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72º Congreso Argentino de Bioquímica
Simposio Medición de Hormonas Libres:
Lo que no podemos dejar de saber
Hipótesis de Hormona Libre
• La hormona libre es la que está disponible para los tejidos y puede inducir efectos metabólicos y experimentar degradación
• La hormona fijada a proteínas hace las veces de un reservorio metabólicamente inerte
Transporte de Hormonas en la sangre
TBG
Transtiretina
Albumina
Libre
T4 Testosterona
Cortisol
Hombre Mujer
Validez de los procedimientos de medición. Requerimientos
• La capacidad de determinar correctamente las concentraciones de hormonas libres séricas
• La capacidad de proveer resultados de las mediciones que sean clínicamente útiles
Métodos para estimar Tiroxina Libre
• Diálisis de trazador
• Diálisis de equilibrio
• Indices de hormona libre
• Inmunoensayos de Un paso
• Inmunoensayos de Dos pasos
• Diálisis de equilibrio/ LC-MSMS
Métodos para estimar Testosterona Libre
• Diálisis de trazador
• Indices de cálculos
• Inmunoensayo de Un paso (Análogo)
• Métodos de cálculos de Testosterona libre
• Medición por Cromatografía Gaseosa/MSMS y cálculos
• Medición por LC/MSMS
Transporte de Testosterona
SHBG Albumina
SHBG
Hombre
Mujer
SHBG Albumina
SHBG
Testosterona Biodisponible
Transporte de Testosterona
Hombre
Mujer
Cálculo de Testosterona Libre y Biodisponible
• Fórmula de Vermeulen
• Fórmula de Sodergard
• Fórmula de Nanjee y Wheeler
• Fórmula de Ly y Handelsman
Testosterona total, SHBG, Albumina
Métodos utilizados para la medición de Cortisol Libre
Inmunoensayos:
No se encuentran disponibles para medir Cortisol libre
plasmático
Se puede resolver en diferentes matrices:
Cortisol Libre Urinario – Reacciones cruzadas
Cortisol salival - Sensibilidad
Equilibrio de Diálisis- LC/MSMS
Si todos los
individuos tuviesen
igual contenido de
proteínas
transportadoras, la
utilidad diagnóstica
de medir Hormonas
totales y Libres
sería la misma
TBG Elevada
Esteroides
Sexuales
Drogas
Enfermedad
Congénito
Afinidad:
Albúmina -FDH
TTR
NTI
Desnutr.
TBG Disminuida Albúmina/TTR
Embarazo
Estrógenos
• Embarazo
• Anticonceptivos orales
Andrógenos
Esteroides anabólicos
5 Fluorouracilo
Heroína/Metadona
Clofibrate
Acido Nicotínico
Perfenacina
Glucocorticoides
L- Asparaginasa
Enfermedad grave - NTI
Síndrome Nefrótico
Desnutrición
Acromegalia
Síndrome de Cushing
Hipertirodismo
Exceso Deficiencia
Hepatitis aguda/crónica
Insuficiencia suprarrenal
SIDA
Porfiria intermitente aguda
Hipotiroidismo
Bartelena, Horm Res 45: 142 -7, 1996
Aumento de Concentración de Proteína
Transportadora
Secuencia de eventos
Estado
basal
Ingreso
Hormona
Egreso
Hormona
Ingreso -
Egreso
[Hormona]
Total
[Hormona
Libre]
Conc.
Hormona
fijada
N N N N N 0
[Proteína
Transporta
dora]
(+) (-)
(-)
(+) (+)
(+) N N
Nuevo estado N N N N (+) (+)
Diseño de Inmunoensayos Inexactitud de medida
• Incorrecta calibración. Falta de estandarización en el proceso
• Dependencia de las concentraciones de proteínas, capacidades de unión y/o presencia de inhibidores o promotores de unión
Características Requeridas en los
Métodos de Inmunoensayos de
Hormonas Libres
Afinidad
Niveles de Hormona
Unida a proteínas
Fase Sólida
Equilibrio
Termodinámico
Efecto de
Drogas
Inexactitud de los
métodos de medida de
hormonas libres:
• Interacción de
componentes de reactivos
(análogos) con
componentes de la
muestra
• “Secuestro” de la hormona
de la muestra
• Combinación de los 2
procesos
C45-A Guideline, CLSI 2012
Anticuerpo
T4 Análogo de T4
Albumina Transtiretina TBG
Distribución “ideal” de análogo marcado entre proteínas séricas
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
TBG Transtiretina Albumina
Ekins R, Endocr Rev 1990
T 4 Análogo
Anticuerpo
T4 Análogo de T4
Albumina Transtiretina TBG
Componentes
de Reactivo
(Albumina) Secuestro
con
componentes
normales
Interferente
Inexactitud de los
métodos de medida de
hormonas libres:
• Interacción de
componentes de reactivos
(análogos) con
componentes de la
muestra
• “Secuestro” de la hormona
de la muestra
• Combinación de los 2
procesos
C45-A Guideline, CLSI 2012
Chrostpfides ND, The immunoassay handbook, 4th ed. Oxford, 2013
Efecto de secuestro del anticuerpo anti analito
Efecto de la Dilución sobre la capacidad de
unión y resultados de T4L
0
20
40
60
80
100
120
6,25 12,5 25 50 100
T4 L
(p
mo
l/l)
Med
ida
T4 L (pmol/l) Esperada
C45-A Guideline, CLSI 2012
0
5
10
15
20
25
30
35
40
2 3 4 5
0
5
10
15
20
25
30
2 3 4 5
Amino N, Clin Chem 1983;29/2:321-325
Efecto de la adición de Albumina sobre resultados de T4 L
pm
ol/
l
pm
ol/
l
g/dl g/dl
Cambios en diferentes métodos de medición
de T4L en función de T4 unida a Proteínas
0
1
2
3
4
5
6
7
10 20 50 100 200 0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
10 20 50 100 150 200
T4 unida a Proteínas
Nelson J, J Clin Endocrinol Metab 1994; 79:76-9
ng
/dl ng
/dl
Cambios en T4 Libre en función de proteínas
séricas
0
5
10
15
20
25
30
35
40
25 50 100 200
0
5
10
15
20
25
30
35
40
25 50 100 200
Flitz K, Clin Chem 2007,53;5:911-915
Porcentaje de Proteína sérica nativa
T4 L
(p
mo
l/l)
T4 T
(n
mo
l/l)
0
50
100
150
200
250
300
350
0
10
20
30
40
50
60
0
10
20
30
100 90 80 70 60 50 40 30 20
Testosterona Total
Fritz K, Clin Chem 2008, 54; 3: 512-516
Efecto de Hormona unida a Proteínas en la Medición de
Testosterona Libre
Diálisis
Testosterona Libre Análogo
pm
ol/
l p
mo
l/l
nm
ol/
l
Variabilidad de Testosterona Libre por diferentes métodos
Sartorius G, Annals of Clin Biochem 2009; 46:137-43
Métodos de Medición con Separación física
Métodos de Medición con Separación física
Etapas:
1.- Separación
física de la
hormona libre de
la unida a
proteínas (Diálisis
de Equilibrio)
2.- Medición de
hormona libre por
LC/MSMS
Métodos de Medición con Separación física
Etapas:
1.- Separación
física de la
hormona libre de
la unida a
proteínas (Diálisis
de Equilibrio)
2.- Medición de
hormona libre por
LC/MSMS
1.- Control de pH
2.- Temperatura
3.- Características
de membrana,
tamaño de poros
4.- Dilución
5.- Buffer de
diálisis
Interferencia Analítica (IFCC)
Error sistemático de la medición, causado
por un componente de la muestra, que
por sí mismo no produce una señal en el
sistema de medición
• Reacción cruzada
• Autoanticuerpos
• Anticuerpos Heterófilos/HAMA
• Factor Reumatoideo
Interferencias en los Inmunoensayos
Limitaciones e Interferencias en las Mediciones
Hormonas Tiroideas Totales y Libres**
• Anticuerpos Anti Hormonas
Deprés N, Clin Chem 1998;44:440-454
• Anticuerpos Anti reactivos (Anti Rhutenio)
Ohba K, Endocr. J. 2012;59(8): 663-7
• Aumento de Afinidad de Albumina
Ruiz M, N Engl J Med 1982;306:635-639
• Aumento de Afinidad de Transtiretina
Scrimshaw B, Thyroid 1992;2:21-26
** Dependiente de métodos
¿Cuándo sospechamos Interferencia ?
• Cuando existe discordancia entre resultados
de Laboratorio
• Cuando existe discordancia entre resultados y
datos clínicos de los pacientes
Estandarización y Armonización de pruebas tiroideas
• En el año 2005 la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC) creó el Grupo de Trabajo para la Estandarización de las pruebas de la función tiroidea (WG-STFT)
Misión: Documentar el estado de la estandarización y la calidad intrínseca de los inmunoensayos actuales de hormonas tiroideas, focalizándose en T4L y TSH • En el año 2012 se transformó en un Comité C STFT,
desarrollando sistemas de medición de referencia para la estandarización de T4L y armonización de TSH
Estandarización de Resultados de
T4L
Antes de la re calibración Después de la re calibración
Antes de la re
calibración
Después de la re
calibración
Thienpont L, Clin Chem 2010;56:912-920
Monitoreo de estabilidad analítica a través de
medianas móviles Poblacionales de T4L
Estandarización de la medición de Testosterona total. Programa de CDC
Objetivo: Mejorar el diagnóstico, tratamiento y la prevención de
enfermedades y desordenes a través de la estandarización de
las mediciones de Testosterona total.
Procedimiento de medida: ID-HPLC/MSMS trazable a método
de mayor jerarquía GC-LC/MSMS (Procedimiento de medida
de referencia)
Material: muestras de suero frescas
Rango: 0.25 – 10 ng/ml - Bias promedio: ± 6,4 %
Porqué es importante
Estandarizar/Armonizar métodos
• Seguridad del paciente
• Guías Clínicas. Uso de puntos de corte únicos
• Confianza del paciente
• Registros electrónicos de resultados unificados
Conclusión
• Existen diferentes estrategias metodológícas para estimar y
medir las concentraciones de hormonas libres circulantes en
el laboratorio clínico
• El conocimiento de los fundamentos involucrados en los
métodos es requerido para poder conocer las limitationes
técnicas potenciales que presentan y considerar estrategias
alternativas ante resultados que dificultan el diagnóstico e
interpretación clínicas
• La estandarización de las metodologías impactará en el
mejor cuidado y seguimiento de los pacientes
Muchas Gracias por su Atención