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PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO PARA LA PRUEBA DE GENOTIPIFICACIÓN DEL
VIH
Blga. Gisely Hijar GuerraCoordinación del Laboratorio de Biotecnología y Biología
Molecular.Responsable de los Procesos de la Prueba de
Genotipificación de VIH – Centro Nacional de Salud Publca
¿COMO MONITOREAR RESISTENCIA?GENOTIPO FENOTIPO
CODIGO GENETICO ALTERADODE LA PROTEINA BLANCO DE LADROGA
SUSCEPTIBILIDAD ALTERADAA LA DROGA
HIV DNA DEL PACIENTE
PATIENT HIV
DEFINICIONES• Genotipo : Secuencia de nucleótidos del virus de la
cual se deduce la secuencia de aminoácido de una proteína (En el caso del HIV, la RT y PV)
• Mutaciones : cambios en la secuencia de AA deducida de la secuencia de nucleótidos con respecto a la secuencia de una cepa de referencia (sensible o salvaje) Ejemplo: Met184Val . Mutaciones específicas se identifican como causantes de resistencia genotípica
• Fenotipo : Deriva del genotipo. En el ejemplo, el cambio Met184Val se traduce fenotípicamente como resistencia a 3TC, ddC y Abacavir.
Regiones de PR y RT Evaluadas por test de Resistencia
Genotipificación VIH-INS242
360
320
305
483
PR RT INRNaseHp7NC p1 p6
Gag Cleavage Sites
9
DE LA MUESTRA A LOS RESULTADOS
Pre-Analitica Analitica Post-Analitica
Analítica
Extracción de Ac. Nucleico
Amplificación deAc. Nucleico
SecuenciamientoAutomático
Post-AnalíticaAlineamiento de
Secuencia
Ensamblaje de Secuencia
Edición de Secuencia
Determinación de mutaciones
Reporte de resultados
Pre-AnalíticaColecta de la
muestra Codificación de muestra
Envío y Almacenamiento
MUESTRA : Sangre Total
CONSIDERACIONES DE LA MUESTRA
• PACIENTE : EN AYUNAS
• TIPO DE MUESTRA: SANGRE
• TIPO DE TUBO : TUBO AL VACIO CON EDTA DE 5 – 7 CC.
• TEMP. TRANSPORTE :AMBIENTE
• TIEMPO DESDE QUE SE TOMA LA MUESTRA HASTA QUE SE SEPARA EL PLASMA : 24 HORAS.
SEPARACIÓN DEL PLASMA Y EXTRACCIÓN DEL MATERIAL GENETICO (ARN )
Controles de la PruebaControles Mutantes Controles Silvestres
TRANSCRIPCIÓN REVERSA (RT) YREACCIÓN DE LA CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)
RT-PCR (Reverse Transcription PCR)
RNA Ë c DNA
ELECTROFORESIS
PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR
SEGUNDO PCR
ÁREA SEGUNDA AMPLIFICACIÓN
SECUENCIAMIENTO DE PRODUCTOS DE PCR(Equipo : Analizador Genético)
ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE ADN DEL VIH
SOFTWARE Sequencing Analysis
SOFTWARE : SeqScape
La secuencia de ADN del virus obtenido es ingresado en la base de datos de la Universidad de Stanford empleando para ello el Programa HIVdb. Este programa analiza las secuencias y determina si están presentes las mutaciones del virus relacionadas a la resistencia antiretroviral.
INFORMES DE RESISTENCIAS
SEPARACIÓN DEL PLASMA TUBO N° 1
EXTRACCIÓN DE ARN
RT - PCR
ELECTROFORESIS
COLECTA /TOMA DE MUESTRA
FLUJOGRAMA DE LA PRUEBA DE
GENOTIPIFICACIÓN DE VIH
No amplifica
ELECTROFORESIS
PURIFICACION Y CUANTIFICACIÓN DE PRODUCTOS DE PCR
SEGUNDO PCR(Primers alternativos)
No amplifica1a vez
INDETERMINADO
ANÁLISIS DE SECUENCIAS
REPORTE DE RESULTADO
Si amplifica
SECUENCIAMIENTO DE PRODUCTOS DE PCR
Si amplifica
SECUENCIAMIENTO CON PRIMERS ALTERNATIVOS
No amplifica2da vez
No hay secuencia1a vez
Hay secuencia
Hay secuenciaNo hay secuencia2da vez
INFORME DE RESULTADO
RT-PCRMuestra /
Separación de Plasma
Reporte Análisis de Datos
Electroforesis Extracción de ARN
Análisis de Datos
http://hivdb.stanford.edu/pages/algs/HIVdb.html
http://hivdb.stanford.edu/pages/algs/HIVdb.html
Por qué son útiles y necesarios los ensayos de Resistencia
• Asiste al médico en la toma de decisiones terapéuticas en distintos escenarios:– Clarifica los tratamientos disponibles– Selecciona los regímenes mas activos– Mejora el resultado clínico– Clarifica la etiología de los aumentos de carga viral– Reduce el uso de drogas inactivas.
• Provee beneficios a nivel de salud pública– Clarifica la epidemiología de la resistencia al HIV – reduce transmisión de virus resistentes– Permite mejorar las guías de tratamiento
• Asiste en el desarrollo de nuevas drogas terapéuticas
ß Dr Robert Grantß Robert Hanceß Maribel Acuñaß Carlos Yabarß Equipo del laboratorio de VIH y del Laboratorio de Biología
Molecular
AGRADECIMIENTOS