“AÑO DE LA INVERSION PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD

ALIMENTARIA”

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA - LA MOLINA

INFORME N°1

TÍTULO: ‘Preparación de una muestra fija de bacterias para tinción’ y ‘Tinción simple con

colorantes básicos’

Integrantes:

Colquehuanca Mejía, Eliana Elsye Flores Calderón, Elvis Norabuena Damian, Juan TantahuillcaLandeo, Pat Teresa

Mesa N°5

Grupo: Miércoles de 3 a 5 pm

2013

1. Introducción

La microbiología es el estudio de los organismos microscópicos (celulares y subcelulares), principalmente de aquellos que se encuentren por debajo del poder de resolución del ojo humano, estos seres tienen un rango de tamaño de 10-5 a 10 mm, por ende es necesario el manejo experimental para observar, describir su morfología y taxonomía. Para ello se debe tener habilidades de manejo de los instrumentos de laboratorio (principalmente el microscopio), saber las técnicas básica de preparación de una muestra fija de bacteria para tinción, que es un procedimiento preliminar a la mayoría de métodos de tinción a bacterias.Se aprenderá a realizar el método de tinción simple con colorantes básicos en cual consiste en destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras básicas.

2. Marco teórico

La gran mayoría de microorganismos son casi incoloros cuando se les observa a través de un microscopio óptico estándar, para una visualización de bacterias de manera adecuada y de sus estructuras internas, se requieren tinciones biológicas. La introducción de tinciones a mediados del siglo XIX influyó mucho sobre los principales avances en microbiología.En tamaño y forma las bacterias de importancia médica son microorganismos muy pequeños que se presentan en tres formas generales: esféricos designados como cocos, organismos en forma de bastón designados como bacilos, y de formas espirilas, dentro de estas tres mencionadas anteriormente se encuentran otros microorganismos que adoptan variantes morfológicas designadas como formas pleomórficas.Las tinciones consisten en preparaciones acuosas u orgánicas de colorantes o grupos de colorantes que proporcionan una variedad de colores a los microorganismos y a los tejidos vegetales y animales, u otras sustancias de importancia biológica (Koneman, 2008).

2.1. Los colorantes Se pueden clasificar según su origen o según su comportamiento químico.Según su origen:

a. Naturales. Son los colorantes extraídos de animales y sobre todo de plantas. Por ejemplo la hematoxilina

b. Artificiales. Son los colorantes preparados en mayor parte de alquitrán de hulla.

Según su comportamiento químico:

Los colorantes son las sales compuestas por un ion positivo y un ion negativo, uno de los cuales esta coloreado y se conoce como cromóforo.(Tortora, 2007).

a. Ácidos o aniónicos.El color de los colorantes ácidos, está en el ion negativo.Son los colorantes citoplasmáticos. Estos no son atraídos por la mayor parte de los tipos de bacterias porque la superficie bacteriana con carga negativa repele los iones negativos del colorante, de modo que este tiñe el fondo en lugar de la estructura bacteriana. Es ejemplo de colorante acido la fucsina ácida

b. Básicos o catiónicos.El color de los denominados colorantes básicos esta en el ion positivo.En un pH de 7 las bacterias presentan una carga levemente negativa. Por lo tanto, el ion positivo coloreado en un colorante básico es atraído hacia la célula bacteriana con carga negativa. Los colorantes básicos entre los que se encuentran el azul de metileno y el cristal violeta o violeta de genciana, se utilizan con más frecuencias que los colorantes ácidos.

c. Neutros. Son sales compuestas de un color ácido y un color básico. Por ejemplo cosinato

d. Indiferentes. Son los colorantes insolubles en agua y solubles en alcohol donde no predomina ni la carga positiva ni la carga negativa. Pero no tienen carácter neutro, colorantes de los lípidos, por ejemplo el Sudan III, negro Sudán.(Granados, 1997)

2.2. Fijación

Todas las técnicas de tinción exigen una preparación previa antes de proceder a la tinción en sí. Hay que seguir tres pasos: extensión, desecación y fijación. De estos depende la calidad de las tinciones (García, 1994).

a. Extensión Consiste en formar una película de la muestra sobre un portaobjetos perfectamente limpio y desengrasado (conservado en alcohol). La deposición de la muestra debe ocupar aproximadamente una superficie de 1cm2 .los portaobjetos suelen flamearse antes de su uso para eliminar los restos de grasa y suciedad. La forma de realizar la extensión depende del estado físico en que se encuentre la muestra: para muestras líquidas basta con depositar una gota en el centro del portaobjetos y extenderla con un asa; para muestras sólidas, o colonias procedentes de un cultivo, se deposita con antelación sobre el portaobjetos una pequeña gota de agua, o mejor de solución salina, en la que se efectúa una emulsión.

b. Desecación

Siempre debe realizarse al aire. Puede favorecerse colocando e portaobjetos sobre el calor suave de una llama de un mechero, pero tomando precauciones para no forzar el proceso de secado.

c. Fijación

El proceso de fijación produce la muerte simultánea de los microorganismos y su adherencia al portaobjetos por su coagulación de sus proteínas plasmáticas mediante calor. También preserva diversas partes de los microorganismos en su estado natural con distorsión mínima. Se aplica el colorante, se lo lava con agua y se lo seca con papel absorbente. Si no se realizara la fijación el colorante podría arrastrar los microorganismos del portaobjetos (Tortora, 2007)

2.3. Técnicas de tinción Las principales ventajas de la técnica de tinción son:

Observar más adecuadamente su morfología. Proporcionar el contraste preciso y suficiente en cada caso, lo

que permitirá diferenciar distintos tipos morfológicos. Establecer una información completaría sobre sus estructuras

internas y/o externas que no podrían ser observadas por examen en fresco.

Conocer sus características tintoriales orientándonos hacia un grupo taxonómico u otro en la clasificación bacteriana.

Las tinciones pueden ser:a. Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de

que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (azul de metileno, safranina) o no (nigrosina).

b. Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante.

c. Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplo: tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes.

2.4. Técnica de tinción simple

Esta es una técnica que utiliza un colorante, todas las células se observan del color del colorante empleado. Aunque los diferentes colorantes se unen de forma específica a las distintas partes de las células el propósito principal de una tinción simple es destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas. El colorante se aplica al extendido fijado por un tiempo determinado, se lava, se seca y examina.

2.5. Factores que afectan a toda técnica de tinción Pureza del colorante Concentración del colorante El pH del colorante Conservación del colorante Elaboración del colorante Técnica empleada Temperatura Cantidad de muestra Realizar correctamente el frotis Tiempo de tinción Soluciones mordientes

2.6. Observación de los microorganismos con microscopio de alto poder amplificadorSe usa mayormente ocular que aumentan de 10 y objetivo de inmersión, dispositivos que brindan amplificaciones de casi 1000 diámetros. Es sabido que el vidrio y el aire no tienen la misma refracción, se emplea aceite de inmersión para que no exista aire entre la preparación y el objetivo. Se procede entonces a descender el objetivo hasta la gota de aceite de manera que no quede aire entre el portaobjetos y la lente (Witton, 1965)

3. Parte experimental

EJERCICIO N. 1 PREPARACION DE UNA MUESTRA FIJA DE BACTERIAS PARA TINCIÓN

Previo al desarrollo de una técnica de tinción, el material al ser observado debe ser fijado, es decir adherido a una lámina de vidrio sobre la cual ha de realizarse la tinción. Si la preparación no es fijada, la muestra tiende a perderse durante el procedimiento de tinción. El procedimiento de fijación mata al microorganismo, coagula el protoplasma celular y provoca su adhesión a la lámina de vidrio. Un agente de fijación ideal preserva la estructura de la célula en la forma y posición normal sin causar la aparición de artefactos (estructuras

no presentes en la célula viviente). Aunque el calentamiento es el agente de fijación de uso más común, el alcohol y otros agentes químicos también pueden ser usados satisfactoriamente.

MATERIALES.- Muestra conteniendo bacterias- Asa de kôlle- Lamina porta objetos- Mechero de alcohol- Piseta con agua

PROCEDIMIENTO 1) Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlo con papel seda.2) Prender el mechero y esterilizar el asa kòlle en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.3) Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos, después acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo. 4) Colocar una gota de agua destilada sobre una lámina porta objeto completamente limpia. Con ayuda del asa de kòlle coloque sobre la gota una pequeña porción de la muestra a fijar. Si la muestra que contiene al microorganismo es líquida puede aplicarse directamente sin la gota de agua.5) Distribuya la gota cargada con la muestra en la lámina hasta formar una película delgada luego seque la lámina al aire o a una razonable distancia sobre la llama del mechero.6) Cuando la película este seca, pase la lámina a través de la llama del mechero unas 2 a 3 veces para así fijarlo con calor, cuidando que la película este hacia arriba y que la lámina no se recaliente. La sobre exposición al calor puede alterar la forma y estructura del microorganismo.

EJERCICIO NRO. 02 TINCION SIMPLE CON COLORANTES BASICOS

La tinción simple constituye una técnica sencilla y directa que a través del uso de un colorante, nos permite constatar y diferenciar los microorganismos de su entorno. Los colorantes básicos, los cuales se utiliza más comúnmente para teñir microorganismos, difieren en el grado de reactividad con las células, estas generalmente tiene una superficie cargada negativamente cuando el pH del medio es cercano a la neutralidad, entonces se aplica el azul de metileno ( ion positivo) que reacciona con la pared celular por medio de enlaces iónicos débiles que están cargadas negativamente a la tasa más baja, tomando de 50 a 60 segundos para teñir apropiadamente una preparación microbiana. El cristal violeta es más reactivo y generalmente requiere solo 10 segundos. La carbolfucsina es un colorante aún más rápido, requiriendo solo 5 segundos. Su reactividad es tan grande que ciertamente puede dificultar una tinción

apropiada, sobre todo cuando la muestra contiene abundante materia orgánica.

MATERIALES.- Laminas fijadas de microorganismos- Aceite de inmersión- Vaso de precipitados de 100 ml- Colorantes básicos- Azul de metileno- Cristal violeta- Carbol-fucsina - Papel secante- Piseta de agua- Soporte para tinción

PROCEDIMIENTO1) Coloque las láminas fijadas de microorganismos sobre el soporte para tinción.2) Agregue 5 a 6 gotas de cada colorantes dejando que actúen por un tiempo de 60 segundos para el azul de metileno; 10 segundos para queel cristal violeta; y 5 segundos para la carbolfucsina.3) Una vez cumplido el tiempo para los colorantes, lave cada lámina con agua destilada.4) Seque las láminas al aire o dentro del papel secante.5) Examine las preparaciones teñidas bajo el objetivo de inmersión (100X) de un microscopio compuesto.6) Elabore esquemas de sus observaciones destacando las diferencias en tamaño forma, y agrupaciones que se presenten.

4. ObservacionesDespués de haber preparado las muestras en los portaobjetos (frotis) se obtuvieron los siguientes resultados:

4.1. Género: Staphylococcus sp.Forma: cocosAgrupación: racimoColorante: azul de metiloGA: 1000X

4.2. Género: Bacillus sp.

Forma: bastónAgrupación:estreptobaciloColorante: fucsinaGA: 1000X

4.3. Género: EcherichiacoliForma: cocobaciloAgrupación: no tieneColorante:cristal violetaGA: 1000X

5. Discusión Según Koneman(2008) como la mayoría de las bacterias carecen de

coloración, es importante teñirlas para poder observarlas al microscopio y determinar su tamaño, morfología y disposición relativa, por tal motivo se utilizó azul de metilo como colorante para la Staphylococcus sp, aunque no se trató de un colorante rápido su uso dificultó una tinción

apropiada, dando como resultado una baja nitidez.

Según Granados (1997) existen distintos factores que afectan a las técnicas de tinción, como el no realizar correctamente el frotis o variar el tiempo de tinción, estos factores pudieron haber afectado la observación de Staphylococcus.

Según Madigan (2004) a las bacterias esférica u ovoide se les denomina cocos, a las de forma cilíndrica bacilos. Para el caso de la

Staphylococcus se observó en forma de cocos, para la E. Coli se trata de una forma ovoide, que también incluye la forma cocobacilo. En el caso del Bacillusobtuvimos una forma de bastón.

Según Madigan (2004) son las características físicas y químicas que un microorganismo necesita para su favorable crecimiento las que generan las comunidades microbianas o agrupaciones donde realizan sus procesos metabólicos. Se observó que la E. Coli no se forma agrupaciones porque su tendencia a permanecer unidas es bastante baja.

Los Staphylococcus forman en agrupaciones de racimos, es por eso que en la muestra teñida de azul de metilo se observó varias colonias de estos microorganismos en grupos con forma de racimos.

.

6. Conclusión

Los colorantes son muy importantes para la observación de microorganismosya que proporciona contraste entre el este y el medio que lo rodea, permitiendo diferenciar su morfología.

Aunque se había recomendado usar el colorante azul de metilo para la tinción de la Staphylococcus sp, se tuvo dificultad para una observación nítida.

La técnica de tinción simple nos ayuda a ser visibles las formas, tamaños y agrupaciones variadas que presentan las bacterias.

7. Bibliografía

AGUILAR P., J. y F. SENENT. 1986. Cuestiones físicas. Reverté Editorial. Primera Edición. Sevilla.

COVADONGA. 2010.Técnicas básicas de Microbiología. Observación de bacterias. Madrid. Disponible en:www.revistareduca.es/index.php/biologia/article/download/819/834consultada el 01 de setiembre del 2013.

GARCIA, P; FERNANDEZ, M y PAREDES, F. 1994. Microbiología clínica práctica.2ª edición. Editorial Universidad de Cádiz servicio de publicaciones. Cádiz.

GRANADOS, R; VILLAVERDE, C. 1997. Ciencia de la Salud Microbiología. Editorial Paraninfo. España

KONEMAN, E;ALLEN, S y JANDA.2008. Diagnostico Microbiológico. Texto y Atlas en color.6ª edición.Panamericana Editorial.Buenos Aires.

MADIGAN, M. et al. 2004. Biología de los microorganismos. Brock. Pearson-Prentice Hall Editorial. 10a edición. Madrid.

PRESCOTT, L. et al. 2002. Microbiología. Mc Graw Hill Editorial. 5ta edición. Madrid.

TORTORA, G.et al. 2007. Introducción a la microbiología. Panamericana Editorial. 9ª edición. Buenos Aires.

WITTON. 1997. Microbiología. Primera edición. Compañía Editorial Continental,SA. México.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las asociaciones más frecuentes en bacterias?

Las células de muchos procariotas se mantienen juntas después de la división celular

formando grupos, y estas asociaciones frecuentes son características de diferentes

organismos.

Los cocos que después de la división permanecen unidos en pares se denominan

diplococos y los que permanecen unidos en forma de cadena se denominan

estreptococos. Los cocos que se dividen en dos planos y permanecen unidos en

grupos de cuatro se conocen con el nombre de tétradas, los que se dividen en tres

planos y permanecen unidos en grupos de configuración cúbica se llaman sarcinas y

los que se dividen en planos múltiples y forman grupos similares a racimos de uva o

láminas amplias se denominan estafilococos.

Los bacilos se dividen exclusivamente a través de sus ejes menores, de manera que la

cantidad de grupos de bacilos es menor que la de cocos. La mayoría de bacilos se

observan como bastones aislados. Los diplobacilos permanecen unidos en pares

después de la división, mientras que los estreptobacilos forman cadenas. Otros

bacilos son ovalados y se parecen mucho a los cocos, por lo que recibieron el nombre

de cocobacilos.

2. ¿En qué rango se definen las bacterias?

Fuente: Tortora et al (2007)

Figura1:Disposición de cocos y bacilos según las agrupaciones más comunes.

Figura 2: Muestra de tamaños comparativos entre distintos procariotas

En conjunto el grupo bacteriano también varía en tamaño tanto como en forma. Las

más pequeñas (como del género Mycoplasma) tienen aproximadamente 0.3 µm de

diámetro. Las nanobacterias un diámetro aproximado de entre 0.2 µm y menos de 0.05

µm. Otro ejemplo es de la Escherichiacoli, bacilo de tamaño medio, mide 1.1 – 1.5 µm

de ancho y 2.0 – 6.0 µm de largo. Algunas bacterias son bastante grandes; la

cianobacterias Oscillatoria tiene un diámetro de casi 7 µm, y algunas espiroquetas

pueden alcanzar ocasionalmente una longitud de 500 µm.

Se ha descubierto una bacteria enorme en el intestino del pez cirujano

Acanthurusnigrofuscus. La bacteria Epulopisciumfishelsoni presenta un tamaño de 600

por 800 µm. más recientemente se ha descubierto una aún más grande en sedimentos

oceánicos, Thiomargaritanamibiensis.

En general, las procariotas presentan tamaños que van desde 0.1 – 0.2 µm de ancho a

más de 50 µm de diámetro.

3. ¿Cuáles son las formas bacterianas más frecuentes?

Aunque es cierto que muchas bacterias tienen una morfología similar, existen

importantes variaciones. La mayoría de las bacterias conocidas presentan forma de

coco o de bacilo.

Los cocos son células casi esféricas, que existen individualmente o en agrupaciones

características que son útiles frecuentemente para identificar a las bacterias; en cuanto

a los bacilos, son bacterias de forma cilíndrica. Otras formas adquiridas por las

bacterias son una forma semejante a bacilos largos retorcidos como espirales o

hélices, denominados espirilos si son rígidos, y espiroquetas cuando son flexibles.

Figura3: Bacterias representativas; observación con el microscopio óptico en bacterias teñidas

(a)Staphylococcus aureus; obsérvense las células esféricas en racimos irregulares (x 1000). (b)Enterococcus faecalis; obsérvense las cadenas de cocos (x 200). (c)Bacillus megaterium, bacteria en forma de bacilo formando cadenas (x 600). (d)Rhodospirillum rubrum (x 500). (e)Vibrio

Fuente: Madiganet al (2004)

4. ¿Qué diferencia a una tinción directa de una tinción negativa?

La tinción directa o simple permite observar la forma, el tamaño y los agrupamientos de

las bacterias usando un único colorante (normalmente básico), pues estos

microorganismos absorben el colorante. Mientras que en la tinción negativa, uso de

colorantes neutros o ácidos, la célula bacteriana no absorbe el colorante quedando

incolora y transparente, sólo se tiñe el fondo. Y debido a que no necesitan del calor, las

morfologías de las células no son alteradas.

5. ¿Qué importancia le atribuye a las diferencias en reactividad de los

colorantes empleados?

Las técnicas de tinción nos permiten observar microorganismos en función de

la capacidad de los mismos para retener o no determinadas sustancias

colorantes (de acuerdo a la composición en sus paredes celulares), lo que

depende de la carga de la célula y del colorante, por ejemplolos catiónicos

penetran en el interior de la célula y las tiñen. Las bacterias, en su mayoría

tienen afinidad por los colorantes de carácter básico.

(a)Staphylococcus aureus; obsérvense las células esféricas en racimos irregulares (x 1000). (b)Enterococcus faecalis; obsérvense las cadenas de cocos (x 200). (c)Bacillus megaterium, bacteria en forma de bacilo formando cadenas (x 600). (d)Rhodospirillum rubrum (x 500). (e)Vibrio

Figura 4: Tinción simpe con cristal violeta de Staphylococcusaureus.

Figura 5: Tinción negativa con cristal violeta de Staphylococcusaureus.

Fuente: Covadonga (2010) Fuente: Covadonga (2010)

Fuente: Prescott et al (2002)

Figura 6: Objetivos secos y de inmersión

Azul de metileno Reacciona con las células cargadas

negativamente.

Cristal violeta Reacciona con células cargadas

negativamente.

Carbolfucsina Para micobacterias de cápsula gruesa y

cerosa son resistentes a la tinción, son

llamadas ácidos resistentes

6. ¿Cuál es la función del aceite de cedro?

La función del aceite de cedro es restringir el movimiento de la muestra, además de

evitar el rozamiento entre porta-objetos con muestra y el objetivo, generalmente se usa

cuando se va a observar con el objetivo 100x. Otra función es evitar que la luz se

desvíe.

El índice de refracción del aceite de cedro y del vidrio es el mismo de la primera lente

objetivo del microscopio, consiguiendo así que los rayos pasen sin sufrir refracción,

eliminando de esta forma reflexiones totales (figura 6) y mejorando la luminosidad de la

imagen. De no tener aceite de cedro, se puede reemplazar con agua, monobromuro de

naftaleno entre otros.

Fuente: Aguilar y Senent (1986)

7. ¿Cuál es la función del lente de inmersión?

La lente de inmersión es usada para lograr un mayor aumento (1 000 x) con buena resolución, para lo que el objetivo es pequeño. Si no se utiliza aceite de inmersión con un objetivo de inmersión la imagen se toma borrosa, con mala resolución.