Presentación de PowerPoint - bioinfo2.ugr.es · tejidos en cualquier región del genoma. Actualmente, la base de datos contiene información para 6 especies y 114 tejidos y/o condiciones

Grupo de Genómica Computacional & Bioinformática Universidad de Granada

INTRODUCCIÓN

Proceso bioquímico de la metilación de citosinas

Metilación del ADN

• ARN polimerasa • Splicing alternativo • Unión de factores de transcripción • Estado de la cromatina • Silenciamiento de elementos repetidos • Compensación de dosis • Impronta génica • …

Funciones de la metilación del ADN

INTRODUCCIÓN

Distribución de la metilación en contextos

Células madre (H1)

Fibroblastos de pulmón (IMR90)

Lister et al. 2009 (Nature)

INTRODUCCIÓN

Dinámica evolutiva de los dinucleótidos CpG

Frecuencia de CpGs en el genoma humano

Desaminación espontánea de las metilcitosinas

INTRODUCCIÓN

Distribución de CpGs en el genoma

Islas CpG (CGIs)

INTRODUCCIÓN

Distribución de CpGs en el genoma

Islas CpG (CGIs)

INTRODUCCIÓN

Metilación diferencial

H1

IMR90

Región diferencialmente metilada

(DMR)

OBJETIVOS

1. Desarrollo de la metodología necesaria para procesar y cuantificar los niveles de metilación, a partir de datos obtenidos mediante protocolos de secuenciación masiva.

2.Desarrollo de una base de datos relacional que permita el almacenamiento y la comparación de los datos de metilación en citosinas individuales.

3.Optimización del algoritmo CpGcluster, con objeto de mejorar sus predicciones.

4.Comparación del algoritmo mejorado con los métodos clásicos de identificación de islas CpGs.

5. Identificar y caracterizar regiones diferencialmente metiladas con una elevada densidad de CpGs.

IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE REGIONES DIFERENCIALMENTE METILADAS


BLOQUE I • Inferencia de la metilación


BLOQUE II • Mejora de CpGcluster • Comparación entre

predicciones de CGIs


BLOQUE III • Almacenamiento de datos • Minería de datos • Análisis de regiones

diferencialmente metiladas


BLOQUE I

SECUENCIACIÓN MASIVA (NGS)

EXPERIMENTAL

COMPUTACIONAL

Fragmentación Selección

Secuenciación

Alineamiento Criterios de

calidad

MUESTRA DE ADN LECTURAS

GENOMA DE REFERENCIA RESECUENCIACIÓN


EXPERIMENTAL

COMPUTACIONAL

Fragmentación Selección

Secuenciación

Alineamiento Criterios de

calidad




EXPERIMENTAL

COMPUTACIONAL

Troceado Selección

Criterios de calidad



2) Variación

DIFERENCIAS

1) Errores de secuenciación y alineamiento

TRATAMIENTO CON BISULFITO

Fragmento de ADN

BSW BSC

BSW Referencia

CITOSINA METILADA BISULFITO

CM C

CITOSINA NO METILADA BISULFITO

C T

C C CITOSINA METILADA

T C CITOSINA NO METILADA

Hackenberg, M., G. Barturen and J. L. Oliver (2012). DNA methylation Profiling from High-Throughput Sequencing Data. DNA Methylation, InTech - Open

Access Publisher, ISBN 979-953-307-453-4.

Alineamiento de lecturas tratadas con bisulfito

Preprocesado de lecturas Desambiguación de multilecturas

Preprocesado de lecturas

Recorte por calidad en 3’

Búsqueda y recorte del adaptador

Desambiguación de multilecturas

Barturen, G., A. Rueda, J. L. Oliver and M. Hackenberg (2013). "MethylExtract: High-Quality methylation maps and SNV calling from whole genome bisulfite sequencing data."

F1000Res 2(217): 217.

Inferencia de los niveles de metilación

Detección de variantes de secuencia Control de la calidad de secuenciación

Detección de variantes de secuencia

Detección de variantes Estimación errónea de la metilación

TCGA TTGA MUESTRA

BISULFITO

TTGA

TCGA

CITOSINA NO METILADA

TIMINA

REFERENCIA

¿CITOSINA NO METILADA?


TCGA TTGA MUESTRA

BISULFITO

TTGA

TCGA


TIMINA

REFERENCIA

Guanina en la hebra complementaria



TCGA TTGA MUESTRA

BISULFITO

TTGA

TCGA


TIMINA

REFERENCIA

Adenina en la hebra complementaria


Control de la calidad de secuenciación

El control de la calidad de secuenciación (minQ) mejora la inferencia de la metilación y la detección de variantes


BLOQUE II

Hackenberg, M., P. Carpena, P. Bernaola-Galvan, G. Barturen, A. M. Alganza and J. L. Oliver (2011). "WordCluster: detecting clusters of DNA words and genomic elements."

Algorithms Mol Biol 6: 2.

Mejora del algoritmo CpGcluster

Cálculo de la intersección genómica

Cálculo de la intersección genómica

Hackenberg et al. 2006 (BMC Bioinformatics)

Distribución de las distancias entre CpGs adyacentes

Comparación entre predicciones

Mayor solapamiento

Comparación entre predicciones

Menor Solapamiento

Hackenberg, M., G. Barturen, P. Carpena, P. L. Luque-Escamilla, C. Previti and J. L. Oliver (2010). "Prediction of CpG-island function: CpG clustering vs. sliding-window methods."

BMC Genomics 11: 327.

Comparación entre algoritmos de predicción de CGIs

Algoritmos de ventana Algoritmos de adición Algoritmos de agrupación (Clustering)

Algoritmos de predicción de CGIs

Especificidad funcional

Takai & Jones

CpGcluster

UCSC

TSSs

TFBSs

Las CGIs predichas por CpGcluster se asocian con mayor especificidad a elementos funcionales del genoma

Dominios de metilación homogéneos

Las CGIs predichas por CpGcluster muestran niveles de metilación más

homogéneos


BLOQUE III

Hackenberg, M., G. Barturen and J. L. Oliver (2011). "NGSmethDB: a database for next-generation sequencing single-cytosine-resolution DNA methylation data." Nucleic Acids Res 39(Database issue): D75-79.

Geisen, S., G. Barturen, A. M. Alganza, M. Hackenberg and J. L. Oliver (2014). "NGSmethDB: an

updated genome resource for high quality, single-cytosine resolution methylomes." Nucleic Acids Res

42(1): D53-59.

Almacenamiento de niveles de metilación para múltiples tejidos Desarrollo de herramientas para visualizarlos y compararlos

Diseño y contenido de NGSmethDB

40 TB FASTQ

Procesados de manera uniforme

Humano – Chimpancé – Macaco – Ratón - Arabidopsis

Tomate (Niveles de metilación y variaciones de secuencia)

114 tejidos y/o condiciones diferentes

Minería de datos


COMPARACIÓN DE MÉTODOS ESTADÍSTICOS

CLASIFICACIÓN DE ISLAS

ANÁLISIS FUNCIONAL

DISTRIBUCIÓN EN REGIONES GENÓMICAS

NIVELES DE METILACIÓN EN LAS CGIs

Niveles de metilación en las CGIs

H1 IMR90

U T N I M

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1


H1 0 0 1 13 41

IMR90 48 1 0 4 3

Datos continuos

Datos discretos

t de Student Wilcoxon

Fisher Binomial negativa

Niveles de metilación en las CGIs

H1 IMR90

U T N I M

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1


H1 0 0 1 13 41

IMR90 48 1 0 4 3

Datos continuos

Datos discretos

t de Student Wilcoxon

Fisher Binomial negativa

Comparación de métodos estadísticos


Diferencias de metilación entre

tejidos

Falsos positivos

Discretos Continuos Combinados




tejidos

Discretos Continuos Combinados

UM

UI IM




tejidos

Binomial Negativa +

Fisher

Clasificación de CGIs


Clases de CGIs en función de su metilación en múltiples tejidos

• Células madre (H1 y H9) • Células mononucleares sanguíneas • Células B • Células CD133 + • Células madre hematopoyéticas • Fibroblastos (pulmón y prepucio) • Córtex pre-frontal • Células epiteliales mamarias • Espermatozoides

UIs: en todos los tejidos U o T MIs: en todos los tejidos M o N DMIs: diferencias estadísticas en un par de tejidos NA: resto

Clasificación de CGIs


Tipos de DMIs

DMIs-M (mayoritariamente

metiladas)

DMIs-U (mayoritariamente no

metiladas)

Distribución en regiones genómicas


Enriquecimiento en elementos

génicos

Aleatorización valores p ≤ 0.01

𝑬𝒏𝒓𝒊𝒒𝒖𝒆𝒄𝒊𝒎𝒊𝒆𝒏𝒕𝒐 (𝒓) = 𝑭𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏 𝒅𝒆 𝑪𝑮𝑰𝒔 𝒅𝒆𝒏𝒕𝒓𝒐 𝒅𝒆𝒍 𝒆𝒍𝒆𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐

𝑭𝒓𝒂𝒄𝒄𝒊ó𝒏 𝒅𝒆 𝑪𝑮𝑰𝒔 𝒇𝒖𝒆𝒓𝒂 𝒅𝒆𝒍 𝒆𝒍𝒆𝒎𝒆𝒏𝒕𝒐

r>1 enriquecimiento r<1 empobrecimiento




génicos

Mayor enriquecimiento de UIs y DMIs-U en promotores





génicos

Elevado enriquecimiento de todas las clases en exones




Enriquecimiento en regiones de interacción de proteínas con el ADN

UIs y DMIs-U enriquecidas en zonas de interacción con el ADN


TFBSs DHSs Potenciadores Aisladores



Enriquecimiento en elementos conservados y

SNPs

CGIs enriquecidas en regiones conservadas




Enriquecimiento en elementos conservados y

SNPs

CGIs enriquecidas en SNPs asociados a

enfermedades


Análisis funcional (términos de ontologías)


FUNCIONES ASOCIADAS A LOS TIPOS DE CGIs

• UIs Funciones básicas celulares (genes domésticos)

• DMIs-U Procesos de desarrollo y diferenciación

• DMIs-M Procesos involucrados en la reproducción

• MIs Actividad de receptores olfativos

CONCLUSIONES

1. En esta Tesis Doctoral se ha desarrollado un procedimiento para identificar regiones genómicas diferencialmente metiladas, que puedan servir como marcadores epigenéticos. Esto ha supuesto el desarrollo y la implementación de: 1) dos herramientas bioinformáticas para la obtención de metilomas de alta calidad en genoma completo; 2) una base de datos para el almacenamiento, visualización y gestión de los metilomas generados; 3) un algoritmo capaz de identificar islas CpG estadísticamente significativas; y 4) un método estadístico fiable para la identificación de islas diferencialmente metiladas, a partir del análisis comparado de múltiples metilomas.

2. NGSmethPipe, el primer programa desarrollado en esta Tesis, permite pre-procesar y alinear las lecturas cortas procedentes de protocolos de secuenciación masiva de ADN tratado con bisulfito. Los controles de calidad implementados consiguen una alta proporción de lecturas correctamente alineadas, sin aumentar en exceso los alineamientos erróneos. Esto, unido a la paralelización de todo el proceso, convierten a NGSmethPipe en una herramienta eficaz para alinear este tipo de librerías.

CONCLUSIONES

3. Por su parte, MethylExtract permite inferir simultáneamente los niveles de metilación y las variantes de un solo nucleótido a partir de una misma librería. Asimismo, este programa implementa estrictos controles para minimizar los errores de secuenciación y los fallos del tratamiento con bisulfito. Esto lo convierte en una herramienta fiable y versátil para la obtención de metilomas de alta resolución en genoma completo.

4. NGSmethDB es una base de datos relacional de metilomas completos, todos ellos procesados mediante el mismo protocolo, lo que permite comparar metilomas procedentes de diferentes estudios. Las herramientas de minería de datos implementadas y el navegador genómico de última generación que incorpora, han sido diseñados para realizar consultas complejas sobre múltiples tejidos en cualquier región del genoma. Actualmente, la base de datos contiene información para 6 especies y 114 tejidos y/o condiciones diferentes, lo que ha supuesto procesar aproximadamente 40 terabytes de librerías de secuenciación masiva. Estas características convierten a NGSmethDB en una herramienta muy potente para el análisis de metilomas de alta resolución.

CONCLUSIONES

5. Sobre la base de CpGcluster, se ha desarrollado WordCluster, un nuevo algoritmo capaz de identificar islas CpG estadísticamente significativas y con una alta densidad de CpGs. WordCluster presenta importantes ventajas con respecto a los métodos convencionales, destacando entre ellas la delimitación de dominios de metilación más cortos pero también más homogéneos, así como una asociación más específica con elementos reguladores y regiones evolutivamente conservadas del genoma.

6. El análisis de la metilación en las islas predichas por WordCluster ha permitido establecer que la combinación de la prueba exacta de Fisher y la binomial negativa es el método estadístico más apropiado para identificar islas diferencialmente metiladas.

CONCLUSIONES

7. Atendiendo al estado de metilación de los tejidos analizados, el 66% de las islas diferencialmente metiladas pueden ser de dos tipos: las que están generalmente metiladas pero aparecen no-metiladas en algún tejido (islas DMI-M), y aquellas que permanecen generalmente no-metiladas pero pueden metilarse en algún tejido (islas DMI-U).

8. El análisis funcional mediante el enriquecimiento en términos de ontologías ha permitido establecer que las islas de tipo DMI-M se asocian con funciones tejido-específicas, mientras que las islas de tipo DMI-U están implicadas en procesos de desarrollo y diferenciación.

CONCLUSIONES

9. Los estudios de enriquecimiento de las islas diferencialmente metiladas en distintos elementos genómicos han revelado importantes diferencias con respecto a las regiones diferencialmente metiladas, identificadas recientemente por otros autores. Entre estas diferencias destacan el elevado enriquecimiento de las islas diferencialmente metiladas en promotores y exones y su empobrecimiento en intrones, así como la significativa menor proporción de las islas de tipo DMI-M asociadas con sitios de unión a factores de transcripción. A su vez, es de destacar que las islas de tipo DMI-U solapan en mucho mayor grado con los sitios de unión a factores de transcripción que las islas de tipo DMI-M.

10.Las importantes características biológicas encontradas en las islas diferencialmente metiladas sugieren que WordCluster puede ser el algoritmo adecuado para preseleccionar las regiones a analizar en futuros estudios de metilación diferencial.

MUCHAS GRACIAS

Grupo de Genómica Computacional & Bioinformática

José L. Oliver Michael Hackenberg

Ángel Martín Alganza Ricardo Lebrón Francisco Dios Cristina Gómez

Ernesto Aparicio

Antonio Rueda (Plataforma Andaluza de Genómica y Bioinformática)

Stefanie Geisen Maarten Hamberg

(Saarland University)

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