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TECNICHE CENTRIFUGATIVE
Le tecniche di separazione mediante centrifugazione sfruttano il comportamento
delle particelle all’interno di un campo centrifugo applicato
Lo scopo di tali metodiche e’ quello di esercitare sulle particelle una forza maggiore
rispetto a quella esercitata dal campo gravitazionale terrestre, in modo tale da
aumentare la loro velocita’di sedimentazione
Grazie a tali metodiche, le particelle che differiscono per densita’, forma o dimensione possono essere separate tra di loro, poiche’
sedimentano a velocita’ diverse. Ogni velocità risulta direttamente proporzionale al campo
centrifugo applicato
PRINCIPI DI BASE DELLA SEDIMENTAZIONE
La velocita’ di sedimentazione dipende dal campo centrifugo (G) applicato, che e’
diretto radialmente verso l’esterno; esso e’ funzione della velocita’ angolare del
rotore (, in radianti/sec) e della distanza della particella dall’asse di
rotazione (r, in cm), in base all’equazione:
G= 2 r
Essendo una rivoluzione del rotore pari a
2 radianti, la velocita’ angolare del rotore,
in radianti al secondo, puo’ facilmente essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto (rpm),
ovvero:
= 2rpm/60
Il campo centrifugo (G) espresso in rpm diventa:
G= 2r 42(rpm)2r/3600
ed e’ generalmente espresso in multipli del campo gravitazionale terrestre, cioe’ come
rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo ed il peso della stessa in
presenza della sola forza di gravita’
Quindi, “ G ” e’ definito in termini di
campo centrifugo relativo (RCF) o, piu’ comunemente, come “ numero di g”
(dove g è il campo gravitazionale terrestre, pari a 980 cm·s-2):
RCF= G/980
RCF= (1,1·10 –5 ) rpm2 ·r
Raggio del rotore mm
NOMOGRAMMA
Allineando due valori, ad es. il raggio del rotore e la forza centrifuga relativa si può leggere sulla terza colonna, direttamente come intercetta della retta, il valore in rpm cercato.
due valori noti terzo valore ottenuto
Forza Centrifuga Relativa RCF o x g
Velocità di rotaz. per minuto rpm
Si deve tener presente che la velocita’ di sedimentazione di una particella dipende non
solo dal campo centrifugo applicato, ma anche dalla sua massa, densita’ e forma, oltre che dalla densità e viscosita’ del
solvente in cui avviene la sedimentazione
Nel corso della sedimentazione, inoltre, la particella e’ sottoposta ad una forza netta verso l’esterno (F),
che e’ data dall’espressione:
F=4/3 rp 3
(p - m ) 2r
» 4/3 rp3=volume della sfera di raggio rp
» p =densita’ della particella
» m =densita’ del mezzo » r= distanza della particella dal centro di
rotazione
Tuttavia, le particelle generano attrito quando migrano attraverso la soluzione; se si assume che la
particella sia sferica e che si muova con velocita’ nota, allora la forza d’attrito che si oppone al moto
della particella e’ data dalla legge di Stokes:
ƒ0 = 6rp
» ƒ0= coefficiente d’attrito per una particella sferica
» = coefficiente di viscosita’ del mezzo
» = velocita’di sedimentazione della particella
Una particella di volume e densita’ noti, in un mezzo a densita’ costante, sara’ percio’ accelerata in un campo centrifugo fino a quando la forza applicata sulla particella stessa sara’ uguale alla forza d’attito,
cioe’ quando:
F = ƒ0
4/3 rp3(p- m)
2r= 6rp
In pratica, le due forze si eguagliano abbastanza rapidamente, con il risultato che la
particella sedimenta a velocita’ costante; quindi, la velocita’ e’ data da:
= dr/dt = 2/9 · rp 2
(p- m) 2r/
Integrando tale equazione, e’ possibile ricavare il tempo di sedimetazione di una particella sferica sottoposta ad un campo
centrifugo, in funzione delle variabili implicate e della lunghezza del percorso compiuto dalla
particella nella provetta da centrifuga:
t = 9/22
rp 2
(p- m) · ln rb/rt
» t =tempo di sedimentazione in secondi
» rt =distanza radiale dall’asse di rotazione al menisco del liquido
» rb = distanza radiale dall’asse di rotazione al fondo della provetta
La velocita’ di sedimentazione puo’ anche essere espressa in termini di velocita’ di
sedimentazione per unita’ di campo centrifugo applicato, comunemente detta
“coefficiente di sedimentazione” (s). Se il mezzo ha una composizione definita, la
velocita’ di sedimentazione e’ proporzionale a
2r, quindi l’equazione si semplifica in:
=s 2r
s= / 2r
Gli studi di velocita’ di sedimentazione possono essere eseguiti impiegando svariati sistemi
soluto-solvente; il valore misurato del coefficiente di sedimentazione, influenzato dalla temperatura,
dalla densita’ e dalla viscosita’ della soluzione, viene spesso corretto nel valore che si otterrebbe in un mezzo la cui viscosita’ e densita’ fossero pari
a quelle dell’ acqua a 20ºC, espresso come “coefficiente di sedimentazione standard”
(S20,w)
N.B.:I coefficienti di sedimentazione della maggior parte delle strutture biologiche sono
molto piccoli e, per comodita’, viene presa come unita’ di misura il valore di 10
-13 secondi,
che viene definito come “unita’ di Svedberg” (S)
1 S (Svedberg) = 10-13 sec
CENTRIFUGHE E LORO UTILIZZO
Le centrifughe possono essere classificate in quattro categorie principali:
piccole centrifughe da banco;
centrifughe refrigerate a grande capacita’;
centrifughe refrigerate ad alta velocita’;
ultracentrifughe
PICCOLE CENTRIFUGHE DA BANCO
» Sono le piu’ semplici e le meno costose
» Impiegate solitamente per raccogliere piccole quantita’ di materiale che sedimenta rapidamente
» Velocita’ max compresa tra 4000-6000 rpm
» Operano generalmente a temperatura ambiente
CENTRIFUGHE REFRIGERATE A GRANDE CAPACITA’
» Hanno una velocita’ max di 600 rpm
» Sono dotate di camere del rotore refrigerate
» Possono impiegare una varieta’ di rotori intercambiabili
CENTRIFUGHE REFRIGERATE AD ALTA VELOCITA’
» Velocita’ max di 25.000 rpm
» Rotori intercambiabili
» Impiegate soprattutto nella raccolta di microrganismi,frammenti cellulari e organuli cellulari
ULTRACENTRIFUGHE
» Preparative: » Velocita’ max di 80.000 rpm;
» Camera del rotore refrigerata, blindata e sottovuoto;
» Sofisticato sistema di controllo della temperatura
» Analitiche: » Velocita’ max di 70.000 rpm;
» Camera del rotore refrigerata, blindata e sottovuoto;
» Dotate di un sistema ottico per l’osservazione del materiale
Tipi di centrifughe
Centrifughe da banco
Ultracentrifughe
centrifuga
VELOCITA' BASSA MEDIA ALTA ULTRA
Velocità (rpm) 7.000 14.000 26.000 100/150.000
Gravità (xg) 7.200 18.000 75.000 800/901.000
Capacità 9 litri 1 litro 3 litri 1.500/40 ml
Raffreddamento no alcune tutte tutte
Vuoto no no alcune tutte
Velocità di centrifugazione
SISTEMA DI ULTRACENTRIFUGA ANALITICA CON SISTEMA OTTICO
DI SCHLIEREN
PRINCIPALI TIPI DI ROTORI
» Rotori a bracci oscillanti;
» Rotori ad angolo fisso;
» Rotori per tubi ad alloggiamento verticale
ROTORI AD ANGOLO FISSO
» Le provette sono poste in cavita’ scavate nel corpo del rotore e formano un angolo fisso tra 14° e 40º rispetto alla verticale
# Coperchio del rotore (a tenuta d’aria)
Coperchio del tubo da centrifuga
Asse di rotazione
Rotori ad angolo fisso - hanno gli alloggiamenti per i tubi disposti circolarmente attorno all’asse di rotazione ad un certo angolo prefissato che varia in genere tra 20° e 40°. Quando le particelle sono proiettate contro le pareti, scivolano verso il fondo con la formazione del pellet.
ROTORI
ROTORE A BRACCI OSCILLANTI
» Possiede bracci che durante l’accelerazione del rotore si portano in posizione orizzontale, in modo tale che la provetta sia perpendicolare all’asse di rotazione e parallela al campo centrifugo applicato
Rotori oscillanti o ad angolo mobile - A riposo, i tubi rimangono in
posizione orizzontale, ma quando il rotore inizia a girare, per effetto della
accelerazione centrifuga, i tubi ruotano sui perni verso l’esterno,
disponendosi orizzontalmente. I rotori oscillanti consentono una
formazione di bande di sedimento ben differenziate e di pellet più
uniformi, ma hanno una maggiore delicatezza rispetto ai rotori ad angolo
fisso.
ROTORI
ROTORI PER TUBI AD ALLOGGIAMENTO VERTICALE
» Rotore ad angolo fisso nullo, in cui le provette sono sempre allineate verticalmente al corpo del rotore
Tipi di rotori
Rotore ad angolo fisso
Rotore swing-out
• Rotore zonale
Metodi di separazione nell’ultracentrifugazione
preparativa
CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE
» Il materiale che dev’essere diviso nelle sue componenti viene separato in un certo numero di frazioni per centrifugazioni successive, aumentando gradualmente il campo centrifugo applicato
» N.B. :Alla fine di ogni centrifugazione solo il pellet viene lavato, risospeso e ricentrifugato
Centrifugazione differenziale
la centrifugazione di una sospensione di particelle per un tempo determinato provoca la formazione di un sedimento e di un sovranatante
Centrifugazione differenziale
» La centrifugazione differenziale e’ la tecnica piu’ usata per l’isolamento degli organuli cellulari da omogenati di tessuto
CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’
Metodo che viene usato quando e’ richiesta una separazione quantitativa di tutti i componenti di una miscela di particelle.
Si utilizza una soluzione la cui densità aumenta in gradiente, ma la densita’ massima non deve superare quella delle
particelle piu’ dense da separare.
Tipi di gradiente:
a) Continuo
b) Discontinuo
c) Una barriera di densità a gradino singolo per sedimentare
selettivamente una particella
Separazione isopicnica su gradiente di densita’
» Centrifugazione isopicnica: dipende unicamente dalla densita’ idrostatica della particella
SEPARAZIONE ISOPICNICA SENZA GRADIENTE PREFORMATO
» Il campione viene mescolato con il mezzo che costituisce il gradiente, anziche’ stratificarlo in un gradiente preformato
Centrifugazione isopicnica
Si basa sulla formazione di un gradiente ripido (molte sostanze come il saccarosio o il Ficoll creano dei gradienti durante la centrifugazione). Si mescola il campione da separare con la sostanza appropriata e si centrifuga per il tempo necessario per la formazione dei gradienti. Le particelle sedimentano in funzione della loro densità (si posizionano dove la loro densità è uguale a quella del mezzo).
All’inizio le particelle sono stratificate al di sopra del gradiente (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni, della loro densità e della densità del mezzo.
Cam
po c
entr
ifugo
Gra
die
nte
di densità
Campione
Particelle piccole
Particelle medie
Particelle grandi
A Z
Centrifugazione zonale
Si crea un gradiente poco ripido e le macromolecole si separeranno in funzione della massa ( quelle più grandi si muoveranno più velocemente)
MATERIALI PER GRADIENTI DI USO COMUNE E LORO APPLICAZIONI
La purificazione (e concentrazione) di macromolecole biologiche può essere effettuata mediante ultracentrifugazione in gradiente all’equilibrio di densità di cloruro di cesio-bromuro di etidio.
Le due differenti forme di DNA possono essere separate mediante ultracentrifugazione in gradiente di densità di CsCl/EtBr, una tecnica di separazione che sfrutta le differenze di densità delle diverse molecole.
DNA circolare chiuso e superavvolto intercala una certa quantità di etidio limitata. In questo caso la molecola assume una forma più compatta, con il conseguente incremento della densità di galleggiamento. Molecole di DNA circolari rilassate e lineari sono invece in grado di intercalare una maggiore quantità di etidio che ne provoca un maggior srotolamento. Di conseguenza il DNA lineare sarà meno denso.
Isolamento e concentrazione di macromolecole