Dr. Juan María Torres Trillo Laboratorio de Biología Molecular y Celular de Priones. Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA).

Valdeolmos (Madrid)

Ratones transgénicos como modelo de estudio de los priones

Encefalopatías espongiformes

Enfermedades neurológicas con tiempos de incubación muy largos

Clínica

Alteraciones neurologicas

disfunción motora (ataxia)

demencia

Anatomía patológica

Etiología

Infecciosa

Genética

Esporádica

Enfermedades de los priones

Gliosis Vacuolization Tejido encefalico Depositos PrP

H & E GFAP PrPSc

Encefalopatías espongiformes de mamíferos

Enfermedad

Kuru

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD)

iatrogénica

esporádica

familiar

Enfermedad de Gertsmann.Sträussler-

Scheinker (GSS)

Insomnio familiar fatal (FFI)

Angiopatía amiloide cerebral (CAA)

Nueva variante de la enfermedad de

Creutzfeldt-Jakob (vCJD)

Scrapie

Encefalopatía transmisible del visón(TME)

Encefalopatía espongiforme bovina (BSE)

Enfermedad de desgaste crónico (CWD)

Encefalopatia espongiforme felina(FSE)

Encefalopatía espongiforme

de ungulados exóticos (EUE)

Huésped natural

Hombre

Hombre

Hombre

Hombre

Hombre

Hombre

Oveja, Cabra

Visón

Vaca

Reno, Alce

Gato doméstico

Felinos superiores

Nyala, Kudu mayor

Etiología

Infección

Infección

Esporadica

Mutación en PrP

Mutación en PrP

Mutación en PrP

Mutación en PrP

Infección

Infección

Infección

Infección

Infección

Infección

Infección

Infección

Prnp: estructura génica

ORF

E1 E2 E3

762 nt

20 kb

2 kb

Sialoglicoproteína

254 aa

27,921 (Pm)

9,4 (pI)

(ratón)

hamster

hombre

ratón

•Alta identidad entre especies

•Expresión ubicua

209 aa 22 23

producto de traducción primario

octarepeticiones

péptido señal señal C-terminal

181 197 231

209 aa

CHO CHO

GPI

PrPC madura (33-35)

maduración

Biosíntesis de PrPC y PrPSc

Source: Weissman et al. Int J. Exp. Path (1996) 77, 283-293

PrPSc (33-35)

209 aa

CHO CHO

GPI

transformación

PrPSc

PrPC

21

30

PrPSc PrPC - + - + PK

transformación

proteasa

proteasa

PrPSc (33-35)

220 aa

Insoluble

150 aa

PrPSc (27-30)

PrPC (33-35)

220 aa

octarepeticiones

Soluble

CARACTERISTICAS BIOQUÍMICAS ISOFORMAS PrPC y PrPSc

•Partial PK resistance (PrPres/ PrP27-30) •Insoluble in non-ionic detergents •resistance to heat and chemicals •tendency to form aggregates •High environmental resistance

PrPC PrPSc

PrPC PrPSc

muy lento rápido rápido

Models for PrPC to PrPSc transformation

Fuente: Weissman et al. Int J. Exp. Path (1996) 77, 283-293

??

Denaturalizatión-renaturalización model

Modelo de polimerización nucleada

Prion transmission -Prion species barrier concept

Mouse prion Hamster prion

Disease/dead

140/150 days

(100%)

Disease/dead

370/400 days

(60%)

Disease/dead

140/150 days

(100%)

Disease/dead

140/150 days

(100%)

Bovine prion

No disease

>700 days

(0%)

Disease/dead

200/250 days

(100%)

Supposed Species

prion

No disease

>700 days

(0%)

No disease

>700 days

(0%)

Infección en un hospedador homólogo

Inoculación

Acumulación

y muerte

Tiempo de incubación corto

Infección en un hospedador heterólogo

Inoculación

Acumulación y

muerte

La PrPSc resultante:

•es de la especie de animal receptor.

•mantiene algunas característica de

origen.

Tiempo de incubación largo

Mo-PrPC gen

H-PrPC gen

H-PrPC

H-PrPSc

H-PrPC gen

H-PrPC

H-PrPSc

Mo-PrPC gen

Bo-PrPC gen

Bo-PrPC

Bo-PrPSc

Bo-PrPC

gen

Bo-PrPC Bo-PrPSc

Ratones transgénicos como modelo para el estudio de las EETs

PK- PK+

E1 E2 E3

ORF

E2 E1

ORF

E3

Microinjection of one-cell embryos

from females PrP-/- null mice

Genration of transgenic mice expressing PrPC from other species

PrP allele Mouse line name Level expression

Bovine-wt BoPrP-Tg110 8 (+/+)

Bovine-5 OR 5OR-BoPrP-Tg008 1 (+/+)

Bovine-7 OR 7OR-BoPrP-Tg007 4 (+/+)

Bovine-10 OR 10OR-BoPrP-Tg012 0.5 (+/-)

Bovine-113L 113L-BoPrP-Tg037 1 (+/-)

Goat-wt wt-GoPrP-Tg501 2 (+/+)

wt-GoPrP-Tg500 1 (+/-)

Goat-222K 222K-GoPrP-Tg516 1.5 (+/-)

Goat-222K 222K-GoPrP-Tg515 2 (+/+)

Goat-142M 142M-GoPrP-Tg541 1 (+/-)

Goat-154H 154H-GoPrP-Tg563 0.25 (+/-)

Goat-211Q 211Q-GoPrP-Tg580 0.5 (+/-)

Porcine-wt PoPrP-Tg001 4 (+/+)

Vole-wt volePrP-Tg407 1 (+/+)

Human-M129 M129-HuPrP-Tg340 4 (+/+)

Human-V129 V129-HuPrP-Tg361 4 (+/+)

Human-V129 V129-HuPrP-Tg362 8 (+/+)

Human-117V 117V-HuPrP-Tg301 2 (+/-)

Human-178N 178N-HuPrP-Tg333 2 (+/-)

Human-200K 200K-HuPrP-Tg313 2 (+/-)

•Bioensayos de alta sensibilidad para la detección de priones: •Detección de priones en productos y procesos (fármacos, vacunas, hemoderivados, etc.).

•Determinación de la infectividad en diferentes órganos y tejidos de animales infectados.

•Dispersión de la infectividad en órganos periféricos (BSE vs Scrapie; CJD vs vCJD).

•Evaluación de estrategias terapéuticas contra EETs. •Implantación de células madre modificadas genéticamente

•Estudio de los procesos moleculares implicados en la replicación y

en la patogénesis de los priones. •Mutaciones en la PrP responsables de las EETs genéticas

•Mutaciones puntuales en la PrP aumenta la susceptibilidad a la infección con priones

exógenos.

•Mecanismo/s de inducción de la patología.

•Estudio de la transmisión y la barrera de transmisión de los

priones. •Evaluación de la capacidad de transmisión de las diferentes cepas de priones en otras especies y

en particular al hombre.

•Determinación de los elementos moleculares que determinan la barrera de especie y la

“virulencia” de las distintas cepas de priones.

Ratones transgénicos como modelo para el estudio de las EETs

Genetic spongiform encephalopathy Polymorphism and pathogenic mutation.

INSERCIONES

Y

DELECIONES

P102L

A117V D178N

E200K

F198S

M129V

GSS

S S CHO CHO Repeticiones

octapéptido

(184) (200)

ATG

0,7 Kb

GPI

STOP

FFI CJD

Mutaciones puntuales aumentan la susceptibilidad a la enfermedad

espontanea.

Desarrollo de modelos de EET expontanea

Mutación

Hipótesis de trabajo: Mutaciones puntuales

en la PrPC bovina pueden aumentar la

susceptibilidad a la transformación

expontanea de la PrPC en PrPSc

Acumulación y

muerte

Objetivo:

1. Estudiar los elementos moleculares

implicados en la patogenesis.

Transgenic mouse Expression

levels*

Survival

time

bo6ORTg 8 x >650

bo10ORTg029+/+ 0.5 x >650

bo10ORTg012+/+ 1 x 500

bo10ORTg006+/- 4 x 180

* Refered to bovine brain equivalent.

Transgenic mice expressing 10OR-PrP develops a spontaneous but not

transmissible disease

Mice showed motor

impairment with

ataxia mainly affecting

the hind limbs and

also had breeding

difficulties

Wt-6OR-PrP-Tg

10OR-PrP-Tg

Transgenic mice expressing bo113L-PrP develops a spontaneous

disease which is transmissible

113L

113P

BoPrPTg-110

113LBoPrPTg-037

Transgenic mouse line Transgene expressiona Onset clinical signs

(days ± SEM)

Death

(days ± SEM)

113LBoPrPTg-037+/- 3x 272±33 345±49

113LBoPrPTg-037+/+ 6x 187±18 223±47

BoPrPTg-110+/-(b) 4x 562±38 631±52

BoPrPTg-110+/+(b) 8x 581±41 667±39

Non-Tg (prnp-/-) 0x 614±26 656±30

Table 2. Onset of clinical signs and survival times for transgenic mice expressing different levels of the mutant

113LBoPrP or wild type BoPrP

A B C D

E F G H

S P

BoPrP-Tg110 113LBoPrP-Tg037

S P

PK - - + - - +

19.3

27.1

35.8

Infectivity of 113LBoPrP-Tg037 mice brain homogenates in BoPrP-Tg110

Transgenic mice expressing bo113L-PrP develops a spontaneous disease

which is transmissible

Inocula Mean survival time in days ± sem (n/n0)

a

1st passage 2nd passage 3rd passage

113LBoPrP-Tg037b

(179 days old) 330 (1/5) 272±38 (6/6) 252±23(6/6)

113LBoPrP-Tg037-poolc

(150-250 days old) 322, 406 (2/6) 291±23 (6/6) 255±14 (7/7)

wtBoPrP-Tg110-pool

(500-600 days old) >650 (0/12) >650 (0/12) na

Normal mouse brain

(500-600 days old) >650 (0/12) >650 (0/12) na

Classical BSE-Cd

(VLAPG817/00) 295 ± 12 (6/6) 265± 35 (6/6) na

Atypical BSE-He

(CASO 03-2095) 292 ± 5 (6/6) 296 ± 7 (6/6) na

Atypical BSE-Lf

(02.2528) 207 ± 7 (6/6) 199 ± 1 (6/6) na

113L-BSE

P3 P2 P1 BS

E-C

(P

1)

BS

E-L

(P

1)

BS

E-H

(P

1)

9A2 mAb

12B2 mAb

Saf84 mAb

R145 mAb

20

29

20

29

20

29

20

29

MW

A B C D

Fig

ure

8

E

Torres et al., 2012 (submited).

Conclusions

• A single amino acid change in the bovine PrP is sufficient to induce the spontaneous

generation of an infectious prion disease supporting the hypothesis of a spontaneous/genetic

origin for the epidemic BSE agent.

• These observations support the view that a variety of prion strains might spontaneously

emerge in host displaying random genetic PrP mutations.

• All these consideration allow us hypothesizing that the BSE epidemic could have begun

by a random genetic mutation able to generate de novo infectious prions which were included

in meat and bone meal fed to cattle and then broadly expanded in cattle population. If that is

the case then there are implications for the beef industry. Concentrating on keeping out

infected cows should not be the only strategy since spontaneous/genetic cases of BSE will

appear. The important point is to prevent the multiplication via cattle cannibalism of those

spontaneous cases that occur.

Toxica Aggregate (+)

PKres (+/-)

Transmissible (-)

PrPSc Aggregate (+++)

PKres (+++)

Transmissible (+++)

Conclusions

Bo-PrPC

113LBo-PrPC

10OR-PrPC

Toxica Aggregate (+)

PKres (+/-)

Transmissible (+)

No Toxica Aggregate (-)

PKres (-)

Transmissible (-)

Otros modelos de encefalopatías genéticas

A117V D178N

E200K

GSS

CJD

FFI

S S CHO CHO Repeticiones

octapéptido

Péptido

señal

(184) (200)

Hu-PRP ATG

Anclaje

GPI

STOP

Modelo Transgén

Línea

Niveles

Expresión

Edad de

aparición de

signos

CONTROL Wild type Hu-PrP 340 4x >600

CJD E200K (CJD) 313 2x 310-360

FFI D178N (FFI) 331 2x 290-330

GSS A117V (GSS) 307 2x 280-340

•Bioensayos de alta sensibilidad para la detección de priones: •Detección de priones en productos y procesos (fármacos, vacunas, hemoderivados, etc.).

•Determinación de la infectividad en diferentes órganos y tejidos de animales infectados.

•Dispersión de la infectividad en órganos periféricos (BSE vs Scrapie; CJD vs vCJD).

•Evaluación de estrategias terapéuticas contra EETs. •Implantación de células madre modificadas genéticamente

•Estudio de los procesos moleculares implicados en la replicación y

en la patogénesis de los priones. •Mutaciones en la PrP responsables de las EETs genéticas

•Mutaciones puntuales en la PrP aumenta la susceptibilidad a la infección con priones

exógenos.

•Mecanismo/s de inducción de la patología.

•Estudio de la transmisión y la barrera de transmisión de los

priones. •Evaluación de la capacidad de transmisión de las diferentes cepas de priones en otras especies y

en particular al hombre.

•Determinación de los elementos moleculares que determinan la barrera de especie y la

“virulencia” de las distintas cepas de priones.

Ratones transgénicos como modelo para el estudio de las EETs

• Infección: Ingestión mucosa intestinal placas de Peyer

sistema linfoide

SNC SNP

• Alteraciones histopatológicas

Transmisión de los priones

Prion strain concept

Tiempos de supervivencia

En una misma especie se pueden encontrar cepas de priones con características biológicas,

histopatológicas y bioquímicas diferenciales que se mantienen a lo largo de los pases.

190 dpi 190 dpi

310 dpi 310 dpi

Histopatología Bioquímica

distinct phenotypes: -incubation times -clinical signs -histopathological lesion profiles -PrPSc deposition patterns -biochemical characteristics: glycoprofile PrPres size PK resistance stability to denaturing agents

30

20

MW

Sheep-Scrapie

strains

Human-CJD

types

Cattle-BSE

types

Survival time Histopathology Biochemical properties

TgOv

190 dpi

TgOv

190 dpi

A

B TgOv

350 dpi

TgOv

350 dpi

Isolate

PrP transgenic mice for strain typing

30

20

MW

Biochemical characteristics: PrPres electrophoretic mobility, PrPres glycoprofile,

PrPSc PK sensitivity profile.

Histopathological characteristics: lesion profile and PrPres distribution pattern.

Biological properties: Survival time, clinical signs

�

Conclusions: •A important diversity of Scrapie

strain can be identified in sheep.

•This diversity is not associated

neither to genotype nor to PrPres

type present in the original isolate.

•The cross-species transmission of

the scrapie isolates tested can lead to

different outcomes which may vary

according to the strain involved. The

passaging of prions into foreign

species can lead to either

conservation of strain phenotype or

emergence of a variant strain with

unprecedented properties.

Strains diversity in sheep scrapie as analized in tg mice

Evolution of Scrapie strains in a bovine PrP background. (Scrapie as origin of epidemic BSE?)

30

20

MW

Ps21 (Atypical Sc) Ps48 (Clasical Sc)

A B

Conclusions: •Scrapie isolates propagated in

tgBov show phenotypic features

different to BSE.

BS

E L

/tg

Ov

BS

E /

tgO

v

tgBov mice

30-

20-

BSE L BSE

L-type BSE (BSE-L) as origin of epidemic BSE

Conclusions: •Ovine BSE recover its atypical

phenotypic features when

propagated in a bovine PrP

background.

BSE

1 2 3 4 5 6 7

BSE-H (07-644 )

in Tg110 mice BSE-C

BSE-H

(07-644)

20

29

A

BSE-H

(07-644)

BSE-H

(03-440)

BSE-H

(03-2095)

BSE-H

(02-2695)

BSE-H

(45)

292±12

6/6

H-type PrPres

6/6

C-like PrPres

6/6

H-type PrPres

292±5

9/12

H-type PrPres

330±14

3/12

C-like PrPres

322±21

8/10

H-type PrPres

307±9

2/10

C-like PrPres

278±12

280±8

7/7

H-type PrPres 7/7

C-like PrPres

278±6 284±6

6/6

H-type PrPres

346±6

6/6

H-type PrPres

274±3

296±7 302±8 298±10

6/6

H-type PrPres

6/6

H-type PrPres

6/6

H-type PrPres

Classical

BSE-C*

100%

C-type PrPres

303±10

100%

C-type PrPres

290±19

H-type BSE (BSE-H) as origin of epidemic BSE

BSE-H (02-2695)

in Tg110 mice BSE-C

BSE-H

(02-2695)

1 2 3 4 5 6

20

29

B

1 2 3 4 5 6 7

BSE-H (07-644 )

in Tg110 mice BSE-C

BSE-H

(07-644)

20

29

A BSE-H (02-2695)

in Tg110 mice BSE-C

BSE-H

(02-2695)

1 2 3 4 5 6

20

29

B

BSEH

(H-type PrPres)

BSEH

(C-type PrPres) Epidemic BSE

H-type BSE (BSE-H) as origin of epidemic BSE

Conclusions: •These findings emphasize the potential capacity of prion diversification during propagation, even in the

absence of species barrier, and represent the first experimental demonstration of the capability of an

atypical, presumably sporadic, bovine prion to acquire epidemic BSE-like properties during propagation in

a homologous bovine PrP context.

•Our observations are consistent with the view that the epidemic BSE agent could have originated from an

endogenous cattle prion.

FACTORES IMPLICADOS EN LA TRANSMISION

DE LOS PRIONES

•Magnitud del inóculo

•Ruta de inoculación

•Factores genéticos

•La susceptibilidad está modulada por el

polimorfismos en el gen PrP.

•Otros factores geneticos???

•Barrera de especie

•Barrera de cepa

especies barrier/strain barrier

Susceptibilidad/Resistencia genética a scrapie

Proteina PrP

CHO CHO

GPI 136 154 171

A R Q

V H R

3’ 5

PrP ORF

PrP genetic risk groups in goats and their in vivo and in vitro modelling

PrP allele Founder

code

Mouse line name Level expression

hemizygosis homozygosis

WT J201 wt-GoPrP-Tg501 1x 2x

J200 wt-GoPrP-Tg500 1x

222K J5 222K-GoPrP-Tg515 1x 2x

142M J401 142M-GoPrP-Tg541 1x

154H J603 154H-GoPrP-Tg563 0.25x

211Q J800 211Q-GoPrP-Tg580 0.5x

Table 2. Selected transgenic mouse lines expressing several Goat-PrP alleles

Subtask 1.3.2. Challenges to test the susceptibility of goat-PrP

transgenic mice to prion infection

Group I : Cattle BSE isolate (as used in WP2, source INRA (P2))

Group II : Goat-passaged BSE isolates from WP2.

Group III: Goat-passaged BSE isolates from a previous IAH (P3) study

Grupo IV: Goat Scrapie Isolates (as used in WP2 (P2))

Group V: Atypical goat scrapie isolate (supplied by (P8 or P9)

Group VI: Goat Scrapie isolate from an outbreak where the allele carrying K at codon 222 seems to confers resistance to scrapie

Groups of isolates:

Cattle-BSE 0 BSE0/Goat

CH0064 BSE/Goat IAH Goat-Sc F10 Goat-Sc S2

Goat-Sc I15§

(atypical)

Group I Group II Group III Group IV Group IV Group V

TgGo 501 wt

(+/+, 2x) 357±9 100% 346±16 100% 328±3 100% 238±10* 100% 228±15 100% >585

TgGo 500 wt

(+/-, 1x) 583±57 100% 497±31 100% 484±34 100% 465±19 100% 449±62 100% >650

TgGo 516 (222K)

(+/-, 1x) >650 0% 519±42 100% 478±31 100% >650 0% >650 0% >650

TgGo 541 (142M)

(+/-, 1x) 535±26*100% 521±46 100% 537±65 100% 515±16 100% 560±50* 100% >585

Tg Go 563 (154H)

(+/-, 0.25x) >650 0% >650 0% 582 1/6 >650 0% >650 0% >650

Tg Go 580 211Q

(+/-, 0.5x) >560 >650 0% >560 >470 >650 0% >470

Table 2. Challenges to test the susceptibility of goat-PrP transgenic mice to prion infection. *Some mice still alive

Human polymorphism and prion susceptibility

INSERCIONES

Y

DELECIONES M129V

S S CHO CHO Repeticiones

octapéptido

(184) (200)

ATG

0,7 Kb

GPI

STOP

Isolates Mean survival time in days ± sem (n/n0)

a

M129-HuPrP-Tg340 mice V129-HuPrP-Tg650 mice

vCJD 595 ±82 (6/6) >700 (0/7)

Ca-BSE 739 (1/6) >700 (0/7)

Sh-BSE0 615 ± 84 (6/6) >700 (0/7)

Go-BSE1 695 ± 22 (6/6) >700 (0/7)

sCJD (type I) 198±8 (6/6) 276 ±22 (6/6)

FACTORES IMPLICADOS EN LA TRANSMISION

DE LOS PRIONES

•Magnitud del inóculo

•Ruta de inoculación

•Factores genéticos

•La susceptibilidad está modulada por el

polimorfismos en el gen PrP…..

•Otros factores geneticos???

•Barrera de especie

•Barrera de cepa

especies barrier/strain barrier…

Limitaciones fundamentales en el control de las EETs

•Tiempos de incubación de la enfermedad muy largos (meses o años)

•Ausencia de un método de diagnostico eficaz durante la fase

subclínica.

•Baja sensibilidad de los métodos de detección de PrPRes comparada

con la elevada infectividad de los priones.

•Desconocimiento de la capacidad de transmisión de las diferentes

cepas de priones en otras especies y en particular al hombre.

•Desconocimiento de los elementos que determinan la barrera de

especie y la “virulencia” de las distintas cepas de priones.

Limitaciones fundamentales en el análisis de riesgos

Limitaciones en el conocimiento de la biología del agente

•Naturaleza del agente causal

•Mecanismo y dinámicas de replicación y de transmisión.

? �

Strain barrier vs. Species barrier

•Desconocimiento de la capacidad de transmisión de las diferentes cepas de priones en

otras especies y en particular al hombre.

•Desconocimiento de los elementos que determinan la barrera de especie y la “virulencia”

de las distintas cepas de priones.

Limitaciones fundamentales en el análisis de riesgos

Strain barrier vs. Species barrier

-La susceptibilidad de una especie a un prion procedente de otra especie depende de la

cepa inoculada.

-Distintas cepas de priones con idéntica secuencia (mismo origen) pueden mostrar

diferente capacidad de infección en un mismo hospedador.

�

Strain barrier vs. Species barrier

-La susceptibilidad de una especie a un prion procedente de otra especie depende de la cepa inoculada.

-Distintas cepas de priones con idéntica secuencia (mismo origen) pueden mostrar diferente capacidad de

infección en un mismo hospedador.

�

BSE-C

BSE-L

BSE-H

739 (1/6)

629±35 (6/6)

>700 (0/6)

Strain barrier vs. Species barrier

-La susceptibilidad de una especie a un prion procedente de otra especie depende de la cepa inoculada.

-Distintas cepas de priones con idéntica secuencia (mismo origen) pueden mostrar diferente capacidad de

infección en un mismo hospedador.

�

vCJD

sCJD-T1

sCJD-T2

284±13(6/6)

>700 (0/6)

>700 (0/6)

vC

JD

sCJD

-T1

sCJD

-T2

542±

42 (

6/6

)

>700 (

0/6

)

>700 (

0/6

)

Scrapie BSE

�

?

?

Others species

?

?

?

vCJD

sCJD

?

•Strains evolution

•Strains relations

•Transmission barrier

Scrapie BSE vCJD

?

?

Others species

? �

?

?

•Strains relations

•Transmission barrier

•Strains evolution

BSE agent evolution induced by trans-species passage: toward deciphering the Prion transmission barrier phenomenon

J.C. Espinosa1, O. Andréoletti2, M.E. Herva1, E. Alamillo1,

D. Padilla, C. Lacroux2, M. Groschup3 and J.M. Torres1

1 Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA), 28130 Valdeolmos, Madrid (Spain).

2 UMR INRA-ENVT 1225, Interactions Hôte Agent Pathogène, Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse, Toulouse, France

3 FLIINEID, Insel Riems, Germany.

Objectives and experimental designing

Characterisation of BSE prions after propagation in host expressing PrP from different

species

Ca-BSE

Sheep-BSE Porcine-BSE Murine-BSE

Pig-BSE

Sheep

Scrapie

Mouse

RML

Histopathological characteristics: lesion profile and PrPres distribution pattern.

Biological properties: Transmission in several mouse models

Biochemical characteristics: PrPres electrophoretic mobility, differential PrPres reactivity against

monoclonal antibody, PrPres glycoprofile, PrPSc PK sensitivity profile.

Molecular and patho-biological properties has been analysed in all the generated BSE-derived prion in

comparison to the original BSE prion as well as to other non related prion strain as control. These BSE-derived

prions will allow us to analyse those properties associated to the prion strain versus those depending on the PrP

amino acid sequence.

�

ARQ

Bovine-BSE Ovine-BSE

ARQ

�

Mouse-BSE

Objectives and experimental designing

Characterisation of BSE prions after propagation in host expressing PrP from different

species

Ca-BSE

Sheep-BSE Porcine-BSE Murine-BSE

Pig-BSE

Sheep

Scrapie

Mouse

RML

�

ARQ

Bovine-BSE Ovine-BSE

ARQ

�

Mouse-BSE

•El agente de la BSE retiene ciertas propiedades bioquímicas cuando pasa a otras especies.

•El único factor que modula las propiedades bioquímicas del agente de la BSE cuando se adapta a otra especie es la

secuencia de la PrP, no interviniendo otros factores genéticos del huésped, ni los niveles de expresión de la PrP.

20 20

30 30

20 20

30 30

MW

Sha31

12B2

MW

•El agente de la BSE retiene ciertas propiedades bioquímicas

cuando pasa a otras especies

12B2

SHEEP...WGQPHGGGGWGQGGSHSQWNKPSKP….

BOVINE..WGQPHGGGGWGQGGTHGQWNKPSKP….

12B2 Sha 31

Cattle-BSE - +

BSE-derived

Scrapie, RML + +

- +

20 20

30 30

20 20

30 30

MW

Sha31

12B2

MW

•El único factor que modula las propiedades bioquímicas del agente de la BSE cuando se adapta a otra especie es la

secuencia de la PrP, no interviniendo otros factores genéticos del huésped, ni los niveles de expresión de la PrP.

PK PK PK

220 aa

Sha31

Transmission in BoPrP-Tg110 mice of BSE-derived prions.

Ovine

Scrapie

Mouse

RML MuTg

BSE

Su

rviv

al

tim

e (

Da

ys

po

st-

ino

cu

lati

on

)

0

100

200

500

400

300

Cattle

BSE

100 %

100 %

100 %

OvTg

BSE

100 %

100 %

PoTg

BSE

100 %

100 %

1st passage

2nd passage

100 %

<7

0 %

>60

0 d

pi

65

%

>

60

0 d

pi

BoTg

BSE

100 %

100 %

•La barrera de transmisión está modulada por propiedades de la cepa de prion

(dependientes de conformación) mas que por las diferencias en la secuencia de la PrP.

Ca-BSE

Sheep-BSE Porcine-BSE Murine-BSE

Pig-BSE

Sheep

Scrapie

Mouse

RML

�

ARQ

Bovine-BSE Ovine-BSE

ARQ

�

Mouse-BSE

Mouse

BSE

100 %

Sheep

BSE

100 %

100 %

Pig

BSE

100 %

100 %

100 %

Lack of transmission barrier in BoPrP-Tg110

High transmission

barrier

Transmission in BoPrP-Tg110 mice of BSE-derived prions.

•Cuando BSE pasa por otras especies puede sufrir alteraciones persistentes de sus propiedades

biológicas. Estas alteraciones solo dependen de la secuencia de la PrP del huésped por el que ha

pasado y no de otros factores genéticos.

MuTg

BSE

Su

rviv

al

tim

e (

Da

ys

po

st-

ino

cu

lati

on

)

0

100

200

500

400

300

Cattle

BSE

100 %

100 %

100 %

OvTg

BSE

100 %

100 %

PoTg

BSE

100 %

100 %

1st passage

2nd passage

100 %

BoTg

BSE

100 %

100 %

Ca-BSE

Sheep-BSE Porcine-BSE Murine-BSE

Pig-BSE

�

ARQ

Bovine-BSE Ovine-BSE

�

Mouse-BSE

Mouse

BSE

100 %

Sheep

BSE

100 %

100 %

Pig

BSE

100 %

100 %

100 %

Figure 2. Comparison of electrophoretic profiles and antibody labeling of PrPres detected with Sha31 (A), 12B2 (B) and 9A2 (C) mAbs. Original

BSE5 inoculum (lane 1), BSE5 infected BoPrP-Tg110 mice (lane 2), BSE5 in BoPrP-Tg110 mice second passage (lane 3). BSE/Sheep (lane 4),

BSE/Sheep in BoPrP-Tg110 mice (lane 5), BSE/Sheep in BoPrP-Tg110 mice second passage (lane 6), scrapie field isolate SC-UCD-99 (lane7),

SC-UCD-99 in BoPrP-Tg110 mice (lane 8), SC-UCD-99 in BoPrP-Tg110 mice second passage (lane 9), scrapie field isolate Langlade (lane 10),

scrapie field isolate SC-N662-97 (lane 11). Panels A, B and C were loaded with the same quantities of extracted PrPres of each sample. MW,

molecular weight given in kilodaltons. D. Schematic representation of PrPres fragments yields according to mAbs reactivity. Arrows indicate

Proteinase K cleavage points as predicted by PeptideCuter program at EXPASY server (http://us.expasy.org/). Numbers reflect sheep PrP

sequence positions. Continue lines represent main PrPres fragments and discontinue lines PrPres fragments found as a minority

Las modificaciones biológicas observadas no se ven reflejadas ni en las

propiedades bioquímicas de su PrPres ni en la histopatológía producida en

ratones BoPrP-Tg110

Similar PrPres electrophoretic mobility

No significant differences in glycoprofiles

Slight or null reactivity with mAb 12B2

Catt

el-

BS

E

Hu

man

-BS

E

(vC

JD

)

20

30

kDa

20

30

M Bo

vin

e-B

SE

Mo

use

-BS

E

Po

rcin

e-B

SE

Sh

ee

p-B

SE

Ovin

e-B

SE

Sha31

12B2

Cerebelum Striatum

Brain stem Hippocampus

A unique and similar lesion profile

Similar PrPd distribution pattern

Inoculated BoPrP-Tg110 mice

• La barrera de transmisión está modulada por propiedades de la cepa de prion

(dependientes de conformación) mas que por las diferencias en la secuencia de la PrP.

•Cuando BSE pasa por otras especies puede sufrir alteraciones persistentes de sus

propiedades biológicas sin verse alteradas otras propiedades especificas de la cepa de

prion.

•Aunque el cambio radical de un prion cuando pasa una barrera de transmisión es un

fenómeno conocido, la posibilidad de una evolución biológica y la generación de

diversidad dentro de un “cluster” de cepas representa un nuevo concepto en el campo de

los priones.

Evolución de BSE en la transmission inter-especies

(Resumen)

•La EEB ovino infecta los ratones BoPrP-Tg110 con una mayor virulencia (reducidos tiempos de

incubación) que la EEB bovina original. Este incremento de virulencia es mantenido a lo largo de los

pases, lo que sugiere que este agente ha cambiado sus propiedades biológicas al pasar por la oveja.

BSE

303±10 (100%) 290±19 (100%)

560±26 (70%) 491±17 (65%)

>600 (100%)

289±15 (100%) SC-UCD-99

SC-LANGLADE

SC-N662-97

SCRAPIE

ARQ/ARQ

Transmission in BoPrP-Tg110 mice of sheep adapted BSE prions

291±20 (100%)

ARQ/ARQ

234±5 (100%) 234±3 (100%) 228±3 (100%)

El incremento de virulencia de la EEB ovina también es extensible a otras especies

Ca-BSE

>650 (0%)

>650 (0%)

475 9 (17%)

>650 (19%)

269 23 (100%)

198 4 (100%)

191 6 (100%)

197 4 (100%)

Transmission in PoPrP-Tg001 mice of several prion strain

BSE1

BSE1/boTg

BSE2

BSE0

Sh-BSE

458 11 (100%) 162 3 (100%)

�

�

�

�

30

20

30

20

MW MW

BSE

Sh-BSE

Transmission in HuPrP-Tga340 mice of sheep adapted BSE prions

SCRAPIE

ARQ/ARQ

El incremento de virulencia de la EEB ovina es también extensible a la especie humana

Sheep-BSE showed an increased virulence when compared to the

original cattle BSE isolate in human-PrP mouse suggesting an

alteration of BSE prions by the passage in sheep.

>700 (0%)

>700 (0%)

615±119 (100%) 564 ± 39 (5/5)

568 ± 65 (85%)

>700 (0%)

In progress

sCJD

vCJD

217±14 (100%) 180±30 (100%)

625±71 (100%) 595±82 (100%)

Isolates

Mean survival time in days ± sem (n/n0)a

HuPrP-Tg340 mice

Ca-BSE2 491 – 707 (0/9)

Ca-BSE2/TgBov 475 – 795 (0/5)

Ca-BSE2/TgOv 596 ± 92 (3/3)

Ca-BSE0 739 (1/6)

Ca-BSE0/TgBov 474 – 749 (0/4)

Sh-BSE0 615 ± 84 (6/6)

Sh-BSE0/TgBov 455 – 647 (0/6)

Sh-BSE0/TgOv 619 ± 47 (4/4)

Go-BSE1 695 ± 22 (7/7)

Go-BSE1/TgBovc 506 – 844 (0/8)

Ca-BSE

Sh-BSE

TgBov

TgBov

TgOv

TgBov

TgOv

Ca-BSE

Go-BSE

TgBov

The increased susceptibility of human PrP mice to Sheep is strongly related to the

ovine PrP primary sequence rather than to other host species-specific factors.

Scrapie/BSE/vCJD

(Hipótesis soportada por los modelos de ratón Tg)

BSE Sh-BSE

vCJD

?

BSE

C-Sc

vCJD

sCJD

?

Aty-Sc

BSE

BSE

BSE BSE-L

BSE-H

L H C