15
CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH Detectia alimentelor iradiate folosid metoda cometei EN 13784/2001 Foodstaff – DNA comet assay for the detection of irradiated foodstaff – screenig method

Principiul metodei :

  • Upload
    urbana

  • View
    106

  • Download
    0

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Detectia alimentelor iradiate folosid metoda cometei EN 13784/2001 Foodstaff – DNA comet assay for the detection of irradiated foodstaff – screenig method. - PowerPoint PPT Presentation

Citation preview

Page 1: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Detectia alimentelor iradiate folosid metoda cometei

EN 13784/2001 Foodstaff – DNA comet assay for the detection of irradiated foodstaff – screenig method

Page 2: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Obiectiv general: asigurarea in tara a expertizei necesare pentru abordarea tematicii alimentelor iradiate.

Obiectiv particular: realizarea unei proceduri pentru detectia alimentelor iradiate pe baza analizei prezentei ruperilor la nivelul macromoleculelor de ADN.

Page 3: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Principiul metodei:

Alimente (seminte, fructe, carne, etc.)

iradiere

Fragmentarea lanturilor de ADN

Alti factori care pot induce fragmentarea AND-ului:

-Conservarea (termic, uscare)

-Tratamente chimice

Page 4: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Celule inglobate 1% agaroza depusa pe o lama de miscroscop

Liza celulara: Triton X-100

Nucleoid

Incubare in tampon alcalin sau neutru:

Electroforeza

Neutralizare, colorare,vizualizare

% ADN in coada se coreleaza cu numarul de ruperi in lantul de ADN

Principiul metodei:

Fragmentele de ADN migreaza formand coada cometei

Page 5: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Etapele procedurii:•separarea celulelor din proba de analizat (rezulta o suspensie care contine celule si resturi de tesut)

•dupa sedimentarea particulelor mari (10-20 min) un volum adecvat din supernatant se amesteca cu agaroza (cu temperatura scazuta de topire) si se depune sub forma unui film pe suprafata unei lame de microscop

•dupa solidificarea agarozei, lama se introduce timp de 30 min intr-o solutie de liza (contine Triton 100) care degradeaza membrana celulara si o face permeabila la fragmentele de ADN

•lama este supusa actiunii unui camp electric (1-2 V/cm, 1 min pentru cometa neutra sau 0.5 V/cm, 30 min pentru cometa alcalina) care produce electroforeza fragmentelor de ADN

•ADN-ul din proba este marcat fluorescent (cu bromura de etidiu) si celulele sunt observate la un microscop cu epifluorescenta (Olympus BX51) iar imaginile sunt inregistrate cu un sistem de achizitie digital.

Page 6: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Control IradiatVita:

Rezultate experimentale:

Page 7: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Control 1 kGy 2 kGyPorumb:

Rezultate experimentale:

Page 8: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Control 1 kGy 2 kGyPorumb:

Grau:

Rezultate experimentale:

Page 9: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Prelucrarea datelor:

Page 10: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 16040

50

60

70

80

90

100

110Data: PORUMB2GY10C_YModel: GaussChi^2 = 2.04601y0 45.92664 ±0.30251xc1 92.44741 ±1.13759w1 50.27853 ±1.53284A1 2699.87492 ±128.62649xc2 120.89231 ±0.17572w2 22.43425 ±0.84728A2 1016.85262 ±95.21643

inte

nsita

te

pixeli

Parametrii cometei:

Fractia de ADN in coada: DNA = AriaP1/(AriaP1+AriaP2)

Lungimea cozii (pixeli): Lungime = XcP2 – XcP1

Momentul cozii: DNA * Lungime

Prelucrarea datelor:

Page 11: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Perfectionarea tehnicii cometei pentru analiza semintelor de cereale iradiate

0 1 20

10

20

30

40

50

60

70

80

90 Grau

*

*

Par

amet

rii c

omet

ei

Doza / kGy

DNA (%) Lungime (pixeli) DNA*Lungime

Prelucrarea datelor:

Page 12: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Perfectionarea tehnicii cometei pentru analiza semintelor de cereale iradiate

0 1 20

10

20

30

40

50

60

70

80

90Porumb *

*

*

Par

amet

rii c

omet

ei

Doza / kGy

DNA (%) Lungime (pixeli) DNA*Lungime

Prelucrarea datelor:

Page 13: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

Concordanta cu metoda bazata pe RES:

330 332 334 336 338 340-5000

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000 Grau 0 kGy 1 kGy 2 kGy

Inte

nsita

te

/ U

A

B / mT

Page 14: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

330 332 334 336 338 34010000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000 Porumb 0 kGy 1 kGy 2 kGy

Inte

nsita

te

/ U

A

B / mT

Concordanta cu metoda bazata pe RES:

Page 15: Principiul metodei :

CALIST 5111 / 22 iunie 2006 IFIN-HH

1. Metoda cometei se dovedeste sensibila la efectele iradierii in cazul probelor de alimente iradiate (carne, seminte) analizate

2. Protocolul bazat pe electroforeza in mediu neutra da rezultate comparabile celor din literatura de specialitate

3. Rezultatele prezentate sunt in concordanta cu cele obtinute prin tehnica RES

Concluzii: