Identificación y herencia de genes de resistencia a Cancro

del tallo (Diaporthe phaseolorum var. caulivora) y Tizón del

tallo y vaina (Phomopsis longicolla) en soja

Dra. Rosanna N. PioliIICAR - BIOVyM-FRE, FCAgrarias UNR, CIUNR

Referencias 3 tesis y respectivas publicaciones

Caracterización Morfológica y Fisiológica de una Interacción PH – P deInterés Agrícola. Glycine max-complejo Diaporthe Phomopis: Soja – D.phaseolorum var. meridionalis. Proy. Tesis formulado por Dra. RN Pioli

Búsqueda e identificación de genes de resistencia a laCancrosis del tallo de soja causada por D. phaseolorum var.caulivora. Beca Doctoral CONICET. 2018 Dra. AM Peruzzo.

Búsqueda e identificación de genes de resistencia a Tizón Tallo y Vaina causado por DP- Phomopsis longicolla en el germoplasma de soja. 2020. Lic. FE Hernández

2006- 2011- 2013- 2019

Aspectos moleculares de la resistencia a la cancrosis del tallo de la soja por D. phaseolorum var. meridionalis. Dra. MA Chiesa

CTS-Dpm

CTS-Dpc

TTV-Plo

Publicaciones de Referencias

Peruzzo AM; Hernández FE; Pratta GR; Ploper LD, Pioli RN.2019. Identification and inheritance of an Rdc geneconferring resistance to soybean stem canker (Dpc).Eur J Plant Pathol. 1180(2019) 154:1179–84

Pioli, R. N.; Morandi, E. N.; Martínez, M.C.; Lucca, M.F.; Tozzini, A.; Bisaro,V.; Hopp, HE. 2003. Morphological, Molecular and PathogenicCharacterization of Diaporthe phaseolorum Variability in the CoreSoybean Producing Area of Argentina. Phytopathology, 93(2):136-146

FE Hernández; RN Pioli; A Peruzzo; ÁN Formento; GR Pratta. 2015. Caracterizaciónmorfológica y molecular de una colección de aislamientos de Phomopsis longicolla(teleomorfo desconocido: Diaporthales) de la región templada y subtropical deArgentina. Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. 63(3):871-884.

TTV-Plo

CTS-Dpm

CTS-Dpc

HIPÓTESIS DE TRABAJO

Variabilidad Genética

Germoplasma VegetalGermoplasma Fúngico

Interacciones Planta – Patógeno

Ejes de trabajo

Selección del germoplasma fúngico

Complejo DP: Dpm, Dpc, Dps - Plo

Selección del germoplasma vegetal

CTS-Dpm genotipos portadores de genes de R a CTS

CTS-Dpc búsqueda y evaluación de genotipos

TTV- Plo genotipos portadores de genes de R a DS

Evaluación de las Interacciones

Glycine max – Dpm G. max – Dpc G. max – Plo

Primera Caracterización morfológica, molecular y patogénica

del Complejo Diaporthe - Phomopsis de Argentina. 2003

Pioli, RN; Morandi, EN; Martínez, MC; Lucca, MF; Tozzini, A; Bisaro, V; Hopp, HE.

2003.

Phytopathology, 93(2):136-146.

Selección del germoplasma fúngico

Marcadores morfológicos

Diaporthe phaseolorum var. meridionalis

D phaseolorum var. caulivora

Diaporthe phaseolorum var. sojae

Marcadores morfológicos

Phomopsis longicolla

Caracterización

Molecular Rapd

CICVA. INTA Castelar

Tozzini, Martinez Hopp

RI- Dpm patógeno responsable del CTS en la zona sojera núcleo1996/97.

Plant Disease Note 1997, 81(10):1215

RI- Existencia de Razas Fisiológicas, en Dpm, 1999Plant Disease Note 1999, 83(11):1071 Mercosoja 99, Pág.15-16

RI- Presencia de la Dp var. caulivora en Argentina y coexistencia de

ambas variedades de Dp: Dpm y Dpc, 2001

Pioli, RN; Morandi, EN. and Bisaro, V. Plant Disease Note 85(1):95.

RI- CTS-Dpc como enfermedad emergente en la región pampeana de

Argentina. 2002.

Pioli, RN; Morandi, EN; Luque, A; Gosparini, CO. Plant Disease Note, 86(12):1403.

Selección del germoplasma vegetal

Genotipos portadores de genes de R a CTS

S CTS sin genes R

Caracterización patogénica: Interacciones - aislamiento Dp - genotipo soja

Dpm

Dpc

Genotipos soja portadores de genes de resistencia a CTS (Dp_?)

Cada interacción aislamiento – genotipo de soja fue realizada con 3 repeticiones de

54, 36 y 54 plantas (n= 144p / I. aislamiento genotipo), respectivamente.

56 IPP

21 IPP

- Se determinó que los genes de RCTS (Rcts1- Rcts4)

conferían resistencia a CTS-Dpm pero no eran efectivos

para CTS-Dpc

- Los genes “Rdc” portados por los genotipos diferenciales se redenominaron

Rdm. La R a CTS había sido caracterizada en base a las cepas más virulentas obtenidas en el sur de EE.UU --- Dpm (Tyler 1996).

- La expresión de un mismo gen de R a CTS-Dpm (Rdm4) variaba según el fondo genético de soja : Rdm4 (Hutcheson o Dowling ).

- 2006 y 2011, se identificaron razas fisiológicas en los aislamientos locales de

Dpc.

Dpm

Interacciones Glycine max - complejo DP

Dpc

DpmRazas fisiológicas

CE109 y 112

Plo - Dps

Rdm 1-2 Tracy

Rdm 3 Crocket

Rdm 4 Hutcheson /Dowling

Rdm 4 Hutcheson/Razas CE 109 y 112

Rdm4-Rdm5

Resistencia a la CTS-Dpc

Tesis y Beca Doctoral CONICET de la Lic. Alejandra Peruzzo 2013-2018

Director RN Pioli y Co-Director LD Ploper

Trabajo 291: P. Oral y Poster: Beca Posdoctoral CONICET, Dra. Alejandra

Peruzzo Director RN Pioli y Co-Director GR Pratta.

Identificación y herencia de un gen (Rdc1) de resistencia a

CTS-Dpc

PeruzzoAM, Hernandez FE, Pratta GR, Ploper LD, Pioli RN.

Identification and inheritance of an Rdc gene conferring resistance to soybean

stem canker (Dpc). Eur J Plant Pathol. 1180(2019) 154:1179–8

Germoplasma vegetal: Evaluación y selección de Progenitores R-S Glycine max par CTS-Dpc

En base a 137 genotipos de soja con diferente respuesta frente a CTS

una colección ampliada 20 cepas Dpc caracterizadas por

morfología y molecularmente (2006-2011)

Evaluación de 405 interacciones soja con diferentes cepas de Dpc

Selección 30 genotipos de soja - de 3 fuentes de germoplasma

4 cepas de Dpc diferenciales

Caracterización y verificación del comportamiento de tales cvs. en 246

interacciones adicionales (López Achaval, 2011-2012)

Selección de 12 genotipos Resistentes (R) y 12 Susceptibles (S).

Area Fisiología Vegetal:

Morandi, Cairo, Gosparini

Cruzamientos Progenitores RxS y RxR y sus recíprocos, obtención de F1

• 288 combinaciones de cruzamientos RxS

• 132 combinaciones de cruzamientos RxR

Muestras de tejido vegetal Progenitores y respectivas F1

Validación molecular de F1 a través de MM de tipo SNP

P13 P4 13x4 (Co-258)

C/C A/A A/C

T/T C/C T/C

T/T T/T T/T

A/A A/A A/A

C/C T/T C/T

G/G A/A A/G

G/G G/G G/G

T/T C/C T/C

Planta F1

Validación molecular de F1 a través de MM de tipo SNPs

y respectivos Progenitores

78 plantas F1 evaluadas

M morfo-estructurales,

resultaron heterocigotas

e híbridos moleculares

- 69 F1 derivadas de RxS

- 9 F1 de RxR

Obtención segura de individuos – poblaciones

segregantes F2, F3 y familias F2:3

Evaluación fenotípica de familias F2:3 derivadas de cada individuo F2 mediante

la inoculación con una cepa Dpc. Prueba de Progenie para CTS-Dpc

Se conformaron familias F2:3

-10 plantas descendientes de un mismo progenitor F2

-Inoculación y evaluación dela reacción fenotípica

de cada individuo F3 a CTS-Dpc

-Inferir frecuencia genotípica de progenitores F2

0 0.3 0.6 1

Escala diagramática para Severidad de CTS-Dpc

Un individuo es Planta Viva o Resistente (PV/PR)cuando a los 56 dpi:

sin síntomas (0 - 0.05)

hasta nivel 0.3 en la escala.

Las plantas con severidad > 0.3 son consideradas

plantas muertas o susceptibles (PM/PS).

Test de ProgenieInoculan P (PM/PS), F1 y F2:3

Progenitores y

progenies

Nro. plantas o

familias

inoculadas

Hipótesis Razón esperada

Reacción de la

enfermedadf2 Lg Pi

R Seg S

Ge(13) 10a R -- 9 1 -- --

Ge(4) 10a S -- 2 8 -- --

F2 (COD 258-2) 32a 3 : 1c 24 : 8 26 6 0,67 nsh 0,41

F2:3 (COD 1-258-2) 74b 1: 2: 1d 18,5 : 37 : 18,5 21 42 11 4,05 nsh 0,13

F3 740a 5:3e 462,5 : 277,5 466 274 0,07 nsh 0,79

Table : Phenotypic reaction and genotypic characterization of F1, F2, F2:3 and F3 segregating

populations obtained from the cross (COD 1–258-2): Ge R(13) and GeS (4) soybean genotypes

in the specific interaction with a(Dpc16)

El análisis de segregación de los genes Rdc se realizó mediante una prueba no paramétrica de 2).

2 calculado < 2 tabulado acepta H0

A partir de los resultados obtenidos se reportó la existencia de al menos

un gen mayor , de herencia simple mendeliana: Rdc1

proveniente del cruzamiento Ge (13)-R x Ge(4)-S

Constituye el Primer Reporte a nivel mundial sobre la detección e identificación de ungen Rdc de R para CTS-Dpc

En este contexto

Proceso de estabilización del gen Rdc1 en la línea derivada del Cruz-258El análisis de otras poblaciones derivadas de diferentes progenitores y

del mismo progenitor R y distinto S: Ge (13)-R x Ge (12)-S

En paralelo se presenta en Poster y PO el trabajo

Beca Posdoctoral CONICET de la Dra. AM Peruzzo

Mapeo molecular de la región genómica que confiere resistencia a la CTS-Dpc

Avances alcanzados

Búsqueda e identificación de genes de resistencia a

TTV causado por DP- Phomopsis longicolla en el germoplasma de soja

Tesis y Beca Doctoral CONICET - Lic. Genética Facundo E Hernández

2016-2020

Director RN Pioli y Co-Director GR Pratta

FE Hernández; RN Pioli; A Peruzzo; ÁN Formento; GR Pratta. 2015.

Caracterización morfológica y molecular de una colección de

aislamientos de Phomopsis longicolla (teleomorfo desconocido:

Diaporthales) de la región templada y subtropical de Argentina.

Rev. Biol. Trop. (Int. J. Trop. Biol. 63(3):871-884.

Germop C. Flor C. Vaina F.Foliolo C. Hilo

Cv 1 Tostado Oval Claro

Cv2 Tostado Ova/Lan Claro

Cv3 Tostado Oval Oscuro

Cv4 Beige Ova/Lan Claro

Cv5 Beige Oval Oscuro

Cv6 Beige Lanceol Oscu (R)

Cv7 Tostado Lanceol Oscuro

Cv8 Beige Ova/Lan Oscuro

Cv 9 Tostado Ova/Lan Claro

Cv 10 Tostado Lanceol Claro

Descriptores de cultivares de soja INASE

Caracterizar el germoplasma fúngico y el vegetal mediante atributos cualitativos.

Validar molecularmente los genotipos fúngicos

255 bandas polimórficas cuatro

cebadores (OP1, OP6, ITs4 y Plo5).

TTyV: Pps Plo

Evaluación de las interacciones PP: Selección de Progenitores

Validar el comportamiento de resistencia / susceptibilidad de los genotipos vegetales.

RESISTENTES SUSCEPTIBLES

Ge 1 (Rpds 1 y 2) Ge 4 (Rpds 2)

Ge 2 (Rpds 3 y 2) Ge 5

Ge 3 (Rpds 3)

Ge 6 (sin genes identificados)

Virulencia de

Aislamientos DP

%

Severidad

TTV Promedio

1 - A1 (227-B2) 21,8 b

2 - A2 (B4L17) 20,7 ab

3 - A3 (B5L16) 23,9 b

4 - A4 (CaB) 19,0 ab

5- A5 (Grupo 3.4) 19,9 ab

6- A6 (Grupo 4.1) 22,6 b

7- A7 (8413) 21,0 ab

8 - A8 (Qcol7) 16,3 a

Peruzzo, 2018

Selección de Progenitores y Cruzamientos RxS y RxR y obtención de respectivas F1.

Test de ProgenieInoculan P (PM/PS), F1 y F2:3

Inoculados

CV 6-R CV 4-S

6 X 4

Cruzamiento de

Progenitores Seleccionados

Determinación del número de Genes R TTV involucrados

Inoculadas

7/3 8/2 10/0 8/2 9/1 3/7 2/8

Rr Rr Rr rrrrRRRR

Frecuencias Fenotípica F2= 12:3: 1

Presencia de 2 GENES (Loci) con interacción una

Epistasis Simple Dominante

10 Plantas /Flia F2:3

F2 Fenotype Observed Expected (O - E)2/E

Resistente 37 39,75 0.225

M. Resiste 10 9,9 0

Suceptible 6 3,3 3

TOTAL 53 53 2obs = 3,225

Como p< 0.05 o manualmente

2 calculado < 2 tabulado

acepta H0

H0 la presencia de DOS genes (2 loci)

en epistasis simple dominante 12:3:1…

Dpm

A partir de los resultados obtenidos en el análisis del TTV- Plo se propone

la existencia de al menos dos genes R-TTV con interacción de

EPISTASIS SIMPLE DOMINANTE

provenientes del cruzamiento Ge(6)-R x Ge(4)-S,

con la potencialidad de detectar uno o más genes de R-TTV aportados

por el progenitor Ge(6)-R, hasta el momento sin antecedentes conocidos.

Aportes de Grupos Interdisciplinares y

BIOVyM-FRE (IICAR)

Se desarrolló un protocolo de

selección de germoplasma vegetal y fúngico

evaluación de interacciones planta – patógenos

Fisiología (Morandi, Cairo, Gosparini) – Fitopatología (Pioli), luego continuado

Protocolo combinado de técnicas de mejoramiento convencional y

herramientas biotecnológicas de asistencia temprana por MM –SNPs, permitieron identificar y seleccionar fuentes de R en el germoplasma de soja

I) Cancrosis del tallo por D. phaseolorum var. caulivora (CTS-Dpc),

II) Tizón del tallo y vaina por Phomopsis longicolla (TTV-Plo)

Agradecimientos

Grupo DM Seeds: Ing. Agr. Bibiana Ferrari, Dr. Gaspar Malone

Bolsa de Comercio Rosario: Ing. Agr. Angel Girardi,

Fisiología Vegetal: Dr. Carlos Cairo, Dr. Carlos Gosparini.

IICAR (CONICET-UNR), FCA.UNR

CONICET

SECTeI

CyT-UNR

CyT.UNR PID AGR286 y PID AGR287

Proyecto macro IICAR PUE043

IO-2017- 00343

CONICET

Bolsa de Comercio