelj lahko zdravimo tudi s sirupom, ki ga pridobimo iz plodov kostanja (Kerler

1984). Listi se lahko uporabljajo tudi pri zdravljenju revmatizma.

Moka iz plodov lahko predstavlja vir škroba, lahko pa jo uporabimo tudi za beljenje lanenih

tkanin.

Kostanjev les je trajen, kakovosten, trd, močan in lahek. Les mladih dreves je zelo trpežen.

Pri starejših drevesih postane lomljiv in nagnjen k temu, da razpoka. Les je široko uporaben

npr. v gradbeništvu, sodarstvu, tesarstvu, strugarstvu in pletarstvu. V Sloveniji kostanjev les

najpogosteje služi za električne drogove, železniške pragove, vinogradniške kole in za

konstrukcije brajd. Ima visoko kalorično vrednost in je tako odličen za kurjavo.

http://www.medex.si/shop/kostanjev-med/http://www.ibiblio.org/pfaf/cgi-bin/



12

Pravi kostanj je pogosto uporabljen tudi kot parkovno drevo ali v drevoredih. O tem pričajo

tudi mnoge sorte, ki so bile selekcionirane zaradi estetskih vrednosti.

V svetu so uporabljeni tudi za proizvodnjo plodov. Sadijo jih na plantaže, kjer večje površine

pobirajo tudi s prirejenimi kombajni. Kostanjeve nasade imajo tudi na Primorskem, a jih

obirajo ročno. Tam sadijo sorte z debelimi plodovi, ki so znani kot laški kostanji ali maroni.

Kot sadno in gozdno drevo je razširjen predvsem v Sredozemlju, v zahodni Evropi pa kot

okrasno drevo. V svetu kot sadno drevo uporabljajo v glavnem azijske vrste in križance z

njimi, ki so odporne na kostanjev rak.

2.6 Razmnoževanje pravega kostanja

2.6.1 Setev kostanja

Plod kostanja dozori oktobra ali novembra. Pobrati ga moramo takoj, ko odpade, kajti z

izsuševanjem izgublja kalivost (Bärtels 1996).

Po pobiranju plodove namakamo za 2-4 ure v topli vodi (45 °C). Nato jih osušimo. Lahko

jih tretiramo s fungicidom, s čemer preprečimo razvoj plesni. Med skladiščenjem moramo

ohranjati vlažnost semen nad 40 do 45 %. Na ta način skladiščimo semena do pomladi.

Zaradi hitre izgube vlage oz. ohranitve vitalnosti ploda, ga lahko posejemo že takoj jeseni,

ali pa ga shranimo do pomladi v zaprtih posodah. Shranimo jih pri temperaturi od –1 °C do

3 °C in pri veliki zračni vlažnosti (70 %). Jeseni jih sejemo novembra, spomladi pa februarja

ali pa marca.



13

Absolutna masa plodov znaša 4000 g. Priporočena količina plodov pri setvi je

800-1000 g/ m2. Seme vzkali aprila v 30-70 %. S tem dobimo od 80 do 100 rastlin na m2.

Lahko jih posejemo že takoj v posamezne lončke. Plodovi v naravi predstavljajo hrano tudi

pticam in glodavcem, zato moramo setve ustrezno zaščititi. Zgodaj vznikla semena rabijo

tudi zaščito pred pozno spomladanskimi pozebami.

Plodove, ki jih kupimo, so pogosto nekoliko suhi, zato jih pred sajenjem 1-2 dneva

namakamo v vodi. Debelina semena ne vpliva na kalitev.

Pomembno je, da sejance v gredah po enem letu presadimo, da pretrgamo srčno korenino,

ki bi oteževala poznejše presajanje (Krüssmann 1997). Korenino mladih kostanjev lahko v

sejalnih gredah na željeni globini spodrežemo tudi s specializiranimi stroji. Sejanci lahko

dosežejo v prvem letu višino 60 cm.

2.6.2 Razmnoževanje s potaknjenci

Na koreninjenje potaknjencev vpliva predvsem starost oz. juvenilnost matične rastline, poleg

tega pa tudi genotip in rastne razmere. Kljub temu, da se za potaknjence uporabljajo

morfološko mladi poganjki (enoletni ali dvoletni les) pa so le-ti fiziološko stari in zato je

koreninjenje oteženo.

Koreninjenje potaknjencev je zelo težavno. Glavni vzrok je juvenilnost matičnih rastlin. Dirr

(2006) navaja uspešen postopek razmnoževanja kostanja s potaknjenci. Matične rastline so

rasle v rastlinjaku. Na njih je nabral poganjke, stare 3 mesece in jih tretiral s primerno

kombinacijo rastnih regulatorjev: 1 del NAA in 10 delov IBA. Po potikanju je potaknjence

postavil v rastlinjak z meglilnim sistemom. Po 4 tednih se je ukoreninilo 80 % potaknjencev.



14

2.6.3 Cepljenje

Po raziskavah različnih institucij in izkušnjah različnih drevesničarjev je mogoče pravi

kostanj cepiti na več načinov:

2.6.3.1 Zimska ročna cepitev

Tehnika ročne cepitve se je dokaj uveljavila pri vzgoji kostanjev. V zimskem času se

uporablja tehnika angleške ali navadne kopulacije ali pa žlebičkanje. Izraz ročna cepitev se

uporablja za cepljenje na »neulončene« sejance.

2.6.3.2 Zimsko cepljenje na »ulončene« podlage

Podlage za ta način so bile že prej posajene v lončke, da so se dobro prekoreninile. Cepimo

s kopulacijo ali žlebičkanjem meseca januarja ali februarja. Cepljenke damo v zaprte

prostore, kjer se cepilno mesto prej zaraste.

2.6.3.3 Septembrska ročna cepitev

Pri tej metodi cepimo v mesecu septembru na podlage z golimi koreninami.

2.6.3.4 Okulacija

Okulacijo izvajamo, ko so podlage muževne, kar je pri kostanju nekje junija. Okuliramo

lahko tudi na prostem. Ta način uspešno uporabljajo v Avstriji, saj lahko cepljenke dosežejo

že v naslednjem letu višino do 2 m (Bärtels 1996).



15

2.6.3.5 Dolaga s strani

Za to tehniko navaja literatura cepljenje meseca maja.

2.6.3.6 Angleška kopulacija

Dirr (2006) navaja, da lahko pri angleški kopulaciji dosežeš od 85 do 90 % uspeh cepljenja.

2.6.3.7 Chi-Tsi metoda cepljenja

Slednji način so razvili Kitajci. Uporabljajo velike podlage, ki so pri tleh debele od 2,5 do

3 cm. Na višini 5 cm nad tlemi podlage odrežejo in naredijo podobno zarezo kot pri cepljenju

v razkol (3 do 4 cm dolga). Cepič ustrezno odrežejo, vstavijo in zavežejo. Cepilno mesto

nato premažejo in zagrnejo z zemljo, tako da gleda iz zemlje le zgornje oko (Krüssmann

1997).

2.6.3.8 Chip-budding ali ploščična okulacija

Ameriška literatura navaja tudi to tehniko kot zelo uspešno pri kostanju. Dosegli naj bi do

100 % prijem.

2.6.3.9 Cepljenje na kaleče sejance

Na ta način lahko cepimo od konca februarja do začetka marca. Kalečemu semenu

prikrajšamo korenine in stebelce tik nad kličnimi listi. Nato med klične liste vstavimo



16

»speči« cepič ter povežemo. Cepljenke vložimo v vlažno šoto in damo na 21 °C. Cepilno

mesto se hitro zaraste in rastlina se izredno hitro razvija, kar razlagamo z juvenilnostjo

podlage (Macdonald 1999). Fernandez-Lorenzo (2010) navaja cepljenje poganjkov iz in

vitro kulture na podlago 4 tedne starih sejancev.

2.6.4 Vegetativno razmnoževanje in vitro

Pri vegetativnem razmnoževanju in vitro iz izsečka (to je organ ali košček tkiva, celica) v

sterilnih pogojih vzgojimo na posebej pripravljenem gojišču novo rastlino. Meristemske

rastlinske celice imajo veliko sposobnost regeneracije in diferenciacije. Temu pojavu rečemo

totipotentnost, kar pomeni, da lahko iz ene celice nastane cela nova rastlina. Za tako

razmnoževanje se uporabljajo različne tehnike tkivnih kultur med katere spada tudi

mikropropagacija.

Za delo s tkivnimi kulturami potrebujemo laboratorij s specifično opremo in priborom, ki

omogoča delo v sterilnih razmerah. Sterilne razmere omogočajo brezprašne komore, ki so

sestavljene iz ograjene delovne površine, na katero piha (z zadnje strani ali od zgoraj) sterilen

zrak. Zrak se prefiltrira skozi zračni filter z drobnimi porami (reda velikosti 0,2 mikrometra)

na katere se ujamejo mikrobi (glive, bakterije). V komori se pri delu uporabljajo sterilne

pincete, skalpeli, igle, ki jih sproti steriliziramo v sterilizatorju, v katerem je cca 180 °C. Pri

pripravi gojišč potrebujemo tehtnice (navadne in analitske), električna mešala, bidestilator

vode, pH meter, mikrovalovno pečico, hladilnik (za shranjevanje založnih raztopin,

kemikalij, rastlinskega materiala itd.), avtomatske pipete, steklovino (erlenmajerice,

steklenice, magnete, epruvete, petrijevke, razne merilne posode itd.), mikroskope itd. Za

sterilizacijo gojišča in tudi drugega materiala, ki ga uporabljamo (stekleni kozarčki, voda za

razkuževanje in spiranje itd.) potrebujemo avtoklav. To je posebna, največkrat stoječa

naprava z žičnimi košarami, v katere naložimo material za avtoklaviranje. Pri avtoklaviranju

se razvije tlak 1,1 bara in temperatura 121 °C, zaradi česar se uničijo vsi neželeni

mikroorganizmi.



17

Poleg opreme potrebujemo tudi različne kemikalije, ki sestavljajo gojišča. Nepogrešljive so

anorganske (makro- in mikroelementi, sladkorji, voda) in organske snovi (rastlinski hormoni

oz. rastni regulatorji, vitamini, strjevalci). Za shranjevanje in gojenje tkivnih kultur

potrebujemo rastne komore, v katerih se vzdržujejo optimalne razmere: temperatura,

fotoperioda (svetlo/temno) in intenziteta osvetlitve.

2.6.4.1 Rastlinski rastni regulatorji

Rastlinski rastni regulatorji so najvažnejša skupina snovi, ki je omogočila razvoj metod

tkivnih kultur (Bohanec 1992). Rastlinski hormoni, naravni ali sintetični, vplivajo na

fiziološke procese v rastlini, na razvoj in rast. Ločimo več skupin rastlinskih hormonov;

za tkivne kulture sta najpomembnejši skupini: avksini in citokinini. Drugi rastni hormoni in

substance, ki se še uporabljajo, so: giberelini, abscizinska kislina, etilen.

Avksini:

IAA (indol ocetna kislina) v visoki koncentraciji vpliva na formiranje adventivnih

korenin;

NAA (α -naftalen ocetna kislina) v nizki koncentraciji vpliva na formiranje poganjkov;

IBA (indol maslena kislina) vpliva na formiranje poganjkov;

2,4-D (2,4-diklorofenoksiocetna kislina) vpliva na celične delitve;

pikloram vpliva na formiranje in rast kalusa.



18

Citokinini:

zeatin je naravni citokinin, v visoki koncentraciji vpliva na formiranje adventivnih

korenin;

2iP [(N6-(δ2-izopentenil) adenin] naravni citokinin, inhibira nastanek korenin;

BAP (6-benzilamino purin) spodbuja celične delitve, nastanek kalusa in poganjkov;

KIN-kinetin (6-furfurilamino purin) stimulira razvoj stranskih poganjkov;

TDZ (tidiazuron) zavira izdolževanje poganjkov, inhibira staranje listov in spodbuja

nastanek poganjkov.

Drugi rastni regulatorji in substance:

GA3 (giberelinska kislina) vpliva na izdolževanje korenin;

ABA (abscizinska kislina) olajša aklimatizacijo, pospešuje dozorevanje somatskih

embrijev, tvorbo gomoljev in čebulic, pospešuje nastanek dormance;

etilen vpliva na staranje listov, dozorevanje plodov;

adenin sulfat, kokosovo mleko, aktivno oglje, kazein hidrolizat, krompirjev izvleček,

kvasni izvleček, izvleček pivskega sladu itd.

Glede na analize odziva številnih rastlin gojenih v in vitro pogojih so znana pravila, ki v

splošnem veljajo:

nastanek kalusa lahko spodbujajo različni avksini ali citokinini ali kombinacija obeh;

razvoj brstov (adventivnih ali aksilarnih) spodbujajo avksini in citokinini, možno pa je

avksine tudi izpustiti;

citokinini preprečujejo koreninjenje, za koreninjenje so potrebni avksini.



19

2.6.4.2 Mikropropagacija

Mikropropagacija je temeljna tehnika tkivnih kultur in je tudi osnova vseh ostalih tehnik

(Bohanec 1992). Proces mikropropagacije v splošnem razdelimo na več faz: gojitev in

priprava matičnih rastlin, iniciacija kulture, indukcija in regeneracija, razmnoževanje

poganjkov, podaljševanje poganjkov in koreninjenje ter aklimatizacija. Vsaka od faz ima

svoje specifične zahteve dela in svoje probleme, ki se lahko pojavijo.

2.6.4.3 Gojitev in priprava matičnih rastlin

Za uspešno mikropropagacijo je zelo pomembna izbira matične rastline. Pri lesnatih

rastlinah, ki jih težje vegetativno razmnožujemo, je zelo pomembna fiziološka starost

rastline iz katere bomo vzeli material, pomembne so rastne razmere, prehranjenost, vodni

režim in zdravje rastlin. Rastlinski material (izsečke) je treba pravilno pripraviti za nadaljnjo

delo. Ne smemo ga izpostavljati neugodnim pogojem ali ga poškodovati. Preden začnemo z

delom je potrebno odstraniti vse umazane, odmrle, nagnite in poškodovane dele.

2.6.4.4 Iniciacija kulture

Ko izseček oz. rastlinski material (meristem, del lista, korenine, stebla, brsti, cvetni deli …)

vzamemo iz naravnih razmer, ga moramo predhodno sterilizirati, da se pridobi aseptična

kultura. Material je lahko okužen z bakterijami, glivami površinsko lahko pa tudi notranje.

Pri površinski sterilizaciji tkiv se uporabljajo različna razkužila, ta so: dikloroizocianurna

kislina, natrijev hipoklorit, kalcijev hipoklorit, živosrebrov klorid, vodikov peroksid. Tem

razkužilom se dodaja detergent za boljšo omočljivost. Razkužila so strupena, zato je treba z

njimi delati previdno. Koncentracije in čas razkuževanja so odvisne od vrste razkužila in

materiala, ki ga razkužujemo. Na učinkovitost razkuževanja vplivajo izbira razkužila,

koncentracija raztopine razkužila in čas tretiranja. Ko rastlinski material razkužimo, ga



20

obravnavamo kot sterilen in vsi postopki morajo potekati v sterilnih pogojih v brezprašnih

komorah (Bohanec 1992). Po razkuževanju izsečke inokuliramo na pripravljeno gojišče in

jih gojimo v rastnih komorah, kjer vzdržujemo optimalne razmere za rast in razvoj.

V tej fazi se lahko pojavi hipersenzitivnost. To je reakcija, ki nastane zaradi mehanične

poškodbe tkiva. Rastlina začne izločati eksudate (fenole, pigmente), ki zavirajo rast in

vplivajo na odmiranje sosednjih celic. Poznamo različne ukrepe, s katerimi zmanjšamo

izločanje snovi; te so: pogostejše subkultiviranje ter dodajanje oglja ali antioksidantov v

gojišča (Bohanec 1992).

2.6.4.5 Indukcija in regeneracija

V fazi indukcije izsečki nabreknejo in lahko se pojavi kalus. Pri regeneraciji se razvijejo

celice ali tkiva s specializiranimi funkcijami, tudi regeneracija embrioidov in organov ter

regenerantov ˗ poganjkov.

2.6.4.6 Razmnoževanje poganjkov

V tej fazi vsebujejo gojišča več citokininov in manj avksinov. Način razmnoževanja

poganjkov je odvisen od vrste rastline in njenega načina rasti. Rastline, ki imajo poganjke iz

členkov, segmentiramo na členke in le-te subkultiviramo na gojišče. Tako lahko dobimo

večje število poganjkov. Ko odrežemo glavni poganjek, odstranimo apikalno dominanco in

sproži se rast stranskih poganjkov. Subkultivacijo lahko ponovimo.

Pojavita se lahko dva nezaželjena pojava; vitrifikacija (hiperhidracija) in odmiranje

vršičkov. Vitrifikacija je pojav, ko tkiva sprejemajo preveč vode in in vitro gojeni poganjki

postanejo steklasti, prosojni, tkiva so polna vode in nabrekla. Na vitrifikacijo vplivajo



21

rastlinski hormoni v gojišču (citokinini) in velika zračna vlaga v posodicah za gojenje.

Odmiranje vršičkov je fiziološki pojav. Vršiček porjavi in odmre, sproži se močnejša rast

stranskih poganjkov, pri katerih se rjavenje ponavadi ponovi. To odmiranje je posledica

pomanjkanja hranil ˗ predvsem železa, ali zaradi premajhne transpiracije v kulturi. To

odpravimo z dodajanjem kalcija v gojišče (Bohanec 1992).

2.6.4.7 Podaljševanje poganjkov in koreninjenje

Če so poganjki v fazi razmnoževanja premajhni, jih subkultiviramo na gojišče za

podaljševanje poganjkov. Koreninjenje je postopek tkivnih kultur, ko poganjke

subkultiviramo na gojišča za koreninjenje. Gojišča za koreninjenje imajo manjšo

koncentracijo makro in mikroelementov, manj saharoze in strjevalca in brez rastnih

regulatorjev ali pa le z avksini (indol maslena kislina IBA, indol ocetna kislina IAA, α-

naftalen ocetna kislina NAA). V tej fazi je problem kalus, ki nastane na odrezanem mestu,

kjer bi morale pognati korenine. Če se korenine tvorijo iz kalusa, nimajo direktnega stika s

poganjkom, tako tudi prevodno tkivo ni spojeno in kasneje v postopku aklimatizacije lahko

sadike propadejo. Namesto na gojišču za koreninjenje, lahko poganjki določenih rastlinskih

vrst koreninijo kar v substratu (Bohanec 1992).

Gornik (2008) navaja oteženo koreninjenje pravega kostanja, saj je koreninilo le od 6,38 %

do 16,66 % poganjkov ali pa je bilo koreninjenje neuspešno. Alternativa koreninjenju je

lahko cepljenje poganjkov iz in vitro kulture na 4 tedne stare sejance (Fernandez-Lorenzo

2010).



22

2.6.4.8 Aklimatizacija

V tej fazi poganjke ˗ mlade rastline, ki so rasle v heterotrofnih razmerah in so pognale

korenine, navajamo na avtotrofni način rasti. Pomembna je izbira rastnega substrata, stalna

visoka zračna vlaga, redno zračenje, primerna toplota, svetloba.

2.6.5 Razmnoževanje pravega kostanja v tkivni kulturi – mikropropagacija

Rastlinska tkivna kultura je tehnika, pri kateri gojimo rastline, organe, tkiva ali posamezne

celice v laboratorijskem, sterilnem okolju (in vitro) na definiranih trdnih in tekočih podlagah

(George 1993).

Najpogostejša tehnika tkivnih kultur je mikropropagacija ali nespolno razmnoževanje rastlin

in vitro. V laboratorijsko sterilnem okolju lahko rastline razmnožimo že iz zelo majhnih

delčkov, kot npr. iz rastnega vršička. Lastnost, da vsebuje sleherna celica informacijo za

razvoj v celo rastlino, imenujemo totipotentnost. Vsaka celica ima potencial, da se na podlagi

svoje celovite genske informacije razvije v popolno rastlino (Bohanec 1992).

Začetki raziskav pravega kostanja v in vitro razmerah segajo že v leto 1947. Ko sta evropski

in ameriški pravi kostanj prizadela kostanjev rak (Cryphonectria parasitica (Murrill) M.E.

Barr) in črnilovka (Phytophthora cambivora (Petri) Buisman) in je velik delež kostanjevih

dreves v gozdovih in nasadih propadel, so raziskave postale bolj intenzivne in so bile

predvsem usmerjene v razmnoževanje odpornejših genotipov oz. hibridov. Že od vsega

začetka raziskav raziskovalci poročajo o velikih težavah pri mikropropagaciji kostanja.

Glavni problemi, ki se pogosto pojavljajo so: majhen odstotek preživetja izsečkov, veliko

fenolnih izločkov, ki zavirajo rast in razvoj, vitrifikacija, nizka stopnja razmnoževanja in

koreninjenja ter nenormalno kalusiranje (Soylu in Ertürk 1999). Te raziskave so tudi



23

opozorile, da sta pri razmnoževanju kostanja in vitro zelo pomembna starost matičnih rastlin

in genotip. S fiziološko starim materialom so uspehi zelo majhni ali pa jih sploh ni.

Vieitez in Vieitez (1980) sta v Španiji opravila raziskavo, v kateri sta uporabila izsečke

(brste) iz 3-4 mesecev starih rastlin C. sativa. Preizkušala sta različne kombinacije in

koncentracije hormonov: citokininov (BAP, kinetin, zeatin), avksina IBA in giberelina GA3

na rast stranskih poganjkov. Uporabila sta osnovno MS gojišče. Ugotovila sta, da obstaja

povezava med različnimi koncentracijami citokininov in odstotkom rasti brstov.

Koncentracije med 0,5-1 mg/l so dobro vplivale na rast brstov, nad 5 mg/l so bile toksične.

Učinkovit za rast stranskih brstov se je izkazal BAP v koncentraciji 1 mg/l. Zeatin, kinetin

in avksin IBA niso imeli vpliva na rast stranskih poganjkov. Giberelin GA3 je vplival na

večjo rast listov. Če so kombinirali giberelin GA3 in avksin IBA se je razvoj kulture

zaustavil. Ko so se formirali poganjki in so se razvili stranski poganjki, so jih razrezali in

subkultivirali na gojišče s polovičnimi koncentracijami soli MS gojišča in 0,1 mg/l BAP.

Probleme sta imela z izločki, ki so zaustavili oz. upočasnili rast poganjkov. To sta preprečila

tako, da sta pustila izsečke 2-3 ure v sterilni destilirani vodi in da sta jih pogosteje

subkultivirala na sveže gojišče.

Vieitez in sod. (1983) so objavili raziskavo, v kateri so uporabili 3 klone 10 in 18 let starih

kostanjev, križancev C. sativa × C. crenata. Poganjke za delo so nabrali v treh obdobjih:

spomladi, pozimi (december-januar) in jeseni (september). Pri spomladi nabranih poganjkih

so uporabili nodije in vršičke. Pozimi nabrane dormantne poganjke so shranili na hladnem,

marca pa so jih potaknili v perlit v rastlinjak. Ko so se formirali stranski poganjki so le-te

odrezali in jih uporabili. Septembra nabrane poganjke so shranili za 3 mesece na hladnem in

jih nato potaknili v perlit in jih silili v rastnih komorah. Za iniciacijo kulture so uporabili MS

gojišče s polovičnimi nitrati MS – ½NO3 + BAP. Po indukciji so izsečke subkultivirali na 9

različnih gojišč za razmnoževanje in podaljševanje poganjkov. Spremljali so razlike med

uporabljenimi gojišči. Eno od gojišč za razmnoževanje je bilo tudi MS – ½NO3. To gojišče

se je v raziskavi izkazalo kot zelo ustrezno za podaljševanje poganjkov, bilo je tudi dokaj



24

uspešno pri razmnoževanju. Poleg gojišč so proučevali tudi vplive različnih koncentracij

NAA in BAP na razmnoževanje, posamezno in v kombinacijah. BAP se je izkazal kot zelo

pomemben za razmnoževanje in podaljševanje poganjkov. Maksimalno razmnoževanje so

dosegli s koncentracijo 0,2 mg/l. Za koreninjenje so uporabili tudi polovično koncentracijo

gojišča (MS – ½NO3). Na tem gojišču so imeli 73 % koreninjenja. S to raziskavo so

dokazali, da je možno tudi in vitro razmnoževanje kostanjevih poganjkov, ki izvirajo iz

starejših dreves. Zaključili so tudi, da na razmnoževanje in različno uspešnost različnih

klonov verjetno vplivajo tudi posamezni genotipi oz. genetske razlike med kloni in da so

potrebne modifikacije glede metod in uporabljenih gojišč za različne genotipe.

Na Novi Zelandiji je Mullins (1987) opravil raziskavo z dvoletnimi sejanci in cepljenkami

C. sativa. Vse rastline so bile vzgojene v rastlinjakih. Za osnovno gojišče so uporabili ½ MS

gojišče (polovična koncentracija makro- in mikroelementov), razen železa + 0,1 mg/l BAP.

Uporabili so izsečke poganjkov. Izsečki so razvili velike bazalne kaluse, kalus pa je rasel

tudi iz lenticel. Problem so imeli z izločki, kar so reševali s prestavljanjem na sveže gojišče.

Ugotovili so, da je možnost preživetja izsečkov odvisna od velikosti in mesta, kjer se je

izseček nahajal na poganjku. Najbolje so preživeli izsečki, vzeti iz baze poganjka, nato

vršički, nato pa tisti iz sredine poganjka. Preživetje izsečkov se je povečevalo skozi

subkulture. Za razmnoževanje so uporabili MS – ½NO3 gojišče + 0,1 mg/l BAP. Tu so imeli

problem z nekrozami. Pojavljala se je tudi vitrifikacija in degenerativna rast. Poganjke so

subkultivirali na gojišče za koreninjenje ½ MS + IBA v različnih koncentracijah od 0,1 do

2,0 mg/l. Preizkusili so tudi koreninjenje in vivo. Poganjke so pomočili v raztopino avksina

IBA, nato so jih posadili v substrat in shranili v rastlinjaku z urejenim megljenjem in talnim

ogrevanjem. Poganjki s koreninami, ki so nastale v in vitro razmerah so imeli nizko stopnjo

preživetja, ko so jih presadili v substrat. Poganjki, ki so koreninili v substratu pa so bolje

preživeli. Pri enem klonu kostanja ni bilo indukcije korenin pri nobeni izmed teh dveh

metod.



25

V Franciji sta Chauvin in Salesses (1988) za raziskavo uporabila več različnih klonov C.

sativa in C. crenata ter hibride C. crenata × C. sativa. Rastlinski material so nabirali v treh

obdobjih: aprila, maja in junija z naravnih rastišč kostanja in iz rastlin v rastlinjakih.

Uporabili so dva tipa materiala: aksilarne brste in meristemske kulture. Osnovna gojišča za

brste sta bila MS gojišče s polovičnimi nitrati (MS –½NO3) in MS gojišče s polovičnimi

nitrati in polovičnimi makroelementi ((MS – ½NO3)/2). Za indukcijo so uporabili 1-2,5 mg/l

BAP, za rast poganjkov pa 0,2-0,5 mg/l BAP. Za meristemske kulture so uporabili enako

gojišče z različnimi hormoni v različnih koncentracijah: BAP, GA3, IBA. Preizkusili so tudi

različne vplive saharoze in fruktoze v gojišču na rast in razvoj poganjkov ter različne

intenzitete svetlobe in temperature. Rezultati so pokazali boljšo rast in razvoj izsečkov, ki

so bili vzeti iz rastlin v rastlinjakih. Ugotovili so da BAP vpliva na boljšo rast poganjkov.

Pri polovični koncentraciji makroelementov v gojišču so opazili nekroze na izsečkih ter

izgubo vigorja. Za fruktozo so ugotovili, da deluje stimulativno na izsečke v kulturi in da sta

se izboljšala razmnoževanje in podaljševanje poganjkov. Prav tako je bilo manj kalusiranja,

listi so bili daljši. Ugotovili so tudi razlike med intenziteto svetlobe in temperaturo v rastnih

komorah na razmnoževanje, podaljševanje poganjkov in rast kalusa. Največji koeficient

razmnoževanja je bil pri visoki intenziteti svetlobe 33 W/m2 in temperaturi 27 °C.

V Italiji sta Piagnani in Eccher (1988) proučevala faktorje, ki vplivajo na razmnoževanje in

koreninjenje kostanja in vitro. Proučevala sta različne koncentracije dušika in njegov vpliv

na vitrifikacijo in pojavljanje nekroz. Ugotovila sta, da nizke koncentracije dušika v gojišču

vplivajo na rast kostanja medtem, ko visoke koncentracije dušika povzročajo vitrifikacijo.

Popolna odsotnost dušika v gojišču pa povzroča klorozo izsečkov. Ugotovila sta tudi velike

razlike glede razmnoževanja in koreninjenja med različnimi kloni kostanja in različnimi

izsečki, ki sta jih uporabila.

V Turčiji sta Soylu in Ertürk (1999) za raziskavo uporabila izsečke 4-7 let v naravi rastočih

dreves, 1-letnih rastlin iz rastlinjaka in od 2 do 3 mesecev starih sejancev. Uporabila sta

aksilarne brste in vršičke poganjkov. Izsečke z aksilarnimi brsti sta nabrala v različnih



26

obdobjih v rastni dobi od maja do avgusta v 5 zaporednih letih. Za iniciacijo kulture so

uporabili gojišči MS – ½NO3 in WPM z dodatkom hormona BAP v različnih koncentracijah.

Za razmnoževanje so uporabili MS – ½NO3 gojišče z 1-2 mg/l BAP in MSMA (MS

razmnoževalno gojišče). Gojišče za koreninjenje MS ˗ ½NO3 je vsebovalo še 1,0 mg/l IBA.

V prvih 4 letih ni bilo pozitivnih rezultatov. Poganjki so se razvili le pri izsečkih, ki so bili

vzeti iz 1-letnih rastlin zraslih v rastlinjaku, a tudi ti kasneje niso koreninili. V zadnjem letu

so dobili boljše rezultate z izsečki, vzetih iz sejancev na gojišču MS – ½NO3. Ugotovili so,

da sta starost matičnih rastlin in genotip pomembna faktorja v tkivni kulturi.

Skupina raziskovalcev iz Španije, Francije, Portugalske, Švice in Avstrije (Ballester in sod.

2001) je raziskovala vplive mineralov in ogljikovih hidratov v gojišču na rast in razvoj

kultivarjev C. sativa × C. crenata. Poskušali so definirati protokol za mikropropagacijo

poganjkov kostanja, definirati protokol za indukcijo, rast in razvoj somatskih embrijev ter

inducirati poganjke iz kotiledonov. Za mikropropagacijo poganjkov so uporabili 8 različnih

gojišč, ki so vsa vsebovala 0,2 mg/l BAP. Raziskovali so vplive različnih ogljikovih hidratov

v različnih koncentracijah (saharoza, fruktoza, glukoza, sorbitol) na rast izsečkov. Rezultati

mikropropagacije poganjkov so pokazali, da je težko ugotoviti, katero gojišče bi bilo v

splošnem najprimernejše. Za razmnoževanje se je kot primerno izkazalo gojišče

MS – ½NO3. Ugotovili so, da je rast poganjkov zelo odvisna od genotipa, zato je treba za

vsak kultivar kostanja protokol prilagoditi in modificirati glede na njegove potrebe.



27

3 MATERIALI IN METODE DELA

3.1 Izvorni rastlinski material

Matične rastline nam služijo kot izhodiščni material, iz katerega porežemo izsečke, ki jih

razmnožujemo v tkivnih kulturah. Zelo pomembne so rastne razmere, v katerih so matične

rastline rasle. Od tega lahko zavisi nadaljnji uspeh mikropropagacije (Šiško 2005).

Rastline za razmnoževanje smo izbrali na območju Kozjaka. Izbrali smo 3 drevesa kostanja,

ki so bila na izgled zelo vitalna in so predstavljala hipotetični vir genov za odpornost ali

tolerantnost na kostanjev rak. Drevesa so bila pomlajena in so močno odgnala. Predpostavili

smo, da zaradi tega vsebujejo v tkivih več rastnih hormonov, kar lahko pozitivno vpliva na

uspešnost tkivnih kultur.

Izbrali smo veje, ki so bile primerno osvetljene in so imele normalno razvite rastne brste ter

odgnane poganjke. Rastlinski material za preliminarni poskus smo nabrali 13. maja 2005, za

drugi del raziskave pa smo material nabrali 14. junija 2005.

3.2 Potek raziskave

Raziskava mikropropagacije je potekala v Laboratoriju za rastlinske tkivne kulture Fakultete

za kmetijstvo in biosistemske vede. Razdeljena je bila na dva sklopa. Najprej smo opravili

preliminarni poskus, s katerim smo ugotovili, kateri od treh genotipov (Priloga 1) bi bil

najbolj vitalen in najprimernejši za nadaljnjo mikropropagacijo.



28

Preizkusili smo 6 različnih metod sterilizacije rastlinskega materiala. Odbrali smo zaprte in

odprte brste (Priloga 2) ter ugotavljali ali ima dodatek askorbinske kisline v iniciacijskem

gojišču (Priloga 3) stimulativni učinek na delitev celic, nastanek kalusa in poganjkov.

V drugem delu raziskave smo nadaljevali z delom na genotipu, ki se je glede na rezultate

preliminarnega poskusa pokazal za najboljšega. Glede na analize rezultatov smo izbrali tudi

najuspešnejši način sterilizacije. V drugem delu raziskave smo preizkušali različna gojišča,

ki so se med seboj razlikovala po vsebnosti mikro in makro elementov, vitaminov, ogljikovih

hidratov, amino kislin in rastnih regulatorjev.

3.3 Priprava brstov in poganjkov

V naravi smo narezali eno in večletne poganjke, jih shranili v navlaženo vrečo in jih prenesli

v laboratorij.

Za pripravo brstov smo iz poganjkov s pomočjo skalpela izrezali brste. Z uporabo pincete in

skalpela pa smo nato iz brstov odstranili še zunanja dva rjava luskolista.

Za pripravo odgnanih poganjkov, namenjenih za iniciacijo, smo uporabili olesenele veje.

Izrezali smo jih s skalpelom in jih prikrajšali na dolžino ca. 5 mm (Priloga 4). Odstranili smo

del listov in jih odlagali v vodo, da se ne bi izsušili.

3.4 Sterilizacija brstov

Izsečke smo pred inokulacijo sterilizirali (Priloga 5). Sterilizacija je pomembna faza

mikropropagacije. Pred razkuževanjem smo odstranili umazana in odmrla tkiva.



29

Za boljšo omočljivost in oprijem smo v vseh primerih dodali razkuževalni raztopini nekaj

kapljic detergenta Tween. Nato smo v raztopino dali pripravljene brste oz. poganjke in jih

med razkuževanjem stalno mešali na magnetnem mešalu. Po sterilizaciji smo izsečke 3-krat

izprali s sterilno destilirano vodo. Tako razkužene izsečke smo dali v epruvete na

indukcijsko gojišče.

V naši raziskavi smo preizkusili 6 različnih načinov sterilizacije (Preglednica 2). Vseh

načinov sterilizacije pa nismo preizkušali pri vseh genotipih oz. pri obeh tipih brstov.

Preglednica 2: Načini sterilizacije in uporabljena sredstva, ki smo jih preizkusili.

Oznaka Opis sterilizacije

A 2 % dikloroizocinaurična kislina, 20 minut

B 70 % alkohol (etanol), 30 sekund, 10 % natrijev hipoklorit, 7 minut

C 60 ml/l Spitaderm, 30 min., 10 % natrijev hipoklorit, 7 minut

D 10 % kalcijev hipoklorit, 20 minut

E 50 % Oxyl, 3 minute

F 3 % dikloroizocinaurična kislina, 20 minut



30

3.4.1 Sterilizacija z dikloroizocinaurično kislino

Dikloroizocinaurična kislina – DICA (C3Cl2N3NaO3) je v obliki prahu oz. granul.

Pri sterilizaciji, ki smo jo označili kot A, smo uporabili 2 % dikloroizocinaurično kislino. V

erlenmajerici smo pripravili 250 ml raztopine in ji za boljšo omočljivost dodali 6 kapljic

detergenta Tween. V raztopini smo pustili brste oz. poganjke 20 minut. Med razkuževanjem

smo ves čas mešali. Nato smo jih 3-krat sprali s sterilizirano, destilirano vodo.

Dikloroizocinaurično kislino smo uporabili tudi pri sterilizaciji F, kjer smo uporabili isti

postopek, le da smo sterilizirali s 3 % dikloroizocinaurično kislino.

3.4.2 Sterilizacija z alkoholom in natrijevim hipokloritom

Natrijev hipoklorit (NaOCl) je brezbarvna tekočina z močnim vonjem po kloru; pri uporabi

je potrebno upoštevati, da s časom razpada (Bohanec 1992).

Drugi način sterilizacije smo označili z B. Izsečke smo najprej potopili za 30 sekund v 70 %

etanol (EtOH), nato pa smo jih 7 minut sterilizirali v raztopini 10 % natrijevega hipoklorita

z dodanimi 6 kapljicami detergenta Tween. Po postopku smo jih 3-krat sprali s sterilizirano,

destilirano vodo.

3.4.3 Sterilizacija s Spitadermom in natrijevim hipokloritom

Spitaderm je razkužilo, ki vsebuje 70 % 2-propanola, 0,5 % klorheksidin diglukonata in

0,45 % vodikovega peroksida.



31

Tretji postopek smo označili s C. Raztopino za razkuževanje smo pripravili tako, da smo

Spitaderm razredčili v razmerju 60 ml/l. Izsečke smo dali najprej za 30 minut v erlenmajerice

z raztopino. Nato pa smo izsečke za 7 minut potopili v 10 % natrijev hipoklorit in jih ves čas

mešali. Po poteklem času smo jih takoj 3-krat sprali s sterilizirano, destilirano vodo.

3.4.4 Sterilizacija s kalcijevim hipokloritom

Način površinske sterilizacije D smo opravili s kalcijevim hipokloritom Ca(OCl2). Pripravili

smo 10 % raztopino kalcijevega hipoklorita, v katerem smo pustili izsečke 20 minut ob

stalnem mešanju. Nato smo jih 3-krat sprali s sterilizirano, destilirano vodo.

3.4.5 Sterilizacija z OXYL-PRO™

OXYL-PRO™ je razkužilo, ki se uporablja za razkuževanje vode. Vsebuje kemijsko

stabiliziran vodikov peroksid (H2O2).

Za postopek E smo uporabili 50 % OXYL-PRO™, v katerem smo pustili izsečke 3 minute.

Po končani sterilizaciji smo jih 3-krat sprali s sterilizirano, destilirano vodo.

3.5 Sestava in priprava gojišč

Rastline rabijo za uspešen razvoj vse potrebne snovi. Te snovi, ki bi jih drugače dobile v

naravi, jim moramo zagotoviti tudi v gojiščih za tkivne kulture. Makroelementi,

mikroelementi, vitamini in ostale sestavine so na voljo v naprej pripravljenih formulacijah

v obliki prahu (Torres 1957).



32

Preglednica 3: Sestava gojišč uporabljenih v raziskavi.

MCWPi MS-NO3 i Fi

McCown's Woody Plant Salt Mixture 2.3 g/l

Murashige in Skoog 1962 - 1/2

NH4NO3 – KNO3 252,09 mg/l

Myoinozitol 100 mg/l 100 mg/l 100 mg/l

Saharoza 30 g/l 30 g/l

Fruktoza 40 g/l

BAP 0,2 mg/l 0,2 mg/l 0,2 mg/l

Vitaminska mešanica 0,5 ml/l 0,5 ml/l

Agar 7g/l 7g/l 7 g/l

pH 5,8 5,6 5,6

Askorbinska kislina 10 mg/l

Nikotin 0,5 mg/l

Piridoksin 0,5 mg/l

Tiamin 1 mg/l

Mikro elementi MS 200 ml/l

NH4NO3 825 mg/l

KNO3 1900 mg/l

CaCl2 440 mg/l

MgSO4 370 mg/l

KH2PO4 170 mg/l



33

Rastlinske rastne regulatorje smo predhodno pripravili kot založne raztopine in jih hranili v

hladilniku. Pri pripravi gojišč smo ustrezen volumen založne raztopine odpipetirali v

gojišče. Na ta način smo zagotovili natančnost koncentracije sestavin gojišča, ki je pri

tehtanju tako majhnih količin ne bi mogli zagotoviti.

Gojišča pravega kostanja (Preglednica 3) smo pripravili tako, da smo v čašo zatehtali makro-

in mikroelemente, saharozo in ostale sestavine in jih prelili z bidestilirano vodo. Sestavine

smo raztopili z mešanjem s pomočjo teflonskega magneta na elektronskem mešalu. Nato

smo odpipetirali in dodali še sestavine iz založnih raztopin (rastlinske, rastne regulatorje).

Končni volumen gojišč smo določili v merilni bučki, ga prelili nazaj v čašo in umerili pH.

Da smo dosegli določen pH, smo po kapljicah dodajali natrijev hidroksid (NaOH) za

zviševanje pH in klorovodikovo kislino (HCl) za zniževanje pH. Gojišča smo prelili v

steklenice (Scott-Duran), ki so primerne za avtoklaviranje. Vanje smo dodali agar in dobro

premešali. Nato smo gojišče dali še za nekaj minut v mikrovalovno pečico, kjer smo ga

segreli do vretja in počakali tako dolgo, da se je agar popolnoma raztopil.

Prej pripravljene epruvete oz. steklenice, primerne za avtoklaviranje, smo s pomočjo

dozatorja napolnili z gojiščem (Priloga 6). Napolnjene gojitvene posode smo vstavili v

mrežaste košare, ki smo jih zložili v avtoklav. Avtoklavirali smo pri temperaturi 121 C in

pritisku 1,1 bar približno 20 minut. Gojišča, ki smo jim dodali glicin, smo po avtoklaviranju

ohladili v mrzli vodi na ca. 40 °C. Nato smo preko filtra Milipore Milex v brezprašni komori

filtersko sterilizirali, v gojišče dodali želeno količino glicina in ga premešali z vrtenjem

steklenice. Gojišče smo pustili na sobni temperaturi, da se je ohladilo in strdilo.

Če smo gojitvene posode nalivali takoj po avtoklaviranju, smo počakali, da se je gojišče

ohladilo na 40-60 C. Nato smo ga premešali in nalili v sterilne epruvete. Nalivanje gojišča

v gojitvene posode smo izvajali v brezprašni komori. Avtoklavirano gojišče, ki smo ga

pustili, da se je strdilo, smo ogreli v mikrovalovni pečici. Tako se je strjeno gojišče ponovno



34

utekočinilo. Enemu delu gojišča, ki smo ga ohladili pod 60 °C smo dodali še askorbinsko

kislino, ki bi se pri višji temperaturi razgradila.

Za mikropropagacijo pravega kostanja smo za indukcijsko gojišče izbrali gojitvene epruvete,

v katere smo nalili 15 ml gojišča. Za regenerativno gojišče pa smo uporabili posode »baby

jar«. Posode smo pred uporabo sterilizirali z avtoklaviranjem. Gojišče smo v posodice nalili

s pomočjo dozatorja (Jencons perimatic GP), ki gojišče enakomerno dozira glede na

volumen, ki ga sprogramiramo. Nalite epruvete smo takoj zaprli, jih pokrili z aluminijasto

folijo, označili in shranili v hladilnik.

3.6 Inokulacija brstov in poganjkov

Brste in poganjke, ki smo jih površinsko sterilizirali, smo v sterilnih pogojih v brezprašni

komori inokulirali na indukcijska gojišča v steklene epruvete s plastičnimi zamaški.

Uporabili smo tri različna indukcijska gojišča, ki smo jih označili z MCWPi, MS-NO3 i in

Fi (Preglednica 3). Gojišče MCWPi smo uporabili tudi kot iniciacijsko gojišče pri

preliminarnem poskusu. V posamezno epruveto smo inokulirali po en brst oz. poganjek. V

prvem delu raziskave smo inokulirali 250 izsečkov, v drugem delu pa 313. Pri delu smo

uporabljali sterilizirane skalpele in pincete, ki pa smo jih še sproti sterilizirali v srednje

temperaturnem grelcu s steklenimi kroglicami. Orodje smo razkužili pred vsakim nadaljnjim

posegom. Sterilizirane brste smo vstavljali v epruvete s 15 ml gojišča.

3.7 Subkultivacija poganjkov

Faza subkultiviranja poganjkov je faza, ko inokulant zraste in začne oblikovati nove

poganjke. Postopek je uspešen, če zraste čim večje število normalno raslih poganjkov v čim

krajšem času (Bohanec 1992).



35

Ko so poganjki zrasli, smo novo nastale poganjke razrezali in jih subkultivirali na sveža

gojišča. Ko so bili poganjki dovolj veliki in je bilo v gojišču veliko fenolnih izločkov, smo

postopek ponovili, da je bil negativen vpliv izločkov čim manjši (Priloga 7). Subkultivirali

smo tudi poganjke, pri katerih so se pojavili fenolni izločki ali pa se je preveč razrastel kalus.

Tega smo odstranili. Pri pojavu vitrifikacije smo odstranili vitrificirani vršiček in poganjek

prestavili na sveže gojišče.

3.8 Negativni pojavi

Pri mikropropagaciji se kot neželeni pojav pojavlja nastanek kalusa, vitrifikacija, odmiranje

vršičkov in izločanje eksudatov.

Kalus nastaja ob bazi poganjka na gojišču za razmnoževanje. Nastanek kalusa lahko zmanjša

uspeh razmnoževanja, saj lahko rastlina izgubi direkten stik z gojiščem (Priloga 8).

Kot drugi negativni pojav se je pojavila vitrifikacija (hiperhidracija). Vitrifikacija je pojav,

ko celice tkiva sprejemajo preveč vode. Celične vakuole se ob tem povečajo in napolnijo z

vodo, celične stene pa se zmanjšajo. Značilnost tega pojava je, da in vitro poganjki postanejo

steklasti, močno prosojni, tkiva pa so polna vode in nabrekla. Vitrifikacija je lahko, kot

velika večina drugih neželenih pojavov, močno odvisna od genotipa (Bohanec 1992). Na

vitrifikacijo lahko vplivamo in jo zmanjšamo s pogostejšo subkultivacijo na gojišča, ki

vsebujejo več strjevalca in z dodajanjem drugih komponent, ki preprečujejo vitrifikacijo.

Tretji negativni pojav je odmiranje vršičkov. Odmiranje vršičkov je fiziološki pojav, ko

vršiček poganjka porjavi in odmre, kar lahko sproži močnejšo rast stranskih poganjkov

(Priloga 9). Pri novo nastalih stranskih poganjkih se lahko rjavenje ponovi. Pojavi se lahko

zaradi pomanjkanja nekaterih hranil, predvsem železa, lahko pa se pojavi tudi zaradi



36

premajhne transpiracije v kulturi. Posledice lahko omilimo oz. odpravimo z dodajanjem

železa in kalcija v gojišče (Bohanec 1992).

Nezaželeni pojav pri mikropropagaciji pravega kostanja je pogosto lahko izločanje

eksudatov (fenolnih spojin, pigmentov), ki povzročajo rjavenje gojišča okrog izsečka

(Priloga 10). To ima za posledico rjavenje izsečka in v končni fazi propad izsečkov. Za

zmanjšanje negativnega vpliva eksudatov porjavele kulture pogosteje subkultiviramo na

novo gojišče.

3.9 Gojenje

Izsečke in regenerante smo gojili v rastni komori pri temperaturi 23 °C s fotoperiodo 16 ur

dan in 8 ur noč ter pri intenziteti svetlobe 1500 luksov.

3.10 Bonitiranje in obdelava podatkov

Bonitiranje smo opravili vsak teden in pri vsaki subkultivaciji. Spremljali smo število

okuženih izsečkov oz. poganjkov, število odgnanih, število neodgnanih izsečkov in število

propadlih izsečkov. Zbrane podatke smo uredili tabelarično in grafično ter jih predstavili z

opisno statistiko.



37

4 REZULTATI Z RAZPRAVO

4.1 Vpliv različnih načinov razkuževanja na uspešno vzpostavljeno kulturo

Analiza rezultatov sterilizacije (Preglednica 4, Grafikon 1) je pokazala, da je bil

najuspešnejši način sterilizacije s 3 % dikloroizocinaurično kislino (sterilizacija F), kjer smo

uspešno sterilizirali kar 72 % izsečkov. Takoj za njim po uspešnosti sterilizacije je bilo

razkuževanje s Spitadermom in natrijevim hipokloritom (55 %). Za približno enako

učinkovito se je izkazalo obravnavanje s kalcijevim hipokloritom in 2 %

dikloroizocinaurično kislino. Pri sterilizaciji z alkoholom in natrijevim hipokloritom

(sterilizacija B) smo uspeli sterilizirati 32 % izsečkov. Pri tem načinu sterilizacije so se

najbolje sterilizirali zaprti brsti. Najmanj uspešna je bila sterilizacija pri Oxylu.

Preglednica 4: Odstotek uspešno steriliziranih izsečkov treh genotipov kostanja, glede na

uporabljeno metodo sterilizacije

G1-o G1-z G2-o G2-z G3-o G3-z Povprečje

A 2 % dikloroizocinaurična kislina 40 % 62 % 50 % 25 % 11 % 38 %

B alkohol in natrijev hipoklorit 12 % 25 % 60 % 32 %

C Spitaderm in natrijev hipoklorit 62 % 45 % 57 % 55 %

D kalcijev hipoklorit 75 % 60 % 40 % 0 % 11 % 0 % 31 %

E Oxyl 0 % 0 % 0 % 0 % 20 % 0 % 3 %

F 3 % dikloroizocinaurična kislina 72% 72%

(G1-o = genotip kostanja 1, odprti brsti; G1-z = genotip kostanja 1, zaprti brsti; G2-o = genotip kostanja 2,

odprti brsti; G2-z = genotip kostanja 2, zaprti brsti; G3-o = genotip kostanja 3, odprti brsti; G3-z = genotip

kostanja 3, zaprti brsti)



38

Grafikon 1: Odstotki preživelih izsečkov pri različnih načinih sterilizacije.

4.2 Vpliv genotipa na uspešno vzpostavljeno kulturo

Dobljeni rezultati kažejo, da ima vpliv na uspešno sterilizacijo in indukcijo poganjkov

zraven izbranega načina sterilizacije tudi genotip rastlinskega materiala, ki ga uporabimo.

Izmed treh genotipov pravega kostanja, ki smo jih proučevali, smo dosegli najboljše

rezultate pri prvem genotipu, kjer je pri izračunanem povprečju preživelo 39 % izsečkov

(Grafikon 2). Pri genotipu 2 je v povprečju preživelo 33 % izsečkov, pri genotipu 3 pa je v

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

G1-o G1-z G2-o G2-z G3-o G3-z Povprečje

40%

62%

50%

25%

11%

38%

12%

25%

60%

32%

62%

45%

57% 55%

75%

60%

40%

0%

11%

0%

31%

0% 0% 0% 0%

20%

0%

3%

72% 72%

2% dikloroizocinaurična kislina (A)

alkohol in natrijev hipoklorit (B)

Spitaderm in natrijev hipoklorit ( C)

kalcijev hipoklorit (D)

Oksyl ( E)

3% dikloroizocinaurična kislina (F)



39

povprečju preživelo 37 % izsečkov. Razlike so se med genotipi pojavile tudi pri odstotku

okuženih izsečkov po sterilizaciji. Največ, 66 % okužb, se je pojavilo pri genotipu 2. Ostala

dva genotipa sta imela v povprečju primerljiv odstotek. Genotip 1 se je okužil v 58 % in

genotip 3 v 57 %. Za nadaljnje raziskave mikropropagacije smo izbrali genotip 3, pri katerem

smo imeli največji odstotek preživelih izsečkov pri sterilizaciji s 3 % dikloroizocinaurično

kislino.

Grafikon 2: Povprečni odstotek okuženih, odmrlih in preživelih izsečkov pri posameznih

genotipih.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

Genotip 1 Genotip 2 Genotip 3

58%

66%

57%

3% 1%

6%

39%

33%37% % okuženi

% odmrli

% preživeli



40

Grafikon 3: Odstotek uspešno sterilizirane rastline treh genotipov po šestih metodah

sterilizacije.

4.3 Vpliv sestave gojišča na uspešno vzpostavljeno kulturo izsečkov

Askorbinska kislina je močan antioksidant, ki pri mikropropagaciji lahko preprečuje ali

zavira oksidacijske procese. Zraven antioksidativne vloge pa askorbinska kislina sodeluje

tudi pri procesih celične delitve in rasti. Pri nekaterih rastlinah ima dodatek pozitivno, pri

nekaterih pa negativno vlogo, kar je lahko odvisno tudi od genotipa rastline

(http://www.arpapress.com/volumes/vol15issue1/ijrras_15_1_02.pdf).

V nekatera gojišča smo dodali askorbinsko kislino, ki pa ni imela pozitivnega vpliva na

razvoj izsečkov, saj je pri vseh obravnavanjih preživelo več izsečkov v gojiščih brez dodane

askorbinske kisline (Grafikon 4). Pri prvem obravnavanju je v gojišču brez askorbinske

kisline preživelo 50 % izsečkov, ob dodatku askorbinske kisline pa je preživelo 20 %

izsečkov. Pri drugem obravnavanju je brez askorbinske kisline preživelo 60 %, ob dodani

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

Genotip 1 Genotip 2 Genotip 3

51%

56%

46%

13%

25%

55%

63% 60%

51%

68%

20%

6%0% 0%

10%

72%

A

B

C

D

E

F



41

pa 50 % izsečkov. Tretje obravnavanje je dalo spet 60 % preživelih izsečkov v gojišču brez

askorbinske kisline. Pri dodani askorbinski kislini pa je preživelo 42 % izsečkov. V

nadaljnjih raziskavah askorbinske kisline nismo dodajali v gojišče. V gojiščih lahko dodamo

askorbinsko kislino, ki lahko zmanjšuje oksidacijo fenolov. Ti lahko povzročajo propadanje

izsečkov. Askorbinska kislina tako lahko poveča regeneracijo poganjkov.

Grafikon 4: Vpliv dodane askorbinske kisline na uspešnost preživetja izsečkov pri treh

obravnavanji

Documents

PRAVEGA KOSTANJA (Castanea sativa Mill.) · Pravi kostanj (Castanea sativa) je lesnata rastlina, ki se težje razmnožuje tako generativno s semenom kot vegetativno s cepljenjem ali