Primena gasne hromatografije u analizi realnih uzoraka

Primena gasne hromatografijeu analizi realnih uzoraka

Nikola KariUvod GC se zasniva na razliitim rastvorljivostima, odnosno razliitoj adsorpciji para razliitih hemijskih jedinjenja u stacionarnoj fazi, koje usled toga za razliito vreme noene noseim gasom stiu do detektora.

Omiljena i iroko rasprostranjena u analitikim laboratorijama zbog brzine, velikog broja jedinjenja koja se mogu ovom metodom analizirati i jednostavnosti pripreme uzoraka, kao i jednostavnosti opreme, a jedini uslov je da je t.k. jedinjenja < 300C (mada i to se moe prevazici derivatizacijom).

Nosei gas: H2, He, N2 ili ArStacionarna faza:-vrsta: silika gel, Al2O3, aktivni ugalj, molekulska sita-tena: razliiti tipovi polimera adsorbovani ili hemijski vezani za povrinu kolone

GC- sistemSastoji se od:- cilindra sa noseim gasomisparivaaGC-koloneTermostatiranog prostora za kolonu(penice)DetektoraSoftverskog sistema ili pisaa

Optimizacija protokaH- duina GC-kolone podeljena sa brojem teorijskih podova A - konstanta vrtlone difuzije (zavisi od oblika i pakovanja kolone) B - konstanta molekulske difuzije (zavisi od vrste noseeg gasa, sa veom Mr gasa opada) C - konstanta otpora prenosu mase u tenoj fazi (najvie zavisi od debljine tene faze i njenog viskoziteta. u linearna brzina gasa (protok)

Isparivai (unoenje uzorka)Teni uzorci se unose odgovarajuim mikropricevima.vrsti uzorci se unose ili u obliku rastvora ili pomocu specijalnih isparivaa.Gasoviti uzorci se unose najee pomou specijalnih gasnih priceva ili gasnih petlji .Pirolizeri, takodje predstavljaju jednu vrstu isparivaa.

Kolone

Punjene - preparativne svrhe

Kapilarne - analitike svrhePunjene kolone Kapilarne koloneDuina (m) 1-5 5-60Unutranji poluprenik (mm) 2-4 0,10-0,53Broj teorijskih podova po metru 1000 5000Rezolucija Niska VisokaProtok (ml/min) 10-60 0,5-15Kapacitet 10 g/pik >100ng/pikDebljina sloja tene faze (m) 10 0,1/1

Tene fazePoto na razdvajanje najvie utiu napon pare i rastvorljivost para supstance u upotrebljenoj tenoj fazi, izbor tene faze je od krucijalnog znaaja. Svaka tena faza mora da ispuni sledee uslove:-Termika stabilnost pri radnim uslovima-Hemijska inertnost-Neisparljivost na radnoj temperaturi-(*) Treba da bude dobar i selektivan rastvara za jedinjenja koja se razdvajajuDele se prema polarnosti na :-polarne: Carbowax, Carbowax (acidic), Carbowax (basic)-srednje polarne: - difeninil-silil-, cianopropil-fenil silil-, bis-cianopropil-silil--nepolarne: dimetil-silil, fenil-metil silil-, skvalen (kod punjenih kolona)Komercijalne kone predstavljaju razliite kombinacije odnosa ovih srednje polarnih i nepolarnih .

Izbor tene fazeAko se radi izotermno eluiranje onda je svakako vazno da polarnost jedinjenja i tene faze budu pribline.Medjutim, kada se radi sa kapilarnim kolonama pri gradijentu temperature, zato to uticaj take kjuan za odvajanje, vae malo drugaija pravila izbora tene faze.Koristi se uvek najmanje polarna kolona koja moe da obezbedi dobro razdvajanje.Prednosti nepolarnih u odnosu na polarne kolone:-Vea temperaturna stabilnost-Vea hemijska inertnost (otpornost prema prisustvu H2O, O2)-Manje isparavnje tene faze, jer je bolje vezana za kolonu.Ipak, kad se rade razdvajanja alkohola ili aldehida , najbolja razdvajanjase dobijaju sa veoma polarnim Carbowax kolonama.Hiralne tene fazeNajee koriene stacionarne faze ove vrste su Chirasil-Val i -ciklodekstrin. Veoma su zgodne za analizu eterinih ulja razliitih aroma, eera (derivatizovanih pomou TMS) i sl.

Izotermna eluacija i temperaturni gradijentU dananje vreme skoro da je izotermna eluacija izumrla. Vie razloga postoji za to:-Ako se izabere preniska teperatura iz kolone e izai samo najisparljivije komponente, dok e tee isparljivim rasti tr i iriti pikovi, a najtee isparljive se nee esto ni u potpunosti eluirati.Ako se izabere previsoka temperatura, pikovi najisparljivijihkomponenti e biti previe zbijeni (tj. rezolucija e biti slaba), moe doi i do degradacije pojedinih komponenti.Glavne prednosti eluacije u temperaturnom gradijentu su:Skraenje vremena analizeBolja rezolucija i smanjenje irine pikova (to poboljava detekciju)Takodje, primenom temperaturnog gradijenta se mnogo bolje isti kolona od eventualno zaostalih neisparljivih komponenti, to za posledicu ima smanjenje efekta memorije.

GC: kvalitativna i kvantitativna analizaKvalitativna analiza:Vri se na osnovu retencionog vremena(tr),odnosno,poredjenjem retencionih vremena standarda i uzorka. Zavisi od mnogo parametara, medjutim, poto su za akreditovane GC-metode u svim oblastima svi parametri precizno definisani, ova veliina je vrlo reproduktivna.Kvantitativna analiza:Vri se na osnovu povrine pikova (eventualno visine), koje su proporcionalne masi jedinjenja.

RF-Faktor odgovoraCu- masena koncentracija uzorkaCs-masena koncentracija standardaPu-povrina pika uzorkaPs-povrina pika standardaDetekcijaTermo-provodljivi detektor (TCD) Plameno-jonizacioni detektor (FID) Azot fosforni detektor (NPD) Hall-ov detektor (ELCD) Hemiluminescentni detektor Detektor sa sa zahvatom elektrona (ECD) Fotojonizacioni detektor Plamenofotometrijski detektori drugi...I naravno MS-detektorICP detektor se primenjuje, npr. u analizi organokalajevih i organoivinih jedinjenja.

GC/MSGC/ MS je danas jedna od najprimenjenijih analitikih tehnika.Koristi se u analizi zagadjivaa ivotne sredine, forenzici, toksikologiji i farmaciji.Osnovni razlog je mogunost identifikacije nepozntog jedinjenja iz neke smee na osnovu MS-spektra, pomou baze podataka. Ova metoda se dosta koristi i za kvantitativnu analizu u svetu.Jedna od velikih mana u primeni u kvantitativnoj analizi jeste neophodnost posedovanja mnotva relativno skupih deuterisanih standarda i ne ba prevelika osetljivost u odnosu na druge detektore.

GC/MS: Kvalitativna i kvantitativna analizaKvalitativna analiza: Na osnovu retencionih vremena i MS-spek-tara jedinjenja iz baze podataka.

Kvantitativna analiza: Na osnovu povrine pika kvanti-jona. Najee se kao kvanti-jon uzima osnovni jon (jon najveeg intenziteta u spektru), zato to on ima najveu povrinu. Ta povrina je proporcionalna masenoj koncenraciji i poredi se povrinom odgovarajueg pika u MS spektru internog standarda.Standardi u GC/MS:Tuning standardi: slue za podeavanje rada aparata i proveru njegovog rada.Surogat standardi: dodaju se uzorku pre pripreme poetka uzorka, kako bi se odredio recovery. Ako je vrednost recovery-a surogat standarda odgovarajua, smatra se da je priprema uzorka dobro obavljena. Interni standardi: U GC/MS-u najee su to izotopski obeleeni analozi jedinjenja koje se analizira ili jednostavno neka druga odgovarajua jedinjenja kojih nema u uzorku i dodaju se neposredno pre injektovanja.-Deuterisani ili C13-analozi analita su odlian izbor, ali su skupi. Prostim poredjenjem povrina osnovnih jona analita i standarda moze se dobiti koncentracija analita.-Kada se koriste druga jedinjenja, mora se vriti kalibracija (najee sa 5 koncentacija analita) i odredjivati faktor odgovora. Kada se analiziraju sloenije smee dodaje se vie internih standarda. To se radi jednostavno da bi interni standard imao to slinije retenciono vreme sa jedinjenjem koje se odredjuje. Tako da je u metodama naznaeno koji interni standard se koristi za koju grupu analiziranih jedinjenja.GC u zatiti ivotne sredineKoristi se za odredjivanje:- Isparljivih organskih jedinjenja (VOC)- Semi-isparljivih organskih jedinjenja (SVOC)Polihlorovanih bifenila, pesticida i drugih jedinjenja rizinih za ivotnu sredinu u uzorcima zemljita, gradskih otpadnih voda, industrijskih otpadnih voda, pepela sa deponija incineratora otpada itd.Pravila uzorkovanja i uvanja uzorakaPravila uzorkovanja su, uglavnom, ista, i uvanje uzorka je relativno slino-uzorak se uva na 4C-na tamnom mestu ( zbog fotoosetljivosti po-jedinih jedinjenja)Kod uzorkovanja pijae vode, rezidualni hlor se uklanja tiosulfatom,da ne bi dolo do oksidacije organskih supstanciKlasa jedinjenjaTip uzorkaPreproruena posudaBrojsudovaKonzervacijauzorakaMax. vreme uvanja na 4 CIsparljiva organska jedinjenjaVodaViala, 40 ml,sa teflonskim septumom 2HCl do pH < 2 14 danaZemljiteTegla 100 ml, sa teflonskimpoklopcem 1Nema 14 danaSemi-isparljiva organska jedinjenjaVodaTamna boca od 1l sa tef. poklopcem 2

Nema

7 dana, 40 posle ekstrakcijeZemljiteTegla 500 ml, sa teflonskimpoklopcem 1Nema

7 dana, 40 posle ekstrakcijePesticidi i PCB-oviVodaTamna boca od 1l sa tef. poklopcem 2Nema

7 dana, 40 posle ekstrakcijeZemljiteTegla 500 ml, sa teflonskimpoklopcem 1Nema7 dana, 40 posle ekstrakcijeIsparljiva organska jedinjenja (VOC)Jedinjenja take kljuanja do 250C i naponapare preko 0,1 Torr-a (pri temperaturi od 25C iatmosferskom pritisku)Razliiti ugljovodonici,halogeno-ugljenici,freoni,alkoholi (TBA), etri (npr. MTBE), estri, karbonilnajedinjenja itd.

VOC: Priprema uzorakaHead-space ekstrakcija (loa, jer nije kvantitativna, problematina za kalibrisanje, zbog efekta matriksa), mada izuzetno dobra kad u uzorku imamo veliku koliinu isparljivih organskih jedinjenja, jer se adsorbens u Purge & Trap tehnici moe preopteretiti, i onda adsorpcija nije kvantitativna.Purge & Trap (znatno skuplja, ali kvantitativna, postoji dosta razliitih adsobenasa pogodnih za razliita jednjenja)

Analiza VOC pomou GC/MSUSEPA SW846 Method 8260C se koristi kako za vodu, tako i za zemljite, samo sa razlikom u pripremi uzorka.Supstanca se identifikuje na osnovu retencionog vremena i masenog spektra, a kvantifikacija naosnovu najzastupljenijeg izdvojenog jona u spektru.Limiti ove metode su:za zemljite: 5 g/kgza vodu: 5 g/Lza otpad: 0.5 mg/kg

Kao standard za praenje efikasnosti Purge&Trapse koriste 1,2dihloretan-d4, toluen-d8 i 1,4-bromo fluorobenzen. To su surogat standardi.Kao interni standard se koriste hlorobenzen d5,bromofluorometan i 1,4 difluorbenzen. Oni se dodaju pre injektovanja.

Kada se analiziraju uzorci zemljita i drugi vrsti uzorci,vri se prethodna ekstarakcija metanolom,koji se zatim mea sa odredjenom zapreminom vode i ubacuje u Purge& Trap sistem, naravno, i standardi su razliiti.

Odredjivanje aromatinih i halogenovanih isparljivih organskih jedinjenja pomou GC/PID/ELCDUsepa 8021 bJedini razlog to se ovde ne koristi MS detektor je niagranica detekcije.Uzorak se sprema slino.PID je veoma osetljiv na prisustvo aromata.ELCD je osetljiva na prisustvo halogenovanih. jedinjenja, jer njihovim sagorevanjem nastaje HCl koja poveava provodljivost usled jonizacije.za zemljite: 1 g/kgza vodu: 1 g/Lza otpad: 0. mg/kg

Semi-isparvljiva organska jedinjenja (SVOC) Kisela:-Najee razliiti fenoliBazna:-Razliiti amini, anilinski derivati, nitrozaminiNeutralna:Razliiti polihlorovani ugljovodoniciJedinjenja sa vie aromamatinih prstenova (PAH) Nitroaromati, di- i trinitroaromatiFtalatni estri

Priprema uzoraka za odredjivanje SVOCNajee podrazumeva teno-tenu ekstrakciju najee sa CH2Cl2, najee u dva koraka, posebno u kiseloj,a zatim u baznoj sredini, organski slojevi se nakon toga spajaju.- Kontinualna ekstrakcija (skoro nezaobilazna kod vrstih uzoraka)- Solid phase exraction- Solid phase microextraction- Ultrazvuna ekstrakcija- Ekstrakcija stimulisana mikrotalasima Uzorci se nakon toga najee preiavaju dodatno jo gel-permeacijom, teno-vrstom hromatografijom ili acido-baznom particijom, kako bi se uklonile eventualne interferencije.Koncentrovanje se vri pomou Kuderna-Danish-aparata.

Odredjivanje semi-isparljivih organskih jedinjenja pomou GC/MSUSEPA metod 8270C

Uzorci vode (1L) se ekstrahuju metilen-hloridom prvo na pH10. Organski slojevi se spajaju, potom koncentruju na 1,0ml.Zemljite (oko 30g) se ekstrahuje smeom metilen-hlorida acetona (1:1)u prisustvu na Na2SO4 kao suila. Ektrakcija se vri ili u ultrazvunom kupatilu ili se vri kontinualna ekstrakcija pomou Soxletovog aparata.Uzorcima su pre ekstrakcije dodati surogat standardi, a pre injektovanja interni standardi, koji sadre vie deuterisanih jedinjenja.

26Kod ove analize je praksa da se pre kolone postavi kolona do 5m duine, koja ne sadri kapilarni sloj kako bi se na njoj adsorbovale eventualno zaostale neisparljive komponente smee.Ova metoda je pogogodna za identifikaciju ali ne i kavntifikaciju odredjenih jedinjenja kao to su hlordan, PCB-ovi i toksafen (insekticid).Benzidin podlee oksidativnim promenama, dok pojedina jedinjenja se raspadaju pri kalsinom ekstrahovanju (npr.- i -BHC ), pa se tada vri pre standardne procedure pripreme uzorka neutralna ekstrakcija. Neka jedinjenja podleu termalnoj degradaciji pri injektovanju uzorka.Za uzorke vode SVOC-ovi se odredjuju rutinski za koncentracije10 g/Li vie, u zemljitu 660 g/kg, a u otpadu 1-200 mg/kg zavisno od matriksa i metode pripreme uzorka.

GC/MS odredjivanje polihlorovanih dibenzofurana i polihlorovanih dibenzodioksinaDioksin je termin pod kojim se smatraju polihlorovani dibenzofurani (PCDFs) i polihlorovani dibenzodioksini (PCDDs),koji se smatrajaju veoma kancerogenim. Iako ih postoji oko 200,samo 17 je od analitikog znaaja. Nastaju najee pri spaljivanju razliitog otpada pre svega plastinih masa uincineratorima otpada. USEPA 8280A i 8290Ove dve metode se razlikuju po tome to jedna koristi konvencionalnu MS detekciju, a druga High resolution MS.Obe metode omoguavaju identifikaciju i kvantifikaciju u razliitim uzorcima: vodi, zemljitu, pepelu,hemijskom otpadu.Metoda 8290 se bavi odredjivanjem ovih jedinjenja u tkivima riba, ljudskom tkivui papirnoj pulpi.

Proces pripreme uzorka je vrlo dugaak i komplikovan.Zemljite se ekstrahuje sa toluenom u Soxlet-ovom aparatu sa Dean-Stark-ovim nastavkom za hvatanje vode, dok se voda klasino ekstrahuje pomou CH2Cl2. Smea heksan/ CH2Cl2 ili CH2Cl2 sekoristi za ekstrakciju iz tkiva. Pre ekstrakcije uzorcima se dodaje standard koji sadri C13 analoge PCDF-ova i PCDD-ova. Uzorak se potom koncentruje na 10 ml. Ispira sa: konc. H2SO4, 5% NaCl,20% KOH i 5% NaCl. Izmenjuje se rastvara u heksan i koncentruje na 1ml. Ekstrakt se proputa kroz kolonu sa sa silika gelom i aluminijum-oksidom. Heksan i metilen hlorid (8:2) se koriste za eluciju sa kolone, uzorci se koncentruju, a zatim kroz eluiraju kolone od aktivnog uglja i dijatomejske zemlje. U uzoke se zatim dodaju nonanski rastvori internih standarda kako bi se utvrdio recovery. Limiti metode su : za zemljite 1 do 5 g/kg, za vodu 50 ng/L (za uzorak od 10 L).

Odredjivanje semi-isparljivih jedinjenja korienjem drugih detektrora Fenoli GC/FID USEPA 8041Ova metoda omoguava odredjivanje blizu 40 jedinjenja u vodi i zemljitu. Kod vode ekstrakcija se vri na pH