Prezentacja programu PowerPoint · Zakład adań Mikroukładów iofizycznych (od 1 stycznia 2016) Tematyka badawcza Zakładu (realizowana do tej pory i dalej kontynuowana) Własności

Własności fizyko-chemiczne w oddziaływaniach

komórek z otoczeniem

Małgorzata Lekka

IFJ PAN

Zakład Badań Mikroukładów Biofizycznych (od 1 stycznia 2016)

Tematyka badawcza Zakładu (realizowana do tej pory i dalej kontynuowana)

Własności chemiczne powierzchni komórki w rozpoznawaniu zmian

nowotworowych

Oddziaływanie komórek z powierzchnią cienkich warstw polimerowych

Oddziaływania receptorów integryn z macierzą zewnątrzkomórkową

Oddziaływanie komórek z otaczającymi komórkami – układy modelowe i

tkanki

Standaryzacja pomiarów AFM

Ocena jakości powierzchni antybakteryjnych wykonanych na bazie miedzi (projekt NCBiR)

Charakterystyka własności fizyko-chemicznych

pojedynczych komórek

pozwoli na uzyskanie parametrów, które

w sposób ilościowy opisywałyby zmiany

zachodzące podczas progresji nowotworu.


Własności chemiczne powierzchni komórek a zmiany nowotworowe

Własności chemiczne powierzchni komórki w rozpoznawaniu zmian nowotworowych

Osoby realizujące: Justyna Bobrowska (z d.Gostek)

doktorantka (obrona planowana w 2016), stypendysta NCN Etiuda oraz OECD (Austria)

M.Lekka - promotor,

Joanna Pabijan (hodowle komórkowe).

Projekt realizowany we współpracy z Zakładem Inżynierii Nowych Materiałów (IF UJ).

Finansowanie:

Projekt Preludium (IFJ PAN) 2014-2017, kierownik projektu mgr J.Bobrowska

J.Gostek, J.Pabijan, K.Awsiuk, J.Rysz, A.Budkowski, M.Lekka

“Differentiation of human bladder cells using PCA analysis of ToF-SIMS mass spectra”

Analytical Chemistry 88(6) 3195-3201 (2015) (IF = 5.825).

Spektrometr masowy jonów wtórnych z analizatorem czasu przelotu ToF SIMS

• Trzy działa jonowe

Bi+

Bi3+

C60+

• Wysoka próżnia ~ 10-8 mbar

• Transport w warunkach sterylnychION TOF,

Zakład Inżynierii Nowych Materiałów (IF UJ)


komórka

Widma masowe

krzemowe podłoże

Opracowanie metody preparatyki materiału komórkowego do pomiarów w próżni

Bobrowska et al. Ultramicroscopy w recenzji

Utrwalanie

Odsalanie

Dehydratacja

Suszenie

Pomiar -> ToF SIMS



Utrwalanie

Odsalanie

Dehydratacja

Suszenie

Pomiar -> ToF SIMS




Utrwalanie

Odsalanie

Dehydratacja

Suszenie

Pomiar -> ToF SIMS


we współpracy z Laboratorium Skaningowej Mikroskopii Elektronowej UJ(prof. Franciszek Krok)


Opracowanie protokołu analizy danych bez uprzedniej znajomości mas


0 100 200 300 400 5000

1x104

2x104

0 100 200 300 400 5000

1x104

2x104

0 100 200 300 400 5000

1x104

2x104

x100 WM115

Inte

nsity x100 WM266-4

Mass (u)

x100 Silicon

praca doktorska J.Bobrowskiej

Opracowanie protokołu analizy danych bez uprzedniej znajomości masw oparciu o analizę składowych pierwotnych (PCA)


-30 -20 -10 0 10 20 30

-30 -20 -10 0 10 20 30

-30

-20

-10

0

10

20

30

-30

-20

-10

0

10

20

30

PC

3 (

9.3

0%

)

PC2 (25.17%)praca doktorska J.Bobrowskiej

Si – podłoże krzemoweWM115 – pierwotne ognisko czerniakaWM266-4 – wtórne ognisko czerniaka

Własności chemiczne powierzchni komórek

są silnie związane

ze zmianami własności adhezyjnych komórek

manifestujących się

w odmiennych oddziaływaniach komórek z otoczeniem

Oddziaływanie komórek z powierzchniami polimerowymi


Oddziaływanie komórek z powierzchnią cienkich warstw polimerowych

Osoby realizujące: Szymon Prauzner-Bechcicki

doktorat (2014), stypendysta NCN Etiuda oraz OECD (Austria)

Joanna Pabijan (hodowle komórkowe).

Projekt realizowany we współpracy z Zakładem Inżynierii Nowych Materiałów (IF UJ);

Politechniką w Pradze (Czechy) oraz ACMIN (AGH).

Magistrantki: Magda Woszczek, Ewelina Madej

Finansowanie:

Projekt Preludium (IFJ PAN) 2011-2015, kierownik projektu Sz.Prauzner-Bechcicki

Projekt Sonata 2013-2016 (IF UJ, IFJ PAN -> hodowle komórkowe); wykonawca

Sz.Prauzner-Bechcicki

Sz.Prauzner-Bechcicki, J.Raczkowska, E.Madej, J.Pabijan, J.Lukes, J.Sepitka, J.Rysz,

K.Awsiuk, A.Bernasik, A.Budkowski, M.Lekka

The effect of PDMS elastic properties on growth of melanoma and prostate cancer cells”

Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials 41 13-22 (2015) (IF = 3.487).

Adhezja komórkowa to inaczej

przyleganie, w którym uczestniczą

różnorodne oddziaływania.

Adhezja komórkowa do powierzchni

o zadanych własnościach jest

szczególnie ważna w urządzeniach

typu lab-on-a-chip, które mogą być

wykorzystywane do identyfikacji

komórek zmienionych chorobowo.

Adhezja komórkowa zależy od wielu

czynników m.in. chropowatości

powierzchni, hydrofobowości,

elastyczności.

Adhezja komórek do podłoża:

Sackmann et al., ChemPhysChem (2002)



poli(dimetylosiloksan) (PDMS)

możliwa zmiana elastyczności poprzez kontrolę czasu wygrzewania

elastomeru lub stężenia czynnika sieciującego


Własności otoczenia wpływają silnie na

zachowanie i własności komórekpoli(dimetylosiloksan) (PDMS)

WM115 WM266-4


soft (0.75 MPa) stiff (2.92 MPa)0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Fm

ax [

nN

]

PDMS

WM266-4

WM115

poli(dimetylosiloksan) (PDMS)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.00

20

40

60

80

100

Rate

[h

-1]

Fadh [nN]

0.75 MPa

2.92 MPa

0.75 MPa 2.92 MPa

WM115

WM266-4

Receptory integrynowe na powierzchni komórki

Oddziaływanie komórek z otoczeniem

jest także realizowane

za pomocą pojedynczych kompleksów molekularnych

charakteryzujących się wysokim stopniem selektywności


www.studyblue.com


Oddziaływanie receptorów integrynowych z macierzą zewnątrzkomórkową

Osoby realizujące (IFJ PAN): Joanna Danilkiewicz, Szymon Prauzner-Bechcicki,

Justyna Bobrowska oraz

- Katrin Mayr & Thu Kim Co (JKU Linz – pomiary w IFJ PAN)

- Katarzyna Herman (Politechnika Poznańska, PP)

- Anna Sobiepanek (Politechnika Warszawska, PW)

J.Pabijan (hodowle komórkowe, mikroskopia fluorescencyjna)

M.Lekka (IFJ PAN) & L.A.Chtcheglova (JKU Linz) & A. Ptak (PP) & T. Kobiela (PW)

Tematyka realizowana we współpracy z (i) Politechniką Poznańską, (ii) Instytutem Biofizyki

JKU Linz, Austria, oraz (iii) Politechniką Warszawską

Finansowanie:

Projekt NCN OPUS 8 (IFJ PAN) 2015-2018, kierownik projektu M.Lekka

J.Gostek, Sz. Prauzner-Bechcicki, B. Nimmervoll, K. Mayr, J. Pabijan, P. Hinterdorfer,

L. A. Chtcheglova, M. Lekka

Nano-characterization of two closely related melanoma cell lines with different metastatic

potential

European Biophysics Journal (2015) 44 49–5541 (IF = 2.747).


Czerniak

K.Mayr, praca magisterska


Colognato et al. (2000). Developmental Dynamics

Receptory integrynowe


Pentapeptide – YIGSR (5AA)Nonapeptide - CDPGYIGSR (9AA)

Fragment lamininy zawierający sekwencję aminokwasów:YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg)


Pomiary wykonywane we współpracy z JKU Linz, Austria





Model Bella-Evansa

gdzie:

F – siła wiązania

r – prędkość obciążania (loading rate)

kB- stała Boltzmanna

T – temperatura

xβ – szerokość bariery potencjału

koff – stała szybkości dysocjacji: 1/ koff –czas życia wiązania

Evans & Ritchie et al. Biophys. J. 1997



WM115 & YIGSR (5AA)

WM115 & YIGSR (9AA)

WM266-4 & YIGSR (9AA)

WM266-4 & YIGSR (5AA)

Unb

ind

ing

forc

e[p

N]

Loading rate [pN/s]


xβ – szerokość bariery potencjału

koff – stała szybkości dysocjacji

koff (s-1) xβ (Å)

5AA YIGSR WM115 0.4 ± 0.6 5.3 ± 1.8

WM266-4 1.1 ± 1.2 3.2 ± 1.3

9AA YIGSR WM115 0.2 ± 0.4 5.1 ± 2.5

WM266-4 0.5 ± 1.1 3.7 ± 2.1

Parametry kinetyczne





Receptory syndekanowe

Uproszczenie -> białko liniowe, modularne

To et al. (2011). Fibrogenesis & Tissue Repair


Fibronektyna

integrynyα5β1 & αVβ5

Syndekan-1Syndekan-4

RGDHepII

kINToff

kSDoff ?

Pierwsze wyniki (rozpoczęcie projektu – wrzesień 2015)


praca doktorska J.Danilkiewicz

10 100 1000 100000

100

200

300

400

500HCV29

Funb [pN

]

RL [pN/s]

HT1376

RGD

Każdy punkt to ok. 1000 „dobrych” krzywych

kontrola ścieżek

sygnalizacyjnych

w komórce


Fibronektyna

integrynyα5β1 & αVβ5

Syndekan-1Syndekan-4

RGDHepII

kINToff

kSDoff ?

Receptory integrynowe Zrekonstruowany potencjałoddziaływania

Rekonstrukcja potencjału oddziaływania będzie wymagała zastosowania większego zakresu

szybkości zmiany siły w czasie powodującej dysocjację pojedynczego kompleksu (zadanie realizowane na PP).

Oddziaływanie komórek z otoczeniem

to nie tylko połączenia z macierzą zewnątrzkomórkową ale

to także oddziaływanie z innymi różnego typu komórkami

znajdującymi się w sąsiedztwie

Oddziaływanie typu komórka-komórka


Oddziaływanie komórek z otaczającymi komórkami – układy modelowe i tkanki

Osoby realizujące: Barbara Orzechowska, Joanna Pabijan (hodowle komórkowe),

Pomiar własności materiału tkankowego:

Joanna Danilkiewicz, Justyna Bobrowska, Iuliana Moldoveanu (Uniwersytet w Bukareszcie),

Jorge Ramos (Uniwersytet w Madrycie), M.Lekka

Tematyka realizowana we współpracy (i) z Collegium Medicum UJ oraz (ii) z Uniwersytetem w

Lozannie (Szwajcaria)

Finansowanie:

Projekt NCN Harmonia (IFJ PAN) 2011-2014, kierownik projektu M.Lekka

Planowany projekt typu Preludium (B.Orzechowska 2016)

Składany projekt typu OPUS (grudzień 2015, umowa konsorcyjna z IF UJ)

J.R. Ramos, J. Pabijan , R. Garcia, M. Lekka

The softening of human bladder cancer cells happens at an early stage of the malignancy

process"

Beilstein Journal of Nanotechnology (2014) 5 447-457 (IF = 2.374).


Geho et al. Physiology 20 (2005) 194-200


Jaki jest wpływ komórek sąsiadujących na własności pojedynczych komórek ?

W pierwszym przybliżeniu analizowana jest morfologia pojedynczych

komórek tego samego rodzaju

komórki nabłonka przewodu moczowego:

niezłośliwy rak przejściowo komórkowy – linia HCV29)

0

10

20

30 T24

HT1376

HCV29

E [kP

a]

A B C


Kolejne podejście pokazuje analizę własności elastycznych

pojedynczych komórek tego samego rodzaju


Grupa A: pojedyncze komórki

Grupa B: klastry komórek (5-10)

Grupa C: monowarstwa

0

10

20

30 T24

HT1376

HCV29

E [kP

a]

A B C


Grupa A: pojedyncze komórki

Grupa B: klastry komórek (5-10)

Grupa C: monowarstwa

Kolejne podejście pokazuje analizę własności elastycznych

pojedynczych komórek tego samego rodzaju


HCV29 > HT1376 > T24


Geho et al. Physiology 20 (2005) 194-200


F-actin

50 μm

fibroblast

50 μmkeratynocyty

Jaki jest wpływ komórek sąsiadujących innego rodzaju na własności

pojedynczych komórek ?

praca doktorska B.Orzechowskiej


Jaki jest wpływ komórek sąsiadujących innego rodzaju na własności

pojedynczych komórek ?

0

5

10

15

20

25

30

culture time:

24h

72hE

[kP

a]

Fibroblasts Keratinocytes

praca doktorska B.Orzechowskiej

Pojedyncze komórki

Mono-culture

FB:K 1:1

FB:K 5:1

Mono-culture

FB:K 1:1

FB:K 5:1


Pomiary makroskopowe

silnie zaawansowane nowotwory

Indenter

Lee et al., Yonsei Med. J. 52 (2011) 553-557

Krouskop et al. Ultrasonic Imaging 20 (1998) 260-274

Tkanka nowotworowa jest sztywniejsza !

Andrews et al. Soft Matter 9 (2013) 5581-5593

Tkanki – układ złożony z wielu typów komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej

tkanka


Pomiary mikroskopowe tkanek

silnie zaawansowane nowotwory

Indenter

Tkanka nowotworowa jest bardziej deformowalna !

Andrews et al. Soft Matter 9 (2013) 5581-5593

Tkanki – układ złożony z wielu typów komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej

Lekka et al. Arch. Biochem. Biophys. 518 (2012) 151-156

Plodinec et al., Nat. Nanotechnol. 7 (2012) 757-765

Prabhune et al. Micron 43 (2014) 1267-1272

cancer

margins

20 um

5, 10, 20 microns

Standaryzacja pomiarów elastyczności

Pomiary własności elastycznych aby mogły być stosowane

powszechnie w wielu laboratoriach

muszą podlegać standaryzacji


Osoby realizujące: M.Lekka, J. Bobrowska

Projekt realizowany w ramach Akcji COST TD1002 we współpracy

z 9 ośrodkami EU w:

Niemczech (Brema i Muenster), Francji (Marcoule, Marsylia), Włoszech (Mediolan),

Hiszpanii (Barcelona, Madryt), Grecji (Patra)

Studenci wykonujący pomiary w IFJ PAN

J.Ramos (Madryt), I.Moldoveanu (Bukareszt),

K.Mayr & Thu Kim Co (Linz),

K.Malohlava & J.Horakova (Ołomuniec)

pobyt finansowany z funduszy poszczególnych uczestników Akcji COST


European network on applications of Atomic Force Microscopy to NanoMedicine and Life Sciences

(COST Action TD1002)

The main objective of the COST Action TD1002 is to further develop and transfer the biophysical

achievements of Atomic Force Microscopy to NanoMedicine and clinical research.

Ocena jakości powierzchni antybakteryjnych wykonanych na bazie miedzi (projekt NCBiR)

Osoby realizujące: M.Lekka, Sz.Prauzner-Bechcicki

Projekt NCBiR na lata 2015 – 2017 realizowany we współpracy z Instytutem Metali Nieżelaznych w Gliwicach (koordynator) oraz z firmami Alveo, Certech i Lipopharm.

Zadanie IFJ PAN – badanie topografii powierzchni antybakteryjnych tworzonych na bazie miedzi.

N55 CuTiO2 Peak-to-peak

[nm]

Szorstkość (Ra)

[nm]

#1 421.45 32.37

#2 668.6 84.8

#3 409.2 43.26


Podsumowanie

Zmiany nowotworowe są akumulacją zmian różnego typu prowadzących do

odmiennych własności komórki nowotworowej

Charakterystyka własności fizyko-chemicznych pojedynczych komórek

pozwoli na uzyskanie parametrów, które w sposób ilościowy opisywałyby

zmiany zachodzące podczas progresji nowotworu


Skład grupy

1. Małgorzata Lekka

2. Szymon Prauzner-Bechcicki

3. Joanna Pabijan

Doktoranci

1. Justyna Bobrowska

2. Barbara Orzechowska

3. Joanna Danilkiewicz

Aktualnie realizowane projekty

- projekt NCN - Preludium (2014 – 2017)

- projekt NCN OPUS (2015 – 2018)

- Projekt NCBiR (2015 – 2018)

- kontynuacja badań wykonywanych w ramach Akcji COST TD1002, AFM4NanoBioMed

(składany kolejny projekt COST (M.Lekka – główny wnioskodawca, 18 krajów, deadline:

9.02.2016)

1. Joanna Wiltowska-Zuber

2. Katarzyna Pogoda

3. Agnieszka Dziekańska


Formalne i nieformalne współprace:

1. Collegium Medicum UJ

2. Uniwersytet w Linzu (Austria)

3. Instytut Fizyki UJ

4. Politechnika w Pradze (Czechy)

5. Politechnika Warszawska

6. Politechnika Poznańska

7. ACMIN (AGH)

8. Zespół instytucji należących do grupy pracującej nad standaryzacją pomiarów

elastyczności

Nie mówiłam o wynikach uzyskanych w ramach:

1. Uniwersytet w Lozannie – badanie własności mechanicznych mięśni (dystrofie)

2. Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu – stabilność mechaniczna białek

3. Instytut Agrofizyki PAN – pomiary sztywności ściany komórkowej

Dziękuję

Documents

Prezentacja programu PowerPoint · Zakład adań Mikroukładów iofizycznych (od 1 stycznia 2016) Tematyka badawcza Zakładu (realizowana do tej pory i dalej kontynuowana) Własności