•Antígeno es una sustancia de alto peso molecular, con cierta rigidez estructural y que tiene la particularidad de ser parcialmente “metabolizado” por células especializadas llamadas macrófagos, por lo tanto es capaz de generar una respuesta inmune en un organismo que la detecte como un agente extraño.

• Anticuerpo es una glicoproteína, producida por linfocitos B activados, llamados células plasmáticas, como respuesta a la presencia de un antígeno en el organismo, a su vez los anticuerpos pueden ser producidos por líneas celulares in vitro, como es el caso de la producción de anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos llamados también inmunoglobulinas, se presentan en cinco clases principales, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, que se diferencian entre sí por sus características físicas, químicas y biológicas.

• La reacción antígeno- anticuerpoLas zonas del antígeno que se unen específicamente

con el anticuerpo o con el receptor de un linfocito, se denominan determinantes antigénicos.

Cada antígeno puede presentar varios determinantes antigénicos diferentes que estimulan la producción de anticuerpos y la respuesta de los linfocitos T.

Los determinantes antigénicos con los responsables de la especificidad de la respuesta inmunitaria.

• Las reacciones mas importantes entre un antígeno y un anticuerpo son las siguientes:

1. Precipitación: Al unirse antígenos y anticuerpos solubles, forman agregados insolubles que precipitan, lo que inactiva a los antígenos.

2. Aglutinación: Los anticuerpos se unen a antígenos situados en la superficie de una célula. Como los anticuerpos tienen dos puntos de unión, los microorganismos forman agregados y ya no pueden infectar otras células.

3. Neutralización: Anticuerpos situados en la membrana plasmática bloquean la acción de los antígenos contra la célula. Así los antígenos no se pueden unir a las células y matarlas.

• La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectrofotométricamente.

• Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal : es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.

DISPOSITIVOS EMPLEADOS EN ELISA

• Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plástico tratado para aumentar su capacidad de absorción de moléculas y con fondos de pocillo ópticamente claros para poder realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA.

DISPOSITIVOS EMPLEADOS EN ELISA

• Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA.

• A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son las que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.

ENZIMOINMUNOENSAYO•En el ELISA, la reacción Ag-Ab se pone de manifiesto por la acción de una enzima conjugada a los inmunocomplejos. La acción enzimática se revela por colorimetría.

•Hay diferentes variantes: indirecto, en sándwich, competitivo.

•Aplicaciones: detección de anticuerpos anti-agentes infecciosos (p. ej.: VIH), detección de anticuerpos en enfermedades autoinmunes (p. ej.: anti-DNA), detección de citocinas, etc.…

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes :

1.Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sándwich, etc.. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.

2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.

3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto).

4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo .