Preparazione di campioni biologiciper la microscopia ottica

ed elettronica

Il microscopio ottico ed elettronico (T.E.M)

OCULARE

OBBIETTIVI

TAVOLINO PORTA CAMPIONE

CONDENSATORE

DIAFRAMMA DI CAMPO

LAMPADA

CANNONEELETTRONICO

PORTA CAMPIONE

CONDENSATORE

OBBIETTIVO

SCHERMOFLUORESCENTE

CAMERAFOTOGRAFICA

1 mm

100 µm

10 µm

1 µm

100 nm

10 nm

1 nm

1 Å

Occhio umanoOcchio umano

Microscopio otticoMicroscopio ottico

Microscopio elettronico Microscopio elettronico a trasmissionea trasmissione

Microscopio elettronico Microscopio elettronico a scansionea scansione

LA

RISOLUZIONE

LA

RISOLUZIONE

Aumentando la risoluzione aumentanoproporzionalmente anche gli artefatti ela loro visibilità

• la luce del microscopio ed il fascio di elettroni possono attraversare solo materiale di spessore molto ridotto

• il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi ed utramicrotomi

• la maggioranza dei tessuti biologici sono molli

• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito– Fissazione – Inclusione– Congelamento

• i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto

• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato o contrastato

• coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

Problematiche…

Fasi della preparazione

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• Colorazione

Prelievo

• Il prelievo è l’operazione fisica con la quale si ottiene il campione da esaminare

• Deve essere eseguito da materiale biologico vivente

• Riduzione 10x10x3 mm per la microscopia ottica

Spessore ≤ 2 mm per la microscopia elettronica

• Deve essere eseguito il più velocemente possibile

Fasi della preparazione

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• Colorazione

La FissazioneHa lo scopo di bloccare i processi di degenerazione del tessuto prelevato rendendolostabile nel tempo ed inalterabile all’azione dei successivi trattamenti

Mantiene inalterate le caratteristiche strutturali del campione, preservandonela morfologia

Protegge il campione da danni osmotici (swelling e shrinking)

FISICA

CHIMICA

Congelamento in N2 o -30°CCalore (fiamma viva per materiale biologico strisciato su vetrino

Esposizione del tessuto a T molto alte o molto basse:

Uso di sostanze chimiche:

PerfusioneImmersioneCon vapori

La fissazione chimicaLE ALDEIDI

FORMALDEIDE• usata in soluzione (4-10%) in tampone pH 7.4

• elevato potere di penetrazione ( 0.8 mm/h)

• agisce formando legami crociati con gli aa delle proteine (reversibili)

• preserva una buona morfologia

PARAFORMALDEIDE

• preserva la reattività delle macromolecole

• indicata per indagini biochimiche

Formaldeide 4-10% + Saccarosio 2%in PBS pH 7.4

4 ore 4°C

Microscopia Ottica

PFA 10% + Saccarosio 2%in PBS pH 7.4

4 ore 4°C

GLUTARALDEIDE• penetra bene nei tessuti, ma meno rapidamente della formaldeide

• forma cross-legami più velocemente e più stabilmente della formaldeide

• non fissa i lipidi, quindi per preservare le membrane

La fissazione chimicaLE ALDEIDI

Microscopia Elettronica

GA 2-4% in Tampone Fosfato pH 7.4

2-4 ore 4°C

Post-fissazione con Osmio Tetrossido

• Fissa i lipidi insaturi

• agisce rapidamene, ma penetra molto poco Fissativo 2°

• reagisce in modo differente con i vari componenti cellulari accentuando le differenze di densità e fornendo una sorta di colorazione

OsO4 1-2%In Tampone Fosfato pH 7.4 2 ore 4°C buio

I TamponiI fissativi devono essere diluiti in tamponi a pH 7-7.4 in modo che non ci sia diversitàdi pH fra il tessuto e la soluzione fissativa e per evitare artefatti dovuti a differenze diosmolarità

Gli stessi tamponi utilizzati per diluire i fissativi devono essere impiegati per effettuarei lavaggi che seguono la fissazione (1-2 ore)

PBS

Tampone fosfato di Sorensen

Tampone Cacodilato

Fosfato bisodico 0.2M + Fosfato monosodico 0.2M

Cacodilato di Na 0.24M + HCl 0.2M

Più stabile nel tempo, ma contiene arsenico che è tossico

Fasi della preparazione

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• Colorazione

La DisidratazioneE’ il passaggio che permette la sostituzione dell’acqua contenuta nel tessuto con unsolvente dei mezzi di inclusione (Paraffina o resine)La disidratazione si effettua mediane passaggi del campione in soluzioni di alcool in una scala crescente di concentrazioni

Alcool 70%

Alcool 90%Alcool 100%

Fissazione 3° con Acetato di Uranile in alcool 70%(T.E.M.)

ChiarificazioneL’ultimo agente deve essere miscibile con i mezzi di inclusione

Xilolo

Acetone assolutoOssido di propilene

Paraffina

Resine idrofobiche per T.E.M.

InfiltrazioneDopo aver concluso la disidratazione del campione bisogna sostituire gradualmente lo xilolo o l’acetone con il mezzo di inclusione in forma liquida (Xilolo/acetone:mezzo di inclusione)

3:1 2:1 1.1 1:2 1:3

Fasi della preparazione

• Prelievo• Fissazione• Disidratazione• Inclusione• Taglio• Colorazione

InclusioneE’ il passaggio che permette di impregnare il campione in un materiale abbastanzaduro ed omogeneo tale da poter essere tagliato in fette molto sottili

PARAFFINA (M.O.)

RESINE(T.E.M.)

• Miscela di idrocarburi saturi

• solida a T ambiente

• punto di fusione a 54-60°

• insolubile in H2O, solubile in xilolo

• Epon, Araldite• liquida a T ambiente• polimerizza a 60-70°C

• insolubile in H2O, solubile in acetone• si preparano a partire da soluzioni di monomeri, da sostanze plasticizzanti che migliorano la consistenza finale del polimero e da un acceleratore chimico per la reazione di polimerizzazione

Il campione viene immerso in paraffinao resina pura per completarne l’infiltrazione

T ambiente4°C

PolimerizzazioneParaffina (m.o.) Resina (T.E.M)

60-70°C

Blocchetti prontiper esseretagliati insezioni

Il taglio delle sezioni

MICROTOMOStrumento che permette di sezionarei blocchetti di paraffina contenenti il campione in fette spesse 3-10 uM

La raccolta delle sezioni

La colorazione

I coloranti sono di solito in soluzione acquosa Le sezioni devono essere

sparaffinate in xilolo e reidratate con scala decrescente di alcool (100, 90, 80, 70, 50,H2O)

Metodica ematossilina eosina

Ematossilina 10 min

Lavaggio con H2O corrente

Eosina 1 min

Disidratazione

Montaggio

VetriniXilanizzati

Ematossilina: nucleiEmatossilina: nuclei

Eosina: citoplasmaEosina: citoplasma

ematossilinaeosina

COLORANTI PER MICROSCOPIA COLORANTI PER MICROSCOPIA OTTICAOTTICAI tessuti assumono i coloranti in base alle caratteristiche delle

strutture che li compongono

ACIDIACIDI carica negativa formano sali con basi colorano citoplasma

BASICIBASICI carica positiva formano sali con acidi colorano i nuclei

NEUTRINEUTRI formati dall’unione di un colorante acido con uno basico

NATURALINATURALI

animali : es. carminio (colorante acido nucleare)vegetali: es. ematossilina (colorante acido)

ARTIFICIALIARTIFICIALI

eosina (colorante basico citoplasmatico)

fucsina, violetto di genziana(coloranti nucleari)

COLORAZIONCOLORAZIONII

• chimichechimiche: reazione tra colorante e substrato

evidenziano molecole come lipidi e zuccheri

COLORAZIONI ISTOCHIMICHE

OLIO ROSSO O O.R.O (PER LIPIDI)• o.r.o. sciolto in soluzione di alcool etilico ed etere

• alcool etilico ed etere estraggono dalle cellule i lipidi

• o.r.o si deposita al loro postoP.A.S. (PER ZUCCHERI)

• acido periodico di schiff ossida i gruppi CHOH-CHOH

degli zuccheri

CHOH-CHOHreagisce con composto fucsina-acido solforoso e da’ colorazione fucsia

CHO-CHO

chimiche

fisiche

chimico fisiche

• FISICHEFISICHE: precipitazione di metalli su strutture biologiche

• CHIMICO-FISICHE CHIMICO-FISICHE : meccanismo di assorbimento elettrico

substrato e colorante hanno cariche diverse e formano sali fra loro

EMATOSSILINA

EOSINA

Es. impregnazione argentica Sali d’argento + sostanza riducenteliberazione di Ag metallico che si deposita sulle strutture biologicheargentofile (fibre nervose)

ULTRAMICROTOMOStrumento usato per sezionare i blocchetti di resina in sezioni molto sottili

SEMIFINI: sezioni di 1 uM di spessore, la cui osservazione al m.o. permette di selezionare i campi utili destinati ell’esame ultrastrutturaleal T.E.M.

SEZIONI ULTRAFINI: sezioni di 60-70 nm di spessore

Lama didiamante

Il tagliodelle sezioni

Raccolta dellesezioni

retino

LA COLORAZIONELA COLORAZIONE

• il contrasto dipende dal numero atomico degli atomi del campione

• piu’ e’ alto il numero atomico, piu’ elettroni sono dispersi, maggiore e’ il contrasto

• le molecole biologiche sono costituite da atomi con numero atomico basso (H, C, O)

• le sezioni vengono contrastate con sali di metalli pesanti

Acetato di Uranile Acetato di Uranile eeCitrato di PiomboCitrato di Piombo

…un esempio di applicazione

semifini

UVB 1 MED UVB 10 MED

fini