PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACION DE PROTEINAS EN … · para evaluar la resistencia de Pseudomonas aeruginosa al Cloro libre residual obteniendo resultados que demuestran que el tiempo

PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE DETERMINACION DE Pseudomonas aeruginosa EN AGUA POTABLE

TRATADA ENVASADA POR LA TECNICA DE SUSTRATO DEFINIDO (Pseudalert* NMP)

CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01

PÁGINA Página 1 de

16

PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE DETERMINACION DE Pseudomonas aeruginosa EN AGUA POTABLE TRATADA ENVASADA POR LA TECNICA DE SUSTRATO

DEFINIDO (Pseudalert* NMP)

ELABORÓ REVISÓ APROBÓ

REFERENTE DE LABORATORIO REPRESENTANTE DE CALIDAD

DIRECTOR (S) TECNICO (S)

SECRETARIO DE SALUD

REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN

PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE DETERMINACION DE Pseudomona aeruginosa EN AGUA POTABLE


CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

1. OBJETIVO

Establecer el Procedimiento para la Detección de Pseudomona aeruginosa por la Técnica de Sustrato Definido - Pseudalert* NMP - para el análisis microbiológico de las muestras de Agua Potable Tratada Envasada. 2. ALCANCE

El procedimiento permite la identificación de Pseudomona aeruginosa en Agua Potable Tratada Envasada, aplica a todas las muestras para análisis microbiológico que son recepcionadas y analizados en Laboratorio de Salud Pública. 3. DEFINICIONES Pseudalert*: Tecnología de Substrato Definido que detecta la presencia de

Pseudomona aeruginosa en aguas. El análisis se basa en la detección de una enzima bacteriana de Pseudomona aeruginosa que cataliza la hidrólisis del sustrato presente en el reactivo del Kit Pseudalert* , la Pseudomona aeruginosa crece y se multiplica con rapidez gracias al gran aporte en amino ácidos, vitaminas y otros nutrientes del reactivo, las cepas en crecimiento activo posee una enzima que hidroliza el sustrato del reactivo y produce una fluorescencia azul cuando se expone a la luz U.V. Pseudalert detecta bacterias Pseudomona aeruginosa a una concentración desde 1UFC en muestras de 100ml en 24 horas en agua no carbonatada y en 26 horas en muestras de agua carbonatada.

<Pseudomona aeruginosa: bacteria Gram-negativa, aeróbica, con motilidad

unipolar, no fermentador. Es un patógeno oportunista en humanos y también en

plantas, P. aeruginosa secreta una variedad de pigmentos como piocianina (azul

verdoso), fluoresceína (amarillo verdoso fluorescente) y piorubina (rojo pardo), cuya

producción evidencia su identificación, con habilidad de crecer a 42°C esta especies

es importante en la alteración de los alimentos y aguas.

NMP: El método del Número más probable (NMP) (Most probable number - MPN - en inglés), también conocido como el método de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia positiva/negativa.

ATCC = American Type Culture Collection. Rockville, EU. Es un material biológico de

referencia certificado. La colección certifica que se suministra una determinada cepa,

que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas

morfológicas, bioquímicas y moleculares.

http://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria

http://es.wikipedia.org/wiki/Gram-negativa

http://es.wikipedia.org/wiki/Flagelo_bacteriano

http://es.wikipedia.org/wiki/Flagelo_bacteriano

http://es.wikipedia.org/wiki/Fluoresce%C3%ADna



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

Agua Potable Tratada: El elemento que se obtiene al someter el agua de cualquier sistema de abastecimiento a los tratamientos físicos. \ químicos necesarios para su purificación, el cual debe cumplir los requisitos establecidos en esta resolución.

Aguas minerales naturales: Se definen como aquellas bacteriológicamente sanas que tienen su origen en un estrato o yacimiento subterráneo, y que brotan de un manantial en uno o varios puntos naturales o perforados.

Estas pueden distinguirse claramente de las restantes aguas potables debido a su naturaleza, caracterizada por el contenido de oligoelementos y otros componentes determinados por su pureza original, los cuales deben conservarse intactos protegiendo el acuífero contra la contaminación orgánica e inorgánica.

Aguas de manantial: Se definen como las potables de origen subterráneo que emergen espontáneamente en la superficie de la tierra, o se captan mediante labores practicadas para tal efecto, con las características naturales de pureza que permitan su consumo, previa aplicación de los mínimos tratamientos físicos requeridos para la separación de los elementos naturales inestables.

4. RESPONSABLES Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico de Alimentos, del Laboratorio Departamental de Salud Publica del Meta cumplir con los lineamientos establecidos en este documento, sin hacer ningún cambio que no esté debidamente documentado y autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de muestras. 5. GENERALIDADES

El grupo Pseudomonas, está constituido por bacilos aerobios gramnegativos y móviles, algunos de los cuales producen pigmentos solubles en agua. Las especies del género Pseudomonas se identifican sobre la base de varias características fisiológicas. Una de las propiedades más notables de Pseudomonas es la gran variedad de compuestos orgánicos que utilizan como fuentes de carbono y energía (ONTIVEROS, 1983). Se ha demostrado que Pseudomonas aeruginosa es capaz de sobrevivir y multiplicarse en aguas tratadas, esto debido a una densa capa polisacárido la cual establece una barrera no solo física sino química capaz de proteger a la bacteria de las moléculas e iones de Cloro libre residual (REILLY, 2000). En el Perú, Torres (1991), efectuó estudios para evaluar la resistencia de Pseudomonas aeruginosa al Cloro libre residual obteniendo resultados que demuestran que el tiempo de reducción del 99% de bacterias a la concentración de 1 mg/l de Cloro libre residual a pH 9 es aproximadamente dos veces menos efectivo que a pH 7, siendo de 100 y 35 minutos respectivamente. Por lo que



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

concluye que la presencia de Pseudomonas aeruginosa en el agua potable es de alto riesgo para la salud, en especial de los neonatos, pacientes hospitalizados e inmunodeficientes; debiendo ser considerado como un indicador de eficiencia de la desinfección, y ser incluida su detección y cuantificación en los análisis de rutina. En resumen, la presencia de este microorganismo es un indicador de la calidad del agua ya que su resistencia al cloro es superior a la de otros microorganismos aislados del agua (GUINEA, 1979; ONTIVEROS, 1983; APHA, 1995). 6. REFERENCIAS

AOAC Official Method 9223 Test Sustrato Definido

De acuerdo a la Resolución 12186 de 1991 Artículo 4 de las condiciones del agua potable tratada envasada:

7. DESARROLLO

7.1 FUNDAMENTO

7.1.1 SUSTRATO DEFINIDO- PSEUDALERT

El kit Pseudalert detecta la presencia de Pseudomona aeruginosa en muestras de agua embotellada, de agua de estanques, piscina y de agua termal. El análisis se basa en la detección de una enzima bacteriana de Pseudomona aeruginosa que cataliza la hidrólisis del sustrato presente en el reactivo del kit Pseudalert. Las bacterias Pseudomona aeruginosa crecen y se multiplican con rapidez gracias al gran aporte en aminoácidos, vitaminas y otros nutrientes del reactivo del kit Pseudalert. Las cepas en crecimiento activo de Pseudomona aeruginosa poseen una enzima que hidroliza el sustrato del reactivo y produce una fluorescencia azul cuando se expone a la luz UV. Pseudalert detecta bacterias Pseudomona aeruginosa a una concentración de 1 UFC en muestras de 100ml o 250ml, en 24 horas en muestras de agua no carbonatada y en 26 horas en muestras de agua carbonatada. 7.1.2 QUANTI-TRAY

El sistema utiliza el mismo modelo de distribución estadística de Poisson en que se basa la fermentación en tubos múltiples, pero utiliza muchas más submuestras (es decir, tubos) y realiza el trabajo automáticamente. El sellador Quanti-Tray distribuye automáticamente la mezcla de muestra y reactivo en pocillos discretos. Este proceso elimina el pipeteado manual de los métodos tradicionales.

El diseño con dos tamaños de pocillos Quanti-Tray/2000 aprovecha el mismo modelo de probabilidad usado por el procedimiento de dilución en serie de números más probables. Los pocillos de mayor tamaño funcionan como submuestras no diluidas; los pocillos



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

pequeños como submuestras diluidas. Sin embargo, no se requiere un diluyente. Los 97 pocillos de Quanti-Tray/2000 dan lugar a márgenes muy amplios de conteos (1 a 2.419) y a límites de confianza del 95% muy precisos. 7.2 MATERIALES Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.

7.2.1 Equipos Equipo Sellador Quanty Sealer-Sellador Modelo 2x

Incubadora a 38°C +/- 0.5

Lámpara de Luz Ultravioleta 365 nm

7.2.2 Insumos

Frascos estéril de 100ml Frascos estéril de 1000ml

7.2.3 Reactivos Agua destilada Reactivo Pseudalert*

Bolsas Quanti tray 2000. Pozos :grandes 49 , pequeños 48

7.2.4 Patrones Pseudomona aeruginosa ATCC 10145 o 27853

Escherichia. coli ATCC 25922

7.3 PROCEDIMIENTO

7.3.1 Controles y/o curvas de calibración Llene tres recipientes estériles con 100 ml de agua estéril, e inocule con un asa estéril los siguientes controles microbiológicos: Frasco 1: Control positivo: Cepa ATCC Escherichia coli Frasco 2: Control negativo: Cepa ATCC Pseudomonas aeruginosa



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

Nota: Para los controles los frascos serán esterilizados junto con el agua

7.3.2 Condiciones Ambientales y manejo de equipos

El acondicionamiento y manejo de equipos se realiza según hoja de vida (F-SA-18) de los mismos.

El análisis no exige condiciones ambientales específicas. 7.3.3 Condiciones Generales y Preparación de la Muestra Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-

SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.

Para el laboratorio de Microbiología de Alimentos deben entregarse tres (3) unidades

de cada muestra, una bolsa presentación mayor de 3L o un (1) botellón.

7.4 Descripción del Método

Detección de Pseudomona aeruginosa por la Técnica de Sustrato Definido - Pseudalert* NMP en muestras de Agua Potable Tratada Envasada. Mezclar la muestra de agua por 15 a 20 segundos con movimientos rotación. Servir en el frasco estéril de 100ml de la muestra en Cabina. Adicionar el contenido del vial de Pseudalert en su totalidad del sobre los 100ml de

agua (muestra) y Añadir 2 gotas de solución antiespumante.

Tapar y agitar el recipiente, asegurarse de que el reactivo se disuelva completamente. Mezclar por 15 a 20 segundos, dejar en reposo, mezclar nuevamente y verificar la

completa disolución del reactivo

Transferir del contenido del frasco (agua a analizar + reactivo) a una Bolsa Quati Tray



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

Tomar la bolsa Quanty tray colocarla en el porta bandeja del sellador Quanti tray y pasarla a traves del sellador con los pozos hacia abajo con la bandeja de soporte de abajo hacia arriba

Llevar la Bandeja de incubación a 38°C ± 0.5ªC por 24 horas. Los resultados son

válidos hasta. Transcurridas 28 horas.

7.4.1 Lectura

Realizar la Lectura de Pseudomona aeruginosa con fluorescencia usando la lámpara de luz UV a 365nm a distancia de unas 5 pulgadas (13cm) de la muestra, en un entorno oscuro. Apuntar el haz de luz en dirección contraria a los ojos y hacia la muestra. Contar cada uno de los pocillos Positivos evidenciados por presencia de Fluorescencia Azul contar por separado los pozos Grandes y Pozos pequeños con estos dos números referirse la tabla NMP para obtener el resultado.

Positivo Negativo

Interpolar los dos numeros ( Pozos grandes vsg Pozos pequeños ) en la tabla de

NMP y hallar el numero conicidente a estos que equivale al numero de microoganismos en 100 ml

Reportar asi Pseudomona = X microorganismso en 100 ml

(X = Numero hallado en la Tabla)

Si la totalidad de los Pozos Grandes y pequeños se presentan sin fluorescencia indica la no prescencia de Pseudomona en la muestra y se reportara

Pseudomona aeruginosa = 0 microorganismso en 100 ml

Rango de Medición: Desde 1 Microorganismos en 100 ml hasta 2419 Microorganismos

en 100 ml



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

7.4.2 Valores Máximos Aceptables

AGUAS POTABLE TRATADA ENVASADA: De acuerdo a la Resolución 12186 de 1991 Artículo 4 de las condiciones del agua potable tratada envasada:

NMP Pseudomonas aeruginosa

< 2/100ml

7.4.3 Obtención Resultados

Con la interpretación de cálculos, los resultados según correspondan se registran en:

Resultados Microbiológicos de Alimentos F-SA-75

Los resultados del control del método se registran en Control de calidad análisis microbiológico F-SA-101

8. VERIFICACIONES

8.1 Aseguramiento de Calidad Resultados Para demostrar la capacidad del laboratorio de detectar Pseudomona con el método

sustrato definido y los medios descritos en el Estándar internacional, realizar los siguientes controles con materiales de Referencia y analizarlos en las mismas condiciones que la muestra:

Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa

de siembra estéril e inoculo en 100 ml de agua estéril y sea procesada como una muestra (actividad 7.5)

8.2 Control de Calidad Interno

Control Positivo Pseudomona Incubar 100ml de agua destilada con de Cepa Pseudomona aeruginosa ATCC 10145 ò ATCC 27853mas el Reactivo Pseudalert servido en bolsa Quanty-Tray/2000 y rotulara Control Positivo.



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

Control Negativo para Pseudomona : Incubar 100ml de agua destilada con la de Cepa E Coli ATCC 25922 más el Reactivo Pseudalert servido en bolsa Quanty-Tray/2000 y rotulada Control Negativo Pseudomona

MATERIAL DE REFERENCIA RESULTADO PREVISTO PARAMETRO EVALUADO

Pseudomona

aeruginosa

ATCC 10145 ò

ATCC 27853

Pozos con Fluorescencia

azul

Positivo reactivo Pseudalert

E. coli ATCC 25922 Pozos Sin Fluorescencia

azul

Negativo reactivo Pseudalert

Agua Desionizada

Estéril

Pozos Sin Fluorescencia

azul

control Negativo del reactivo

Registrar en los formatos

F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas

F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos

F-SA-34 Control Interno de Equipos

F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos.

F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

Criterio de Aceptación o Rechazo

CRITERIO LECTURA RANGO DE ACEPTACION ACCION PARA

INCUMPLIMIENTO DE CRITERIOS

Control Negativo de Reactivo

El control negativo no debe presentar cambio de color en los pozos ni Fluorescencia.

Pseudomona = 0 microorganismso en 100 ml

Repetir Análisis Verificar proceso de limpieza y desinfección de material

Control Positivo Pseudomona ATCC 10145 ò ATCC 27853

Verificar el Crecimiento en el control Positivo el cambio de color en los pozos pasando de incoloro a amarillo y sin presentar fluorescencia al exponerse a la luz UV

Pseudomona = >2419 microorganismos en 100 ml

Repetir siembra de cepas ATCC y

repetir el Análisis

Control Negativo para Pseudomona Cepa E. coli ATCC 25922

Verificar la presencia de fluorescencia Azul al exponerse a la luz UV

Pseudomona = 0 microorganismos en 100 ml

Verificar Material Repetir siembra de

cepas ATCC Repetir Análisis

Reactivos vigentes Vigencia del reactivo dentro de la fecha

Reactivo Vigente a la fecha de utilización

Descartar Reactivos y adquirir y procesar con reactivos en fechas vigentes

Temperaturas de Incubadoras

Temperatura ajusta a 38ºC +/- 0.5

Temperatura 38ºC +/- 0.5

Ajustar control de Temperatura y tomar nuevamente hasta obtener temperatura deseada.

Mantenimiento de equipos

Calibración, verificación y mantenimiento vigente

Calibración, verificación y mantenimiento vigente

Solicitar y ejecutar los mantenimientos o verificaciones pendientes para realizar análisis con equipos idóneos

Control de Esterilización de Material

Verificar la fecha de esterilización de Material que no supere 8 días, verificar la cinta indicadora de esterilización su viraje.

Fecha de esterilización de Material que no supere 8 días. Cinta indicadora de esterilización con viraje.

Descartar el Material y realizar el proceso con material que cumpla la fecha y el viraje de la cinta.

Los resultados de los controles se registran en el Control De Calidad Análisis Microbiológico F-SA-101



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

9. REGISTROS

Registro Responsable Como

conservarlo Donde conservarlo

Tiempo de conservación

Disposición final

F-SA-18 Hoja de Vida de

Equipos

Profesional

Universitario o Profesional del

Laboratorio

Físico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o

tabla de retención documental





F-SA-34 Control Interno

de Equipos.

Auxiliar de

Laboratorio, Profesional


Laboratorio

Físico







F-SA-46 Control De

Temperatura, Limpieza y

Desinfección de Equipos

Auxiliar de



Laboratorio

Físico







F-SA-64 Identificación de Sustancias

Químicas

Auxiliar de



Laboratorio

Físico







F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos

Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio

Físico

Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental





CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

Registro Responsable Como

conservarlo Donde conservarlo

Tiempo de conservación

Disposición final

F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico

Profesional del Laboratorio

Físico




10.1 Tabla NMP



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

10.2 ANEXO 2

N. RESPONSAB

LE ACTIVIDAD FLUJOGRAMA REGISTRO

1 INICIO

2 ANALISTA

Verificar la identificación y numeración de las muestras que ingresan con cada Acta de toma de Muestra

3 ANALISTA

Realizar el registro de la muestra que ingresa en el Libro Resultados Microbiológicos de Alimentos

Registro de Libro Resultados

Microbiológicos de Alimentos

4 ANALISTA

Marcar los frascos estériles y Bolsas Quanti tray 2000 con el número de la muestra a analizar

5 ANALISTA

Mezclar la muestra de agua por 15 a 20 segundos con movimientos rotación

6 ANALISTA

Servir en el frasco Schott 100ml de la muestra en Cabina de flujo laminar

Registro de Control de uso cabina de Flujo

Laminar

7 ANALISTA

Adicionar el contenido del vial de Pseudalert en su totalidad sobre los 100ml de agua y

Añadir 2 gotas de solución antiespumante

8 ANALISTA

Mezclar por 15 a 20 segundos, dejar en reposo, mezclar nuevamente y verificar la completa disolución del reactivo

Marcar los frascos estériles y Bolsas Quanti tray 2000 con el número de la muestra a analizar.

Registrar en Libro Resultados Microbiológicos de Alimentos

Verificar identificación y numeración de las muestras

INICIO

Mezclar la muestra de aguas 15 a 20 segundos

Servir en el frasco Schott 100 ml de la muestra .

Adicionar el contenido del vial de Pseudalert.+ 2 gotas de antiespumante

Mezclar hasta la completa disolución del reactivo.



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

N. RESPONSAB

LE ACTIVIDAD FLUJOGRAMA REGISTRO

9 ANALISTA

Transferir del contenido del frasco (agua a analizar + reactivo) a una Bolsa Quati Try

10 ANALISTA

Tomar la bolsa Quanty try colocarla en el porta bandeja del sellador Quanti try y pasarla a traves del sellador con los pozos hacia abajo con la bandeja de soporte de abajo hacia arriba

Registro Control de Limpieza y

desinfección de equipos

11 ANALISTA

Llevar la Bandeja de incubación a 38°C ± 0.5ªC por 24 horas. Los resultados son válidos hasta. Transcurridas 28 horas.

Registro Control de Temperaturas de

Incubadoras

12 ANALISTA

Realizar la lectura de Pseudomona contando el numero de pozos grandes y pequeños que presentan Fluorescencia Azul al exponer la Bandeja a la luz UV de 365nm en cuarto oscuro pasar el dato a la tabla de NMP (anexo 1) interpolar los 2 numeros (pozos grandes vsg pozos pequeños) y obtener el numero coincidente a estos que indica el numero de micoorganismos en 100ml reportar: Pseudomona = X microorganismso en 100 ml

Registro de Resultados Análisis Microbiológico de

Aguas de estanques de Piscina

Sistema Integral de

Información en Salud modulo

Laboratorio

16

FIN

13. HISTORIAL

VERSIÓN

VIGENCIA

IDENTIFICACIÓN DE LOS CAMBIOS

1

22/07/2016

Versión inicial

FIN

Transferir el contenido del frasco schott a una Bolsa Quanti Try

Tomar la bolsa Quanti Try colocarla en el porta Bandejas del sellador Quanty try y pasarlo a través del sellador

Llevar la Bandeja de incubación a 38°C ±

0.5ªC por 24 horas

Realizar la lectura de Pseudomona contando el numero de pozos grandes y pequeños que presentan Fluorescencia pasar el dato a la tabla de NMP (Anexo 1) e interpolar los números para obtener el número de microorganismos

FIN



CODIGO P-SA-82

FECHA DE EMISIÓN

22/07/2016

VERSIÓN 01


16

Documents

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACION DE PROTEINAS EN … · para evaluar la resistencia de Pseudomonas aeruginosa al Cloro libre residual obteniendo resultados que demuestran que el tiempo