Presentación de PowerPoint - · PDF file*Brotes, embutidos y carne cocida: 13 muestras de 25g para un total de 325g + ... En una sola corrida se obtendrán resultados para O157:H7

15/06/2015

1

M. en C. Patricia Regina Aranguré Peraza

16/Junio/ 2015

Detección, aislamiento e identificación de

Escherichia coli O157:H7 y Escherichia

coli productora de toxina de Shiga no

O157 por el método FSIS/USDA.

Escherichia coli fue descubierta en

1885 por Theodor Escherich.

En 1964 el género Escherichia fue

definido en la obra “Topley and

Wilson´s Principles of

Bacteriology and Immunity” de

Wilson y Miles

Kauffmann 1947, esquema de serotipificación.

176 antígenos somáticos (O) serogrupo.

112 flagelares (H) serotipo.

60 capsulares (K).


2015

INTRODUCCIÓN

15/06/2015

2

• Escherichia coli es una bacteria que se encuentra normalmente en el intestino del ser humano y de los animales de sangre caliente.

• La mayoría de las cepas de Escherichia coli son inofensivas.


2015

INTRODUCCIÓN

• Sin embargo algunas de ellas pueden causar graves enfermedades a través de los alimentos (ETA).

• La bacteria se transmite al hombre principalmente por el consumo de alimentos contaminados, como productos de carne cruda o poco cocida.


2015

INTRODUCCIÓN

15/06/2015

3

Mecanismos de patogenicidad de los seis patotipos reconocidos de Escherichia coli

Kaper y col., 2004 M. en C. Patricia Regina Aranguré Peraza

2015

INTRODUCCIÓN

• STEC se considera un patógeno emergente (ETA)

• STEC ha sido implicada en numerosos brotes incluyendo el desarrollo del Síndrome urémico hemolítico (SUH) en algunos pacientes.

STEC INTRODUCCIÓN


2015

15/06/2015

4

• La mayor parte de la información disponible sobre EHEC/STEC guarda relación con el serotipo O157: H7


2015

INTRODUCCIÓN

STEC

1983-2002

70% de infecciones

(Brooks et al., 2005).

O26

O45

O103

O111

O121

O145

INTRODUCCIÓN


2015

15/06/2015

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HISTORIA

Konowalchuck y col.; 1977

¿STEC?

Karmali y col.; 1983

Riley ; 1983

Stx

INTRODUCCIÓN


2015

• Colitis hemorrágica

• Síndrome urémico hemolítico .


2015

INTRODUCCIÓN

15/06/2015

6

• Toxina de Shiga (Stx1, Stx2)

• Isla de patogenicidad LEE (locus of enterocyte effacement) que contiene entre otros el gen eae (fenómeno de A/E (attaching and effacing)).

• Plásmido pO157 (60Md).


2015

INTRODUCCIÓN

Factores auxiliares de virulencia

Mecanismo de acción de STEC

CH


2015

INTRODUCCIÓN

15/06/2015

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Mecanismo de acción de la Toxina Stx1/Stx2

SUH


2015

INTRODUCCIÓN

• Escherichia coli O157:H7 y Escherichia coli no O157, son considerados patógenos en humanos con una baja dosis infecciosa.

• Ingestión de 100 células puede causar enfermedad

• Bioseguridad Clase II


2015

MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

15/06/2015

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Este método es usado para el análisis de carne cruda para la detección de Escherichia coli O157:H7 y Escherichia coli no O157.

Utilizando herramientas y métodos como lo son enriquecimiento en caldo selectivo, PCR en tiempo real, separación inmunomagnética, placas de agar

altamente selectivas, serología, identificación bioquímica y ELISA


2015

Fundamento

METODOLOGIA


2015

Fundamento

The methods described in this guidebook are for use by the FSIS

laboratories. FSIS does not specifically endorse any of the mentioned test

products and acknowledges that equivalent products may be available for

laboratory use. Method validation is necessary to demonstrate the

equivalence of alternative tests as detailed in the document titled “FSIS

Guidance for Evaluating Test Kit Performance” available on the FSIS website.

METODOLOGIA

15/06/2015

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2015

Referencias

MLG 5A.04 FSIS Procedure for de Use of Escherichia coli O157:H7 Screening Test for Meat Products and Carcass and Environmental Sponges MLG 5.09 Detection, Isolation and Identification of Escherichia coli O157:H7 from Meat Products and Carcass and environmental Sponges. MLG 5B.05 Detection and Isolation of non-O157 Shiga Toxin-Producing Escherichia coli (STEC) from Meat Products and Carcass and environmental Sponges.

METODOLOGIA

Non-O157 STEC Test Methods that Received No-Objection Letters and are Validated by an Independent

Organization

Log Number Company Name Method Name 12-SMP-0848-N-A Biocontrol Systems Assurance GDS Top 7 STEC (eae) method

12-SMP-0849-N-A Biocontrol Systems Assurance GDS MPX Top 7 STEC method

12-SMP-0850-N-A IEH Laboratories IEH Non-O157 STEC detection and identification method

12-SMP-0858-N-A Bio-Rad Laboratories iQ Check™ VirX and iQ Check™ SerO STEC test methods

12-SMP-0860-N-A DuPont Qualicon BAX® System Real-Time PCR STEC Suite

12-SMP-0926-N-A Pall Corporation GeneDisc® Top 6 STEC test kit

Non-O157 STEC Test Methods that Received No-Objection Letters and are not Validated by an

Independent Organization

Log Number Company Name Method Name

12-SMP-0854-N-A Life Technologies RapidFinder™ STEC Screening and Confirmation Assays for Beef Products

12-SMP-0855-N-A Neogen Corporation NeoSeek Approach to STEC Detection Identification *confirmatory test


2015

Carta de No Objeción

PCR EN TIEMPO REAL ( PRUEBA TAMIZ)

http://www.fsis.usda.gov/wps/portal/fsis/topics/regulatory-compliance/New-Technologies/summary-table-of-nols-non-O157-stec-test-methods/NOL-non-O157-STEC-+test-methods

15/06/2015

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CEPAS DE REFERENCIA

Microorganismo ATCC Serotipo stx1 stx2 eae

Escherichia coli. 35150 O157:H7 + + +

Escherichia coli. 700728 O157:H7 - - -


2015

CEPAS DE REFERENCIA

Microorganismo Serogrupo stx1 stx2 eae Resistencia al

telurito de potasio

Escherichia coli. O26 + + + +







2015

15/06/2015

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Preparación de la muestra y enriquecimiento

primario


16/Junio/ 2015

BAX

325 ± 32.5g + 975±19.5mL CSTm

15-24h / 42 ± 1ºC

*Brotes, embutidos y carne cocida: 13 muestras de 25g

para un total de 325g + 975±19.5mL CSTm ó 25g de

muestra + 225 ± 4.5 mL CSTm

15-24h / 42 ± 1ºC

GDS

375g + 1.5mL mEHEC

10-18h / 42 ± 1ºC

25g + 225mL mEHEC

10-18h / 42 ± 1ºC

* Escherichia coli O157:H7

C+


2015

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y ENRIQUECIMIENTO PRIMARIO

15/06/2015

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PCR en tiempo real

(prueba tamiz)


16/Junio/ 2015

Consiste en la amplificación automatizada de ácidos nucleicos:

Escherichia coli O157:H7

Factores auxiliares de virulencia eae, stx1 y stx2 Los 6 principales serogrupos de cepas de Escherichia coli productoras de toxinas de Shiga (STEC) no O157:H7


2015

PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ)

15/06/2015

13

BAX

PCR

O157:H7

PCR (STEC)

eae/stx

(Previamente positivo a eae/stx)

PCR

Panel 1/Panel 2



2015

• O157:H7

• STEC Screening : eae, stx

• Panel 1: O26, O111, O121

• Panel 2: O45, O103, O145

BAX


2015


15/06/2015

14


2015

Preparar previamente

tubos con 200µL de

buffer de lisis

Agregar 20µL de la muestra al buffer de

lisis

37ºC/20min.

95ºC/1Omin

Enfriar los tubos 4ºC/5min


BAX


2015

Capturar los datos en el

sistema

Transferir 50µL del

lisado a los tubos de

amplificación

Colocar los tubos e iniciar

la corrida

BAX


15/06/2015

15

BAX

PCR

O157:H7

Positivo (SIM)

PCR (STEC)

eae/stx

Positivo (PCR Panel 1 Y 2)

(Previamente positivo a eae/stx)

PCR

Panel 1/Panel 2

Positivo (SIM)


2015


BAX

GDS

PCR

MPX Top 7 STEC

O157:H7

y (STEC) eae/stx1 y stx2



2015

15/06/2015

16

Preparación del material y reactivos

X 2

Adición de: Reactivo de Concentración. (immunobeads) (20µL) Solución de lavado. (1 mL) Buffer de resuspensión. (45µL)


2015

GDS


Adición de 1ml de la muestra

Vortex por 10min Usar la PickPen para capturar la bacteria


2015

PCR EN TIEMPO REAL (PRUEBA TAMIZ) GDS

15/06/2015

17

Transfiriendo los “inmunobeads” del

bloque de muestras para el plato de resuspensión

Concentrado Transfiriendo los

“inmunobeads” a los tubos de amplificación


2015


Capturar los datos en el sistema

Acomodar los tubos de

amplificación en el rotor

Leer los resultados después de 75 a

80min.

En una sola corrida se obtendrán resultados para O157:H7 y STEC


2015


15/06/2015

18

Si la muestra es positiva a PCR en tiempo real

se considera

POTENCIALMENTE POSITIVA


16/Junio/ 2015


Método confirmatorio

Procedimiento de Inmunoseparación

Magnética (SIM)


16/Junio/ 2015

15/06/2015

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BAX

SIM

O157:H7 ó cualquier de los 6 serogrupos STEC

previamente identificados por PCR

GDS

SIM

7 serogrupos incluido el serotipo O157:H7 ó a seis serogrupos STEC


2015

PROCEDIMIENTO DE INMUNOSEPARACIÓN MAGNÉTICA (SIM)

• Anticuerpos anti-Escherichia coli purificados, adsorbidos y unidos covalentemente a la superficie de partículas esféricas paramagnéticas de poliestireno.

• Reaccionan con el antígeno somático.


2015

Fundamento SIM


15/06/2015

20

Tomar una alícuota de la muestra (1mL)

SIM


2015

Colocar 50 µL inmunoperlas serogrupos: O157, O26, O45, O103, O111,O121 y O145.

Colocar 50 µL inmunoperlas + 1mL de muestra.

Incubar 15 min en movimiento a una temperatura de 18-30ºC.


Añadir 1 mL de la muestra en las columnas

Colocar las columnas de inmunoseparación en el imán OCTOMACs y humectar con 500µL de Buffer E

Realizar 4 lavados Buffer E

Separar las columnas del imán y colocarla en tubos de 12 x 75 mm +1mL

Buffer E , posteriormente utilizar el émbolo.


2015


15/06/2015

21

Por cada muestra y control se prepararan: 3 tubos con 900 µL de Buffer E (diluciones) 1 tubo con 25 µL con HCl 1N (tratamiento ácido).

De la muestra directa se realizará dos diluciones con los tubos 900 µL de 1:10 y 1:100

Previamente se secaron 4 placas de agar rainbow modificado por cada muestras 2placas: 1:10 y 1:100 2 placas : tratamiento ácido y 1:10


2015


De las diluciones de 1:10 y 1:100 se sembraran 100 µL en ARM


2015

Se dispersa con asa de Digralsky y se incubaran a 35±2ºC por 20-24h


15/06/2015

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Posterior a la incubación se agregará 475 µL Buffer E se sembraran con asa de Digralsky 100µL de la muestra, de igual forma se realizará una dilución 1:10, se procederá a inocular la placa de ARM y se incubaran a 35±2ºC por 20-24h

De la muestra sin diluir se tomaran 450 µL y se añadirá al tubo con 25 µL de HCl IN (pH 2) y se incubaran por una hora


2015


Seleccionar colonias típicas bien aisladas en ARM y realizarla prueba de serología para los antígenos somáticos : O26, O45, O103, O111,O121, O145 y O157.


2015

MLG 5B Apendix 2.01 Morphologies of Representative Strains from Six non-O157 Shiga Toxin-Producing Escherichia coli (STEC) Grown on modified Rainbow Agar.

IDENTIFICACIÓN

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Medio cromogénico selectivo.

• β-galactosidasa (un sustrato cromogénico azul-negro )

• β-glucuronidasa (un sustrato cromogénico rojo )

Para aumentar la selectividad del agar

• Telurito de Potasio 0.15 mL.

• Novobiocina 1.25 mL.

• Cefixima (concentración de 0.5mg/ mL) 0.1 mL.


2015

Agar Rainbow Modificado (ARM)

IDENTIFICACIÓN

1ª serología ARM detección de serogrupo sospechoso

STEC PCR opcional

Se sembraran por lo menos 5 colonias sospechosas en agar sangre

35 °C/16-24hrs Si la muestra es positiva a serología a partir de ARM se

reporta como:

Presuntamente positiva


2015

IDENTIFICACIÓN

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• Las partículas de látex son cubiertas con un anticuerpo contra el antígeno Escherichia coli O157 y Escherichia coli no O157.

• Cuando las partículas del látex son mezcladas con colonias frescas ,la bacteria se une al antisuero, causando que las partículas de látex se aglutinen (resultado positivo).

• Las bacterias que no sean del serogrupo de interés no se unirán a los antisueros y no dará como resultado aglutinación alguna. (resultado negativo)

SEROLOGÍA

Fundamento


2015

2ª Serología

Para obtener colonias

aisladas y puras.

O157:H7 Se realiza la serología para el

antígeno somático y el antígeno flagelar

STEC Se realiza la

serología para el antígeno somático

Agar sangre


2015

SEROLOGÍA

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1) ELISA,PCR (eae/stx)

2) Identificación bioquímica (VITEK®, API 20E®).

1) PCR (eae/stx)

2) PCR (Panel 1 ó 2)

3) Identificación bioquímica (VITEK®, API 20E®).

O157:H7 STEC no O157


2015

Positivos a serología

SEROLOGÍA

Una colonia a partir de agar

sangre

Resuspender en 50µL de agua grado

biología molecular

Al buffer de lisis, se le agregará 5µL de la

suspensión bacteriana y se continuará con el proceso previamente

visto.

Positivo O157

ID bioquímica, ELISA

Positivo STEC

PCR serogupo

PCR EN TIEMPO REAL


2015

PCR (eae/stx)

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Una colonia a partir de agar

sangre

Resuspender en 50µL de agua grado

biología molecular

Al buffer de lisis, se le agregará 5µL de la

suspensión bacteriana y se continuará con el proceso previamente

visto.

PCR EN TIEMPO REAL

PCR (Panel 1 Y Panel 2)


2015

ID bioquímica

Positivo STEC

• Es un sistema estandarizado que permite la identificación de

enterobacterias y otros bacilos Gram negativos no exigentes

• 21 tests bioquímicos miniaturizados, así como una base de datos.

• Las reacciones bioquímicas producidas durante el periodo de incubación

se traducen en cambios de colores espontáneos o revelados mediante la

adición de reactivos.

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA

API 20E


2015

15/06/2015

27

1 • A partir de una colonia aislada del agar sangre, hacer una suspensión en

5 mL de solución salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua estéril.

2 • Llenar con la suspensión de bacterias los tubos, no la cúpula (cada

pocillo tiene un tubo y una cúpula, parte aerobia), de todos los pocillos.

3 • Llenar la cúpula de los pocillos CIT, VP, GEL con la suspensión de

bacterias.


2015



2015


4 • Llenar la cúpula de los pocillos ADH,LCD,ODC y H2S con parafina

5 • Poner la tira en su propia cámara húmeda de incubación

6 • Incubar a 35 ± 2 °C durante 18-24 h y realizar la lectura.

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• La prueba Premier EHEC utiliza anticuerpos monoclonales de captura anti- toxina Shiga, absorbidos en los micropocillos.

• Junto a un anticuerpo policlonal anti- toxina Shiga y un anticuerpo policlonal anti-igG conjugado a un enzima .

• Se realiza siguiendo las indicaciones del proveedor.


2015

PRUEBA DE ELISA

ELISA (O157:H7)


2015

ELISA (O157:H7)

PRUEBA DE ELISA

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• Si la toxina está presente, se forma un complejo antígeno-anticuerpo.

• Se desarrolla color por actividad enzimática en presencia del sustrato .

• Los resultados se interpretan visual o espectrofotométricamente.


2015

ELISA (O157:H7)

PRUEBA DE ELISA

Para confirmar la muestra como positiva deberá ser:

• Bioquímicamente identificada como Escherichia coli

• Serológica o genéticamente determinada como O157

Y que cumpla al menos uno de los siguientes criterios:

• Positiva a la producción de toxina de Shiga

• Positivo al gen de la toxina de Shiga (stx)

• Genéticamente determinado como H7

Si no cumple con ninguno de los criterios será reportada como Ausente en 325 ó 375g.

REPORTE DE RESULTADOS

O157:H7

Presente en 325g (BAX) ó

Presente en 375g (GDS)

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Para confirmar la muestra como positiva deberá ser :

• Bioquímicamente identificada como Escherichia coli

• Positivo al gen de la toxina de Shiga (stx) y al gen eae

• Serológica o genéticamente determinada como cualquiera de los 6 serogrupos


REPORTE DE RESULTADOS

No-O157:H7

Presente en 325g (BAX) ó

Presente en 375g (GDS)

MVZ Juan Gay Gutiérrez

Director del Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal (CENAPA)

Dr Jorge E. Torroba Secretarío ex officio de la RILAA - OPS/OMS

Dr Susana Horta Fonseca

LANAGRO, Brasil

QI Martha Laura Dominguez

Subdirector de Constatación (CENAPA)

QBP Cesar Linares Altamirano

Jefe del Departamento de Químicos Farmacéuticos y Alimenticios (CENAPA)

Ing. Ivan Casarrubias Ayala

Sistemas de informática (CENAPA)

Ing Alberto Horacio Mendia

PANAFTOSA-OPS


AGRADECIMIENTOS

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Prof. Ejec. de Serv. Espdos. Enlace C

Laboratorio de Microbiología

Centro Nacional de Servicios de Constatación en Salud Animal

Carretera Federal Cuernavaca-Cuautla No. 8534, Col.

Progreso

Jiutepec Mor CP 62550

Tel. Conm. (55) 59 05 10 00, Ext. 53112

[email protected]

mailto:[email protected]

Documents

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