72º Congreso Argentino de Bioquímica

Simposio Medición de Hormonas Libres:

Lo que no podemos dejar de saber

Hipótesis de Hormona Libre

• La hormona libre es la que está disponible para los tejidos y puede inducir efectos metabólicos y experimentar degradación

• La hormona fijada a proteínas hace las veces de un reservorio metabólicamente inerte

Transporte de Hormonas en la sangre

TBG

Transtiretina

Albumina

Libre

T4 Testosterona

Cortisol

Hombre Mujer

Validez de los procedimientos de medición. Requerimientos

• La capacidad de determinar correctamente las concentraciones de hormonas libres séricas

• La capacidad de proveer resultados de las mediciones que sean clínicamente útiles

Métodos para estimar Tiroxina Libre

• Diálisis de trazador

• Diálisis de equilibrio

• Indices de hormona libre

• Inmunoensayos de Un paso

• Inmunoensayos de Dos pasos

• Diálisis de equilibrio/ LC-MSMS

Métodos para estimar Testosterona Libre

• Diálisis de trazador

• Indices de cálculos

• Inmunoensayo de Un paso (Análogo)

• Métodos de cálculos de Testosterona libre

• Medición por Cromatografía Gaseosa/MSMS y cálculos

• Medición por LC/MSMS

Transporte de Testosterona

SHBG Albumina

SHBG

Hombre

Mujer

SHBG Albumina

SHBG

Testosterona Biodisponible

Transporte de Testosterona

Hombre

Mujer

Cálculo de Testosterona Libre y Biodisponible

• Fórmula de Vermeulen

• Fórmula de Sodergard

• Fórmula de Nanjee y Wheeler

• Fórmula de Ly y Handelsman

Testosterona total, SHBG, Albumina

Métodos utilizados para la medición de Cortisol Libre

Inmunoensayos:

No se encuentran disponibles para medir Cortisol libre

plasmático

Se puede resolver en diferentes matrices:

Cortisol Libre Urinario – Reacciones cruzadas

Cortisol salival - Sensibilidad

Equilibrio de Diálisis- LC/MSMS

Si todos los

individuos tuviesen

igual contenido de

proteínas

transportadoras, la

utilidad diagnóstica

de medir Hormonas

totales y Libres

sería la misma

TBG Elevada

Esteroides

Sexuales

Drogas

Enfermedad

Congénito

Afinidad:

Albúmina -FDH

TTR

NTI

Desnutr.

TBG Disminuida Albúmina/TTR

Embarazo

Estrógenos

• Embarazo

• Anticonceptivos orales

Andrógenos

Esteroides anabólicos

5 Fluorouracilo

Heroína/Metadona

Clofibrate

Acido Nicotínico

Perfenacina

Glucocorticoides

L- Asparaginasa

Enfermedad grave - NTI

Síndrome Nefrótico

Desnutrición

Acromegalia

Síndrome de Cushing

Hipertirodismo

Exceso Deficiencia

Hepatitis aguda/crónica

Insuficiencia suprarrenal

SIDA

Porfiria intermitente aguda

Hipotiroidismo

Bartelena, Horm Res 45: 142 -7, 1996

Aumento de Concentración de Proteína

Transportadora

Secuencia de eventos

Estado

basal

Ingreso

Hormona

Egreso

Hormona

Ingreso -

Egreso

[Hormona]

Total

[Hormona

Libre]

Conc.

Hormona

fijada

N N N N N 0

[Proteína

Transporta

dora]

(+) (-)

(-)

(+) (+)

(+) N N

Nuevo estado N N N N (+) (+)

Diseño de Inmunoensayos Inexactitud de medida

• Incorrecta calibración. Falta de estandarización en el proceso

• Dependencia de las concentraciones de proteínas, capacidades de unión y/o presencia de inhibidores o promotores de unión

Características Requeridas en los

Métodos de Inmunoensayos de

Hormonas Libres

Afinidad

Niveles de Hormona

Unida a proteínas

Fase Sólida

Equilibrio

Termodinámico

Efecto de

Drogas

Inexactitud de los

métodos de medida de

hormonas libres:

• Interacción de

componentes de reactivos

(análogos) con

componentes de la

muestra

• “Secuestro” de la hormona

de la muestra

• Combinación de los 2

procesos

C45-A Guideline, CLSI 2012

Anticuerpo

T4 Análogo de T4

Albumina Transtiretina TBG

Distribución “ideal” de análogo marcado entre proteínas séricas

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

TBG Transtiretina Albumina

Ekins R, Endocr Rev 1990

T 4 Análogo

Anticuerpo

T4 Análogo de T4

Albumina Transtiretina TBG

Componentes

de Reactivo

(Albumina) Secuestro

con

componentes

normales

Interferente

Inexactitud de los

métodos de medida de

hormonas libres:

• Interacción de

componentes de reactivos

(análogos) con

componentes de la

muestra

• “Secuestro” de la hormona

de la muestra

• Combinación de los 2

procesos

C45-A Guideline, CLSI 2012

Chrostpfides ND, The immunoassay handbook, 4th ed. Oxford, 2013

Efecto de secuestro del anticuerpo anti analito

Efecto de la Dilución sobre la capacidad de

unión y resultados de T4L

0

20

40

60

80

100

120

6,25 12,5 25 50 100

T4 L

(p

mo

l/l)

Med

ida

T4 L (pmol/l) Esperada

C45-A Guideline, CLSI 2012

0

5

10

15

20

25

30

35

40

2 3 4 5

0

5

10

15

20

25

30

2 3 4 5

Amino N, Clin Chem 1983;29/2:321-325

Efecto de la adición de Albumina sobre resultados de T4 L

pm

ol/

l

pm

ol/

l

g/dl g/dl

Cambios en diferentes métodos de medición

de T4L en función de T4 unida a Proteínas

0

1

2

3

4

5

6

7

10 20 50 100 200 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

10 20 50 100 150 200

T4 unida a Proteínas

Nelson J, J Clin Endocrinol Metab 1994; 79:76-9

ng

/dl ng

/dl

Cambios en T4 Libre en función de proteínas

séricas

0

5

10

15

20

25

30

35

40

25 50 100 200

0

5

10

15

20

25

30

35

40

25 50 100 200

Flitz K, Clin Chem 2007,53;5:911-915

Porcentaje de Proteína sérica nativa

T4 L

(p

mo

l/l)

T4 T

(n

mo

l/l)

0

50

100

150

200

250

300

350

0

10

20

30

40

50

60

0

10

20

30

100 90 80 70 60 50 40 30 20

Testosterona Total

Fritz K, Clin Chem 2008, 54; 3: 512-516

Efecto de Hormona unida a Proteínas en la Medición de

Testosterona Libre

Diálisis

Testosterona Libre Análogo

pm

ol/

l p

mo

l/l

nm

ol/

l

Variabilidad de Testosterona Libre por diferentes métodos

Sartorius G, Annals of Clin Biochem 2009; 46:137-43

Métodos de Medición con Separación física

Métodos de Medición con Separación física

Etapas:

1.- Separación

física de la

hormona libre de

la unida a

proteínas (Diálisis

de Equilibrio)

2.- Medición de

hormona libre por

LC/MSMS

Métodos de Medición con Separación física

Etapas:

1.- Separación

física de la

hormona libre de

la unida a

proteínas (Diálisis

de Equilibrio)

2.- Medición de

hormona libre por

LC/MSMS

1.- Control de pH

2.- Temperatura

3.- Características

de membrana,

tamaño de poros

4.- Dilución

5.- Buffer de

diálisis

Interferencia Analítica (IFCC)

Error sistemático de la medición, causado

por un componente de la muestra, que

por sí mismo no produce una señal en el

sistema de medición

• Reacción cruzada

• Autoanticuerpos

• Anticuerpos Heterófilos/HAMA

• Factor Reumatoideo

Interferencias en los Inmunoensayos

Limitaciones e Interferencias en las Mediciones

Hormonas Tiroideas Totales y Libres**

• Anticuerpos Anti Hormonas

Deprés N, Clin Chem 1998;44:440-454

• Anticuerpos Anti reactivos (Anti Rhutenio)

Ohba K, Endocr. J. 2012;59(8): 663-7

• Aumento de Afinidad de Albumina

Ruiz M, N Engl J Med 1982;306:635-639

• Aumento de Afinidad de Transtiretina

Scrimshaw B, Thyroid 1992;2:21-26

** Dependiente de métodos

¿Cuándo sospechamos Interferencia ?

• Cuando existe discordancia entre resultados

de Laboratorio

• Cuando existe discordancia entre resultados y

datos clínicos de los pacientes

Estandarización y Armonización de pruebas tiroideas

• En el año 2005 la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC) creó el Grupo de Trabajo para la Estandarización de las pruebas de la función tiroidea (WG-STFT)

Misión: Documentar el estado de la estandarización y la calidad intrínseca de los inmunoensayos actuales de hormonas tiroideas, focalizándose en T4L y TSH • En el año 2012 se transformó en un Comité C STFT,

desarrollando sistemas de medición de referencia para la estandarización de T4L y armonización de TSH

Estandarización de Resultados de

T4L

Antes de la re calibración Después de la re calibración

Antes de la re

calibración

Después de la re

calibración

Thienpont L, Clin Chem 2010;56:912-920

Monitoreo de estabilidad analítica a través de

medianas móviles Poblacionales de T4L

Estandarización de la medición de Testosterona total. Programa de CDC

Objetivo: Mejorar el diagnóstico, tratamiento y la prevención de

enfermedades y desordenes a través de la estandarización de

las mediciones de Testosterona total.

Procedimiento de medida: ID-HPLC/MSMS trazable a método

de mayor jerarquía GC-LC/MSMS (Procedimiento de medida

de referencia)

Material: muestras de suero frescas

Rango: 0.25 – 10 ng/ml - Bias promedio: ± 6,4 %

Porqué es importante

Estandarizar/Armonizar métodos

• Seguridad del paciente

• Guías Clínicas. Uso de puntos de corte únicos

• Confianza del paciente

• Registros electrónicos de resultados unificados

Conclusión

• Existen diferentes estrategias metodológícas para estimar y

medir las concentraciones de hormonas libres circulantes en

el laboratorio clínico

• El conocimiento de los fundamentos involucrados en los

métodos es requerido para poder conocer las limitationes

técnicas potenciales que presentan y considerar estrategias

alternativas ante resultados que dificultan el diagnóstico e

interpretación clínicas

• La estandarización de las metodologías impactará en el

mejor cuidado y seguimiento de los pacientes

Muchas Gracias por su Atención