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UNIVERSIDAD DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
LABORATORIO DE BIOELECTROQUÍMICA
"PREPARACIÓN, CARACTERIZACIÓN ELECTROQUÍMICA Y REACTIVIDAD DE NUEVAS
1,4-DIHIDROPIRIDINAS-4R-SUSTITUIDAS"
TESIS PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR EN QUÍMICA
RICARDO ANDRÉS SALAZAR GONZÁLEZ
Directores de tesis: Dr. Luis J. Núñez Vergara Dr. J. Arturo Squella Serrano
SANTIAGO-CHILE
2008
Este trabajo fue posible gracias al apoyo financiero de los proyectos FONDECYT
1050761 y Beca CONICYT de apoyo a la realización de tesis nº23070093. Se
agradece el apoyo de CONICYT, beca para estudiantes de postgrado año 2004 y
beca de término de tesis. A la Universidad de Chile por la beca de arancel de
estudios de doctorado. Al MECESUP y el proyecto UCH 0408 por las becas para
estancias en laboratorios nacionales e internacionales.
Se agradece también la colaboración del Centro de Estudios para el
Desarrollo de la Química (CEPEDEQ) y del Laboratorio de Análisis Antidoping de
la facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.
Quiero agradecer al grupo de Bioelectroquímica por su colaboración
en el desarrollo de este trabajo. Particularmente agradezco a mis directores de
tesis Arturo Squella y Luis Núñez, por confiar en mí desde un comienzo, por
enseñarme, apoyarme y guiarme, y también por su amistad y confianza.
Agradezco por igual a Soledad Bollo y Claudia Yáñez, a quienes también
considero mis directoras de tesis y sobretodo, grandes amigas. También quiero
agradecer a los profesores Patricio Navarrete y Juan Carlos Sturm por su gran
disposición y colaboración.
A mi madre, porque llena esa palabra en su totalidad.
A mi abuelo, porque me enseña a luchar día a día.
A Paola, porque cualquier lugar es bueno con ella.
Otros agradecimientos…
Y bueno… llegó el momento. Quizá algunos de ustedes sólo lean esta página y por eso espero mencionar a todos quienes de alguna u otra manera estuvieron conmigo durante estos años y que contribuyeron a que esta difícil tarea resultara más agradable, más llevadera y más gratificante. También para todos los que no entendían que hacía yo con 30 años en la Universidad o aquellos que me preguntaban una y otra vez: ¿Cuánto te falta para terminar? Para todos ustedes muchas gracias!!!
Bueno, comencemos… En primer lugar quiero agradecer a mi familia porque siempre me hacen
sentir querido y me demuestran a diario lo orgullosos que están de mí. A mi madre, mi abuelo, mi padre, abuela, tíos y primos. Los amo.
A los mejores amigos del mundo: Paola (curruñis) porque sin dudas estos años no habrían sido tan llevaderos si tú no hubieras estado a mi lado, donde pasamos de todo (momentos buenos, otros malos y otros muy pero muy buenos), y siempre estábamos el uno para el otro… gracias por escucharme, acompañarme, soportarme y quererme; Diana (munrra quetzacoatl), que aunque estabas a gran distancia física, siempre me acompañaste y me dabas ánimos para continuar; Karla (barbie araukana), que con tu particular sentido del humor siempre eras capaz de subirme el ánimo y devolverme la sonrisa aun en los peores momentos; Cristián y Roberto , por todos los buenos momentos pasados en estos años, donde nos reímos del resto y de nosotros mismos, donde nos acompañamos en las buenas, en las malas y en aquellas que es mejor no recordar. También agradezco a Tito, Daniel, Clarita y Marco. Gracias a todos por demostrarme siempre cuanto me quieren y por ser los mejores amigos del mundo.
A todos los profesores que me guiaron y me ayudaron en el desarrollo de la tesis y en mi formación profesional, por su colaboración, sus enseñanzas y por la amistad: Hernán Pessoa, Inés Ahumada, Pablo Richter, Claudio Olea, Alejandro Álvarez, Diego Venegas, Jacqueline Pezoa, Leonardo Guzmán y Marcelo Kogan.
A los profesores Jorge Fuentealba y Luis Aguayo de la Universidad de Concepción y al Profesor Rodolfo Lavilla del Parc Científic de Barcelona por hacerme sentir en casa estando lejos de ésta. A todos aquellos colegas y memoristas del laboratorio de bioelectroquímica que hicieron que los días largos resultaran más agradables. Así también al grupo de Neurofisiología de la Universidad de Concepción y de Biosyner en el Parc Científic de Barcelona.
Agradezco especialmente también a Cecilia, Ximena, Gisella, Benito y José por su gran disposición y colaboración.
Las siguientes publicaciones han sido generadas en el desarrollo de
esta tesis:
1. R. Salazar, P. A. Navarrete-Encina, C. Camargo, J. A. Squella and Luis J.
Núñez-Vergara. “Oxidation of 4-(3-Indolyl) and 4-(5-Indolyl)-1,4-Dihydropyridines
in aprotic and protic media. Reactivity towards alkylperoxyl radicals”. J.
electrochem. Soc. In Press.
2. R. Salazar, P. A. Navarrete-Encina, C. Camargo, J. A. Squella and Luis J.
Núñez-Vergara. “Reactivity of C4-Indolyl substituted 1,4-Dihydropyridines
towards superoxide anion (O2•) in dimethylsulfoxide”. J. Phys. Org. Chem. DOI
10.1002/poc.1453.
3. R. Salazar, P. A. Navarrete-Encina, C. Camargo, J. A. Squella and Luis J.
Núñez-Vergara. “Electrochemical oxidation of C-4-Vanillin and C-4-Isovanillin-
1,4-Dihydropyridines in aprotic medium. Reactivity towards free radicals”. J.
Electroanal. Chem. 622 (2008) 29-36.
Índice
1. Introducción…………….…………………………………………………………….1 2. Hipótesis ………………………………………………………………………………6 3. Objetivos
a. Generales …………………………..…………………………………...……6 b. Específicos ………………………..…………………………………………7
4. Materiales y métodos 4.1. Materiales
4.1.1. Reactivos y solventes …………....…………………………..8 4.1.2. Tampones ...………………………………………………………....8 4.1.3. Material de vidrio …..………………………………………………8 4.1.4. Equipos ..…………………………………………………………….9
4.2. Métodos 4.2.1. Preparación de soluciones de trabajo …….…...…………… 12
4.2.2. Caracterización electroquímica y espectroscópica. Estudio de la reactividad con radicales libres .......……………………12
5. Resultados y discusión 5.1. Preparación de los derivados …………………………………..20 5.2. Medio aprótico …………………………………………………….26
5.3. Reactividad frente al anión radical superóxido …………….58 5.4. Medio prótico ……………………………………………………..81
5.5. Reactividad con radicales alquilperoxilo (ROO•) ABAP-
derivados …………………………………………………………..88 5.6. Análisis conformacional de los compuestos sintetizados ..93
5.7. Estudios biológicos ……………………………………….….....104
6. Breve discusión de los resultados ……………………………………........…110 7. Conclusiones ……………………………………………………....………....…..119 8. Presentaciones a congresos ………………………………………….………..120 9. Referencias bibliográficas ……………………………………………….……..122
Resumen
La presente tesis reporta la síntesis, la caracterización electroquímica en
medio aprótico y prótico, y la reactividad frente a radicales libres nuevos compuestos
1,4-dihidropiridínicos (1,4-DHPs). Los compuestos diseñados presentan dos centros
susceptibles a oxidación: el anillo 1,4-dihidropiridínico y los sustituyentes en la
posición-4 del mismo (indol y o-metoxifenol). Se evaluó el efecto de ambos centros
redox en el proceso oxidativo y la influencia de los sustituyentes frente a radicales
libres (anión radical superóxido y radicales alquilperoxilo). Los estudios por voltametría
de pulso diferencial (VPD), voltametría cíclica (VC) y voltametría de barrido lineal
(sobre electrodo rotatorio), mostraron dos señales simples e irreversibles. En el caso
de las 1,4-DHPs que poseen un sustituyente indol en la posición-4, la primera señal
corresponde a la oxidación del anillo dihidropiridínico y la segunda a la oxidación del
indol. Las 1,4-DHPs con un sustituyente o-metoxifenol presentaron un primer proceso
oxidativo correspondiente a la oxidación del fenol de la posición-4 y el segundo paso
anódico correspondiente a la oxidación del anillo 1,4-DHP.
Experimentos por electrólisis a potencial controlado (EPC) acoplada con
resonancia de espín electrónico (atrapamiento con PBN) confirmaron la generación de
un radical piridinio como intermediario de la reacción electródica y la posible formación
de otro radical que incluye al segundo núcleo redox. El producto final de la EPC fue
estudiado por espectroscopía UV-visible, cromatografía líquida de alta eficiencia
(HPLC) y cromatografía gaseosa con detector de masas (GC-MS). Por esta última
técnica fue posible identificar en medio aprótico y prótico, al derivado piridínico como
producto final de la electro-oxidación.
Mediante VC se estudió la interacción de los derivados frente al O2●
electrogenerado. Por este método, se encontró que los derivados o-metoxifenol 1,4-
DHPs disminuyeron en un 50% la razón de corriente de la cupla O2/ O2●. Mediante
espectroscopía UV-visible se establecieron las constantes cinéticas de pseudo primer
orden para la reacción de los derivados frente al O2●, las que fueron determinadas de
manera indirecta en función de la especie aniónica. Por esta técnica, los derivados C4-
indolil 1,4-DHP fueron los más reactivos. La reactividad frente a los radicales
alquilperoxilo arrojó resultados similares.
En todos los experimentos se comparó los resultados a los compuestos no
sustituidos y 1,4-DHPs comerciales, siendo los compuestos sintetizados, los más
reactivos. El producto final de la reacción entre los derivados y los radicales
estudiados correspondió al derivado piridínico.
Abstract
The present thesis reports the synthesis, electrochemical characterization in
protic and aprotic media, and the reactivity towards free radicals of new 1,4-
Dihydropyridines (1,4-DHPs). The derivatives own two redox centers: the 1,4-
dihydropyridine ring, and the substituents in C4-position, indole and o-methoxyphenol
moieties. It was studied the interaction between both redox centers in the anodic
process and the effect of the inclusion of the subtituents about the reactivity towards
free radicals (superoxide radical anion and alkylperoxyl radicals). Studies by
differential pulse voltammetry (DPV), cyclic voltammetry (CV) and linear sweep
voltammetry on rotating disk electrode, revealed two signals. The C4-Indolyl 1,4-
dihydropyridines showed that the first signal is due to oxidation of the dihydropyridine
ring and the second one is due to oxidation of the indolyl moiety. The oxidation peaks
in the derivatives C4-methoxyphenol substituted can be assigned as follows: -those
appearing at lower potential values belong to the oxidation of the OH group and the
remaining ones correspond to the oxidation of DHP ring.
Controlled potential Electrolized (CPE) studies were conducted in the ESR cell
in the presence of N-tert-butylamine-α-phenylnitrone (PBN). The above splitting
constants for the spin adducts are consistent with the fact that PBN interacts with
carbon-centered radicals and other intermediates probably involving the indole moiety.
The final product of the CPE was assessed by UV-Vis spectroscopy, HPLC and GC-
MS. By means of this latter technique, the pyridine derivative was identified as the final
product of the electro-oxidation both in aprotic and protic media.
Ipa/Ipc (anodic/cathodic current ratio) corresponding to the oxygen/superoxide
anion couple (O2/O2●) was used to assess the reactivity of 1,4-DHPs towards
superoxide anion in dimethyl sulfoxide. Addition of different concentrations of 1,4-
DHPs, significantly decreased the current ratio of the couple, indicating that tested 1,4-
DHPs reacted with the radical. The derivatives V-DHP and I-DHP decreased the
Ipa/Ipc ratio to approximately 50%. By UV-visible spectrophotometry we calculated
apparent kinetic rate constant values in a pseudo first order conditions for the
derivatives towards O2●. C4-Indolyl 1,4-DHPs were more reactive than the commercial
derivatives. The reactivity of the derivatives towards alkylperoxyl radicals shows similar
results. Analyses of the reaction products between 1,4-DHPs derivatives and free
radicals permit us the identification of the pyridine derivative as the final product.
1. Introducción
Las 1,4-dihidropridinas (1,4-DHPs) son fármacos que tienen la característica de
bloquear el Canal de calcio tipo L voltaje dependiente en numerosos tipos celulares
como el músculo esquelético, cardíaco y la musculatura lisa. En consecuencia,
presentan una importancia clínica significativa, lo que ha motivado su desarrollo e
investigación para mejorar su aplicación en patologías cardiovasculares como la
hipertensión y la angina pectoris [i-iii].
Figura 1. Estructura Básica de las 1,4-dihidropiridinas
El farmacóforo de este tipo de bloqueadores de canales de Ca+2 es el anillo
dihidropiridínico y su actividad farmacológica está directamente relacionada con los
sustituyentes presentes en dicho anillo. La presencia de un grupo arilo en posición 4
potencia su actividad antagonista, la cual se ve favorecida con sustituyentes
electroatractores y electrodonores, mientras que grupos éster en las posiciones 3 y 5
influencian la selectividad vascular. Es por esto que modificaciones estructurales
pueden hacer la diferencia sobre la potencia del fármaco y la selectividad sobre los
canales de calcio donde éstos actúan [iv-vi]. Desde el descubrimiento de los efectos farmacológicos de estos compuestos,
se ha generado un gran interés por determinar qué tipo de estructura produce el efecto
óptimo con el propósito de mejorar la potencia en su efecto antagonista/agonista de
canales; y qué relevancia farmacológica tienen algunos cambios estructurales, de
manera de diseñar compuestos más seguros y con menos efectos indeseables. Así, el
1
H N
R 2 H C
R
O
R 2
O
O
R 1
p
m
o
O
Crítico
Grupos alquil y aminoalquil
Función éster paraantagonismo óptimo:-CO2R >COMe>CN>H
Centro quiral:
estereoselectividadAngulo de torsión
del anillo aril
Sustituyentes o ≥ m ≥ pElectroatractorElectrodonor
1
2 34
56
H N
R 2 H C
R
O
R 2
O
O
R 1
p
m
o
O
Crítico
Grupos alquil y aminoalquil
Función éster paraantagonismo óptimo:-CO2R >COMe>CN>H
Centro quiral:
estereoselectividadAngulo de torsión
del anillo aril
Sustituyentes o ≥ m ≥ pElectroatractorElectrodonor
1
2 34
56
estudio de las 1,4-DHPs en este aspecto, ha permitido avanzar sobre el conocimiento
acerca de los posibles mecanismos moleculares que dan cuenta de la transferencia de
protones o átomos de hidrógeno, en reacciones mono- o bi-electrónicas en las que
participan este tipo de coenzimas que cumplen un rol muy importante como cofactores
de diversas óxido-reductasas involucradas en procesos vitales.
Estudios sobre 1,4-DHPs con variaciones en los sustituyentes de las
posiciones 1 y 4, han mostrado que afectan el efecto antagonista sobre los canales de
calcio [vii,viii]. Así por ejemplo, al reemplazar el protón de la posición-1 por grupos
alquilo, el efecto bloqueador sobre canales de calcio, se pierde completamente,
demostrando así la importancia de la existencia del nitrógeno amínico secundario de
la 1,4-DHP. En forma análoga, si se reemplaza en la posición-4 el grupo arilo por
grupos menos voluminosos, como un grupo metilo, se obtienen compuestos agonistas
de canales de calcio, esto es, aumenta la actividad sobre los mismos, facilitando la
entrada de calcio al citoplasma y por lo tanto, produciendo contracción vascular y un
aumento de la presión arterial [ix].
Ahora bien, analizando las 1,4-DHPs desde el punto de vista de la
metabolización en el organismo, se ha encontrado que éstas sufren una rápida y
extensa transformación por la oxidación por enzimas hepáticas, debido a la acción del
sistema CYP 3A dando origen a la piridina correspondiente, la cual es
farmacológicamente inactiva [x-xii]. Es por esta razón, que la oxidación de 1,4-DHPs ha
despertado también un gran interés para la investigación en química orgánica y en
electroquímica. Recientemente, se ha establecido que las 1,4-DHPs son oxidadas
cuando reaccionan con algunos endobióticos de relevancia biológica. Un ejemplo de
lo anterior, lo constituye la reacción de 1,4-DHPs con óxido nítrico (NO), un radical
libre gaseoso que cumple importantes funciones biológicas de regulación dentro del
organismo y que se forma a partir de L-arginina por acción de óxido nítrico sintasa. A
resultados similares, se ha arribado al ensayar donores de NO, tales como, N-metil-N-
nitrosotolueno-p-sulfonamida (MNTS) o S-Nitroso glutatión [xiii,xiv]. En todos los casos,
se ha encontrado como producto final de la reacción, el derivado oxidado de la 1,4-
DHP, esto es, la piridina correspondiente.
Estudios acerca de la oxidación electroquímica de 1,4 DHPs se han realizado
en medio acuoso y en diferentes solventes orgánicos como Dimetilsulfóxido (DMSO),
Acetonitrilo, N-N Dimetilformamida, etc [xv-xxii]. En este medio, se ha reportado que el
mecanismo de electroxidación es de tipo ECEC, donde la primera etapa consiste en la
remoción de un electrón de la molécula inicial de 1,4-DHP lo que lleva a la formación
de un catión radical 1,4-DHP•+. Este catión radical pierde un protón rápidamente
formando un radical neutro, Py•, el cual se oxida a un catión dihidropiridínico -(a un
2
potencial igual o menor que la primera etapa)-, para producir cationes Py+, el que
pierde un segundo protón para formar el derivado piridínico. En medio no acuoso y a
pHs ácidos, se observa el mismo mecanismo, mientras que en medio básico el
mecanismo es del tipo DISP-1. Cualquiera sea el medio en el que se realiza la
electrooxidación, el producto formado corresponde a la piridina [xxiii-xxx].
En la actualidad se sabe con certeza que el daño oxidativo juega un rol crucial
en el envejecimiento y en varios desórdenes patológicos, entre los que se incluyen la
ateromatosis, la inflamación, la diabetes, la hipoxia y muchos desórdenes
neurológicos. En el caso particular de la hipertensión, se ha establecido una relación
causal entre ésta y el estrés oxidativo provocado por los radicales libres. Por lo tanto,
la propiedad adicional como antioxidantes que han manifestado las 1,4-DHPs aparece
como una característica relevante con vistas hacia el futuro, en orden a mejorar su
espectro terapéutico. Se ve entonces la importancia de diseñar nuevas moléculas con
actividad potencial para inhibir los procesos mencionados.
En los últimos años numerosos autores han descrito actividades antioxidantes
para las 1,4 DHPs, lo que involucraría una desactivación de los radicales libres o la
preservación de la actividad de la Superoxido-dismutasa (SOD) [xxxi].
En relación con los estudios sobre los efectos antioxidantes de 1,4-DHPs,
éstos presentan al menos dos características distintivas: a) La primera, es el hecho
que gran parte de ellos se sustentan en un efecto antioxidante de tipo indirecto
[xxxii,xxxiii] o bien se trata de estudios en que se mide el daño sobre algún blanco en
ausencia y en presencia de 1,4-DHP. En general, se estudian daños lipoperoxidativos
sobre membranas lipídicas o bien sobre lipoproteínas que transportan colesterol [xxxiv].
Asimismo, la metodología empleada para determinar los efectos antioxidantes de las
1,4-DHPs son de tipo indirecto [xxxv,xxxvi]. En consecuencia, no se han encontrado en la
literatura estudios sistemáticos sobre relaciones estructura química-actividad con
respecto a la reacción directa entre 1,4-DHPs y radicales libres.
En estudios recientes se ha reportado la reacción directa entre una serie
comercial de 1,4-DHPs y anión superóxido [xxxvii-xxxix]. Estos estudios se condujeron en
medio aprótico (DMSO) utilizando voltametría cíclica como técnica principal,
generando el radical anión superóxido electroquímicamente. A partir de estos estudios
electroquímicos, se concluyó que estas moléculas reaccionan directamente con el
anión radical superóxido y que la reactividad no es afectada en gran medida por los
substituyentes de las posiciones 3 y 5 del anillo. Por otra parte utilizando la
microscopía de barrido electroquímico se establecieron constantes de interacción
entre diferentes 1,4-DHPs y el anión radical superóxido mostrando diferencias en
dicha interacción dependiendo de los substituyentes presentes en las posiciones-3 y 5
3
del anillo dihidropiridínico [xl]. Además se identificó, por cromatografía gaseosa
acoplada a detector de masas, a la piridina como producto final de esta reacción y se
concluye que la presencia del nitrógeno de la posición-1 en la molécula de 1,4-DHP,
resultó ser fundamental para la velocidad de reacción.
Los radicales libres de mayor relevancia biológica son las especies reactivas
del oxigeno (ROS), entre los que destacan el anión radical superóxido (O2●) y el radical
hidroxilo (·OH), ya que estos se generan a partir del propio metabolismo de los
organismos que utilizan el oxigeno como aceptor final de electrones para la producción
energética. En esta tesis se estudió la reactividad de 5 nuevas 1,4-DHPs y otras 3 1,4-
dihidropiridinas de uso comercial frente al anión radical superóxido, debido a que este
es el de mayor abundancia en los sistemas biológicos, pero no el único, y su
generación puede deberse tanto a procesos enzimáticos como no enzimáticos
(esquema 1). El estudio de la reactividad de las dihidropiridinas frente a anion radical
superoxido se realizó en medio no acuso (dimetilsulfoxido) debido a que le otorga
mayor estabilidad a las soluciones de este radical.
Esquema 1. Generación de anión radical superóxido.
4
Compuesto Oxidado Compuesto
Reducido
NADP + NADPH NADPH - citocromo P 450 reductasa
O 2 O 2 .-
H 2 O 2 H 2 O + O 2
S.O.D.
H 2 O
Catalasa
Fe 2+ Cu +
. OH
GSH
GSSG GSH Reductasa
Xantina oxidasa activada
Glutatión Peroxidasa
NADPH NADP +
NO.
ONOO-
El núcleo indol es uno de los sutituyentes que se incluyeron en la posición C4
de las 1,4-DHPs, ya que además de ser electroactivo no es ajeno al organismo puesto
que está presente en algunos neurotransmisores como la melatonina, la serotonina y
triptófano, por nombrar algunos. Además, como núcleo está presente en compuestos
que poseen una gran variedad de propiedades biológicas como anti-inflamatorias,
antibacteriales, anticonvulsionantes y antioxidantes, específicamente como protectores
del sistema nervioso central [xli-xliii]. Por esto, se sintetizaron dos compuestos que
presentan un anillo dihidropiridínico y un anillo indol, teniendo así, dos centros redox
en una misma molécula: 4-(3-indolil)-1,4-dihidropiridina y 4-(5-indolil)-1,4-
dihidropiridina. Previamente, Lavilla y colaboradores reportaron la síntesis, el efecto
farmacológico y la inhibición de EROs de una serie de 4-(3-indolil) dihidropiridinas, las
que mostraron una potencia similar a Nifedipino [xliv].
Los otros sustituyentes considerados en este estudio son derivados de la
vainillina e isovainillina. Vainillina, 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehido, es el mayor
componente de la vainilla, la cual es uno de los savorizantes más importante y más
usado a nivel mundial. En común con muchos otros compuestos fenólicos de bajo
peso molecular, la vainillina presenta propiedades antioxidantes [xlv-xlix]. Vainillina es un
compuesto electroactivo posible de cuantificar electroanalíticamente, tanto en la
vainilla como en los productos finales en los cuales ésta se agrega, mediante
amperometría, voltametria de pulso diferencial u onda cuadrada [ l-lii]. Por otra parte,
recientemente se desarrolló un sensor detector de vainillina basado en electrodos
impresos [liii].
En la presente tesis, se estudió la oxidación electroquímica en medio aprótico y
prótico de dos isómeros del tipo C4-indolil 1,4-DHP y dos isómeros C4-hidróxi-metóxi-
fenil 1,4-DHP. Además, se midió la reactividad de los compuestos frente al anión
radical superóxido en dimetilsulfóxido mediante técnicas electroquímicas y
espectrofotométricas; y de radicales alquilperoxilo ABAP-derivados en medio prótico.
En ambos casos se establecieron las constantes cinéticas aparentes de reactividad. A
modo de comparación y para visualizar el efecto provocado por los sustituyentes en el
anillo dihidropiridínico, es que se estudió electroquímica y espectrofotométricamente el
indol, el guayacol (2-metoxi-fenol) y una 1,4-DHP C4-fenil sustituida, además de tres
1,4-DHPs comerciales (amlodipino, nisoldipino y nimodipino). Se espera que la
inclusión de dos centros redox en una misma molécula afecte tanto el comportamiento
electroquímico como su reactividad frente a los radicales libres propuestos.
5
2.-Hipótesis.
Hipótesis de trabajo.Se espera que la presencia de dos centros redox en una misma molécula
afecte significativamente el comportamiento electroquímico respecto a la oxidación
electroquímica de, por una parte: el anillo 1,4-DHP y el indolil en posición 4; y del anillo
1,4-DHP y el –OH del grupo hidroxi-metoxifenol. Además se espera ver diferencias
significativas entre isómeros de posición. Se espera también que la inclusión de éstos
nuevos sustituyentes en posición 4 del anillo dihidropiridínico sinergice su reactividad
frente a radicales libres.
3. Objetivos.
a) Generales .
1. Sintetizar 1,4-DHPs con un sustituyente indol, 4-hidróxi-3-metoxifenil y 3-hidróxi-4-
metoxifenil en la posición-4.
N
H
O
O
O
O
N
H
N
H
O
O
O
O
N
H
N
H
O
O
O
O
OH
OCH3
N
H
O
O
O
O
OCH3
OH
N
H
O
O
O
O
3-Ind-DHP 5-Ind-DHP
V-DHP I-DHP Fenil-DHP
1,4-dihidropiridinas propuestas en esta tesis
2. Evaluar la influencia en el mecanismo electrooxidativo de la coexistencia de dos
centros susceptibles a oxidación en una misma molécula. Caracterizar o
6
determinar productos finales e intermediarios en el proceso electrooxidativo.
3. Establecer los mecanismos involucrados en el apagamiento de los radicales por
parte de las 1,4-DHPs sintetizadas y buscar correlaciones entre potenciales de
oxidación y reactividad con radicales libres.
b) Específicos .
1. Sintetizar derivados de 1,4-DHPs conteniendo un substituyente indol, 4-
hidróxi-3-metoxifenil y 3-hidróxi-4-metoxifenil. Los compuestos sintetizados se
caracterizarán por RMN, IR-FT, análisis elemental.
2. Caracterización de la oxidación electroquímica en medio aprótico y prótico
de la serie de 1,4-DHPs propuesta, a través de técnicas electroquímicas
(voltametría de pulso diferencial, voltametría cíclica, voltametría lineal con
electrodo de disco rotatorio, electrolisis a potencial controlado), espectroscópicas
(UV-Vis, RPE) y cromatográficas (HPLC, GC-MS).
3. Caracterización sistemática de la reactividad de la serie con anión radical
superóxido y radicales alquilperoxil-ABAP derivados, a través de la determinación
de sus reactividades relativas.
4. Determinación de los mecanismos de reacción entre las 1,4-DHPs
sintetizadas y los radicales propuestos. Buscar correlaciones entre potenciales de
oxidación y la reactividad con radicales libres. Se comparará los valores de
constante de reactividad obtenidos con 1,4-DHPs comerciales como amlodipino,
nisoldipino y nimodipino, las cuales son de uso habitual en la clínica.
7
4. Materiales y métodos.
4.1 Materiales. 4.1.2. Reactivos y solventes.
• Acetoacetato de etilo, Merck.
• Ácido acético glacial, p.a. Merck.
• Ácido bórico (99%) p.a., Fluka Chemica.
• Ácido clorhídrico (36%) p.a., Reutter.
• Ácido fosfórico (85%) p.a., Merck.
• Agua purificada para HPLC (Milli-Q).
• (2,2 azobis (2 - amidinopropano)) diclorhidrato (ABAP), 98%. Sigma.
• Cloruro de potasio, p.a., Merck.
• Dimetilsulfóxido (DMSO) p.a., Merck.
• Dimetilsulfóxido (DMSO) p.a., Winkler.
• Dimetilsulfóxido-d6 (DMSO-d6) Sigma.
• Etanol absoluto (99,8%) p.a., Merck.
• Guayacol (98%) p. a., Merck.
• Hexafluorofosfato de tetrabutil amonio (HFFTBA), Merck.
• Hidróxido de amonio concentrado, Merck.
• Hidróxido de tetrabutilamonio, Merck
• Hidróxido de sodio (pellets), Merck.
• Indol, Aldrich.
• Indol 3-carboxaldehído, Aldrich.
• Indol 5-carboxaldehído, Aldrich.
• Nitrógeno (99%), AGA.
• Nifedipino (99%) p.a., Merk.
• Nitrógeno extra puro, INDURA.
• N,N-Dimetilformamida. p. a., Merck
• Oxígeno (99%), AGA.
• Superóxido de potasio (KO2), Aldrich.
4.1.2. Tampones.
• Britton Robinson 0,04 M, con fuerza ionica ajustada con KCl en una
concentración 0,1 M.
8
4.1.3. Material de vidrio.
• Todo el material de vidrio utilizado fue clase A.
4.1.4. Equipos. a) Equipos usados para el análisis de productos de síntesis:
• Espectroscopía NMR: espectrómetro Bruker Avance DRX 300.
• FT-IR: espectrómetro Bruker IFS 55 Equinox.
• Análisis elemental: Fisons Instrument.
b) Equipos de uso general:
• Balanza de precisión Precisa 40SM-200ª (sensibilidad 0,01 mg).
• Sonicador Bransonic Branson 2210.
• Medidor de pH WTW modelo pMx 3000.
• Agitador magnético Heidolph MR 3002.
• Sistema purificador de agua Milli-Q Ultra- Pure Water System.
c) Sistema voltamétrico y computacional:
• Analizador voltamétrico BAS CV-50W y BAS CV-100W.
• Celda electroquímica BAS (10 mL) protegida de luz.
• Electrodo de trabajo: electrodo de carbón vítreo (glassy carbon MF-2070).
• Electrodo auxiliar: platino BAS MW-1032.
• Electrodo de referencia: Ag/AgClsat BAS RE-5B.
• PC pentium II Gateway para adquisición y tratamiento de datos.
d) Sistema espectroscópico UV-vis:
• Espectrofotómetro UV-vis CHEMSTATION diode array.
• Software 845X UV-Visible System.
• Copyright Agilent Technologies 95-03 para tratamiento y adquisición de datos.
e) Sistema cromatográfico (HPLC):
• Columna cromatográfica Kromasil 100-5C18 (4,6 x 150 mm).
• Precolumna: C-18 µBondapak (30 x 4,6 mm).
• Inyector: 20 µL.
• Bomba Waters 600 Controller Millipore Model code 6CE.
• Detector de arreglo de fotodiodos Waters 996.
9
• Jeringa Hamilton 81065 de 25µL.
• PC 486 Computer Multy Sync 4D con programa MILLENIUM 2,1.
f) Espectroscopía EPR:
• Espectrómetro Bruker ECS 40 XG con 50 kHz de modulación de campo.
• Electrodo de trabajo, malla de Platino confeccionada en el laboratorio.
• Alambre de platino utilizado como contraelectrodo.
g) Cromatografía gaseosa con detector de masas, GC-MS:
• Cromatógrafo gaseoso con detector de masas Hewlett Packard 5890/5972
(Palo Alto, California, USA) y autosampler Hewlett Packard 7673.
• Computador Hewlett Packard Pentium II.
• Columna cromatográfica: Hewlett-Packard Ultra-1,25 m x 0,2 mm i.d. x 0,11
(Little Falls, Wilmington, Delaware, USA).
h) Cálculos teóricos:
• Todos los cálculos se realizaron usando el programa Jaguar 5.5 [liv] y Titan
1.0.8.
i) Registros de Ca+2 intracelular.
• Los transientes espontáneos de Ca+2 fueron detectados con la sonda
fluorescente sensible a Ca2+, Fluo4-AM® (2µM, Molecular Probes). Las
neuronas se colocaron en la cámara de perfusión de un microscopio (Nikon, TE
2000). Los cambios del Ca+2 citosólico fueron registrados con una cámara CCD
(SensiCam, 12BIT CCD PCO) y una interfase Lambda 10-2 (Sutter
Instruments, USA).
j) Registros Electrofisiológicos.
• Los registros de corrientes se realizaron con la técnica de Patch-Clamp en la
configuración de célula entera y fijación de voltaje, para ello se utilizó un
amplificador Axon 200-B (Axon Instrumentos, Union City, CA). Los
microelectrodos de Patch-Clamp se rellenaron con una solución que contienen
(en mM): 140 KCL, 10 BAPTA, 10 HEPES (pH 7.4), 4 MgCl2, 0.3 GTP y 2 ATP-
Na2, 300 mOSM. La solución externa contenía (en mM): 150 NaCl, 5.4 KCL,
2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 10 HEPES (pH 7.4) y 10 glucosa.
10
k) Determinación de CREB fosforilado.
• Para la detección de CREB fosforilado (CREB-P), las neuronas de médula
espinal fueron incubadas con una concentración 50 µM de Nifedipino, 4-Fenil-
DHP y 5-Ind-DHP durante 30 minutos, todos en presencia de un estimulo
depolarizante de alto K+ (60 mM). Una vez transcurrido este tiempo las células
fueron lavadas y tratadas para la medición de la concentración de proteína.
Una cantidad igual de proteína (6 µg) fue analizada por electrofóresis en gel de
polyacrylamide (PAGE). Las proteínas fueron transferidas a nitrocelulosa y el
CREB-P fue identificado mediante la técnica de “wester blot”, que usa un
anticuerpo específico (UpstateTM). La señal de CREB-P fue comparada con la
señal de una proteína cuyo nivel de expresión era el mismo en todas las
condiciones (control de carga), todas las imágenes se analizaron con el
programa ImageJ.
Figura 2. Efecto de las distintas DHPs sobre el nivel de fosforilación de CREB (CREB-P) analizado por western blot.
11
4.2. Métodos.4.2.1. Preparación de soluciones de trabajo.a) Soluciones de 1,4-DHP.
• Se prepararon soluciones stock de cada 1,4-DHP, con una concentración
constante de 0,1 M en DMSO o Etanol. Las soluciones de trabajo fueron
preparadas por dilución de la solución stock hasta obtener la concentración
deseada. Estas soluciones se mantuvieron refrigeradas a -10ºC y protegidas
de la luz para evitar su descomposición.
b) Soluciones tampón.Solución tampón Britton Robinson 0,04 M con fuerza iónica ajustada con KCl 0,1 M.
• Preparada con 1,5 g. de Acido Bórico, 1,7 mL de Acido O-Fosfórico y 1,4 mL
de Acido Acético Glacial, enrasando a un volumen de 1 L con agua destilada.
c) Solución de anión radical superóxido
• Se pesaron 0.071 gramos (1mmol) de KO2 y se disolvieron en 10 mL de
DMSO, quedando en una concentración 0,1 M. La mezcla fue sonicada durante
0.5-3 horas hasta obtener una solución de color amarillo pálido. La solución
almacenada a -40ºC permanece estable durante semanas sin aparente
descomposición. A partir de esta solución madre, se prepararon diferentes
soluciones.
4.2.2. Caracterización electroquímica y espectroscópica. Estudio de la reactividad con radicales libres.
a) Voltametría.
• Para los experimentos voltamétricos, voltametría de pulso diferencial (VPD) y
voltametría de barrido lineal (VBL) se utilizó como concentración de rutina 1
mM de cada 1,4-DHP, de guayacol y de indol en medio aprótico y de 100 µM
en medio prótico. Para voltametría cíclica (VC) las soluciones de trabajo
tuvieron una concentración de 1mM. La celda electroquímica estaba
compuesta de un electrodo estacionario de carbón vítreo, como electrodo de
trabajo (área = 0,0717± 0,004 cm2) para VPD y VC mientras que para VBL se
utilizó un electrodo de disco rotatorio de la misma naturaleza. Como
contraelectrodo se usó un alambre de platino y todos los potenciales fueron
medidos frente a un electrodo de Ag/AgCl. El electrodo de carbon vítreo fue
12
pulido antes de cada medición utilizando alumina de 0.3 and 0.05 µm de
diámetro.
Medio aprótico : se utilizó como solvente DMSO y como electrolito
soporte hexafluorofosfato de tetrabutilamonio (HFFTBA) 0,1 M.
Medio prótico : para este medio todas las soluciones se prepararon en
tampón Britton Robinson (0,04 M; KCl 0,1 M) / Etanol, 70/30. El pH del
medio se ajustó adicionando alícuotas de NaOH o HCl concentrado.
b) Espectrofotometría UV-visible.• Se prepararon soluciones de concentración 100 µM de cada
compuesto en DMSO. Para el estudio de la generación del anión 1,4-DHP, se
agregaron diferentes alícuotas de hidróxido de tetrabutilamonio 0,1 M. Para la
regeneración de la 1,4-DHP se utilizó CH3COOH en solución alcohólica. En
todos los casos los espectros se registraron entre λ = 200 y 1200 nm. En el
caso de medio prótico se comprobó que no existían cambios significativos a lo
estudiado en DMSO y se trabajó en el mismo rango de concentraciones. Las
soluciones stock para este medio se prepararon en etanol.
c) Cálculo del número de electrones transferidos en el proceso oxidativo.
• Estos estudios se basaron en la electrólisis exhaustiva a potencial controlado
de todos los compuestos (tabla 1) usando una celda de tres compartimentos.
Se utilizó una malla de carbón vítreo como electrodo de trabajo, un alambre de
platino como contraelectrodo y un electrodo de Ag/AgCl como electrodo de
referencia.
Para el cálculo del número de electrones se estimó la sumatoria de las cargas
finales (con corrección de la carga basal) de electrólisis sucesivas. Desde la
carga total neta y empleando la ecuación de Faraday (Q neta = n F e, donde
n= número de moles, F= constante de Faraday (96500 C / mol) y e= número de
electrones) se calculó el número de electrones transferidos por mol de 1,4-
DHP. Como las 1,4-DHPs C4 Indolil sustituidas poseen dos señales de
oxidación, al igual que V-DHP e I-DHP, las electrólisis se realizaron aplicando
en primer lugar un potencial aproximadamente 100 mV más alto que el
potencial de pico de la primera señal oxidativa y así obtener el número de
electrones involucrados en ese proceso. Luego, a soluciones nuevas se aplicó
un potencial aproximadamente 100 mV más alto que el potencial de pico de la
segunda señal oxidativa, obteniéndose el número de electrones totales
13
involucrados en la molécula, es decir, involucrando ambos procesos redox que
incluyen la oxidación del anillo 1,4-DHP y la oxidación del sustituyente en la
posición 4 de dicho anillo.
E / mV vs Ag/AgClMedio prótico Medio aprótico
Compuesto pH 3 pH 11Pico I Pico II Pico I Pico II Pico I Pico II
3-Ind-DHP 900 1300 500 750 1100 15005-Ind-DHP 900 1300 500 750 1100 1500fenil-DHP 800 --- 550 --- 1200 ---
V-DHP 800 1200 300 650 900 1280I-DHP 800 1200 300 650 900 1280
Tabla 1: Potenciales aplicados al electrodo de trabajo para el cálculo del número de electrones.
d) Estudio de la reactividad de las 1,4-DHPs frente al anión radical superóxido.
i) Voltametría cíclica. Los experimentos de voltametría cíclica se realizaron en
DMSO + 0,1 M de HFFTBA. Previamente a los experimentos de reactividad, el
DMSO fue secado con tamiz molecular de 3 A°. Se burbujeó oxígeno gaseoso
directamente en la celda de trabajo de manera de obtener una concentración
fija de oxígeno y durante el experimento el oxígeno gaseoso fue burbujeado
superficialmente sobre la solución.
Para obtener una concentración de trabajo 1mM de oxígeno en la celda, en
primer lugar se burbujeó nitrógeno extra puro durante 10 minutos para eliminar
todo el oxígeno presente en la solución. Luego, conociendo la solubilidad del
oxígeno en DMSO [lv,lvi] y utilizando un aparato formado por dos flujómetros
equipados con válvulas de agujas, una para oxígeno y la otra para nitrógeno,
se establecieron los flujos de ambos gases que pasan a través de la celda. Así
fue posible determinar la concentración requerida de oxígeno en la celda de
trabajo [lvii] de acuerdo a la siguiente ecuación:
CO2 = SO2 rO2
rO2 + rN2
donde:
SO2 : solubilidad de O2 en DMSO antes de mezclarse con N2 (2,1 mM).
rO2 : flujo de O2.
rN2 : flujo de nitrógeno.
14
Se fijó la concentración de oxígeno en 1mM en DMSO. Los estudios se
realizaron a 25° C ± 0,1. La velocidad de barrido utilizada fue de 100 mV / s. En
todas las mediciones se compensó la caída ohmica con el fin de minimizar
alguna resistencia no compensada.
La razón de corrientes ipa/ipc fue obtenida para cada voltamograma, aplicando
el método desarrollado por Nicholson [lviii] de acuerdo a la siguiente ecuación:
ipa = (ipa)0 + 0,485 (ips)0 + 0,086 ipc (ipc)0 (ipc)0
donde los datos experimentales utilizados en esa ecuación son:
(ipc)0 : intensidad de la corriente catódica (referida al 0 de corriente).
(ipa)0 : Intensidad de la corriente anódica (referida al 0 de corriente).
(ips)0 : Intensidad de la corriente en el potencial de switching o potencial
de inversión.
Este método se aplica siempre que el potencial de inversión sea mayor que el
potencial de pico catódico 60/n mV, donde n es el número de electrones que se
transfieren en el proceso redox.
i) Espectrofotometría UV-Visible. Los compuestos sintetizados presentan un
máximo de absorción alrededor de los 360 nm. Dicho máximo sufre un efecto
batocrómico en presencia de una base producto de la formación de un
compuesto de color amarillo intenso, debido a la deprotonación de los
nitrógenos amínicos y del fenol. Esta solución amarilla absorbe cerca de los
450 nm. El producto principal de la reacción entre el anión radical superóxido y
las 1,4-DHPs es la piridina correspondiente, la cual absorbe en la zona de los
280 nm. Por su parte, el anión radical superóxido presenta una gran banda de
absorción próxima a los 300 nm, la que interfiere con la absorción de la
piridina. Para solucionar este problema se implementó una metodología
indirecta de cuantificación para la formación de la piridina y así poder
determinar la constante de velocidad de la reacción entre el radical y la 1,4-
DHP.
Dado que el anión radical superóxido es una base fuerte, éste actúa en primera
instancia abstrayendo rápidamente los protones de los Nitrógenos secundarios
tanto del anillo 1,4-DHP como del grupo indolil en 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP, así
como el protón de la posición 1 del anillo dihidropiridínico y el protón del grupo
15
OH en la V-DHP e I-DHP, siguiendo el mismo esquema de reacción de una
base común, es decir formando el anión respectivo, para luego establecer un
equilibrio acido-base entre las 1,4-DHPs y su especie aniónica. A medida que
transcurre la reacción en el tiempo, la banda correspondiente al anión decae
considerablemente, mientras la zona de la 1,4-DHP se mantiene constante, por
lo que asumimos que el anión que desaparece reconstituye la 1,4-DHP que a
su vez es oxida a piridina, de esta manera la velocidad de desaparición del
anión para reconstituir la 1,4-DHP que pasa a piridina, es indirectamente la
velocidad de oxidación de las 1,4-DHP a sus respectivos derivados piridínicos.
Para establecer los valores de las constantes de reactividad de las 1,4-DHPs y
el anión radical superóxido, se consideró la zona de los 450 nm, donde
aparece o desaparece el anión formado a tiempos cortos. Para evaluar los
cambios producidos en su concentración se debieron realizar curvas de
calibración para cada 1,4-DHP de la siguiente manera: Se prepararon 6
soluciones de distintas concentraciones de cada 1,4-DHP (20, 40, 60, 80, 100,
120 y 150 µM) y a cada una se le adicionó un exceso de tetrabutilamonio
hidróxido (OHTBA, el doble de la concentración de 1,4-DHP en la cubeta), de
modo de desplazar todo el equilibrio hacia la formación del anión. Se tomó la
precaución que esto fuera cuantitativo y se consideró que las concentraciones
iniciales de las 1,4-DHPs inmediatamente después de la adición de la base
eran iguales a la del su anión. Así se obtuvo las absorptividades molares de las
especies aniónicas, mediante la ecuación de Lambert Beer.
e) Estudio de la reactividad de las 1,4-DHPs frente a radicales alquilperoxilos ABAP derivados.
Esquema 2: Formación de radicales alquilo y alquilperoxilo
El progreso de la reacción de las 1,4–DHPs con radicales alquilperoxilo fue
seguido por espectrofotometría UV-Vis. La solución resultante se analizó por
16
ABTS
+ O2
+
Cl-C
CH3
CH3
C+H2N
H2N
Cl-C
CH3
CH3
C+H2N
H2N
OO
N
SN N
-O3S
EtN
S
Et
SO3-
37ºC
Cl-C
CH3
CH3
C+H2N
H2N
OO
(734 nm)
N
SN N
-O3S
EtN
S
Et
SO3-
C
CH3
CH3
C+H2N
H2N NH2
N2H+
CH3
CH3
CCNN
Cl-Cl-+ N2
2
Cl-
C
CH3
CH3
C+H2N
H2NABAP
[1]
[2]
[3]
GC – MS. Como generador de radicales libres se utilizó (2,2 azobis (2 -
amidinopropano)) diclorhidrato (ABAP). ABAP es un azocompuesto que a
37ºC y pH 7,4 genera radicales alquilo o alquilperoxilo dependiendo si está en
ausencia o presencia de oxígeno (Esquema 2) [lix,lx].
Soluciones de 20 mM de ABAP en tampón Britton Robinson 0,04 M (KCL 0,1
M)/ DMF, 70 / 30 a pH 7,4 fueron incubadas con 100 μM de cada 1,4-DHP o
NADH a 37ºC por 150 minutos. Previo a cada incubación las soluciones se
burbujearon con oxígeno por 15 minutos. La velocidad de formación de
radicales desde ABAP no sería constante ya que depende de la concentración
de ABAP (velocidad = k [ABAP]. Sin embargo, es posible estimar que a los 150
minutos a 37ºC sólo una pequeña parte de ABAP decae, por lo que la
velocidad de formación de radicales se puede considerar constante. En
solución acuosa a pH 7,4, ABAP tiene una vida media cercana a 175 horas, por
lo tanto la generación de radicales desde este iniciador es constante en las
primeras horas de incubación.
Para calcular la velocidad de reacción se utilizaron las pendientes de los
gráficos concentración de Ln[1,4-DHP] vs tiempo de todos los compuestos
estudiados. Tomando en cuenta que la concentración del ABAP es 200 veces
mayor que la concentración de las 1,4-DHPs, el sistema se consideró como
una reacción de pseudo primer orden para las 1,4-DHPs. De esta forma la
constante cinética de velocidad se calculó directamente a partir de los datos de
la pendiente de los gráficos.
f) Estudio de los productos de EPC y de reacción por cromatografía gaseosa con detector de masas, GC-MS.
Se inyectaron en el cromatógrafo las soluciones electrolizadas de cada 1,4-
DHP en los diferentes medios estudiados y luego de la reacción frente a los
radicales.
Condiciones cromatográficas:
Temperatura de detector: 300 ºC.
Temperatura de inyector: 250ºC.
Razón split: 1/10.
Presión: 13 psi
Flujo de purga: 40 mL min-1.
17
Tiempo de purga: 0,5 ml min-1.
Programa de temperatura:
La rampa de temperatura fue programada desde 130 hasta 305ºC a 15ºC min-1.
La temperatura fue mantenida a 305°C por 5 minutos.
Tiempo de corrida: 16,7 minutos.
Como carrier se utilizó Helio, inyectado con una presión de 35 kPa. El rango de
masa monitoreado fue entre 45 y 550 u.m.a. con una velocidad de barrido de
1scan/s. La energía de ionización fue de 70 eV.
Después de cada experimento, las soluciones finales fueron extraídas con éter
etílico e inyectadas al cromatógrafo sin otros tratamientos. Salvo en el caso de
V-DHP e I-DHP a las cuales con el propósito de mejorar sus características
cromatográficas gaseosas, fueron silanizados con N-metil-N-trimetilsilil-
trifluoroacetamida (MSTFA) previo a la inyección.
g) Seguimiento por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC).Se inyectó una alícuota de estándar, de una solución electrolizada o de la celda
de reacción frente al anión radical superóxido de cada 1,4-DHP en el sistema
cromatográfico. Como fase móvil se utilizó una mezcla de aacetonitrilo/ 0,05 M
tampón fosfato (55/45) a pH 4,3. Para cuantificar, se usó el detector de arreglo
de fotodiodo (PDA) a una longitud de onda de 360 nm para las 1,4-DHPs y de
250 nm para los productos de oxidación y reacción frente al anión radical
superóxido. La fase móvil se mantuvo con un flujo de 1 mL/min y se burbujeó
helio constantemente a 30 mL/min.
h) Espectroelectroquímica.
La electrolisis a potencial controlado fue seguida mediante espectrofotometría
UV-Vis. El potencial aplicado corresponde a aproximadamente 100 mV más
positivos que los potenciales de oxidación. Se siguió el curso de la electrolisis
registrando espectros cada 5 minutos.
i) Cálculos teóricos.
• Los cálculos de las geometrías óptimas de los compuestos neutros y
radicalarios, así como el cálculo de potenciales redox en DMSO se realizó
utilizando métodos SCF-DFT, basados en la Teoría de Funcionales de la
Densidad (DFT). Esta teoría se basa principalmente en determinar la densidad
18
electrónica del estado base de un sistema para poder extraer sus propiedades
(conocer la función de onda del sistema, Ψ2=ρ).
• La funcional utilizada corresponde a la funcional híbrida B3LYP[lxi,lxii], y las
bases orbitales analíticas cc-pVTZ(-f)[lxiii] y 631-G*[lxiv].
• Se aplicó un modelo de solvente continuo, basado en la solución numérica de
la ecuación de Poisson – Boltzmann[lxv] para los cálculos de energía. Las
estructuras utilizadas son obtenidas por optimización de geometría en fase gas
y posteriormente en fase solución.
j) Estudios biológicos.Medidas de calcio intracelular. Cada imagen fue registrada cada 2 s y el tiempo
de exposición fue de 200 ms. El registro del experimento es de
aproximadamente 500 segundos. Durante este tiempo se realizan los
siguientes pasos:
0 – 100 s: registro de actividad espontánea de las células.
100 -105 s: se agrega solución normal de alto potasio.
100 – 200 s: registro de actividad provocada por la presencia de una mayor
concentración de potasio en el medio.
200 – 300 s: se agrega solución normal, la cual contiene una concentración
de fármaco de 50 µM.
300 – 305 s: se agrega solución normal de alto potasio.
300 – 300 s: registro de actividad provocada por la presencia de una mayor
concentración de potasio en el medio luego de la acción del fármaco.
400 – 500 s: registro de actividad normal de la célula en presencia de solución
normal.
19
5. Resultados y discusión.
5.1. Preparación de los derivados.
La estrategia sintética se basa principalmente en la clásica síntesis de
Hantzsch (1850) y variaciones de la misma [lxvi], la cual se presenta en forma
resumida mediante la siguiente figura:
Figura 3. Síntesis clásica de Hantzch.
Síntesis de C4-Indolil 1,4-DHPs:
A una disolución de 6 mmol de aldehído (Indol-3-carboxaldehído e Indol-5-
carboxaldehído, Figura 4) en etanol (20 mL) se adicionaron 0,015 mol de Acetil acetato
de etilo y 0,01 mol de solución amoniaco. La disolución resultante se mantuvo a reflujo
en constante agitación durante 30 horas, bajo atmósfera de nitrógeno. Posteriormente
se destiló el disolvente al vacío obteniéndose un sólido anaranjado que se purificó por
cristalización en etanol / agua.
R
O
H
O
O
O O
O
O
R
NH4OH
O
O
O
NH4OH
NH2
O
O
NH2
O
OO
O
O
R
NH4OH
N
O
O
O
OR
H
Figura 4. Aldehídos utilizados en la síntesis de las 1,4-DHPs C4-indolil sustituidas. A: Indol-3-carboxaldehído, B: Indol-5-carboxaldehído.
Caracterización de los compuestos.
3-Ind-DHP: 2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-4-(3-Indolil)-1,4-dihidropiridina.
Rendimiento: 73%. Pf.:183-184º C. IR (KBr): δmax 3344.4; 2978.1; 1676.7; 1487.1;
1367.9; 1305.6; 1215.4; 1100.3; 1020.4; 807.2; 744.7. 1H-NMR (300 MHz, DMSO δ6):
δmax 1.18 (t, 6H, 2x -CH2-CH3); 2.31 (s, 6H, 2x -CH3); 4.03 (q, 4H, 2x -O-CH2-CH3); 5.23
(s, 1H, Ar-CH<); 6.975 (m, 3H, J = 7,83 Hz, 3 x Ar-H); 7.33 (d, 2H, J = 7.92 Hz, 2x Ar-
H); 7.92 (d, 2H, J = 7.92 Hz, 2x Ar-H); 8.89 (s, 1H, DHP-N-H); 10.74 (s, 1H, Indol-N-H). 13C-NMR (75 MHz, DMSO δ6): 13.70; 17.64: 29.98; 58.25; 101.43; 110.85; 117.54;
118.91; 119.77; 121.31; 122.17; 125.25; 135.54; 143.58; 166.71. Anal. Elem.
Calculado para: C21H24N2O4: C 68.46; H 6.57; N 7.60. Encontrado: C 67.89; H 6.71; N
7.61.
5-Ind-DHP: 2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-4-(5-Indolil)-1,4-dihidropiridina. Rendimiento: 61%. P. f.:178-180º C. IR (KBr): νmax 3351.2; 2978.5; 1657.6; 1481.6;
1371.4; 1303.5; 1208.2; 1100.5; 1018.2; 727.0. 1H-NMR (300 MHz, DMSO δ6): δmax
1.20 (t, 6H, 2x -CH2-CH3); 2.32 (s, 6H, 2x -CH3); 4.04 (q, 4H, 2x -O-CH2-CH3); 4.99 (s,
1H, Ar-CH<); 6.37 (s, 1H, Ar-H); 7.00 (d, 1H, J=7.92 Hz, 1 x Ar-H); 7.25 (m, 3H, J =
7,56 Hz, 3x Ar-H); 8.76 (s, 1H, DHP-N-H); 10.94 (s, 1H, Indol-N-H). 13C-NMR (75 MHz,
DMSO δ6): 13.74; 17.96: 48.802; 58.37; 100.20; 102.53; 110.01; 117.72; 120.76;
124.49; 127.07; 134.08; 138.52; 143.88; 166.71. Anal. Elem. Calcd. para.: C21H24N2O4:
C 68.46; H 6.57; N 7.60. Encontrado: C 67.00; H 6.85; N 7.38.
N
H
OH
N
H
H
OR=
A B
Síntesis de 1,4-DHPs a partir de derivados de vainillina e isovainillina:
Se calentó a reflujo durante 3 horas, una mezcla de 3,3 mmoles de acetil
acetato de etilo y 4,5 mL de solución amoniacal al 25% en 8,5 mL de etanol. La
solución resultante se adiciona a una mezcla de 3,3 mmoles de Acetil acetato de etilo,
3,3 mmoles del aldehído (vainillina e isovainillina, Figura 5), 5 mL de solución de
amoniaco al 25% y 4 mL de etanol. La mezcla resultante se calentó a reflujo por 15
horas. Se obtuvo un sólido color amarillo pálido, el cual se filtró al vacío y se lavó 3
veces con una mezcla fría de etanol/agua (1:1).
Figura 5. A: Vainillina, B: Isovainillina.
Caracterización de los compuestos.V-DHP: 2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-4-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,4-dihidropiridina. Rendimiento: 80.2 %.m.p.: 161 -163 ºC. IR (KBr): νmax 3350.0; 2982.7;
1680.7; 1652.4; 1489.7; 1369.1; 1303.9; 1271.9; 1216.7; 1121.9; 753.3. 1HNMR (300
MHz, DMSO d6): 1.1 (t, J= 7.0, 6H,2x -CH3); 2.2 (s, 6H, 2x-CH3); 3.7 (s, 3H, OCH3); 4.0
(q, J = 7.0, 4H, -CH2); 4.82 (s, 1H, C-H); 7,7; 6.6 (m, 3H, Ar); 8.6 (s, 1H, N-H); 8,7 (s,
1H, OH). 13CRMN (75 MHz, DMSO-d6): 15.0(2); 18.8(2); 39.0. 56.2. 60.0(2); 103.3(2);
113.2(2); 116.0; 120.5; 131.0; 140.5; 145.7(2); 147,6; 169. Anal. Calcd. para
C20H25O6N: C:63.98; H: 6.71; N: 3.73. Encontrado: C: 63.77; H: 7.55; N: 4.07.
I-DHP: 2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-4-(3-hidroxi--4metoxifenil)-1,4-dihidropiridina. Rendimiento: 61.6 %. m.p.: 166-168 ºC. IR (KBr): νmax 3316.4, 2957.6;
1669.5; 1592.4; 1484.2; 1371.1; 1270.7; 1209.2; 1116.1; 1018.3; 764.8. 1HNMR (300
MHz, DMSO d6): 1.2 (t, J= 7.0, 6H, -CH3); 2.3 (s, 6H, -CH3) 3.6 (s, 3H, OCH3); 4.0 (q, J
OH
O
OH
O
OH
OH
R=
A B
= 7.0, 4H, -CH2); 4.75 (s, 1H, C-H); 7,7; 6.6 (m, 3H, Ar); 8.70 (s, 1H, N-H); 8,72 (s, 1H,
OH). 13CRMN (75 MHz, DMSO-d6): 15.1(2); 19.5(2); 38.6. 58.2. 60.0(2); 102.9(2);
112.4(2); 116.0; 118.5; 133.5; 142.2; 146.1(2); 148.1; 167. Anal. Calcd. para
C20H25O6N: C:63.98; H: 6.71; N: 3.73. Encontrado: C: 63.77; H: 7.59; N: 4.06.
Síntesis del derivado C4-fenil-1,4-dihidropiridína:A una solución de 6,0 mmoles de aminocrotonato de etilo disuelto en 15 en
ácido acético glacial se adicionó gota a gota, una solución que contenía 3,0 mmoles de
benzaldehído disueltos en 5 mL de ácido acético glacial. Una vez adicionado todo el
benzaldehído, se calentó la solución durante 6 horas a 60°C. Una vez transcurridas las
6 horas de agitación se formó un precipitado de color amarillo. La solución se enfrió y
luego se filtró. Se obtuvo un sólido color amarillo, el cual se recristalizó en etanol y se
lavó 3 veces con una mezcla fría de etanol/agua (1:1).
Fenil-DHP: 2,6-Dimethil-3,5-dietoxicarbonil-4-fenil-1,4-dihidropiridina. Rendimiento: 92%. Pf: 150–153 °C. 1H NMR (300 MHz, DMSO d6): dmax 1,16 (t, 6H,
2· –CH2–CH3); 2.26 (s, 6H, 2· –CH3); 3.98 (q, 4H, 2· –O–CH2–CH3); 4.88 (s, 1H, Ar-
CH<); 7.18 (m, 3H, J = 6.975 Hz, 3· Ar-H); 7.22 (d, 2H, J = 8.14 Hz, 2· Ar-H); 8.80 (s,
1H, N–H). 13C NMR (75 MHz, DMSO d6): 10.51; 9.26; 9.07; 7.88; 7.78; 6.18; 2.09;
2.05; 2.04; 1.97; 0.63. Anal. Elem Calc. para C19H23O4N: C:62.28; H: 7.04; N: 4.25.
Encontrado: C: 63.08; H: 6.98; N: 4.33.
5.2. Medio aprótico: DMSO + 0,1 M de HFFTBA.
a) Voltametría y coulombimetría.
Se observó por VPD que los compuestos 4-Indolil sustituidos presentan dos
picos anódicos (Figura 6A). La primera señal de oxidación (pico I) se encontró a +988
mV para 3-Ind-DHP y a +992 mV para 5-Ind-DHP, mientras que el pico II aparece a
+1288 mV para 3-Ind-DHP y a +1292 mV para 5-Ind-DHP. Si comparamos estos
valores con los encontrados para Fenil-DHP que se oxida a +1060 mV y para indol
que tiene un potencial de oxidación de +1200 mV bajo las mismas condiciones
experimentales, podríamos asumir que para 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP la primera de las
señales correspondería a la oxidación del anillo dihidropiridínico, mientras que las
señales a mayores potenciales corresponderían a la oxidación del grupo indol
presente en la posición 4.
Figura 6: A: Voltamogramas de pulso diferencial de 1 mM de cada compuesto en DMSO, HFFTBA 0,1 M. B: Voltamograma cíclico de los compuestos. Velocidad de barrido= 0,1
V/s. DMSO, HFFTBA 0,1 M.
Como se observa en la figura 6A, los potenciales correspondientes a la
oxidación del grupo indolil son desplazados hacia valores más positivos en ambos
compuestos comparados con la molécula de indol (∆= 90 mV, aproximadamente). Por
otra parte, si analizamos la oxidación de la 1,4-DHP podemos concluir que ésta ocurre
más fácil que la 4-fenil-DHP. Estos resultados se pueden explicar debido a que ambos
centros están mutuamente interaccionando en sus respuestas redox. Si el anillo DHP
está enlazado a la posición-3 y -5 del indol, se produce una alta densidad electrónica
en esa posición, dificultando la oxidación del indolil y facilitando la oxidación del anillo
600 800 1000 1200 1400
Pico II
Pico II
Pico I
A
5-Ind-DHP
3-Ind-DHP
Pico I
Indol
Fenil-DHP
5µ A
E (Ag / AgCl) / mV0 200 400 600 800 1000 1200 1400
B
5-Ind-DHP
3-Ind-DHP
Indol
4-Fenil-DHP
10 µ A
E (Ag / AgCl) / mV
DHP. Estos resultados concuerdan con cálculos teóricos moleculares INDO
postulados por Waltman y colaboradores [lxvii], quienes describen que el catión radical
indol, el radical intermediario en la oxidación vía un electrón del indol, se caracteriza
por una alta densidad de espín en las posiciones -1, -3 y -5.
Mediante estudios coulombimétricos, se determinó el número de electrones
involucrados en el proceso oxidativo de ambos compuestos en DMSO. Mediante una
electrolisis a potencial constante (+1500 mV) se obtuvo un promedio de 3 electrones
totales involucrados en la oxidación de ambos centros redox por mol de compuesto. La
electrólisis a +1100 mV determinó que el número de electrones promedio involucrados
durante el primer proceso oxidativo (pico I) es de 2 electrones por mol de 1,4-DHP. Por
lo tanto, de un total de 3 electrones involucrados en la oxidación de 3-Ind-DHP y 5-Ind-
DHP, un total de dos electrones estaría involucrado en la primera señal de oxidación
(pico I, oxidación del anillo dihidropiridínico) y 1 electrón en la oxidación de la señal a
potenciales mayores (pico II, oxidación del grupo indolil). Al finalizar la electrolisis a
+1500 mV, se encontró un depósito verde-azulado depositado sobre la malla de
carbón reticulado que se utilizó como electrodo de trabajo.
Por VC a todas las velocidades de barrido estudiadas (0,1- 3 V/s), los
compuestos 4-Indolil sustituidos presentaron dos señales anódicas irreversibles
(Figura 3B), mientras que la 4-Fenil-DHP y el Indol presentaron una señal anódica
irreversible. Los gráficos logarítmicos de corriente vs velocidad de barrido mostraron
pendientes entre 0,5 y 1,0 en todos los casos; indicando que la corriente está
controlada por un fenómeno mixto (difusión y adsorción). Los potenciales de oxidación
fueron dependientes de la velocidad de barrido, respaldando el carácter irreversible de
la oxidación de estas moléculas en este medio.
Por otra parte, el voltamograma de pulso diferencial de V-DHP (Figura 7A)
muestra dos picos anódicos, el primero de ellos con un potencial de +824 mV y el
segundo a +1118 mV. I-DHP también presentó dos picos de oxidación, sin embargo,
los potenciales fueron más positivos comparados con V-DHP. Los valores de
potenciales de pico de I-DHP fueron Epico I= +884 mV y Epico II= +1174 mV.
Considerando que el potencial de oxidación de la 4-fenil-DHP es de +1064 mV y que
Guayacol (2-metoxifenol) se oxida a +950 mV (Figura 7B) se puede concluir que el
pico que aparece a potenciales menos positivos (pico I) correspondería a la oxidación
del grupo OH y el pico que aparece a potenciales más positivos correspondería a la
oxidación del anillo 1,4-DHP (pico II).
Figura 7. A: Voltamogramas de pulso diferencial de 1 mM de A: V-DHP e I-DHP . B: Fenil-DHP y Guayacol, en DMSO + HFFTBA 0,1 M.
Cambios en los potenciales de oxidación de V-DHP e I-DHP comparado con
los compuestos no substituidos mencionados anteriormente evidencian un
desplazamiento hacia potenciales menos positivos para la oxidación del grupo OH y
un desplazamiento hacia valores más anódicos para la oxidación del anillo 1,4-DHP.
Estos resultados son consistentes con el efecto electrón-donor de ambos grupos
metoxilos y el anillo dihidropiridínico sobre la oxidación del grupo OH. Primero, en el
caso de V-DHP, el anillo dihidropiridínico se encuentra en posición para respecto del
grupo OH, el cual contribuye a aumentar la densidad electrónica de este grupo
facilitando su oxidación. Dicho efecto puede sostenerse al observar la figura 7A, donde
V-DHP exhibe un potencial de oxidación menor que I-DHP (ΔEpico I= 60 mV). Por otra
parte, la oxidación del grupo OH genera el radical fenoxilo, el que finalmente da lugar a
la formación de un derivado quinona [lxviii,lxix], el cual afecta la oxidación del anillo DHP
produciendo un desplazamiento del potencial de oxidación de éste hacia valores más
altos.
Los estudios coulombimétricos, arrojaron un promedio de 3 electrones (por mol
de compuesto) involucrados en el proceso oxidativo total de V-DHP e I-DHP en DMSO
cuando la electrolisis se realizó a +1270 mV. La electrólisis a +900 mV determinó que
el número de electrones promedio involucrados durante el primer proceso oxidativo
(pico I) es de 1 electrón por mol de 1,4-DHP. En conclusión, de los 3 electrones
involucrados en la oxidación de V-DHP e I-DHP, 1 electrón estaría involucrado en la
primera señal de oxidación (pico I, oxidación del grupo -OH) y 2 electrones en la
400 600 800 1000 1200 1400
A
pico II
pico II
pico I
pico I
I-DHP
2µ A
E / mV (Ag / AgCl)
V-DHP
600 800 1000 1200
B
4-Fenil-DHP
Guayacol
2µ A
E / mV (Ag / AgCl)
oxidación de la señal a potenciales más positivos (pico II, oxidación del anillo 1,4-
DHP).
Figura 8: Voltamogramas cíclicos. Oxidación de los compuestos V-DHP (A) e I-DHP (B) (1mM) en DMSO + HFFTBA 0,1 M.
Los experimentos de voltametría cíclica se realizaron a diferentes velocidades
de barrido (100 a 4000 mV / s). Bajo estas condiciones, se obtuvieron señales
anódicas irreversibles como se muestra en la figura 8. Los gráficos de log ip vs log v
arrojaron pendientes cercanas a 0,5 para ambas señales, lo que indica que el proceso
está controlado por difusión. Además, los potenciales de oxidación fueron
dependientes de la velocidad de barrido en todo el rango estudiado, respaldando el
carácter irreversible de la oxidación de los compuestos en este medio.
Con el fin de obtener los coeficientes de difusión de los compuestos, se estudió
la oxidación de éstos a diferentes velocidades de rotación del electrodo por
voltamperometría lineal (figura 9A). Al registrar la corriente límite por VDR vs la raíz de
la velocidad de rotación del electrodo, se obtuvieron rectas que están de acuerdo con
la ecuación de Levich[lxx]. Los valores de coeficientes de difusión obtenidos se
muestran en la tabla 2. En la figura 9B, se muestran los voltamogramas sobre un
electrodo rotatorio de grafito correspondiente a soluciones 1 mM de V-DHP e I-DHP.
Ambos derivados exhiben dos ondas de oxidación (I – II). Los valores de potenciales
de media onda para V-DHP fueron: I=+848 mV, II=+1160 mV; y para I-DHP fueron:
I=+851 mV, II=+1157 mV. La 1,4-DHP C4-fenil sustituida presentó una única onda
anódica cuyo potencial de media onda fue de +1051.mV a una velocidad de rotación
de 500 rpm. Dicha onda corresponde a la oxidación del anillo dihidropiridínico. En
consecuencia, la primera onda corresponde a la oxidación del hidroxilo y la segunda a
la oxidación del anillo DHP. Al comparar entre isómeros no se observan diferencias
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
-50
0
50
100
150
200 A3,0 V / seg
0,1 V / seg
i / µ
A
E / mV (Ag / AgCl)
-200 0 200 400 600 800 1000120014001600
-50
0
50
100
150
200 B4,0 V / seg
0,1 V / seg
i / µ
AE / mV (Ag / AgCl)
significativas entre éstos, sin embargo las 1,4-DHPs C4-Indolil sustituidas presentaron
los valores más bajos, mientras que V-DHP e I-DHP presentaron los valores de
coeficientes de difusión más altos.
Figura 9A: Voltamogramas de barrido lineal con electrodo de disco rotatorio de 1 mM de V-DHP, I-DHP y Fenil-DHP en. DMSO, HFFTBA 0,1 M. Velocidad de rotación del electrodo:
500 rpm. Figura 9B: Voltamogramas lineales a diferentes velocidades de rotación del electrodo. Compuesto 3-Ind-DHP, 1 mM. DMSO, HFFTBA 0,1 M.
Tabla 2: Coeficientes de difusión calculados para los compuestos estudiados. Viscosidad cinemática del DMSO a 25°C: 0,01817 stokes.
Coeficientes de difusión /(cm2 s-1 / 106)
Compuesto DMSO + 0,1 M de HFFTBA
3-Ind-DHP 2,50 ± 0,2
5-Ind-DHP 2,32 ± 0,2
4-Fenil-DHP 2,77 ± 0,1
V-DHP 3,71 ± 0.1
I-DHP 3,22 ± 0.2
400 600 800 1000 1200 1400
B II
II
I
I
V-DHP
4-Fenil-DHP
I-DHP 10 µ A
E / mV (Ag / AgCl)750 900 1050 1200 1350 1500
A
20 µ A
E / mV (Ag / AgCl)
b) Estudios por Resonancia de Espín Electrónico (REE).
Para identificar la generación de posibles intermediarios en el proceso de
oxidación en medio aprótico se realizaron experimentos de electrólisis a potencial
controlado acoplados con REE. Se utilizó como atrapador de radicales libres N-tert-
butilamina-α-fenilnitrona (PBN). La electrólisis de 1mM de los compuestos indolil
sustituidos se realizó de la siguiente manera: Para la fenil-DHP se aplicó un potencial
de +1100 mV debido a que sólo presenta una señal de oxidación la que corresponde a
la oxidación del anillo dihidropiridínico en presencia de un exceso del atrapador.
Como se observa en la figura 10 el espectro REE evidencia la formación de un
nitróxido espín aducto, mostrando un triplete debido al nitrógeno de la nitrona, el que
se desdobla en dobletes debido a los hidrógenos adyacentes.
Figura 10: Espectros REE del aducto PBN-radical piridinio. Radical electroquímicamente generado desde una solución de 1,4-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA. A: Línea base correspondiente a la electrólisis de PBN. B: 1mM de Fenil-DHP + PBN (100 barridos).
Para 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP, en primer lugar se aplicó un potencial 100 mV
más positivo que los potenciales de pico correspondientes al primer pico anódico, que
involucra la oxidación del anillo 1,4-DHP y luego a la misma solución se aplicó un
potencial 100 mV mayor que el potencial de pico correspondiente a la oxidación del
indolil en posición 4, siempre en presencia de un exceso del atrapador PBN. El
espectro REE evidenció la formación del espín aducto en ambos casos al aplicar el
potencial correspondiente a la oxidación del anillo dihidropiridínico (figura 11A y B). Sin
embargo, al aplicar un potencial suficiente para oxidar el indol en posición 4, no se
obtuvo cambios en el espectro de 3-Ind-DHP. Por el contrario, el espectro de 5-Ind-
A
B
A
*
*
B
C
A
*
*
B
C
DHP mostró nuevas señales (* en Figura 11C), lo que podría atribuirse a la formación
de un nuevo espín aducto en el cual esté involucrado en grupo indolil.
Figura 11: Espectros REE del aducto PBN-radical piridinio. Radical electroquímicamente generado desde una solución de 1mM de A: 3-Ind-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA (100
barridos) a +1100mV. B: 5-Ind-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA (100 barridos) a +1100mV. C: 5-Ind-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA (100 barridos) a +1500mV.
Según datos encontrados en la literatura, indol e indoles sustituidos se oxidan
vía 1 electrón - 1 protón para formar un catión radical que en una primera instancia
está centrado en el átomo de Nitrógeno. Este catión radical está en equilibrio
resonante con un radical centrado en el carbono de la posición 3 (Esquema 3).
Esquema 3. Electrooxidación de indol. Formación de un catión radical centrado en nitrógeno en equilibrio con el catión radical centrado en carbono.
Según cálculos teóricos, existe una alta densidad de espín sobre la posición 1
y 3 del indol, lo que explicaría la diferencia en los espectros REE de ambos isómeros.
En el caso de 3-Ind-DHP la posición 3 del indolil está directamente enlazada al anillo
dihidropiridínico por lo que la probabilidad de centrar el radical en dicha posición es
menor, y en el caso de que así fuera existe un gran impedimento estérico para que el
atrapador forme el espín aducto. Por el contrario, la 5-Ind-DHP tiene libre la posición 3
lo que facilitaría el atrapamiento del radical en esa posición por parte del PBN.
Compuesto aN/Gauss aH/Gauss
Fenil-DHP13,2 3,5
3-Ind-DHP 13,9 2,1
5-Ind-DHP 14,0 2,2
Tabla 3: Constantes de acoplamiento aN y aH de los espín aductos formados con PBN durante la electrolisis de los compuestos en estudio en DMSO + 0,1 mM de HFFTBA.
Los valores de constantes de acoplamiento obtenidos durante la electrolisis a
potencial controlado y que se muestran en la tabla 10, son consistentes con que el
atrapador PBN interactuó con radicales libres centrados en carbono, como se describe
para otras 1,4-DHPs y otros compuestos con un atrapador similar [lxxi]. Los espectros
presentaron un ancho de línea que indicaría que el atrapador habría interactuado con
más de una especie radicalaria, lo que se explica por la delocalización del radical
piridinio sobre la posición 2,4 y 6 del anillo dihidropiridínico.
N
H
N
-1e, -1H+
N1
35
c) Caracterización por cromatografía gaseosa acoplada a un detector de masas (GC/MS) de los derivados sintetizados y los productos finales de la oxidación electroquímica.
Los derivados V-DHP e I-DHP fueron silanizados con N-metil-N-trimetilsilil-
trifluoroacetamida (MSTFA) previo a la inyección para mejorar las características
cromatográficas gaseosas.
i) Fragmentación de las 1,4-DHP.
En primer lugar se estudió la fragmentación de los compuestos sintetizados. El
fragmento más abundante corresponde a m/z 252 en todos los derivados, excepto en
la 3-Ind-DHP cuyo fragmento más abundante fue el de m/z 295. El fragmento m/z 252
se forma directamente a partir de los iones, por la pérdida del sustituyente en la
posición-4. Así, todos los derivados que directamente están enlazados a un anillo
aromático tuvieron una similar vía de fragmentación.
Los compuestos Fenil-DHP, 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP presentaron tiempos de
retención de 8,65; 11,92 y de 12,16 minutos , respectivamente. Dicho cromatograma
con el patrón de fragmentación se muestran en las figuras 12, 13 y 14
respectivamente.
Tal como se observa en la Figura 12 para el derivado fenil-DHP junto con el
fragmento más abundante de m/z 252, se observa el fragmento m/z 196 entre un 20 a
30% de abundancia que corresponde a la pérdida del grupo fenilo y la pérdida
completa de ambos grupos etilos en las posiciones 3 y 5, formando los respectivos
ácidos. Por otro lado, la pérdida consecutiva de un grupo etilo y del fenilo produjo un
fragmento de m/z 224 (6-9%). Fragmentos de menor abundancia (menos de un 5%)
son aquellos que poseen el ión molecular de m/z 327, m/z 301 correspondiente a la
pérdida de un grupo etilo y m/z 284 correspondiente a la pérdida de un grupo etoxilo.
La fragmentación se presenta en el esquema 4.
Figura 12. Ión cromatograma del derivado fenil-DHP y espectro de masas de los fragmentos.
7.80 8.00 8.20 8.40 8.60 8.80 9.00 9.20 9.40 9.60 9.8010.0010.2010.400
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
Time-->
Abundance
Ion 252.00 (251.70 to 252.70): 0902DHP1.D 8.65
40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 3800
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
m/z-->
Abundance
Scan 310 (8.648 min): 0902DHP1.D252
196
224
284300150 32917877 105 12851 268 368352
Esquema 4. Vías de fragmentación del derivado fenil-DHP.
En la Figura 13, se muestra el cromatograma y el espectro de masas del
derivado 3-Ind-DHP. Tal como se observa en dicha figura, los fragmentos de mayor
abundancia resultaron aquellos con m/z 295, m/z 368, m/z 339 y m/z 267. En este
caso el fragmento más abundante es el m/z 295 (100%) que corresponde a la perdida
completa de uno de los sustituyentes en la posición 3 o 5 del anillo 1,4-DHP. Cabe
resaltar que el m/z 368 que corresponde al ión molecular del derivado se encuentra en
un 50%. Entre los patrones de fragmentación el m/z 252 correspondiente a la pérdida
del sustituyente presente en posición C4 se encuentra en un 20% lo que se podría
atribuir a que el anillo dhihidropiridínico está enlazado a la posición 3 del indol y es por
esta razón que las abundancias en los patrones de fragmentación son diferentes para
este derivado.
N
H
O
O
O
O
N
H
O
O
O
O
N
H
HO
O
OH
O
m/z 329
N
H
O
O
OH
O
N
H
O
O O
m/z 252 m/z 196
m/z 301 m/z 284
2x CH3 -CH
2 -
CH3-CH2-O-CH3-CH2-
N
H
O
O
OH
O
CH3-CH2-
m/z 224
Figura 13. Ión cromatograma del derivado 3-Ind-DHP y espectro de masas de los fragmentos.
6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.000
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
5500000
6000000
6500000
Time-->
AbundanceIon 295.00 (294.70 to 295.70): 108DHP3.D
11.92
50 100 150 200 250 300 350 400 4500
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
5500000
6000000
m/z-->
AbundanceScan 402 (11.878 min): 108DHP3.D (-)
5163
89
117
150 179
206
221
267
295
323
339
368
393 426446 477490
Esquema 5. Vías de fragmentación del derivado 3-Ind-DHP.
Como se observa en figura 14, los fragmentos de mayor abundancia del
derivado 5-Ind-DHP resultaron ser aquéllos con m/z 252, m/z 368, m/z 295 y m/z 196.
En este caso el fragmento más abundante es el m/z 252 (100%) que corresponde a la
perdida del indol de la posición 4 del anillo 1,4-DHP. El ión molecular de m/z 368 se
encuentra en un 40%. Patrones de similar m/z a los encontrados para 3-Ind-DHP son
menos abundantes. La diferencia entre la abundancia de dichos fragmentos entre
ambos isómeros estaría dada por la posición entre el enlace del anillo 1,4-DHP y el
indol. En el caso de 5-Ind-DHP el enlace está directamente unido al anillo benceno del
indol y por esta razón el fragmento más abundante de m/z 252 coincide con el de la
fenil-DHP.
N
O
O
O
O
H
NH
N
O
O
H
N
H
N
O
O
O
O
H
N
H
N
O
O O
H
N
H
N
HO
O
H
N
H
m/z 222
m/z 267
m/z 295
m/z 368
m/z 339
m/z 323
N
H
N
H
O
O
H2CCH2
CO2
H2CCH2
Figura 14. Ión cromatograma del derivado 5-Ind-DHP y espectro de masas de los fragmentos.
50 100 150 200 250 300 350 400 4500
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
5500000
6000000
6500000
m/z-->
AbundanceScan 412 (12.050 min): 108DHP4.D
53
67
89
117
150178
196
224
252
295
323
339
368
383 406 446 469 499
6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.000
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
Time-->
AbundanceIon 368.00 (367.70 to 368.70): 108DHP4.D
12.16
Esquema 6. Vías de fragmentación del derivado 5-Ind-DHP.
Los cromatogramas, los patrones de fragmentación y las vías de fragmentación
propuestas para los compuestos V-DHP e I-DHP luego de la derivatización con
trimetilsilano (TMS) se muestran en las Figuras 15 y 16 y en los esquemas 7 y 8. En
estas Figuras se puede observar que la primera vía general, corresponde a la pérdida
del sustituyente completo de la posición-4, dando lugar a un fragmento común de m/z
252, que corresponde al pico de base con las más altas abundancias (100 %). Los
tiempos de retención (Rt) de ambos compuestos silanizados fueron de 11,8 minutos
para V-DHP y de 11,5 minutos para I-DHP, en las condiciones experimentales
anteriormente descritas.
En la figura 15, se muestra la fragmentación del derivado V-DHP. Tal como se
observa en dicha Figura, los fragmentos de mayor abundancia resultaron aquéllos con
m/z 252, m/z 224 y m/z 196. Los resultados encontrados para el compuesto I-DHP son
mostrados en la figura 16. Se observa que la posición del grupo OH no afectó los
patrones de fragmentación de este compuesto.
N
O
O
O
O
H
N
H
N
O
O
O
O
H
NH
N
O
O
O
O
H
N
O
O
OH
O
H
N
HO
O
OH
O
H
N
O
O
H
NH
m/z 252
m/z 224
m/z 196
m/z 339
m/z 295
m/z 368
N
H
H2CCH2
H2CCH2
H2CCH2
CO2
Figura 15. Ión cromatograma del derivado V-DHP y espectro de masas de los fragmentos.
9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 13.00 13.50 14.000
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
1300000
1400000
1500000
Time-->
Abundance
Ion 252.00 (251.70 to 252.70): 238DHP1.D 11.51
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
1300000
1400000
1500000
m/z-->
Abundance
Scan 1173 (11.506 min): 238DHP1.D (-)252
196
73374
150 418224447
45 316106 344172128 286 470 565510396
Esquema 7. Vías de fragmentación del derivado V-DHP.
N
H
O
O
O
O
OTMS
O
N
H
OH
O
O
O
OTMS
O
N
H
O
HO
O
OTMS
O
N
H
O
O
O
O
N
H
OH
O
HO
O
N
H
OH
O
O
O
m/z 447
m/z 252
m/z 224 m/z 196
m/z 418
m/z 374
OTMS
O
CH3-CH2-
2x CH3 -CH
2 -
CH3-CH
2-
CH3-CH2-H2O
Figura 16. Ión cromatograma del derivado I-DHP y espectro de masas de los fragmentos.
9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 13.00 13.500
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
Time-->
Abundance
Ion 252.00 (251.70 to 252.70): 238DHP2.D 11.57
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 5500
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
m/z-->
Abundance
Scan 1181 (11.557 min): 238DHP2.D (-)252
196
73374 418
150 224447
31610645 344285 477 552 591528
Esquema 8. Vías de fragmentación del derivado I-DHP.
ii) Fragmentación e identificación de productos generados en la electrolisis a potencial controlado.
Las soluciones electrolizadas en las condiciones experimentales descritas
anteriormente fueron analizadas también por CG-MS. En todos los casos, los tiempos
de retención de los compuestos oxidados (piridinas) disminuyeron respecto de los
derivados sintetizados (1,4-dihidropiridinas). Una de las características principales de
estas vías es que de acuerdo a la fragmentación no se pierde el sustituyente de la
posición-4 (grupos fenilo, indolil, 2-metóxifenol y 3-metóxifenol) a diferencia de la
fragmentación en los compuestos 1,4-DHPs. En este caso, la fragmentación implica
principalmente la pérdida parcial o total de los sustituyentes de las posiciones 3 y 5 de
las piridinas respectivas. Probablemente, la formación de piridina impide la reacción de
N
H
O
O
O
O
O
OTMS
N
H
O
O
O
O
N
H
OH
O
HO
O
N
H
OH
O
O
O
O
OTMS
N
H
O
HO
O
O
OTMS
O
OTMS
2 x CH3-CH2-
m/z 447
m/z 252
m/z 196
CH3-CH
2-
CH3-CH2-H2O m/z 418
m/z 374
eliminación del sustituyente de la posición-4, estabilizando la carga interna
favoreciendo la deslocalización en todo el sistema.
Figura 17. Ión cromatograma del derivado fenil-DHP electrolizado a 1200 mV durante 90 minutos en DMSO + 0,1 M de HFFTBA, y espectro de masas de los fragmentos.
5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.500
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
Time-->
AbundanceIon 327.00 (326.70 to 327.70): 2310DHP7.D
7.47
50 100 150 200 250 300 350 400 4500
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
m/z-->
AbundanceScan 143 (7.468 min): 2310DHP7.D
5677
105115
139
180
210
236
254
282
312
327
355 402 429446463 489
Esquema 9. Vías de fragmentación del derivado oxidado de fenil-DHP en DMSO aplicando un potencial de 1200 mV.
En todos los casos, el fragmento más abundante corresponde a los iones
moleculares, M+. En la figura 17 se muestra el cromatograma y la fragmentación del
derivado oxidado fenil-DHP, el cual presenta un tiempo de retención de 7,4 minutos.
Tal como muestra la Figura, los fragmentos de mayor abundancia resultaron ser el ión
molecular, M+ 327, los fragmentos de m/z 254 (pérdida simultánea de un grupo etoxi y
etilo de las posiciones 3 y 5, m/z 236 (pérdida simultánea de los dos grupos etoxi de
las posiciones 3 y 5) y m/z 282 (pérdida del un grupo etilo).
N
O
O
O
O
N
O
O
O
N
O
O
N
OO
N
O
N
CH 3-CH 2-O
-
-CO
2x CH3 -CH
2 -O -
-CO
-CO
m/z 327
m/z 282
m/z 254
m/z 236
m/z 210m/z 180
Figura 18. Ión cromatograma del derivado 3-Ind-DHP electrolizado a 1100 mV durante 90 minutos en DMSO + 0,1 M de HFFTBA, y espectro de masas de los fragmentos.
6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Time-->
AbundanceIon 366.00 (365.70 to 366.70): 2310DHP8.D
10.41
50 100 150 200 250 300 350 400 4500
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
m/z-->
AbundanceScan 315 (10.396 min): 2310DHP8.D
56 73 100126
142178
207219
247
291321
338
366
401 429446461 489
Esquema 10. Vías de fragmentación del derivado oxidado a 1100 mV de 3-Ind-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA.
Por otra parte, los cromatogramas y los patrones de fragmentación de los
productos indolil sustituidos oxidados a 1100 mV se muestran en las figuras 18 y 19.
En ambos casos, se observa el ión molécular como el fragmento más abundante con
un m/z 366 (100%). Otros fragmentos encontrados son m/z 321 (30%) correspondiente
a la pérdida de uno de los grupos etoxilo de las posiciones 3 o 5, m/z 293 (25%)
formado por la pérdida de un grupo CO y m/z 248 (20%) debido a la pérdida de un
segundo grupo etoxilo. La vía de fragmentación propuesta se muestra en el esquema
7. Luego, al realizar la electrolisis del mismo compuesto a 1500 mV, no se obtuvo un
cromatograma definido y como se mencionó anteriormente se observó la formación de
un residuo azulado absorbido sobre la malla de carbón utilizada como electrodo de
trabajo en la EPC.
N
O
NH
O O
O
N
O
NH
O
O
N
O
NH
O
N
O
NH
CH3 -CH
2 -O -
-CO
CH3 -CH
2 -O -
m/z 366
m/z 321
m/z 293
m/z 248
Figura 19. Ión cromatograma del derivado 5-Ind-DHP electrolizado a 1200 mV durante 90 minutos en DMSO + 0,1 M de HFFTBA, y espectro de masas de los fragmentos.
50 100 150 200 250 300 350 400 4500
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
650000
700000
750000
m/z-->
AbundanceScan 343 (10.872 min): 2310DHP9.D (-)
4773
103 133152178 207
219
248
275
321
338
366
405 430447 475489
6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.000
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
1000000
1100000
1200000
1300000
1400000
Time-->
AbundanceIon 366.00 (365.70 to 366.70): 2310DHP9.D
10.86
Esquema 11. Vías de fragmentación del derivado oxidado a 1100 mV de 5-Ind-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA.
Por otra parte, la solución electrolizada a 1100 mV de 5-Ind-DHP presentó una
única señal cromatográfica a 10,8 minutos y el patrón de fragmentación presentó como
fragmento más abundante al ión molecular con un m/z de 366 (100%). Luego se
observa un fragmento con m/z 275 correspondiente a la pérdida de los grupos etoxilos
(de las posiciones 3 y 5), luego un m/z 248 debido a la perdida de CO y luego la
pérdida de otro CO dando lugar a un fragmento con m/z 220.
N
O
O
O
O
N
H
N
O O
N
H
N
O
N
H
N
N
H
2x CH3 -CH
2 -O -
-CO
-CO
m/z 366
m/z 276
m/z 248
m/z 220
Figura 20. Ión cromatograma del derivado V-DHP electrolizado a 1280 mV durante 90 minutos en DMSO + 0,1 M de HFFTBA, y espectro de masas de los fragmentos.
7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.500
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
Time-->
Abundance
Ion 445.00 (444.70 to 445.70): 163DHP2.D 8.82
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 6000
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
600000
m/z-->
Abundance
Scan 747 (8.810 min): 163DHP2.D73
445415
324298 35445 268227197148115 387172 535567475 594508
Figura 21. Ión cromatograma del derivado I-DHP electrolizado a 1280 mV durante 90 minutos en DMSO + 0,1 M de HFFTBA, y espectro de masas de los fragmentos.
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 6000
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
220000
m/z-->
Abundance
Scan 736 (8.741 min): 163DHP5.D445
73
415384
298 35432445 270228198154115 496528 562471 586
8.00 8.20 8.40 8.60 8.80 9.00 9.20 9.40 9.60 9.80 10.0010.2010.4010.600
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
220000
Time-->
Abundance
Ion 445.00 (444.70 to 445.70): 163DHP5.D 8.75
Esquema 12. Vías de fragmentación del derivado oxidado a 1280 mV de V-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA.
Los compuestos V-DHP e I-DHP oxidados a 980 mV no presentaron cambios
en el ión cromatograma ni en el patrón de fragmentación respecto a las figuras 20 y
21. Sin embargo, al aplicar un potencial constante de 1280 mV, los tiempos de
retención disminuyeron a 8,8 y 8,7 minutos para V-DHP e I-DHP respectivamente.
Ambos compuestos oxidados presentaron un similar patrón de fragmentación como el
que se muestra en el esquema 11. Se puede observar en el patrón, el fragmento más
abundante correspondiente al ión molecular cuyo m/z es de 445 (derivado silanizado).
Se observan además, otros dos fragmentos, el primero de ellos con un m/z 415 que
corresponde a la pérdida del grupo metoxilo vecino al grupo –OTMS y otro fragmento
derivado del anterior en el cual se pierden los grupos O-CH2-CH3 de las posiciones 3 y
5 del anillo piridínico (m/z 324).
N
O
O
O
O
OTMS
O
N
O
O
O
O
OTMS
N
OO
OTMSCH 3-O
-
2x CH3-CH2-O-
m/z 415
m/z 445
m/z 324
d) Caracterización por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de los derivados sintetizados y los productos finales de la oxidación electroquímica.
Esta técnica se utilizó para seguir la electrólisis de los compuestos y estudiar la
posibilidad de cuantificar no sólo el decaimiento de la concentración del derivado 1,4-
DHP, sino en lo posible la piridina u otro producto que se forma en el curso de la
electrolisis.
Se encontró que era posible separar el compuesto sintetizado y el derivado
oxidado a través de la siguiente fase móvil: acetonitrilo/tampón fosfato [55/45] a pH
4,3, con un flujo de 1 mL/min a 35 ºC. Se puede observar una única señal
cromatográfica para los derivados sintetizados en las condiciones experimentales
mencionadas anteriormente. Los derivados de la vainillina e isovainillina presentaron
tiempos de retención cercanos a los 4 minutos, mientras que las C4-indolil DHPs
presentaron tiempos de retención mayores, cercanos a los 6 minutos (Figura 22, Tabla
2).
Figura 22: Señales cromatográficas (HPLC) de los derivados. Detector arreglo de fotodiodos. Fase móvil: acetonitrilo/tampón fosfato pH 4,3; 55/45. flujo: 1 mL/min, 35 ºC.
Un caso aparte fue el cromatograma de la fenil-DHP la cual presentó un tiempo
de retención mucho mayor que los otros derivados. Como se puede observar en la
figura 19, dicho compuesto presentó un tiempo de retención en la columna cercano a
los 8,5 minutos.
3 4 5 6 7 8 9 10
5-Ind-DHP
3-Ind-DHP
tiempo / min.3 4 5 6 7 8 9 10
I-DHP
V-DHP
tiempo / min
Los tiempos de retención y las longitudes de onda máxima a los cuales se
midió la absorción de los derivados se muestran en la tabla 2.
Figura 23: Cromatograma (HPLC) de fenil-DHP. Detector arreglo de fotodiodos. Fase móvil: acetonitrilo/tampón fosfato pH 4,3; 55/45. flujo: 1 mL/min, 35 ºC.
Tabla 3: Características UV-visible y cromatográficas de las 1,4-DHPs[a]Características espectrales UV-vis de las 1,4-DHPs.
[b] Promedio de los tiempos de retención determinados por detector de arreglo de fotodiodos.
En la figura 24A, se ilustra la evolución temporal de las señales encontradas
para la electrólisis a potencial controlado a 1100 mV para el derivado 3-Ind-DHP
seguida con detector de arreglo de fotodiodos (λ 254 nm). Se observa que a tiempo
Compuesto λ max[a]
1,4-DHPTr / min
1,4-DHP[b]
3-Ind-DHP 355 5,9
5-Ind-DHP 356 5,5
V-DHP 288-372 3,9
I-DHP 352 4,1
Fenil-DHP 354 8,5
3 4 5 6 7 8 9 10
Fenil-DHP
tiempo / min.
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
A
gfedcba
0,5 UA
tiempo / minutos
7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0
B
7
65
4
3
2
1
0,2 UA
tiempo / minutos
cero de electrolisis hay una única señal con un tiempo de retención de 5,9 minutos
correspondiente al compuesto 1,4-dihidropiridínico. A medida que transcurre el tiempo
de electrolisis dicha señal disminuye su intensidad y aparece una nueva señal a un
tiempo de retención mayor de 6,2 minutos, la que correspondería al oxidado piridínico.
Luego al aplicar el potencial de 1500 mV, ambas señales desaparecen y nuevamente
se observa la formación de un residuo azulado sobre la malla de carbón utilizada como
electrodo de trabajo. Se observó un resultado similar para 5-Ind-DHP, esto es, sólo
dos señales cromatográficas, la primera correspondiente a la 1,4-DHP con un tiempo
de retención de 5,5 minutos y luego del derivado oxidado a un tiempo de retención
mayor de 5,9 minutos. En el caso de la fenil-DHP, también se observó una señal
correspondiente a la piridina cuando el derivado es oxidado e 1200 mV (figura 24B).
Figura 24. A: Curso temporal de una electrólisis a potencial controlado aplicando +1200 mV del compuesto 3-Ind-DHP (1 mM) en DMSO + 0,1 M de HFFTBA; (a) Señal original, (b) 10 minutos (c) 20 minutos, (d) 30 minutos, (e) 40 minutos, (f) 50 minutos, (g) 60 minutos.
B: Curso temporal de la EPC a 1200 mV de fenil-DHP (1 mM) en DMSO + 0,1 M de HFFTBA. Detector de arreglo de fotodiodo (λ=250 nm). Fase móvil: acetonitrilo/tampón
fosfato pH 4,3; 55/45. flujo: 1 mL/min, 35 ºC.
En el caso de los derivados de la vainillina e isovainillina, en el que en primer
lugar se oxida el sustituyente en posición C4 no se observaron cambios
cromatográficos en las condiciones experimentales. Luego al oxidar a un potencial
mayor de 1280 mV, aparece la nueva señal correspondiente al derivado piridínico.
En resumen, en todos los casos se obtuvieron las dos señales descritas
anteriormente, en las cuales el producto piridínico presentó tiempos de retenciones
mayores que los derivados 1,4-DHP. A partir de estos experimentos podemos concluir
5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
A
gfedcba
0,5 UA
tiempo / minutos
7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0
B
7
65
4
3
2
1
0,2 UA
tiempo / minutos
que a través de esta técnica es posible también seguir la electrolisis en las condiciones
experimentales descritas en esta Tesis. Los valores de tiempos de retención de cada
uno de los compuestos oxidados aparecen en la tabla 4.
Compuesto Tr / min. 1,4-DHP
[a]
Potencial de pico
[b] /mV
Tr / min Prod. oxidado[c
]
3-Ind-DHP 5,9 +1100 6,2
5-Ind-DHP 5,5 +1100 5,9
V-DHP 3,9 +1280 4,3
I-DHP 4,1 +1280 4,3
Fenil-DHP 8,5 +1200 9,5
Tabla 4. Tiempos de retención determinados por detector de arreglo de fotodiodos obtenidos para los productos sintetizados y los productos electrolizados en DMSO + 0,1
M HFFTBA. Fase Móvil: acetonitrilo/tampón fosfato [55/45] a pH 4,3, con un flujo de 1 mL/min a 35 ºC.
[a] Promedio de los tiempos de retención de 1,4-DHPs a λ = 350 – 360 nm.[b] Potencial aplicado durante la electrolisis a potencial controlado.
[c] Promedio de los tiempos de retención de los productos de la EPC a λ = 250 nm.
e) Espectroelectroquímica.Estos experimentos se realizaron para determinar la presencia de especies
intermediarias o productos finales in situ durante la EPC por cambios en el espectro
UV-Vis de los compuestos durante 120 minutos. Todos los compuestos presentan una
gran banda de absorción en el rango de los 350-360 nm. 3-Ind-DHP tiene un máximo
de absorción en los 353 nm y al aplicar un potencial de 1100 mV se produce una
disminución considerable en dicha banda original a 353 nm conforme aumenta el
tiempo de electrólisis. Además se observa un incremento en la zona de los 270-330
nm (Figura 25-A y B)
Figura 25. A: Espectro UV-Vis del curso de la electólisis a potencial controlado de 3-Ind-DHP.Potencial aplicado durante los primeros 60 minutos: +1100 mV. Potencial aplicado
en los posteriores 60 segundos: +1500 mV. DMSO + 0,1 M de HFFTBA. B: Espectro diferencial de A. C: Decaimiento de la absorbancia máxima a 353 nm de A.
Por otra parte, aplicando un potencial de +1500 mV, el cual es superior al
segundo pico anódico encontrado por VPD, no se observaron cambios en el espectro
(Figura 25-C). La figura 21-B muestra el espectro diferencial de 3-Ind-DHP como una
función del tiempo de electrólisis. Las bandas UV-Vis entre 270 y 330 nm
corresponden al derivado piridínico. El resultado del estudio espectroelectroquímico de
5-Ind-DHP fue muy similar. Claramente durante este experimento no se observaron
especies intermediarias, sin embargo la señal formada a 270-330 nm corresponde al
derivado oxidado, la piridina respectiva.
En el caso de V-DHP e I-DHP se aplicó en primer lugar un potencial de 900
mV, el cual, como se ha mencionado anteriormente, es un potencial mayor que el
potencial de pico encontrado por VPD para el primer pico anódico. Durante el tiempo
en que se aplicó dicho potencial, no se observaron cambios significativos en el
espectro UV-Vis como se observa en la figura 26 para I-DHP. Sin embargo, al aplicar
un potencial superior al segundo pico de oxidación (específicamente se aplicó 1270
mV), se produce una notoria disminución de la banda original a 354 nm conforme
avanza el tiempo de electrólisis. Se puede observar también que junto con la
0 20 40 60 80 100 120
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2 C
BA
250 300 350 400
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
∆ A
bsor
banc
ia /
UA
λ / nm
250 300 350 400 450
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
Absor
banci
a / UA
λ / nm
Eapp= 1500 mVEapp= 1100 mV
Abs
orba
ncia
/UA
tiempo /min
disminución de dicha banda a 354 nm existe un aumento en la absorción a 270 y 303
nm. En el inserto de la figura 22 se observa el espectro diferencial de la electrólisis de
I-DHP en función del tiempo. Cómo se puede observar, la aparición de nuevas bandas
con máximos en 273 y 303 nm son más notorias. Dichas señales corresponden al
derivado piridínico. Claramente, durante la electrólisis a 900 y 1270 mV no se
observaron especies intermediarias. El curso de la electrólisis de V-DHP presentó un
comportamiento similar.
Figura 26: Gráfico diferencial de los máximos de absorbancia encontrados en el espectro UV-Visible durante la EPC a 900 y 1270 mV de 100 µM de I-DHP durante 120 minutos.
Inserto: Espectro diferencial de I-DHP durante la EPC a potenciales de 900 y 1270 mV. DMSO + 0,1 M de HFFTBA.
0 20 40 60 80 100 120 140
-0.9
-0.6
-0.3
0.0
0.3
0.6
0.9
300 350 400-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6 λ = 270 nm
λ = 303 nm
λ = 354 nm
∆Abs
orba
nce
/ UA
λ / nm
Eaplicado = +1270 mVEaplicado = +900 mV
λ 303
λ 270
λ 354∆Ab
sorb
an
cia
/ U
A
tiempo / min
5.3. Reactividad frente al anión radical superóxido.
Se estudió la interacción de los derivados sintetizados y tres 1,4-DHPs
comerciales (amlodipino, nimodipino y nisoldipino) frente al anión radical superóxido
mediante estudios electroquímicos y espectrofotométricos.
a) Experimentos electroquímicos.Mediante voltametría cíclica se estudió la electrogeneración del anión radical
superóxido a través del barrido catódico por la reducción de oxígeno molecular
disuelto en la solución de trabajo y la interacción con las moléculas sintetizadas. En
primer lugar se estudió la cupla O2/O2● para una concentración de O2 1 mM
(concentración de trabajo). Los valores de razón de corriente, Ipa/Ipc, y de ∆Ep de la
cupla O2/O2● fueron determinados para cada voltamograma. Los valores de ∆Ep a
diferentes velocidades de barrido mostraron un comportamiento lineal respecto a la
velocidad de barrido (Figura 27), lo cual se ajusta muy bien a datos encontrados en la
literatura para procesos con características cuasireversibles [39,lxxii]. La velocidad de
barrido utilizada para estudiar la interacción frente a las 1,4-DHPs fue 100 mV / s.
Figura 27. A: Voltamogramas cíclicos de 1 mM de O2 en DMSO + 0,1 M de HFFTBA a diferentes velocidades de barrido (50 – 1500 mV). B: Dependencia del ∆Ep con el
cuadrado de la velocidad de barrido.
-300 -400 -500 -600 -700 -800
ν
10 µ A
E / mV (Ag / AgCl)0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
r = 0,9973
ν 1/2 / V1/2 s− 1 / 2
∆Ep
/ mV
(Ag
/ AgC
l)
La razón de corrientes ipa/ipc refleja la tendencia de una especie
electroquimicamente generada, para dar reacciones químicas posteriores como podría
ser la interacción con 1,4-DHPs si éstas están presentes en solución. En las figuras 28
y 29 se muestran los voltamogramas cíclicos de la cupla O2/O2● en presencia de
diferentes concentraciones de las 1,4-DHPs (0,5 – 50 mM). Como se puede observar,
después de la adición de los compuestos, la corriente de pico correspondiente a la
oxidación de O2● (corriente anodica (ipa), regeneración de oxígeno) disminuye,
mientras que la corriente de reducción (corriente catódica (ipc), formación de O2●)
aumenta levemente. Estos resultados evidencian que los compuestos reaccionan con
el O2●, esto es, que el O2
● generado en DMSO es atrapado, de manera concentración-
dependiente, lo que se observa con la disminución pronunciada de la ipa a medida que
aumenta la concentración de 1,4-DHPs. En términos cuantitativos 3-Ind-DHP y 5-Ind-
DHP disminuyen la razón de corriente en un 15% y 20% respectivamente cuando la
concentración presente en solución es de 50 mM (figura 28 A y B).
Figura 28 . Voltamogramas cíclicos correspondientes a la cupla O2/O2• : (a) 1 mM of O2 (b)
+ 1,0 mM (c) +10,0 mM (d) +30,0 mM y (e) +50,0 mM of 3-Ind-DHP (A) y 5-Ind-DHP (B). Velocidad de barrido 100 mV s-1, en DMSO + 0.1 M de HFFTBA.
-300 -400 -500 -600 -700 -800
Be
d
c
b
a10 µ A
E / mV (Ag / AgCl)-300 -400 -500 -600 -700 -800
Ae
d
c
b
a10 µ A
E / mV (Ag / AgCl)
Por otra parte, la corriente de pico anódica de la cupla O2/O2● desaparece por
completo cuando la celda contiene una concentración 30mM de V-DHP e I-DHP,
disminuyendo la razón ipa/ipc en un porcentaje mayor al 50% a bajas concentraciones,
no encontrando diferencias significativas entre ellos (Figura 29). En el caso de los
compuestos Fenil-DHP, amplodipino, nimodipino y nisoldipino la razón de corriente
disminuye en un 30% a concentración 50mM para todos los casos. En la literatura está
demostrado que el superóxido actúa como una base de Bronsted abstrayendo el
Hidrógeno presente en la posición 1 del anillo 1,4-DHP del Nisoldipino, por lo que
mediante dicha reacción el fármaco actuaría como atrapador del radical [39]. Un efecto
similar está descrito para indol y derivados, donde el Hidrógeno en posición 1 actúa
como protón donor frente al O2• [lxxiii], y está ampliamente demostrado que fenoles
sustituidos con grupos metoxilos presentan actividad atrapadora de radicales [lxxiv].
Figura 29. (A) Voltamogramas cíclicos correspondientes a la cupla O2/O2• : (a) 1 mM de O2
(b) + 0,5 mM (c) +1,0 mM (d) +5,0 mM y (e) +10,0 mM V-DHP. (B) Voltamograma cíclico correspondiente a la cupla O2/O2
• : (a) 1,0 mM of O2 (b) + 1,0 mM (c) + 5,0 mM (d) +10,0 mM y (e) +30,0 mM I-DHP. Velocidad de barrido 100 mV s-1, en DMSO + 0.1 M de HFFTBA.
-300 -400 -500 -600 -700 -800
Ae
d
c
b
a
10µ A
E / mV (Ag / AgCl)-300 -400 -500 -600 -700 -800
B e
d
c
b
a10 µ A
E / mV (Ag / AgCl)
En la figura 30, las razones de corriente, Ipa/Ipc, son graficadas en función de
la concentración de las 1,4-DHPs sintetizadas y las 1,4-DHPs comerciales. Se puede
concluir de este gráfico, que existe una directa interacción entre el anión radical
superóxido electroquímicamente generado in situ y los compuestos, lo cual se
evidencia por la disminución de las razones de corriente Ipa/Ipc a medida que
aumenta la concentración, y donde se puede observar que los compuestos V-DHP e I-
DHP presentaron la mayor interacción frente al radical, disminuyendo la razón de
corriente en más de un 50% a concentraciones menores a 50 mM. Por otra parte, las
1,4-DHPs C4-Indolil sustituidas presentaron una menor interacción frente al anión
radical, y éste resultado es similar al observado para la Fenil-DHP, Amlodipino,
Nisoldipino y Nimodipino en las mismas condiciones experimentales. Si bien, todos los
compuestos en estudio mostraron una interacción con el anión radical generado sobre
la superficie del electrodo, la diferencia encontrada entre éstos (principalmente entre
V-DHP e I-DHP frente a 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP) se debería a factores de difusión de
los compuestos hacía la superficie del electrodo, a la presencia de grupos electrón-
donores y a factores estéricos.
Figura 30. Razón de corrientes ipa/ipc de la cupla O2/O2• en presencia de diferentes
concentraciones de los derivados 1,4-DHPs. Concentración de O2 1 mM en DMSO + 0.1 M de HFFTBA. Velocidad de barrido: 100 mV s-1.
0 10 20 30 40 50
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
I-DHPV-DHP
NisoldipinoAmlodipinoNimodipinoFenil-DHP5-Ind-DHP
3-Ind-DHP
[1,4-DHP] / mM
ipa
/ ipc
b) Experimentos espectrofotométricos.Para calcular las constantes cinéticas aparentes para la reactividad entre los
derivados sintetizados y algunas 1,4-DHPs comerciales frente al anión radical
superóxido se utilizó una metodología indirecta basada en espectroscopia UV-Visible,
la cual se sustenta en los siguientes hallazgos experimentales:
1. “El anion superóxido se comporta como base” [lxxv].
Se registró el espectro 1H-NMR de cada uno de los compuestos en ausencia y
en presencia de KO2 (en DMSO-d6) observándose la completa pérdida de la señal en
8,8 ppm correspondiente al Hidrógeno en posición-1 del anillo dihidropiridínico (DHP-
H) como se muestra en la figura 31.
Figura 31. Espectro 1H-RMN correspondiente al derivado fenil-DHP (A). (B) fenil-DHP + 20 mM O2
•_ disuelto en DMSO-d6.
En el caso de las 1,4-DHPs C4-Indolil sustituidas, la señal correspondiente al
protón de la posición 1 de la dihidropiridina y de la posición 1 del indolil desaparecieron
12 10 8 6 4 2 0
B
A
C4-H
1 2 1 0 8 6 4 2 0p p m
C4-HDHP-H
ppm
en presencia de la sal de superóxido. Como se observa en la figura 32A, el espectro 1HRMN de 3-Ind-DHP en DMSO-d6, la señal en 8,9 ppm corresponde al Hidrógeno en
posición 1 del anillo dihidropiridínico (DHP-NH) y en 10,8 ppm la correspondiente al
Hidrógeno en posición 1 del grupo indol (Ind-NH). Luego, a la misma muestra se
agregó un exceso de superóxido de potasio disuelto en DMSO-d6 y se observó la
completa desaparición de las señales correspondientes a los Hidrógenos DHP-H e
Ind-H, junto con la aparición de un fuerte color amarillo en la mezcla. En la figura 32 B
y C se muestran ambos espectros ampliados. Un comportamiento similar se observó
en el espectro 1HNMR de 5-Ind-DHP bajo las mismas condiciones experimentales. De
este experimento se puede concluir que la especie que se forma por la adición de
superóxido de potasio a soluciones de 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP corresponde a un
dianión centrado en ambos Nitrógenos secundarios.
Figura 32. Espectro 1H-RMN correspondiente al derivado 3-Ind-DHP (A). (B) Espectro extendido. (A) + 20 mM O2
•_ disuelto en DMSO-d6 (C).
12 10 8 6 4 2 0
A
ppm
12 11 10 9 8 7 6 5
B
IND-H
DHP-H
C4-H
ppm12 11 10 9 8 7 6 5
C *C4-H
ppm
Un efecto similar se observó para los compuestos V-DHP e I-DHP, donde la
deprotonación del nitrógeno secundario del anillo dihidropiridínico (DHP-H) y el fenol
del sustituyente posición-4 (R-OH) se muestra en la Figura 33 para V-DHP. Junto con
la desaparición de la señal correspondiente al Hidrógeno DHP-H en 8,7 ppm y la
desaparición de la señal R-OH en 8,6 ppm, se observó un ensanchamiento del resto
de las señales del espectro.
Figura 33. Espectro 1H-RMN correspondiente al derivado V-DHP (A). (B) Espectro extendido. (A) + 20 mM O2
•_ disuelto en DMSO-d6 (C).
En todos los espectros 1HRMN en presencia de la sal de superóxido, la señal
correspondiente al átomo de Hidrógeno en posición 4 del anillo dihidropiridínico (C4-H)
permanece intacta. Implicando que a tiempos cortos no hay oxidación por parte del
radical. Además la solución que contiene la especie aniónica presenta un fuerte color
amarillo.
10 8 6 4 2 0ppm
9 8 7 6 5
C4-H
ppm9 8 7 6 5
R-O-HDHP-H
C4-H
1HNMR (300 MHz, DMSO d6): 1.1 (t, J= 7.0, 6H,2x -CH3); 2.2 (s, 6H, 2x-CH3); 3.7 (s, 3H, OCH3); 4.0 (q, J = 7.0, 4H, -CH2); 4.82 (s, 1H, C-H); 7,7; 6.6 (m, 3H, Ar); 8.6 (s, 1H, N-H); 8,7 (s, 1H, OH).
ppm
2. “La especie aniónica formada entre los compuestos sintetizados y el
anión radical superóxido presenta una longitud de onda diferente a la especie protonada”.
Figura 34. A: Espectro UV-Vis de 100 µM de 5-Ind-DHP (a) en presencia de 20 mM de KO2
(b). B: Espectro UV-Vis de 100 µM de V-DHP (a) en presencia de 20 mM de KO2 (b).
Como se mencionó anteriormente, una vez que se agregó la sal de superóxido
a las 1,4-DHPs, se forma la especie aniónica, lo que implica un cambio de color en la
solución. Este cambio es posible de apreciar en el espectro UV-Vis de los compuestos,
que presentan una banda característica a una longitud de onda cercana a los 360 nm
y que en presencia del superóxido de potasio sufre un efecto batocrómico, mostrando
una nueva banda a una longitud cercana a los 450 nm y con una mayor absorbancia,
tal como se observa en la Figura 34 para 3-Ind-DHP (A) y V-DHP (B). Todos los
compuestos, incluyendo a nisoldipino, nimodipino y amlodipino mostraron un
comportamiento similar.
Para confirmar lo recientemente planteado, se utilizó una base orgánica (Hidróxido de
tetrabutil amonio, OHTBA) bajo las mismas condiciones experimentales. En la figura
35 se muestra el espectro UV-Vis de 100 µM de 5-Ind-DHP en DMSO la cual muestra
una longitud de onda máxima de absorción en 356 nm. Posteriormente se adicionaron
concentraciones crecientes de OHTBA y se observó que la señal en 356 nm disminuye
y aparece una nueva señal a 446 nm conforme aumentaba la concentración de base,
lo que coincide con los resultados encontrados frente al superóxido. Finalmente se
agregó OHTBA hasta la completa formación de la especie aniónica (figura 35B). Para
moléculas similares se ha establecido que el anión de la 1,4-DHP tiene un patrón de
250 300 350 400 450 500 550
A
λ 446
λ 356
b
a
0.2 UA
λ / nm250 300 350 400 450 500 550
B
b
a
λ 444 nm
λ 291 nm
λ 354 nm
0,2 UA
λ / nm
absorción UV-Visible diferente al de la 1,4-DHP. Los valores de pKa y de indol en
DMSO son 19.0 [lxxvi] y 21.0 [lxxvii], respectivamente. En consecuencia, el primer paso de
la interacción entre el O2● y los derivados corresponde a la abstracción de ambos
protones en la posición 1 del anillo DHP y del indol en las condiciones experimentales
en las cuales se realizó la reacción.
Figura 35. A: espectro UV-Vis de 100 µM de 5-Ind-DHP en DMSO. B: Espectros UV-Vis de 100 µM de 5-Ind-DHP en presencia de concentraciones crecientes de OHTBA en DMSO.
En el caso de V-DHP e I-DHP se observó la desaparición de la señal de
absorción a 360 nm y la aparición de una banda a aproximadamente 450 nm, cuando
se agregó el OHTBA. Dicha banda desapareció completamente cuando a la celda se
agregó una solución alcohólica de CH3COOH, revirtiendo el proceso completamente,
restituyendo así la banda original a 360 nm como se muestra en la figura 36A. Cuando
se adicionó primero CH3COOH alcohólico no se evidenciaron cambios en el espectro
UV-Vis. Dicho fenómeno se repitió en todos los derivados con similares resultados.
Al estudiar la electro-oxidación de los compuestos, los resultados revelan que
para soluciones 1 mM de V-DHP e I-DHP, la adición de 3mM de OHTBA en una
solución 1 mM de I-DHP (Figura 36B) produjo la desaparición de la señal en +873 mV,
mientras que el pico en +1166 mV permanece prácticamente constante.
Conjuntamente con la desaparición de la señal en +873 mV se observó la aparición de
una nueva señal en –59,7 mV. Por otra parte, la adición de CH3COOH alcohólico sobre
la misma solución, revirtió el proceso completamente. Resultados similares se
obtuvieron para las otras DHPs. Cuando se adicionó primero CH3COOH alcohólico no
se evidenciaron cambios en el comportamiento electroquímico.
250 300 350 400 450
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4 Aλ
máx 356 nm
Abso
rban
cia
/ UA
λ / nm250 300 350 400 450 500 550
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5B
356 nm
446 nm
Abso
rban
cia
/ UA
λ / nm
Figura 36. A: Espectro UV-Vis de 0,1 mM de I-DHP en DMSO. (a) señal original, (b) a en presencia de 0,7mM de OHTBA y (c) b en presencia de 0, 7 mM de CH3COOH. B:
Voltamperogramas de pulso diferencial de 1 mM de I-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA. (a) señal original, (b) a en presencia de 7mM de OHTBA y (c) b en presencia de 7 mM de
CH3COOH.
Por lo tanto, estos resultados implican cambios en las especies electroactivas
como consecuencia de la adición de una base o de un ácido, sugiriendo un equilibrio
de disociación como el que se describe en los esquemas 12 y 13. La señal
voltamétrica y espectroscópica original (≈1000 mV, pico I y a λ≈ 360 nm,
respectivamente) correspondería a la oxidación de la especie I. La especie no
protonada II, sería la responsable de la señal que aparece a ≈ 59 mV y a 450 nm.
Esquema 12. Equilibrio Acido-Base de V-DHP
-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400
B
c
b
a
5 µ A
E / mV250 300 350 400 450 500 550
A
c
b
a
λ 291nm
λ 443nm
λ 353nm1 UA
λ / nm
N
H
O
OO
O
OH
O
N
O
OO
O
O-
O
Base
Acido
Esquema 13. Equilibrio Acido-Base de 5-Ind-DHP
En conclusión, al agregar una base fuerte como el anión radical superóxido o el
OHTBA se genera una especie dianión, donde la carga negativa está centrada en los
átomos de Nitrógeno y Oxigeno. Esta especie vuelve a generar el compuesto neutro
una vez que se agrega ácido al medio.
Se obtuvieron los valores de coeficientes de absorbilidad molar (ε) para las
especies neutras y aniónicas de acurdo al procedimiento descrito en materiales y
métodos. Para esto, se prepararon soluciones de distintas concentraciones de cada
1,4-DHP a las cuales se les adicionó un exceso de la base (TBA-OH), de modo de
desplazar complemente el equilibrio hacia la formación del anión. En la tabla 3 se
muestran los valores de absorbilidad molar en DMSO, los cuales corresponden los
derivados dihidropiridínicos y las absorbilidades molares correspondientes a los
aniones obtenidos en presencia de DMSO + OHTBA. Se puede concluir que existen
diferencias significativas entre los valores de absorbilidades molares de las especies
aniónicas y aquéllas de los derivados originales. Prácticamente la especie aniónica
tiene el doble del valor de la especie neutra.
N
H
O
OO
O
N
Base
Acido
H
N
O
OO
O
N
ε / M-1 cm-1
Compuesto λ=345-360nm λ=445-460nm3-Ind-DHP 10161 ± 16 16674 ± 225-Ind-DHP 8966 ± 20 15968 ± 28
4-Fenil-DHP 6900 ± 14 12625 ± 16V-DHP 6701 ± 18 12920 ± 15
I-DHP 7102 ± 2 11095 ± 14Amlodipino 5992 ± 8 11243 ± 10Nisoldipino
Nimodipino
3332 ± 5
6612 ± 9
9976 ± 11
9983 ± 9
Tabla 5: Absorbilidad molar de las 1,4-DHPs y su especie deprotonada.
Una vez caracterizada la especie aniónica se procedió a realizar el experimento
cinético, esto es, la reacción de la serie de 1,4-DHPs con superóxido de potasio. Para
esto se utilizaron soluciones 100 µM de 1,4-DHP en presencia de un exceso de
superóxido de potasio. La reacción fue seguida por espectrofotometría UV-Vis durante
un tiempo de 5 a 6 horas.
3. “La evolución temporal de la reacción entre el radical superóxido y las
1,4-DHPs reveló que la intensidad de la banda UV-Visible correspondiente al anión dihidropiridínico entre λ= 440-450 nm formado por la reacción
ácido-base con el radical, disminuye significativamente”.
Figura 37. (A) Espectros UV-Visible para la reactividad de 0.1 mM 5-IND-DHP con 20 mM anión superóxido en DMSO. (B) Espectros UV-Visible para la reactividad de 0.1 mM Fenil-
DHP con 20 mM anión superóxido en DMSO.
Conforme transcurre el tiempo de reacción, la banda en la zona de los 450 nm
disminuye en intensidad, lo que indica que existe reacción entre la especie aniónica
formada en el comienzo de la reacción y el anión radical superóxido. En el caso de las
1,4-DHPs C4 indolil sustituidas, la disminución de la banda ocurre de manera más
pronunciada respecto de los otros compuestos, llegando incluso a desaparecer por
completo la banda a 450 nm para ambas 1,4-DHPs (figura 37A). Para la Fenil-DHP
(figura 37B), V-DHP e I-DHP, la disminución de la banda correspondiente a la especie
aniónica disminuye en un 20% luego de 5 horas de reacción, y cerca de un 5% para
los compuestos comerciales. En todos los casos, junto con la disminución en los 450
nm aparece una nueva banda en la zona de los 300 nm. Dicha nueva banda
correspondería al producto de la reacción.
250 300 350 400 450 500 550
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 A308 nm
446 nm
Abso
rban
cia / U
A
λ / nm250 300 350 400 450 500 550
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
1.8
2.1 B
303 nm
447 nm
Abso
rban
cia / U
A
λ / nm
4. “Los espectros UV-Visible exhibieron dos puntos isosbésticos”.
Figura 38. Espectros UV-Visible diferenciales de la reactividad de 0.1 mM 3-Ind-DHP (A) y 5-Ind-DHP (B) con 20 mM anión superóxido en DMSO.
En la figura 38A y B se muestran los espectros diferenciales de 3-Ind-DHP y 5-
Ind-DHP. Como se puede observar, la banda correspondiente al anión se consume a
medida que transcurre el tiempo de reacción (zona 450 nm, absorbancias negativas),
mientras que una banda en la zona entre 300 y 400 nm aumenta (absorbancias
positivas), que correspondería al producto de reacción. Es posible observar la
presencia de dos puntos isosbésticos en ambas figuras (donde la absorbancia es
cero). Esta característica indica que hay dos especies principales durante la reacción,
que en este caso correspondería a la especie que está reaccionando y al producto de
reacción [lxxviii].
250 300 350 400 450 500 550 600-1.5
-1.2
-0.9
-0.6
-0.3
0.0
0.3
0.6
0.9 Bλ 308 nm
λ 446 nm
∆ Ab
sorb
anci
a / U
Aλ / nm
300 350 400 450 500 550 600
-1.2
-0.9
-0.6
-0.3
0.0
0.3
0.6
0.9A
λ 455
λ 389
∆ Ab
sorb
anci
a / U
A
λ / nm
5. “Los resultados de los análisis de los productos de la reacción entre el
superóxido y las 1,4-DHPs por CG/MS sustentan que el anillo 1,4-dihidropiridínico se oxidó hasta el derivado piridínico”.
Para identificar el o los productos de la reacción entre el anión radical
superóxido y los derivados 1,4-DHPs, se utilizó la técnica de cromatografía gaseosa
acoplada a un detector de masas (GC/MS). Así, todas las 1,4-DHPs que reaccionaron
durante 5 horas a 37°C con 20 mM de superóxido de potasio en DMSO, presentaron
las siguientes características: (a) Los tiempos de retención en la columna fueron
coincidentes con los tiempos de retención de los compuestos electrolizados a
potencial constante; (b) Los patrones de fragmentación fueron los mismos que los
encontrados para los compuestos electrolizados (a 1200 mV para la fenil-DHP, a 1100
mV para las indolil DHP y a 1280 para V-DHP e I-DHP); (c) en todos los patrones de
fragmentación la especie más abundante correspondió al ión molecular con un m/z
327 para la fenil-DHP, un m/z 366 para 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP y un m/z 445 para V-
DHP e I-DHP derivatizados con TMS.
De estos resultados se puede concluir que el único producto de reacción entre los
compuestos sintetizados y el anión radical superóxido en DMSO corresponde al
respectivo derivado piridínico.
6. “La 1,4-DHP es la que reacciona con el anión radical superóxido”. Cuando se agregó una concentración equimolar de una base fuerte (OHTBA) a las
soluciones de 1,4-DHPs, se observó la formación de la especie aniónica. A esas
soluciones se adicionó una alícuota del stock de superóxido de potasio y no se
observó la formación del producto piridínico
La evolución de la reacción entre 20 mM de superóxido de potasio y 0.1 mM de
cada 1,4-DHP en DMSO a 37 °C con agitación constante fue registrada durante 5
horas a intervalos de 10 minutos. Las condiciones experimentales en las cuales se
llevaron a cabo los estudios cinéticos, es de pseudo primer orden, donde la
concentración del anión radical superóxido fue al menos 200 veces mayor a la de la
1,4-DHP en estudio.
Como ya se mencionó anteriormente, todos los derivados sintetizados exhiben
una banda con un máximo de absorbancia en la zona entre 350-360 nm. Los
compuestos 3-Ind-DHP, V-DHP e I-DHP exhiben una banda adicional en la zona 270-
280 nm.
Tomando en cuenta las pruebas experimentales detalladas anteriormente y
teniendo la certeza de haber encontrado reacción entre las 1,4-DHPs sintetizadas y
comerciales con el anión radical superóxido, concluimos que no era posible seguir la
reactividad en términos cuantitativos a través de los cambios en la absorción de los
derivados 1,4-DHP a la longitud de onda en la cual absorben ( λ= 360 nm), o de la
aparición del derivado piridínico que absorbe en una longitud de onda cercana a los
280 nm, lo cual está impedido debido a que el propio anión radical superóxido
presenta una intensa banda de absorción próxima a los 300 nm y que también
interfiere en cualquier determinación cuantitativa en esa zona del espectro. Por esta
razón, se planteó una metodología basada en los cambios de absorbilidad molar de la
especie aniónica, es decir los cambios registrados en la zona de los 440- 460 nm. La
metodología asume de manera indirecta, que la velocidad de desaparición de la
especie aniónica es equivalente a la velocidad de oxidación de la 1,4-DHP para formar
el derivado piridínico. Por lo tanto, las constantes cinéticas aparentes para la reacción
entre las 1,4-DHPs sintetizadas y el anión radical superóxido fueron determinadas a
partir de estos cambios.
Tal como se observa en las figuras 37 y 38, la banda a 455 nm para 3-Ind-
DHP, a 446 nm para 5-Ind-DHP y a 447 nm para la fenil-DHP decae significativamente
después de la adición del radical. Considerando que el anión radical superóxido se
encuentra en exceso en el medio de reacción, implica que todas las 1,4-DHPs en
solución se encuentran en su forma aniónica y por lo tanto es posible asumir que dicho
anión que está desapareciendo, repone la 1,4-DHP que se está oxidando a la piridina.
De esta manera, la velocidad de desaparición de la especie aniónica corresponde
indirectamente a la velocidad de oxidación de las 1,4-DHPs a sus respectivos
derivados piridínicos.
Con estos antecedentes se planteó el siguiente desarrollo cinético que nos
permitió calcular, las constantes aparentes cinéticas de la reacción en condiciones de
pseudo primer orden:
[DHP] + [O2●] → [Piridina]
La ley de velocidad con la cual aparece la piridina está dada por la expresión:
d[Piridina] = k [DHP]n [O2●] m, quedando entonces:
dt
d[Piridina] = k’ [DHP], en que k’= k [O2●] m
dt
Considerando los siguientes pasos en función de los resultados experimentales:
Equilibrio ácido-base:
k3
proceso oxidativo: DHP + 2O2● piridina + 2HO2
-
d [piiridina] = k3 [DHP] n [O2●] m, luego
dt
d [piiridina] = k’ [DHP], donde k’= k3 [O2●] m asumiendo primer orden cinético.
dt
Sin embargo, si la concentración de la 1,4-DHP es << O2●, en el estadio estacionario
d [DHP] = k1 [DHP-] - k2 [DHP] – k’ [DHP] = 0 dt
sabiendo que [DHP] = k1[DHP-] / (k2 + k’)
y -d [DHP - ] = d [piridina] = - k’ k1 [DHP - ] dt dt (k2 + k’)
k ’’ = k’ k1
(k2 + k’)
-d [DHP -] = -k’’ [DHP-] dt
d[DHP -] = k’’ t [DHP -]
Integrando:
ln [DHP-] = - k’’ t + ln [DHP -]0
k1
k2
DHP DHP –
Si la información preliminar de que m =1 es correcta, entonces al graficar ln
[DHP-] v/s tiempo, se debería obtener una línea recta con pendiente negativa e igual a
k’’. A partir de la cual entonces es posible calcular una constante de velocidad relativa,
que tiene implícita la constante de equilibrio de la reacción, tal como se procede en
casos de mecanismos complejos que involucran un equilibrio [lxxix].
Los valores de absorbilidad molar de los derivados fueron empleados en la
determinación cuantitativa de las concentraciones de la especie aniónica y el posterior
cálculo de las constantes cinéticas para la reacción entre el radical libre y las 1,4-
DHPs.
Las constantes cinéticas aparentes se obtuvieron a partir de las pendientes de
los gráficos log [DHP- , anión] versus tiempo (figura 39), y los resultados se muestran
en la Tabla 6.
Figura 39. Evolución del ln [DHP_] versus tiempo para el derivado 5-Ind-DHP
Los derivados indolil sustituidos, presentaron la mayor reactividad frente al
anión radical superóxido con una constante de 2,25 x 10-4 segundos-1para 3-Ind-DHP y
de 1,79 x 10-4 segundos-1 para 5-Ind-DHP. Si éstos valores son comparados con el de
la constante del derivado Fenil-DHP, la 3-Ind-DHP resultó ser 6 veces más reactiva,
mientras que la 5-Ind-DHP 5,7 veces. Por otra parte, los valores de constantes
obtenidos para V-DHP e I-DHP son mucho menores que los indolil sustituidos y similar
0 5000 10000 15000 20000-11.5
-11.0
-10.5
-10.0
-9.5
-9.0
Ln(D
HP
- )
tiempo / seg
r=-0,99992r2=0,99984
a la fenil-DHP. Notablemente, todos los derivados sintetizados fueron más reactivos
que las 1,4-dihidropiridinas comerciales, amlodipino, nisoldipino y nimodipino.
Nuevamente, se aprecia que la estrategia de síntesis de incluir un grupo indolil o
metoxifenil en la posición-4 del anillo 1,4-dihidropiridina, produce un aumento
significativo en la reactividad frente al anión radical superóxido y que la posición de
dicho sustituyente es relevante en su reactividad frente al radical.
En la tabla 6, se muestran los valores de constante de reactividad obtenidos
para todos los compuestos frente al radical superóxido en DMSO a 37°C. El valor de
constante más alto es el de 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP. Todos los compuestos
sintetizados presentaron una reactividad mayor que nisoldipino, nimodipino y
amlodipino, 1,4-DHPs comerciales con demostrada actividad antioxidante.
Compuesto k ’’ (a) (seg-1) x 10-4 Relativo a Nisoldipino(b)
3-Ind-DHP 2,25 ± 0,04 16,15-Ind-DHP 1,79 ± 0,06 12,8
4-Fenil-DHP
V-DHP
I-DHP
0,38 ± 0,03
0,21 ± 0,02
0,62 ± 0,05
2,7
1,5
4,4Amlodipino 0,15 ± 0,02 3,6Nisoldipino
Nimodipino
0,14 ± 0,01
0,03 ± 0.01
1,0
0,2
Tabla 6. Constantes cinéticas de la serie en estudio frente al anión radical superóxido en DMSO a 37°C.
(a) Constante de reactividad asumiendo un primer orden cinético para la reacción entre 1,4-DHP y KO2.
(b) Razón: constante de reactividad de 1,4-DHP / constante de reactividad de Nisoldipino en presencia de KO2.
Finalmente, un gráfico que relaciona de manera lineal, los valores de
constantes cinéticas aparentes vs. los potenciales de oxidación del anillo
dihidropiridínico (Figura 40) muestra que aquel compuesto que posee el menor
potencial de oxidación es el que presenta el valor de constante cinética más alto.
Figura 40. Relación entre las constantes cinéticas aparentes k” y los potenciales de oxidación del anillo dihidropiridínico de los derivados.
El curso en el tiempo de la reacción entre los derivados frente al anión radical
superóxido en las mismas condiciones del experimento espectrofotométrico fue
seguido también mediante HPLC. Como se puede observar en la figura 41, el
compuesto 5-Ind-DHP exhibe una señal cromatográfica a 5,5 minutos, tal como se
mencionó anteriormente. Luego de la adición del radical libre (20 mM de KO2) se
produce la aparición de una nueva señal a 5,8 minutos, la cual corresponde a la
piridina respectiva. El curso de la reacción fue seguido durante 5 horas al igual que el
estudio espectrofotométrico, y se inyectó la solución en el cromatógrafo en intervalos
de una hora (Figura 41a-39f). La oxidación de 5-Ind-DHP por superóxido de potasio
terminó a las 5 horas (Figura 41f). Al comparar las características cromatográficas de
los productos oxidados, es decir, las soluciones después de 5 horas de reacción con
KO2 y las soluciones electrolizadas a los potenciales correspondientes a la oxidación
del anillo dihidropiridínico, éstos resultaron ser de similares características
cromatográficas como se puede observar en la Tabla 7, donde el tiempo de retención
de la solución de reacción coincide con el tiempo de retención de las soluciones
electrolizadas (Tabla 4). Estos datos confirman mediante otra técnica que el producto
corresponde al derivado piridínico.
950 1000 1050 1100 1150 1200 1250
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
R=0,85
I-DHP
V-DHP
Fenil-DHP
5-Ind-DHP
3-Ind-DHP
NisoldipinoAmlodipino
Nimodipino
E / mV (Ag / AgCl)
k" s
-1/ 1
0 -6
Figura 41. Curso de la reacción entre 0,1 mM de 5-Ind-DHP y 20 mM de KO2 en DMSO a 37°C, seguida por HPLC con detector de arreglo de fotodiodo (λ=250 nm). Fase móvil Acetonitrilo / Tampón fosfato (55/45) a pH 4,3. Flujo 1 mL/min a 35°C. (a) 5-Ind-DHP. Mezcla de reacción: (b) t= 0, (b) t= 1 hora, (c) t= 2 horas (d) 3 horas (e) 4 horas (f) 5
horas.
Compuesto Tr / minProd. de reacción[a]
3-Ind-DHP 6,2
5-Ind-DHP 5,9
V-DHP 4,2
I-DHP 4,3
Fenil-DHP 9,6
Tabla 7: Tiempos de retención por detector de arreglo de fotodiodos (λ = 250 nm) obtenidos para los productos de reacción frente al anión radical superóxido en DMSO.
Cabe resaltar, que no fue posible identificar la especie aniónica mediante ésta
técnica, debido a que la fase móvil utilizada (Acetonitrilo / Tampón fosfato (55/45))
5 6 7 8 9
0.1 UA
f
e
d
c
b
a
tiempo / min
posee un pH=4,3 por lo que una vez extraída la alícuota desde el medio de reacción
de los derivados frente al anión radical superóxido, el equilibrio se ve desplazado hacia
la especie protonada.
Resumiendo, a partir de los experimentos voltamétricos y espectroscópicos se
demostró la reactividad de los derivados frente al anión radical superóxido. En los
experimentos voltamétricos (VPD y VC), se observaron diferencias respecto al rango
de concentraciones utilizadas. Así, en los experimentos de VC, el O2● es
electroquímicamente generado in situ sobre la superficie del electrodo, en una solución
que contiene Oxígeno disuelto. De este modo, solo las 1,4-DHPs que alcanzan la
superficie del electrodo reaccionan con el anión radical electroquímicamente generado
y disminuyen, por lo tanto, la corriente anódica. En el caso de los experimentos de
VPD, el anion superóxido (KO2) se adhirió a la solución junto con los derivados 1,4-
DHPs. Y como se demostró previamente, es la especie aniónica la que alcanza la
superficie del electrodo y es posteriormente oxidada a piridina, por lo que es necesario
una menor concentración de los derivados para observar cambios en los
voltamogramas. Los resultados espectrofotométricos permitieron calcular las
constantes de reactividad de pseudo primer orden para todos los derivados frente al
anión radical superóxido, mediante un método indirecto, esto es, a partir de la especie
aniónica. Se puede concluir entonces, que la inclusión de un grupo indolil en la
posición-4 de anillo dihidropiridínico favorece la reactividad frente al radical respecto
de los otros compuestos estudiados (sintetizados y comerciales), en las condiciones
experimentales usadas.
En el esquema 14 se propone un mecanismo lógico para la oxidación de la
dihidropiridina a piridina, la cual fue identificada por GC-MS como el producto final de
la reacción.
Esquema 14. Mecanismo propuesto de la reacción de los derivados frente al anión radical superóxido.
NH
R5
R4
R3
N
R5
R4
R3
+ HO2O2
H
N
R5
R4
R3
H
N
R5
R4
R3
H
O2
N
R5
R4
R3
+ HO2
N
R5
R4
R3
5.4. Medio prótico: Tampón Britton Robinson 0,04 M – etanol (70-30) + KCl 0,1M.a) Voltametría y coulombimetría.
Se estudió la dependencia del proceso de oxidación de los compuestos mediante
voltametría de pulso diferencial en tampón Britton-Robinson 0.04 M / etanol, 70/30 y
ajustando la fuerza iónica con KCl a 0.1 M, en un intervalo de pH de 2 a 12.
Figura 42: Voltamogramas de pulso diferencial de soluciones 0,1 mM de A: 3-Ind-DHP, B: 5-Ind-DHP, C: Fenil-DHP y D: indol. En tampón Britton Robinson 0,04 M / etanol, 70/30.
Los derivados C4-indolil sustituidos exhibieron dos picos de oxidación bien
definidos en todo el rango de pH estudiado (pico I y II) al igual que en medio aprótico.
En la Figura 42A se muestra el voltamograma de pulso diferencial a pH 7 de la 3-Ind-
DHP, el pico I con un valor de Ep= 590 mV que corresponde a la oxidación del anillo
dihidropiridinico y el pico II a un Ep= 865 mV correspondiente a la oxidación del grupo
indolil de la posición-4. En el caso de 5-Ind-DHP, el pico I tiene un valor más anódico
que 3-Ind-DHP con un Ep= 662 mV y el pico II un Ep= 872 mV, correspondiente a la
oxidación del anillo dihidropiridina y a la oxidación del grupo indolil, respectivamente.
0 200 400 600 800 1000 1200
pico II
pico I
E / mV (Ag / AgCl)
B
0 200 400 600 800 1000 1200
pico II
pico I
2µ A
E / mV (Ag / AgCl)
A
0 200 400 600 800 1000 1200
2µ A
E / mV (Ag / AgCl)
C
0 200 400 600 800 1000 1200E / mV (Ag / AgCl)
D
fenil-DHP e indol, presentaron un único pico anódico en todo el rango de pH (Figuras
42C y D, respectivamente). En las figuras 43A y B se muestra el comportamiento de
los Ep (I y II) versus el pH para 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP. Se observa, que en ambos
casos, el pico I fue independiente del pH entre valores de 2 < pH < 4, pero a pH > 4
fue pH dependiente. Por otra parte, el pico II fue pH-dependiente en todo el rango de
pH estudiado (2 - 12). Estos resultados implican que en ambos compuestos el proceso
de oxidación que corresponde a la señal I involucra dos mecanismos diferentes. En la
zona independiente del pH (zona ácida) no habría protones involucrados en la etapa
determinante de la velocidad ni en alguna etapa previa, pero en la zona de pH-
dependiente (pH alcalino) los protones sí estarían involucrados en la etapa
determinante de la velocidad o en alguna etapa previa. En el caso de la oxidación del
pico II solo habría un mecanismo involucrado en todo el rango de pH. Por otra parte, la
Fenil-DHP y el indol mostraron un único pico anódico que corresponden a la oxidación
del anillo 1,4-dihidropiridínico y de la molécula de indol, respectivamente. La
electrooxidación de la Fenil-DHP fue similar al mostrado por el pico I, es decir, el
potencial de pico no varió entre el rango 2 < pH< 4. Sin embargo se hizo dependiente
del pH a valores de pH > 4. Por otra parte, la oxidación de indol fue pH-dependiente en
todo el rango estudiado (pH 2 – 12), comparable a lo encontrado en la molécula en la
que coexisten los dos grupos electroactivos, esto es, el pico II.
Figura 43: Dependencia del potencial de pico (VPD) con el pH. Gráfico A: compuesto 3-Ind-DHP. Gráfico B: compuesto 5-Ind-DHP.
Al igual que en medio aprótico, el primer pico (pico I) correspondería a la
oxidación del anillo dihidropiridínico y el pico II correspondería a la oxidación del indol.
Como se puede observar, la inclusión de un indol en la posición 4 del anillo 1,4-DHP
2 4 6 8 10 12300
450
600
750
900
1050B
pico II
pico I
Ep /
mV
(Ag
/ AgC
l)
pH2 4 6 8 10 12
300
450
600
750
900
1050
1200 Apico II
pico I
Ep /
mV
(Ag
/ AgC
l)
pH
desplaza el potencial de oxidación de éste, a potenciales menos anódicos comparado
con la fenil-DHP. Por otra parte, el potencial de oxidación del grupo indolil se desplaza
hacia potenciales más positivos en ambos derivados en relación con la molécula de
indol.
Si se comparan los valores de potencial de oxidación del anillo dihidropiridínico
en términos de la facilidad de oxidación, se obtiene el siguiente orden: 3-Ind-DHP (554
mV) > 5-Ind-DHP (655 mV) > fenil-DHP (660 mV). Este orden podría ser explicado por
la influencia que ejercería el sustituyente indol sobre el anillo dihidropiridínico y la
posición a la cual está enlazado. El sustituyente indolil en la posición-4 del anillo
dihidropiridínico aumenta la densidad electrónica y en consecuencia, favorece la
oxidación, esto es, los potenciales de oxidación de este compuesto son menos
anódicos (menos positivos). La oxidación del indol a pH 7.4 ocurrió a un valor de Ep=
740 mV. Este resultado indica que al menos a este pH, la oxidación del grupo indolil
presente en el anillo dihidropiridínico, ocurre a valores significativamente más positivos
que el indol, demostrando que la presencia del anillo dihidropiridínico retrasa la
oxidación del indolil evidenciando el efecto que tiene la coexistencia de dos centros
redox en estas moléculas. En conclusión, los potenciales de oxidación del grupo indolil
a pH 7.4 presentan el siguiente orden: indol (740 mV) > 3-Ind-DHP (860 mV) > 5-Ind-
DHP (870 mV).
El número de electrones transferidos de los derivados en medio prótico se
determinó por EPC a pH 3 y 11. De esta manera, soluciones exactamente pesadas de
los derivados indolil-DHPs fueron electrolizadas a potencial constante en el medio
electrolítico previamente descrito. A pH 3 se aplicó un potencial de 900 mV y el
número de electrones transferidos en el primer proceso oxidativo resultó ser 2,16 ±
0,20. Este valor está de acuerdo con el mecanismo de oxidación del anillo
dihidropiridínico en medio ácido y aprótico que ocurre vía 2 electrones – 2 protones.
Cuando nuevas soluciones se electrolizaron a 1300 mV al mismo pH, se obtuvo un
valor total de 3,44 ± 0,30 electrones. Este último valor correspondería a la oxidación de
los dos grupos electroactivos, es decir, la oxidación del anillo 1,4-DHP (2 electrones –
2 protones) y la oxidación del grupo indolil que involucra 1-electrón – 1-protón. Por otra
parte, a pH 11 se encontró un valor total de 2,5 ± 0,20 electrones cuando las
soluciones se electrolizaron a 700 mV. En ambos pHs se observó la formación de un
depósito azul sobre la malla de carbono utilizada como electrodo de trabajo al aplicar
el potencial correspondiente a la oxidación del segundo centro redox.
Las soluciones electrolizadas en medio prótico fueron analizadas también por
CG-MS. Los cromatogramas y los patrones de fragmentación coinciden con los
obtenidos en medio aprótico, encontrándose los siguientes resultados: (a) tiempos de
retención menores para los compuestos electrolizados respecto de los derivados
sintetizados; (b) la presencia de fragmentos con el sustituyente de la posición-4
(grupos fenilo, indolil y 2-metóxifenol); (c) el ion molecular M+, fue uno de los
fragmentos más abundantes. Los cromatogramas y los patrones de fragmentación
fueron similares a los presentados en las figuras 12-14 Para las 1,4-DHPs C4-indolil
sustituidas no se observa un cromatograma definido luego de electrolizar a potenciales
mayores que el correspondiente al segundo pico obtenido por VPD a ningún pH, y se
observó nuevamente la formación de un producto sobre la superficie de carbón de la
malla utilizada como electrodo de trabajo.
Concluyendo, en este medio el orden de oxidación de los centros redox
coincide con el encontrado en medio aprótico, siendo la primera señal correspondiente
a la oxidación del anillo dihidropiridínico y el segundo pico, la oxidación del grupo
indolil. Se encontró el derivado piridínico como producto de la oxidación electroquímica
del pico I. El producto fue identificado por GC/MS. Al oxidar los compuestos a un
potencial mayor que el segundo pico anódico se observó la formación de una película
azul sobre la malla de carbón utilizada como electrodo de trabajo.
Figura 44: Voltamogramas cíclicos de 1mM de los compuestos 4-Indolil sustituidos. Tampón Britton Robinson 0,04 M / etanol 70/30, pH 7,0. Velocidad de barrido 0,25 V/s.
En orden a investigar el comportamiento voltamétrico en diferentes escalas de
tiempo, se realizaron experimentos por voltametría cíclica (VC). Se realizaron estudios
a distintos pH (3; 7 y 11) y velocidades de barrido (0,1- 5 V/s), encontrándose en todos
los casos resultados muy similares, esto es, las ondas de oxidación fueron de carácter
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
3-Ind-DHP
5-Ind-DHP
50 µ A
E / mV (Ag / AgCl)
irreversible en esas condiciones. Se distinguieron dos ondas anódicas
correspondientes a la oxidación del anillo DHP y la oxidación del grupo indolil de la
posición-4.
En todos los casos los gráficos log ip vs log V exhibieron pendientes cercanas
a 0,8; indicando que la corriente es controlada por un proceso mixto (difusión y
adsorción). Además, los potenciales de pico (Ep) fueron dependientes de la velocidad
de barrido, dando cuenta de un proceso de carácter irreversible.
En el caso de V-DHP se observaron tres picos en medio ácido los cuales se
desplazaron a valores menos positivos conforme aumentaba la basicidad del medio. I-
DHP presentó sólo dos picos en todo el rango de pH estudiado (2-12). En la Figura
45A se muestran los voltamogramas de pulso diferencial a pH 3, 7 y 11 de V-DHP.
Fenil-DHP y guayacol, presentaron un único pico anódico en todo el rango de pH . En
las figuras 45B y C se muestra el comportamiento de los Ep (I y II) versus el pH para
V-DHP e I-DHP. Se observa, que en el caso de V-DHP, no existe un claro
comportamiento debido a que se observaron dos señales poco definidas a valores de
potencial mayores de 600 mV, sin embargo, el pico I fue dependiente del pH en todo el
rango estudiado. Por otra parte, I-DHP presentó una dependencia en todo el rango de
pH para el pico I y dos tendencias para el pico II. Por otra parte, la Fenil-DHP y el
guayacol mostraron un único pico anódico que corresponden a la oxidación del anillo
1,4-dihidropiridínico y del OH del o-metoxifenol, respectivamente. Al comparar los
resultados con la electrooxidación de la Fenil-DHP, en este caso, el comportamiento
fue similar al mostrado por el pico II, es decir, que el potencial de pico prácticamente
no varió entre los valores 2 < pH< 4, volviéndose relativamente pH-dependiente a
valores de pH > 4. Guayacol presentó un único pico anódico el que fue pH
dependiente en todo el rango de pH estudiado, similar al patrón mostrado por el pico I.
A pH 7, el guayacol presentó un potencial de pico de 424 mV, esto es, 40 a 50 mV
más que el encontrado para el pico I de V-DHP e I-DHP, por lo que en este medio
también se observa que la presencia del anillo 1,4-DHP favorece la oxidación del
fenol, desplazando los potenciales hacia valores menos anódicos. Por el contrario, el
potencial de pico de la segunda señal de V-DHP e I-DHP, correspondiente al anillo
dihidropiridínico, es desplazada a potenciales más anódicos respecto de la Fenil-DHP.
Figura 45. A: VPD de 0,1 mM de V-DHP en Tampón Britton Robinson 0,04 M / etanol a pH 3, 7 y 11. B: Ep / pH de V-DHP. C. Ep / pH de I-DHP.
En orden a investigar el comportamiento voltamétrico en diferentes escalas de
tiempo, se realizaron experimentos por voltametría cíclica (VC). Se distinguieron dos
0 200 400 600 800 1000 1200
A
peak III
peak II
peak II
peak IIpeak I
peak I
peak I
pH 11
pH 7
pH 31µ A
E / mV (Ag / AgCl)
2 4 6 8 10 120
200
400
600
800
1000
1200 B pico I pico II pico III
E /
mV
/A
g /
Ag
Cl)
pH
2 4 6 8 10 12
200
400
600
800
1000C
E /
mV
(A
g /
Ag
Cl)
pH
pico I pico II
ondas anódicas correspondientes a la oxidación del –OH del sustituyente en posición-
4 y a la oxidación del anillo dihidropiridínico (Figura 46A). Se realizaron estudios a
distintos pH (3; 7 y 11) y velocidades de barrido (0,1- 5 V/s), encontrándose en todos
los casos resultados muy similares, esto es, las ondas de oxidación fueron de carácter
irreversible en esas condiciones.
En todos los casos los gráficos log ip vs log V exhibieron pendientes cercanas
a 0,5 (Figura 46B); indicando que la corriente es controlada por un proceso de
difusión. Además, los potenciales de pico (Ep) fueron dependientes de la velocidad de
barrido, confirmando la irreversibilidad del proceso.
Figura 46. A: Voltamogramas cíclicos a diferentes velocidaddes de 0,1 mM de I-DHP en Tampón Britton Robinson a pH 11. Vel. Barrido: 100 – 3000 mV / seg. B: Gráfico log i vs
log v. de A.
El número de electrones transferidos de los derivados en este medio se
determinó por EPC a pH 3 y 11. De esta manera, soluciones exactamente pesadas de
los derivados V-DHP e I-DHP fueron electrolizadas a potencial constante en tampón
Britton Robinson 0,04M / etanol (70/30). A pH 3 se aplicó un potencial de 800 mV y el
número de electrones transferidos en el primer proceso oxidativo resultó ser 1,10 ±
0,15. Este valor está de acuerdo con el mecanismo de oxidación del fenol al radical
fenoxilo que posteriormente deriva a la formación de una quinona. Cuando nuevas
soluciones se electrolizaron a 1200 mV en el mismo pH, se obtuvo un valor total de
3,04 ± 0,21 electrones. Este último valor correspondería a la oxidación de la molécula
completa, es decir, a la oxidación del fenol (vía 1-electrón – 1-protón) y a la oxidación
del anillo dihidropiridínico vía 2 electrones – 2 protones. Por otra parte, a pH 11 se
-200 0 200 400 600 800
A
20µ A
E / mV (Ag / AgCl)1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4B
log
i peak
I
log v
encontró un valor total de 2,2 ± 0,11 electrones cuando las soluciones se electrolizaron
a 650 mV a pH 11.
5.5. Reactividad con radicales alquilperoxilo (ROO • ) ABAP-derivados.
Considerando que los radicales alquilperoxilo juegan un importante rol en los
procesos químicos y biológicos del organismo humano, esto es, están involucrados en
variadas reacciones en cadena, como por ejemplo la lipoperoxidación lipídica, el daño
a proteínas y fenómenos de toxicidad en general, se estudió la reactividad de los
compuestos sintetizados con radicales alquilperoxilo.
Como generador de radicales se utilizó ABAP (2,2’-azobis (2-amidinopropano
diclorhidrato, esquema 1), un azocompuesto que se descompone térmicamente en
tampón acuoso a pH 7.4 y 37 ºC, y que en la presencia de oxígeno genera radicales
alquilperoxilo.
Para evaluar la reactividad se empleó espectroscopía UV-Visible y
cromatografía gaseosa acoplada a masas (GC/MS). El curso temporal de la reacción
se siguió por cambios en las bandas originales de absorción UV-Vis de los
compuestos, esto es, entre λ= 345–360 nm. Los resultados revelaron que la adición
de los derivados 1,4-DHP a una mezcla acuosa conteniendo los radicales
alquilperoxilo (ROO•), disminuyeron significativamente las bandas de absorción en
función del tiempo de reacción.
En la Figura 47A, C y E se muestra la evolución temporal de la intensidad de la
banda de absorción máxima cercana a los 360 nm de 3-Ind-DHP (A), de Fenil-DHP (C)
y de V-DHP (E) en presencia de un exceso del generador de radicales se observa una
disminución significativa de la intensidad de las bandas. Paralelo con este cambio se
observa la aparición de una nueva banda cercana a los 280 nm que corresponde a la
piridina. Estos cambios espectrales se aprecian de mejor manera en las Figuras 47B,
D y F, las cuales muestran los espectros diferenciales correspondientes a las bandas
más relevantes.
En estos espectros se observa claramente la presencia de puntos isosbésticos
que indican la presencia de dos especies principales, la 1,4-DHP que se consume en
la reacción frente a los radicales y el producto de la reacción, el derivado piridínico.
El tratamiento cinético aplicado para obtener las constantes de reactividad
frente a los radicales alquilperoxilo, comprende la condición de pseudo primer orden
para la reacción y consideran constante la descomposición de ABAP que se encuentra
en una proporción 200 veces mayor que la concentración de los derivados 1,4-DHPs:
ABAP 2ROO●
Así, la siguiente expresión fue usada para determinar las constantes cinéticas
aparentes:
1,4DHP + ROO● PIRIDINA
De acuerdo a la ley de velocidad:
vPIRIDINA = k [ROO●] [1,4-DHP].
En nuestras condiciones experimentales: [ROO●] >>[DHP], donde
vPIRIDINA = k' [1,4-DHP], con k' = k [ROO●]
vPIRIDINA = -v[1,4-DHP] = - d[1,4-DHP] / dt = k' [1,4-DHP]
d [1,4-DHP] / [1,4-DHP] = -k' dt,
Considerando los límites de integración [1,4-DHP]0 a t=0 y [1,4-DHP] a t=t
respectivamente, luego
∫d [1,4-DHP] / [1,4-DHP] = -∫ k' dt
ln [1,4-DHP] = -k' t + ln [1,4-DHP]0
Como se puede observar en la figura 48, los gráficos de Ln[1,4-DHP] versus
tiempo son una línea recta con pendiente igual a k'. La linealidad de los gráficos,
superior a r= 0.9994 para todos los derivados, soporta la condición de pseudo primer
orden asumida para la reacción.
Las constantes de velocidad para las 1,4-DHPs frente a los radicales alquilperoxilo
ABAP-derivados, fueron calculadas a partir de cinco experimentos independientes. Los
valores de k´obtenidos fueron comparados con las 1,4-DHPs comerciales a través de
la razón:
r = k´1,4-DHP sintetizadas/ k´ 1,4-DHPcomerciales
Finalmente, las soluciones control (en ausencia de ABAP) no mostraron cambios en el
espectro original de los compuestos ni en sus espectros de masa.
Para comparar la reactividad, se utilizaron los valores de constantes cinéticas
obtenidas para los derivados propuestos y los comerciales (Tabla 8). Se puede
observar que nuevamente los derivados C4-Indolil sustituidos presentaron la mayor
reactividad, siendo 5 a 6 veces más reactivos que nisoldipino.
Se comprobó por GC-MS que el único producto de la reacción fue el derivado
piridinico.
Figura 47. A: Espectro de 100 uM de 3-Ind-DHP + radical alquilperoxilo ABAP derivado. B: Espectro diferencial de A. C: Espectro de 100 uM de 4-Fenil-DHP + radical
alquilperoxilo ABAP derivado. D: Espectro diferencial de C. E: Espectro de 100 uM de V-DHP + radical alquilperoxilo ABAP derivado. F: Espectro diferencial de E. Tampón
Britton-Robinson 0,04 M /DMF 70/30 a pH 7,4, 120 minutos, 37 °C.
250 300 350 400
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0A
Abs
orba
ncia
/ U
A
λ / nm250 300 350 400 450 500 550 600
-1.0
-0.5
0.0
0.5 B
λ / nm
∆Abs
orba
ncia
/ U
A
270 300 330 360 390 420-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4D
∆Abs
orba
ncia
/ UA
λ / nm240 270 300 330 360 390 420
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4 C
Abso
rban
cia
/ UA
λ / nm
260 280 300 320 340 360 380 400 420
-0.3
0.0
0.3
0.6 F
Abso
rban
cia / U
A
λ / nm240 270 300 330 360 390 420
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6E
Abso
rban
cia /
UA
λ / nm
Figura 48. Gráfico ln[1,4-DHP] versus tiempo para la reacción de A: 3-Ind-DHP y B: I-DHP frente a los radicales alquilperoxilo ABAP derivados en tampón Britton Robinson 0,04 M /
DMF; 70/30 a pH 7.4 a 37ºC.
Tabla 8. Constantes cinéticas aparentes para la reacción entre 1,4-DHPs C4-sustituidas y radicales alquilperoxilo ABAP-derivados en tampón Britton Robinson 0,04 M / DMF; 70/30
a pH 7.4 a 37ºC.
Compuesto ak / 10-3 / s-1 b k/Nisoldipino cEp
Fenil-DHP 0,05 ± 0,005 2,5 6443-Ind-DHP 0,12 ± 0,004 6,0 5965-Ind-DHP
V-DHPI-DHP
0,11 ± 0,0080,08 ± 0,0070,07 ± 0,005
5,54,03,5
648---
755Nisoldipino 0,02 ± 0,009 1,0 681Amlodipino 0,03 ± 0,007 1,5 725Nimodipino 0,03 ± 0,005 2,0 736
a Constantes cinética aparentes calculadas de los gráficos de ln[1,4-DHP] versus tiempo para la reacción frente a los radicales alquilperoxilo. Los valores corresponden a cinco medidas
independientes.b Razón entre las constantes cinéticas aparentes de las 1,4-DHPs estudiadas y la constante
cinética aparente obtenida para nisoldipino en las mismas condiciones experimentales.c Potenciales de oxidación obtenidos por VPD en tampon Britton-Robinson /etanol: 70/30 at pH
7,4.
En conclusión, la inclusión de un sustituyente indol y o-metoxifenol favorece la
reactividad de las 1,4-DHPs respecto de la Fenil-DHP y las 1,4-DHPs comerciales.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000-9.65
-9.60
-9.55
-9.50
-9.45
-9.40
-9.35
-9.30
-9.25
-9.20 B
Ln[I-
DHP
]
tiempo / seg.0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
-9.8
-9.7
-9.6
-9.5
-9.4
-9.3
-9.2
-9.1 Aln
[3-In
d-DH
P]
tiempo / seg.
5.6 Análisis conformacional de los compuestos sintetizados.
a) Optimización de las estructuras.
En la literatura, existen diversos estudios teóricos y experimentales acerca de
la relación estructura-actividad de 1,4-DHPs, las cuales indican que la naturaleza y la
posición de los sustituyentes en el anillo dihidropiridínico juegan un rol muy importante
sobre la actividad biológica de estos fármacos, pudiendo en algunos casos predecir la
actividad biológica de determinadas drogas usando modelos matemáticos que
relacionan su estructura química [lxxx,lxxxi]. Trabajos acerca de cálculos y análisis
estructurales por rayos X de compuestos 1,4-DHPs, muestran que el anillo
dihidropiridínico adquiere la conformación tipo bote, que es la más estable y que el
sustituyente arílico en C4 puede ocupar una posición pseudoaxial o ecuatorial [lxxxii,lxxxiii].
Por otra parte, los grupos carbonilos de los ésteres en las posiciones 3 y 5 adoptan
principalmente tres conformaciones esenciales: trans-trans, cis-trans y cis-cis
(respecto a los dobles enlaces del anillo dihidropiridínico).El volumen de cada derivado
se muestran en la tabla 9.
Compuesto V° (Å 3)Fenil-DHP 385,813-Ind-DHP 421,645-Ind-DHP 420,75
V-DHP 425,07I-DHP 426,27
Tabla 9. Volúmenes obtenidos para los derivados en fase gas utilizando la base orbital ccpVTZ.
Las estructuras optimizadas de la serie en estudio muestran que todos los
derivados presentan la conformación tipo bote para el anillo dihidropiridínico,
independiente de si el sustituyente es un grupo fenilo, un grupo indolil o un grupo
metoxifenol, observándose diferentes desviaciones del C4 y el N1 respecto del plano
definido por la base del bote por C2-C3-C5-C6.
Si el sustituyente en el C4 es un fenilo, como en el caso de la Fenil-DHP, éste
adquiere una posición axial por encima del anillo 1,4-DHP, quedando de esta manera,
tanto el anillo dihidropiridínico como el fenilo, perpendicular uno con el otro. La
distancia de los átomos N1 y C4 respecto al plano formado por la base del bote se
muestran en la tabla 10. Respecto de los grupos carbonilos, ambos se encuentran en
posición trans respecto de los dobles enlaces del anillo 1,4-DHP (trans-trans). En la
figura 49 se muestra la estructura optimizada de Fenil-DHP.
Figura 49. (A) fenil-DHP; (B) Vista frontal de la estrutura optimizada de fenil-DHP; (C) Vista lateral de la estrutura optimizada de fenil-DHP; (D) Mejor plano medio formado por
los átomos C2-C3-C5-C6 del anillo 1,4-DHP. La ilustración muestra a los átomos de carbono en color gris, hidrógeno en blanco, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul.
En el caso de 3-Ind-DHP el grupo indolil se encuentra axial y perpendicular al
anillo dihidropiridínico (figura 50). La posición de los grupos carbonilos en las
posiciones 3 y 5 es cis respecto de los dobles enlaces del anillo dihidropiridínico,
quedando ambos grupos etoxicarbonil hacia el lado contrario del grupo indol,
espacialmente hacia abajo respecto al plano C2-C3-C5-C6. Las distancias respecto
del plano base del bote para el C4 es de 0,27 Å y para el N1 es de 0,09 Å (Tabla 10).
Figura 50. (A) 3-Ind-DHP; (B) Vista frontal de la estrutura optimizada de 3-Ind-DHP; (C) Vista lateral de la estrutura optimizada de 3-Ind-DHP; (D) Mejor plano medio formado por
los átomos C2-C3-C5-C6 del anillo 1,4-DHP. La ilustración muestra a los átomos de carbono en color gris, hidrógeno en blanco, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul.
Tanto para el compuesto 3-Ind-DHP como el 5-Ind-DHP el grupo indolil se
encuentra axial en el anillo dihidropiridínico. A diferencia de 3-Ind-DHP, en el
compuesto 5-Ind-DHP el plano del grupo indolil se encuentra formando un ángulo de
87,36°con el plano del anillo DHP (figura 51 y 52). Por otra parte, los sustituyentes
etoxicarbonil en las posiciones 3 y 5 se extienden hacia ambos costados del anillo
dihidropiridínico, con los grupos carbonilos en posición trans respecto de los dobles
enlaces de la base del bote. Puede observarse en la figura 51-D que la estructura tipo
bote es más pronunciada que en el isómero 3-Ind-DHP, lo que queda confirmado con
las distancias del C4 en 0,60 Å y el N1 en 0,27 Å, respecto del plano C2-C3-C5-C6.
Figura 51. (A) 5-Ind-DHP; (B) Vista frontal de la estrutura optimizada de 5-Ind-DHP; (C) Vista lateral de la estrutura optimizada de 5-Ind-DHP; (D) Mejor plano medio formado por
los átomos C2-C3-C5-C6 del anillo 1,4-DHP. La ilustración muestra a los átomos de carbono en color gris, hidrógeno en blanco, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul.
Figura 52. (A y B) Estructura optimizada de 5-Ind-DHP. En azul se muestra el plano formado por la base del bote del anillo dihidropiridínico (C2-C3-C5-C6) y en rojo el plano
formado por el sustituyente en el C4 (indol).
Por su parte, los derivados con un sustituyente metoxifenol presentaron claras
diferencias en las estructuras optimizadas. En primer lugar, V-DHP presentó una
estructura tipo bote con una distancia entre el C4 y el mejor plano medio formado por
la base del bote (átomos C2-C3-C5-C6) de 0,69 Å y el N1 respecto al mismo plano
presentó una distancia de 0,36 Å (Figura 53). El sustituyente en posición 4 se
encuentra axial, prácticamente en el mismo plano respecto al anillo dihidropiridínico
formando un ángulo de 146° (tomando como un segundo plano el anillo fenólico). Los
sustituyentes etoxicarbonil están orientados hacia la parte posterior del plano del bote
y los grupos carbonilos presentan una orientación cis respecto de los dobles enlaces
del anillo dihidropiridínico.
Figura 53. (A) V-DHP; (B) Vista frontal de la estructura optimizada de V-DHP; (C) Vista lateral de la estrutura optimizada de V-DHP; (D) Plano formado por los enlaces dobles del
anillo 1,4-DHP (C2-C3-C5-C6). La ilustración muestra a los átomos de carbono en color gris, hidrógeno en blanco, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul.
Figura 54. (A) I-DHP; (B) Vista frontal de la estrutura optimizada de I-DHP; (C) Vista lateral de la estrutura optimizada de I-DHP; (D) Mejor plano medio formado por los átomos C2-C3-C5-C6 del anillo 1,4-DHP. La ilustración muestra a los átomos de carbono en color
gris, hidrógeno en blanco, oxígeno en rojo y nitrógeno en azul.
El grupo metoxifenol en la posición 4 del anillo 1,4-DHP se encuentra axial y en
un plano perpendicular en la estructura optimizada de I-DHP. En este compuesto se
observó que los sustituyentes etoxicarbonil de las posiciones 3 y 5 del anillo
dihidropiridínico presentan orientaciones distintas, el sustituyente presente en la
posición 3 se encuentra orientado por sobre el plano de la base del bote, mientras que
el que se encuentra en la posición 5 se encuentra orientado hacia la parte posterior del
mismo.
Figura 55. (A y B) Estructura optimizada de I-DHP. En azul se muestra el mejor plano medio formado por los átomos C2-C3-C5-C6 del anillo dihidropiridínico y en rojo el plano formado por el sustituyente en el C4 (metoxifenol).
En resumen, dado que en todos los derivados se encontró una conformación
tipo bote en el anillo 1,4-DHP, se resumen las distancias entre el plano base del bote
respecto a los átomos N1 y C4 en la siguiente tabla:
Compuesto Distancia N1-plano
(Å)
Distancia C4-plano
(Å)Fenil-DHP 0,38 0,173-Ind-DHP 0,09 0,275-Ind-DHP 0,27 0,60
V-DHP 0,36 0,68I-DHP 0,18 0,29
Tabla 10. Energía calculada para las estructuras optimizadas de las moléculas propuestas y la distancia vertical (Å) de los átomos de C4 y N1 a la base del bote
formado por los cuatro átomos de carbono del anillo dihidropiridínico con enlaces dobles (C2-C3-C5-C6).
De acuerdo al análisis estructural de los derivados, se observaron diferencias
claras respecto a la geometría dependiendo del sustituyente presente en la posición
C4 del anillo 1,4-dihidropiridínico, esto es que todas las moléculas presentan una
estructura tipo bote, y esta estructura es más marcada dependiendo del sustituyente.
Este tipo de conformación es apropiada para su acción antagonista de los canales de
calcio.
b) Cálculo del potencial de oxidación de Fenil-DHP
De acuerdo a los datos experimentales encontrados en esta tesis, el
compuesto Fenil-DHP se oxida vía 2 electrones-2 protones en DMSO. El mecanismo
propuesto consta de una primera etapa de tipo electroquímica donde la 1,4-DHP
pierde un electrón formando el catión radical piridinio.
Etapa 1
La segunda etapa es de tipo química. El catión radical piridinio pierde un
protón (H ubicado en el Carbono 4) formando el radical piridinio.
Etapa 2
La tercera etapa es de tipo electroquímica, en ésta se forma el catión piridinio
por la pérdida de un electrón.
Etapa 3
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3+ e-
+•
4-Fenil-1,4-DHP Catión Radical
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3+ e-
+•
4-Fenil-1,4-DHP Catión Radical
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3
+•
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3+ H+
•
Radical
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3
+•
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3+ H+
•
Radical
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3
•
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3+ e-
+
Catión
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3
•
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3+ e-
+
Catión
La cuarta y última etapa es la formación del producto de la oxidación, el
derivado piridínico, el cual se forma por la salida del protón de la posición 1.
Etapa 4
Mediante este mecanismo y en función de las energías obtenidas para cada
una de las especies del mismo, es que se determinará el potencial de oxidación
teórico. La determinación del potencial teórico se basa en el proceso de quitar
electrones a la especie reducida, la que tiene N electrones para producir una especie
oxidada con N-1 electrones y calcular las diferencias de energía para ambas
especies.
Así, mediante un ciclo de energía libre, se calculan los potenciales redox.
Esquema 15. Ciclo termodinámico para el cálculo de potenciales de oxidación.
En el ciclo 15 aparecen los siguientes términos:
EA: electroafinidad vertical, corresponde a la diferencia entre la especia
oxidada y la especie reducida.
∆GSolvatación: energía de solvatación, calculado a partir de la diferencia entre la
especie en fase solvente y en fase gas.
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3+N CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3 + H+
4-Fenil-Piridina
NH
CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3+N CH3CH3
O
OCH3 O
O
CH3 + H+
4-Fenil-Piridina
De este modo, la ecuación termodinámica que define el potencial redox es:
E = EA + ∆ZPE + ∆(∆GSolvatación) + ∆Gevr
Donde EA y ∆GSolvatación fueron definidos anteriormente, ∆Gevr corresponde a las
contribuciones térmicas, es decir las contribuciones de energía libre rotacional,
vibracional y electrónica y ∆ZPE es la diferencia de la corrección de punto cero.
El potencial de oxidación experimental fue obtenido en DMSO con HFFTBA como
electrolito soporte, lo cual es muy diferente a medir el potencial en DMSO puro. Para el
cálculo de potencial de oxidación teórico se usa DMSO puro como solvente en el
modelo de solvatación contínua. Y de referencia se usó el potencial de Ag/AgCl 0,2223
V.
Como se describió anteriormente, la oxidación de las 1,4-DHPs en DMSO ocurre vía
dos electrones dos protones:
DHP → Py + 2H+ + 2e-
Y presenta un único pico de oxidación a +1064 mV en DMSO sobre un electrodo de
carbono vítreo respecto a la referencia de Ag / AgCl.
Figura 56. Voltamograma de pulso diferencial de 0,1 M de Fenil-DHP en DMSO + 0,1 M de HFFTBA.
Los valores de potencial teóricos obtenidos fueron los siguientes:
4-Fenil-DHP10 µ A10 µ A
600 800 1000 1200 1400E (Ag / AgCl) / mV
600 800 1000 1200 1400E (Ag / AgCl) / mV
1.- Utilizando la base cc-pVTZ:
Primera etapa electroquímica: +1330 mV.
Segunda etapa electroquímica: -680 mV.
2.- Utilizando la base 6-31G*:
Primera etapa electroquímica: +1516 mV.
Segunda etapa electroquímica: -451 mV.
5.7 E studios biológicos.
a) Fluorescencia Las células utilizadas en el estudio fueron previamente incubadas con 2 µM de la
sonda Fluo4-AM®[lxxxiv], la cual, en contacto con iones Ca+2 intracelular forma un
complejo fluorescente, el cual es proporcional a la concentración del ión y que es
ampliamente utilizada para cuantificar Ca+2 intracelular en rangos de concentración de
100 nM a 1µM. De esta manera, se determina la cantidad de calcio en el interior de la
célula en presencia y en ausencia de distintas concentraciones de los derivados en
estudio.
Para toda la serie propuesta de moléculas, en los 100 primeros segundos de
registro de la actividad neuronal, éstas presentan actividad espontánea de Ca2+, la cual
se observa como un incremento en intensidad de fluorescencia. Al perfundir las
neuronas con una solución de alto potasio, es posible observar un drástico incremento
en la fluorescencia, la cual recupera su nivel de reposo tiempo después de retirar el
estimulo depolarizante (solución con alto K+). En la misma neurona, pasados los 300
segundos se perfunde, en la solución externa, las moléculas en estudio, observándose
que per ce no inducen ninguna respuesta especial durante este tiempo.
Posteriormente, al adicionar solución con alto potasio, se observa una disminución en
la intensidad de fluorescencia, producto del efecto de las 1,4-DHPs ensayadas. En la
figura 57, se observa un 30% de disminución en la intensidad de fluorescencia luego
de la acción de I-DHP.
Figura 57. Registro de incrementos en la fluorescencia de Ca+2 en células hipocampales luego de la perfusión de I-DHP (50µM).
El “screening” general del efecto de todas las 1,4-DHPs ensayas, sobre la
disminución de la señal de Ca+2 intracelular, se muestra en la figura 58. Se puede
observar que Nifedipino presenta el mayor efecto bloqueador de canales ya que el
porcentaje de disminución en la intensidad de fluorescencia es superior al 70% del
K +
K +100 s
100 UAFI-DHP
control (aplicación de solución de alto potasio sola). Del grupo de fármacos
sintetizados, sólo la Fenil-DHP supera el 50% de bloqueo en las condiciones
estudiadas. Le sigue 5-Ind-DHP, con un efecto cercano al 50%. Los otros compuestos
no superan el 40% de disminución en la intensidad de la fluorescencia observada. Los
resultados fueron obtenidos en diferentes registros (n=5), para células hipocampales y
espinales cultivadas entre el 3 y el 16 de Noviembre del 2006.
Figura 58. Porcentaje de bloqueo en los incrementos en el Ca2+ intracelular, obtenidos luego de la adición de
50 µM de cada compuesto de la serie de 1,4-DHPs.
Curvas dosis-respuesta.
Figura 59: A. Curva dosis-respuesta de 5-Ind-DHP sobre células hipocampales. B. Registro original de Ca+2 intracelular antes y después de la pre-incubación con 50µM de
5-Ind-DHP.
De acuerdo a los resultados obtenidos para la serie completa, se procedió a
realizar una curva dosis–respuesta para dos de los compuestos en estudio que
mostraron un mayor porcentaje de bloqueo (Figura 59A). Utilizando concentraciones
B
K+K+50 s
50 AUF 5-Ind-DHP
10 1000
20
40
60
80
100A
IC50=45,8mM
% In
tens
idad
Flu
ores
enci
a
log Concentración / µ M
0
20
40
60
80
100
3-I
nd
-DH
P
V-D
HP
I-D
HP
5-I
nd
-DH
P
4-F
en
il-D
HP
Nife
dip
ino
Co
ntr
ol
%
In
ten
sid
ad
Flu
ore
sen
cia
en un rango entre 3 y 300 µM, se obtuvo una concentración inhibitoria 50 (IC50) de
17,8µM ± 1,8 para la Fenil-DHP y de 45,8µM ± 1,8 para la 5-Ind-DHP. Los resultados
fueron obtenidos en diferentes registros (n=4), para las neuronas cultivadas entre el 3
y el 16 de Noviembre del 2006. En la figura 59-B se observa el efecto producido por 5-
Ind-DHP (50µM) sobre células hipocampales.
b) P ruebas electrofisiológicas.
Figura 60. Registros de actividad eléctrica espontánea obtenidos por patch clamp. A: Actividad eléctrica espontánea en condiciones control (sin estimulo externo). B:
Actividad espontánea en presencia de 50 µM de Fenil-DHP.
El estudio electrofisiológico se realizó sobre neuronas hipocampales y
espinales, las cuales presentaron una actividad sináptica espontánea (Figura 60A), la
cual mostró una disminución de su frecuencia y amplitud mientras las células estaban
en presencia de las 1,4-DHPs (figura 60B: en presencia de 50µM de Fenil-DHP). Es
posible observar que en presencia del derivado 1,4-DHP disminuye la frecuencia del
actividad sináptica espontánea y levemente la intensidad de las señales.
Al aplicar un estímulo depolarizante de alto potasio (60mM), se obtuvieron los
registros de corrientes de calcio antes y después de la aplicación del compuesto. Se
observa que en presencia de los compuestos utilizados existe una disminución en la
intensidad de la corriente obtenida.
5 s
500 pA
5 s
500 pA
A
B
200 pA200 pA
Figura 61. Registros electrofisiológicos de corrientes de Ca2+ inducidas por un estímulo depolarizante de alto K+, en ausencia y presencia de Nifedipino.
Para el caso de Nifedipino, se observó una disminución por sobre el 35% en
la intensidad de la señal electrofisiológica (Figura 61). En el caso de la Fenil DHP y la
5-Ind-DHP el bloqueo es cercano de 20% (Figura 62 y 63, respectivamente).
Figura 62. Registros electrofisiológicos de corrientes de Ca2+ inducidas por un estímulo depolarizante de alto K+, en ausencia y presencia de Fenil-DHP. El porcentaje máximo
de bloqueo es cercano al 20%.
Figura 63. Registros electrofisiológicos de corrientes de Ca2+ inducidas por un estímulo depolarizante de alto K+, en ausencia y presencia de 5-Indol-DHP. El porcentaje máximo
de bloqueo es cercano al 20%.
c) Determinación de CREB fosforilado.
CREB es una proteína con función en la transcripción de genes. Esta descrito
que al aumentar el Ca2+ intracelular se activan ciertas otras proteínas que incorporan
grupos fosfatos a CREB. Al estar CREB fosforilado puede actuar como factor de
transcripción. Es por eso que CREB se ha usado como una señal de la activación de
proteínas intracelulares que tienen que ver con el Ca2+. Por esta razón se utilizaron 3
200 pA200 pA
derivados 1,4-DHPs de la serie y se evaluó el efecto provocado por éstas sobre la
fosforilación de CREB.
Figura 64. Cuantificación de CREB-P en presencia de 50µM de Fenil-DHP, 5-Ind-DHP y Nifedipino.
En el experimento en sí, lo que se obtiene como resultado es una señal en un
film fotográfico. Esta señal (intensidad de píxeles) se cuantifica en el programa Imagen
J. A mayor intensidad, es mayor la cantidad de proteína que es reconocida por el
anticuerpo, en este caso anticuerpo contra CREB fosforilado (CREB-P). Esta
cuantificación se normaliza al analizar las mismas muestras, pero ahora con un
anticuerpo que reconoce a una proteína cuyo nivel no es alterado, en este caso
tubulina (una proteína que forma parte del citoesqueleto de las células). Lo que se
muestra entonces, es la intensidad de CREB-P normalizado (Figura 64). Se puede
observar que no existe un comportamiento uniforme para las tres repeticiones. Lo
claro es que todas provocaron una disminución respecto del blanco. El promedio es
presentado en la figura 65.
D E F G0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
CR
EB
-P
/ T
ubu
lin
a
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Nifedipino4-Fenil-DHP5-Ind-DHPControl
CR
EB
-P
/ T
ub
ulin
a
0,75
0,8
0,85
0,9
0,95
1
1,05
Cont Ind Fenil Nife Cont Ind Fenil Nife Cont Ind Fenil Nife
ContIndFenilNifeContIndFenilNifeContIndFenilNife
Figura 65. Promedio de intensidad de CREB-P obtenida para las mediciones con 50µM de 1,4-DHPs.
En resumen, todos los derivados 1,4-DHPs estudiados presentaron un efecto
bloqueador sobre canales de calcio en neuronas, sin embargo ninguno de ellos
presentó un efecto superior al Nifedipino, bajo las mismas condiciones experimentales.
Entre los derivados sintetizados, la Fenil-DHP y 5-Ind-DHP exhibieron una respuesta
superior al 50% de bloqueo de canales a una concentración 50µM. Siendo en todos
los casos un efecto bloqueador dependiente de la concentración.
La aplicación de 1,4-DHPs disminuye la intensidad de la corriente
electrofisiológica y la frecuencia de la actividad sináptica espontánea. Nuevamente
Nifedipino es el que provoca una mayor disminución de las señales.
Mediante el método de fosforilación de CREB se observó una disminución en
la intensidad de las señales al aplicar 5-Ind-DHP, Fenil-DHP y Nifedipino. En este caso
el efecto no es significativo entre los compuestos.
6. Breve d iscusión de los resultados • Los cambios estructurales en posición-4 de la 1,4-dihidropiridina afectaron su
comportamiento voltamétrico en términos del proceso de oxidación de los dos
centros que coexisten en las moléculas. La coexistencia de dos centros redox en
los derivados produjo una interacción mutua en la cual se favorece la oxidación
del anillo 1,4-DHP y se dificulta la oxidación del grupo indol para los compuestos
C4-Indolil sustituidos (Tabla 11). El efecto contrario lo provoca el sustituyente o-
metoxifenol en V-DHP e I-DHP donde la oxidación del fenol se ve favorecida y la
del anillo dihidropiridínico se desplaza a potenciales más anódicos (Tabla 12).
Este efecto, es particularmente significativo en el caso de la oxidación del anillo
1,4-dihidropiridínico comparado con los compuestos de referencia Fenil-DHP,
indol y guayacol bajo las mismas condiciones experimentales.
Tabla 11. Potenciales de pico para la oxidación sobre carbon vítreo en medio aprótico (DMSO + 0.1 M HFFTBA) y prótico (Tampón Britton Robinson 0,04 M /etanol (70/30) a pH3
y pH 11).aDiferencia de los potenciales de pico del anillo 1,4-DHP respecto al derivado 4-Fenil-
DHP.bDiferencia de los potenciales de pico del sustituyente indolil respecto al indol.
Medio Aprótico E/ mV (Ag/AgCl)Derivado Pico I aΔEp-DHP Pico II bΔE p-Indol
3-Ind-DHP 944 -120 1280 +805-Ind-DHP 992 -72 1288 +88
Fenil-DHP 1064 - - -
Indol - - 1200 -
Medio prótico pH3 Pico I aΔEp-DHP Pico II bΔEp-Indol3-Ind-DHP 754 -126 1112 +162
5-IndDHP 774 -106 1088 +138
Fenil-DHP 880 - - -
Indol - - 950 -
Medio prótico pH11 Pico I aΔEp-DHP Pico II bΔEp-Indol
3-Ind-DHP 398 -42 606 +65
5-Ind-DHP 425 -15 628 +87
Fenil-DHP 440 - - -
Indol - - 541 -
Tabla 12. Potenciales de pico para la oxidación sobre carbon vítreo en medio aprótico (DMSO + 0.1 M HFFTBA) y prótico (Tampón Britton Robinson 0,04 M /etanol (70/30) a pH3
y pH 11).aDiferencia de los potenciales de pico del sustituyente o-metoxifenol respecto al
guayacol.bDiferencia de los potenciales de pico del anillo 1,4-DHP respecto al derivado Fenil-DHP.
• En medio aprótico y prótico los derivados C4 indolil y metoxifenol sustituidos
exhibieron dos señales de oxidación (excepto V-DHP), las que correspondieron
a la oxidación del anillo 1,4-dihidropiridínico y el grupo indolil e hidroxilo de la
posición-4.
• En medio aprótico por VPD fue posible diferenciar la oxidación correspondiente
al equilibrio entre las especies protonada y aniónica correspondientes a los
grupos electroactivos: amina secundaria (1,4-DHP e indol) y grupo hidroxilo. La
presencia de dichos aniones se comprobó también por 1H-RMN y UV-Vis.
Medio Aprótico E/ mV (Ag/AgCl)Derivado Pico I aΔEp-Fenol Pico II bΔEp-DHP
V-DHP 824 -126 1118 +58I-DHP 884 -66 1174 +114
Fenil-DHP - - 1064 -
Guayacol 950 - - -
Medio prótico pH3 Pico I aΔEp-Fenol Pico II bΔEp-DHPV-DHP 606 -70 - -
I-DHP 615 -61 939 +138
Fenil-DHP - - 880 -
Guayacol 676 - - -
Medio prótico pH11 Pico I aΔEp-Fenol Pico II bΔEp-DHP
V-DHP 181 -55 513 +65
I-DHP 135 -101 495 +87
Fenil-DHP - - 440 -
Guayacol 236 - - -
• En medio aprótico (DMSO) se atrapó el radical dihidropiridilo como
intermediario de la reacción electródica del primer proceso oxidativo para los
derivados C4-indolil sustituidos, utilizando PBN como atrapador de espín.
Basados en los valores de las constantes de acoplamiento encontradas, se
puede concluir que PBN interactuó con un radical centrado en carbono, lo que
concuerda con los resultados encontrados con los cálculos teóricos. Se
observaron cambios en el espectro ESR cuando se aplicó un potencial de pico
superior al potencial de oxidación del segundo núcleo redox de 5-Ind-DHP,
donde posiblemente el PBN atrapó un nuevo radical centrado en carbono en el
cual estaría involucrado el grupo indol. Dicho comportamiento no se observó
para 3-Ind-DHP.
No fue posible obtener los espectros de ESR para los derivados V-DHP e I-
DHP bajo las condiciones experimentales utilizadas.
• Estudios coulombiométricos en medio prótico en todo el rango de pH (2 - 12) y
en medio aprótico nos permitieron obtener el número de electrones
involucrados en ambos procesos redox. En medio aprótico: Fenil-DHP=2
electrones; 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP= 3,4 electrones (2 electrones
correspondientes a la oxidación del anillo dihidropiridínico y uno
correspondiente al indol); V-DHP e I-DHP 3,2 electrones (1 electrón
correspondiente a la oxidación del fenol y dos electrones para el proceso
oxidativo que involucra el anillo 1,4-DHP).
• En el caso de los derivados C4-Indolil-DHP se observó la formación de un
depósito azul sobre la malla de carbón vítreo utilizada como electrodo de
trabajo cuando se aplicó un potencial de oxidación mayor que el
correspondiente al segundo pico anódico y que implica la oxidación de ambos
centros redox. Se realizaron diferentes pruebas para identificar o caracterizar
este producto (HPLC, GC-MS y espectroelectroquímica), sin embargo no fue
posible obtener resultados concluyentes.
• Mediante la técnica cromatografía gaseosa acoplada a detección de masas
(GC-MS) se identificó el derivado piridínico como producto final de la reacción
de oxidación electródica del anillo 1,4-dihidropiridínico tanto en medio prótico
como aprótico.
• Así, de acuerdo a los resultados obtenidos y a datos encontrados en la
literatura[lxxxv,lxxxvi], es posible postular los mecanismos concernientes a la oxidación
electroquímica de los compuestos estudiados. Todos los compuestos en medio
acuoso, siguieron un mecanismo diferente si el medio involucrado es ácido o básico.
Así, se considera de manera independiente, la electro oxidación de ambos centros
redox. Analizando el proceso anódico que involucra la oxidación del anillo 1,4-
dihidropiridínico a piridina, se asume un mecanismo de tipo ECE (esquema 16) si la
oxidación ocurre en medio ácido y un mecanismo de disproporcionación, DISP1
(esquema 17) si el proceso oxidativo ocurre en medio básico. En medio ácido la etapa
determinante de la velocidad (edv), sería la transferencia del primer electrón de la 1,4-
DHP. En medio básico la etapa determinante de la velocidad (edv), es la
desprotonación del catión radical pridinio; lo que está de acuerdo con la dependencia
del potencial de pico obtenido por VPD con el pH del medio.
Esquema 16: Mecanismo ECE, postulado para la oxidación del anillo dihidropiridínico de los
compuestos en la zona de pH ácida (menor a 4).
N
H
R
O
O
O
OH
N
H
R
O
O
O
OH
N
H
R
O
O
O
O
N
H
R
O
O
O
O
e. d. v + e-
N
H
R
O
O
O
OH
+ H+
N
H
R
O
O
O
O
+ e-
[ ] RTF
ox eDHPkFi2
1 4,1φ∆
×−=
Esquema 17: Mecanismo DISP1, postulado para la oxidación del anillo dihidropiridínico en la zona alcalina de pH (sobre pH 8).
Aplicando la aproximación de estado estacionario para los mecanismos
anteriormente postulados de acuerdo a los esquemas 16 y 17 se tiene que los
factores que contribuyen a la corriente de pico anódica para la primera etapa
del mecanismo del esquema 16 (Corriente independiente del pH) son:
, con β=1/2
En la zona de pH alcalino, los factores que contribuyen a la corriente de pico
anódica para la segunda etapa del mecanismo del esquema 7 (Corriente
dependiente del pH) son:
En medio no acuoso, el anillo 1,4-DHP se oxidó de acuerdo al esquema 17
(ECEC).
[ ] [ ]RTF
ox eOHDHPkkkFi
φ∆
− ××−= 4,11
12
N
H
R
O
O
O
OH
N
H
R
O
O
O
OH
N
H
R
O
O
O
O
e. d. v
+ e-
N
H
R
O
O
O
OH
+ H2O+ OH-
N
H
R
O
O
O
O
N
H
R
O
O
O
OH
+
N
R
O
O
O
O
+ 1,4-DHP + H+
1,4-DHP
Esquema 18: Mecanismo ECEC, postulado para la oxidación del anillo dihidropiridínico en medio no acuoso.
En el caso de los derivados indolil sustituidos, luego de la oxidación del anillo
dihidropiridínico ocurre la oxidación del grupo indolil de acuerdo a los datos
experimentales mostrados en esta tesis. La oxidación ocurre vía 1-electrón-1
protón y es dependiente del pH del medio. En ambos medios electrolíticos se
formó un producto sobre la malla de carbono usada como electrodo de trabajo.
Por lo tanto se puede asumir que la etapa determinante de la velocidad sería la
salida del protón de la segunda etapa de acuerdo al mecanismo mostrado en el
esquema 19.
R
NH
O
O
O
O R
NH
O
O
O
Oe. d. v
+ e-
R
NH
O
O
O
O R
NH
O
O
O
O + H+
R
NH
O
O
O
O R
NH
O
O
O
O
R
NH
O
O
O
O R
N
O
O
O
O
+ e-
H H
+ H+
H
Esquema 19. Mecanismo EC, postulado para la oxidación del anillo indolil.
En el caso de los derivados de la vainillina e isovainillina, la primera
señal oxidativa corresponde a la oxidación del fenol. De acuerdo a datos
bibliográficos, la oxidación de fenoles ocurre vía 1-electrón- 1-protón para dar
como producto de la electro oxidación el derivado quinona. El mecanismo
propuesto para la oxidación de V-DHP e I-DHP en ambos medios electrolíticos
se muestra en el esquema 20, donde la etapa determinante de la velocidad
sería la deprotonación del catión radical.
N
O
O
O
O
NH
+ e-
N
O
O
O
O
NH
N
O
O
O
O
NH
e. d. v
N
O
O
O
O
N
+ H+
N
O
O
O
O
N
Producto
Esquema 20. Mecanismo EC, postulado para la oxidación del fenol.
• Los derivados sintetizados exhibieron una reactividad significativa frente a los
radicales libres estudiados de importancia farmacológica. Así, la reactividad
frente al anión radical superóxido y a los radicales alquilperoxilo ABAP-
derivados fue significativamente mayor que las 1,4-dihidropiridinas comerciales
actualmente en uso clínico a nivel mundial. La inclusión de los sustituyentes
indol y o-metoxifenol en la posición-4 del anillo 1,4-dihidropiridina potenció
significativamente la reactividad hacia los radicales estudiados. Cabe destacar
que se implementó un método indirecto para obtener las constantes de
reactividad entre los derivados y el anión radical superóxido en función de las
OH
OCH3
DHP
OH
OCH3
DHP
+ e-
OH
OCH3
DHP
O
OCH3
DHP
+ H +
O
OCH3
DHP
Quinona
e. d. v
especies aniónicas de los derivados. La reactividad frente al O2● se observó
también por VC, a través de la disminución de la razón de corrientes de anión
radical superóxido electro-generado.
• Los derivados 3-Ind-DHP y 5-Ind-DHP resultaron ser los más reactivos frente
al anión radical superóxido. Todos los derivados sintetizados fueron más
reactivos que las 1,4-DHPs comerciales frente a los radicales alquilperoxilo
ABAP derivados.
• Se identificó por GC/MS el derivado piridínico como producto de la reacción
entre los radicales estudiados (alquilperoxilo ABAP-derivados y el anión
superóxido) y las 1,4-DHPs.
• Los resultados electroquímicos y de reactividad fueron soportados por otras
técnicas como HPLC, espectroelectroquímica, ESR, etc.
• El estudio estructural de la geometría optimizada de los derivados mostró
diferencias claras respecto al sustituyente presente. Se calculó el potencial
anódico de la Fenil-DHP, el cual se acerca al resultado experimental.
• Los derivados presentaron acción bloquedora de los canales de calcio, siendo
en determinadas condiciones, similar a nifedipino.
7. Conclusiones.
• La inclusión de dos centros redox en una misma molécula (indol-1,4-DHP y
o-metoxifenol-1,4-DHP) afecta el comportamiento electroquímico de cada
centro comparado con los compuestos no sustituidos (Fenil-DHP, indol y
guayacol), provocando un desplazamiento en los potenciales de pico.
• La inclusión de un sustituyente indol favorece la oxidación del anillo 1,4-
DHP en medio prótico y aprótico respecto de un sustituyente fenil. La
piridina electrogenerada desplaza el potencial de oxidación del grupo indolil
respecto al indol.
• La presencia del anillo 1,4-DHP desplaza el potencial de oxidación, hacia
valores menos anódicos, del grupo fenol en los derivados V-DHP e I-DHP
respecto del guayacol. Contrario sucede con el anillo 1,4-DHP, el cual
mostró potenciales de oxidación mayores al encontrado para la Fenil-DHP.
• Los sustituyentes propuestos en el diseño de los compuestos favorecieron
la reactividad frente al anión radical superóxido y los radicales alquilperoxilo
ABAP-derivados, comparado con la Fenil-DHP, y los compuestos
comerciales: nisoldipino, nimodipino y amlodipino.
• El producto del primer proceso de oxidación (pico I) y de la reacción frente
a los radicales libres correspondió al derivado piridínico, el cual fue
identificado por GC-MS.
• De la información obtenida por cálculos de optimización de la geometría se
puede concluir que todos las moléculas presentan una estructura tipo bote.
Esta tipo de conformación es la que resulta más adecuada para los efectos
antagonistas sobre los canales de calcio.
• A partir de los ensayos farmacológicos realizados en células hipocampales,
se puede concluir que todos los compuestos tienen actividad sobre los
movimientos de calcio en dichas células.
Presentaciones a congresos.
Intern acionales
1. R. Salazar. P. Navarrete., J. A. Squella & L. J. Núñez-Vergara. “C4-Indolil 1,4-
Dihidropiridinas: Caracterización electroquímica, espectroscópica y su
reactividad con O2●. XVIII Congreso de la Sociedad Iberoamericana de
Electroquímica, SIBAE. 10 - 14 de Marzo 2008. Medellín, Colombia.
2. Ricardo Salazar. P. Navarrete., J. A. Squella & L. J. Núñez-Vergara.
“Electrochemical Characterization and Reactivity towards O2• of new 4-indolyl
1,4-dihydropyridines”. 3rd. West of Mediterranean Chemistry. (13 – 15 de Junio
2007). Montpellier, Francia.
3. Ricardo Salazar. P. Navarrete., J. A. Squella & L. J. Núñez-Vergara.
“Electrochemical Characterization of new 4-indolyl 1,4-dihydropyridines”. 57th
Annual Meeting of the Internacional Society of Electrochemistry, ISE. 27 de
Agosto al 1 de Septiembre 2006. Edimburgo, Escocia.
4. R. Salazar. M. López. P. Navarrete. L. J. Núñez-Vergara. J. A. Squella.
“Caracterización electroquímica y reactividad de 4-(4-hidroxi-3-metoxifenil) y 4-
(3-hidroxi-4-metoxifenil)-2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-1,4-dihidropiridinas”. XVII
Congreso de la Sociedad Iberoamericana de Electroquímica, SIBAE. 3 - 7 de
abril 2006. La Plata, Argentina.
a) Nacionales.
1. R. Salazar., P. Navarrete., J. A. Squella. & L. J. Núñez-Vergara. “Caracterización
electroquímica y espectroscópica de C4-Indolil 1,4-Dihidropiridinas”. XXVII
Jornadas Chilenas de Química. (20 – 23 Noviembre del 2007). Chillán, Chile.
2. R. Salazar., P. Navarrete., J. A. Squella. & L. J. Núñez-Vergara. “Reactividad de
nuevas 1,4-Dihidropiridinas frente al anion radical superóxido”. VIII Jornadas de
investigación en ciencia y tecnología (03 de Abril del 2007), Facultad de Ciencias
químicas y farmacéuticas, Universidad de Chile. Santiago, Chile
3. R. Salazar., A. Besoaín., P. Navarrete., L. J. Núñez-Vergara., J. A. Squella.
“Caracterización electroquímica en medio no acuoso de nuevas 1,4-
Dihidropiridínas y su interacción con radicales libres”. VIII Jornadas de
investigación en ciencia y tecnología (03 de Abril del 2007), Facultad de Ciencias
químicas y farmacéuticas, Universidad de Chile. Santiago, Chile
4. R. Salazar., M. López., P. Navarrete., L. J. Núñez-Vergara., J. A. Squella.
“Determinación de la Absorbilidad molar de nuevos compuestos orgánicos y su
aplicación a estudios cinéticos”. VIII encuentro de Química Analítica y Ambiental
(16 – 19 de Octubre 2006). Universidad de Arturo Prat, Iquique, Chile.
5. R. Salazar. P. Navarrete. J. A. Squella., C. Camargo., L. J. Núñez-Vergara.
“Reactividad de nuevas 1,4-dihidropiridinas con radicales alquilperoxilo”. XXVI
Jornadas Chilenas de Química (10-13 Enero 2006), Universidad de Concepción,
Concepción, Chile.
6. R. Salazar. M. López. P. Navarrete. L. J. Núñez-Vergara. J. A. Squella.
“Caracterización electroquímica de 4-(4-hidroxi-3-metoxifenil) y 4-(3-hidroxi-4-
metoxifenil)-2,6-dimetil-3,5-dietoxicarbonil-1,4-dihidropiridinas”. XXVI Jornadas
Chilenas de Química (10-13 Enero 2006), Universidad de Concepción,
Concepción, Chile.
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