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PRODUCCIÓN BIOLÓGICA DE NANOPARTÍCULAS DE ÓXIDO DE SILICIO
UTILIZANDO ESCOMBROS PROCEDENTES DE CONSTRUCCIONES DEL ÁREA
METROPOLITANA DE BUCARAMANGA
JAHIR OSWALDO VARGAS DOMINGUEZ
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2019
ii
PRODUCCIÓN BIOLOGICA DE NANOPARTÍCULAS DE OXIDO DE SILICIO
UTILIZANDO ESCOMBROS PROCEDENTES DE CONSTRUCCIONES DEL ÁREA
METROPOLITANA DE BUCARAMANGA
JAHIR OSWALDO VARGAS DOMINGUEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito para optar al título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
Director
JORGE DANIEL OSORIO MARQUEZ
Microbiólogo
Est. Maestría en Estadística Aplicada
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA
2019
iii
iv Dedicatoria
Dedico este libro principalmente a mis padres, Rafael Vargas y a Roció Domínguez, por
brindarme su amor, voz de aliento, esfuerzo y compromiso para poder lograr este gran sueño, por
enseñarme día a día el significado de las palabras constancia, sacrificio, dedicación y
responsabilidad, por la educación que siempre me brindaron, que a pesar de las diversas
circunstancias que se presentaron y a la distancia siempre estuvieron presentes aconsejándome y
guiándome por un buen camino.
A mi abuela Fabiola González, a quien me acompañó día a día en este largo camino,
quien fue testigo de cada uno de los sacrificios por los que tuve que pasar para poder llegar hasta
este punto; a mis hermanos Luis Humberto, Andrés Felipe y Nicolle Valeria, quienes fueron un
motivo para superarme cada día y no dejarme vencer por diversas situaciones que se me
presentaron.
v Agradecimientos
En primer lugar, gracias a Dios por brindarme la salud, la vida y darme la bendición de
poder tener y disfrutar una familia la cual me apoyó en cada decisión durante esta etapa de mi vida,
a mis padres y hermanos por confiar en mí y por haber estado presentes en este largo recorrido,
quienes fueron el motivo y la inspiración para lograr y cumplir este sueño; gracias a la vida porque
hasta la fecha sigue demostrándome lo grandiosa y justa que puede llegar a ser siempre y cuando
se obre de buena fe.
Al ser más especial, bondadoso, comprensible y amoroso, mi abuela Fabiola González,
quien significa un todo en mi vida, gracias a sus lágrimas, desvelos, consejos, enseñanzas,
aceptación, regaños y su apoyo incondicional, los cuales fueron un pilar durante todo el trascurso
de mi carrera, gracias por ser mi guía cuando veía las tinieblas, en ti quedan mis más grandes
secretos, ocurrencias, andanzas y triunfos; a mi tío Luis Eduardo Dominguez por brindarme su
apoyo incondicional, sus sabios consejos y por ser una guía en este largo caminar.
A mi tutor Jorge Daniel Osorio, quien aportó grandes conocimientos tanto en lo profesional
como en lo personal, por su dedicación, constancia, compromiso y paciencia que me brindó en
esta etapa de mi vida; a todo el componente administrativo de Tecnoparque nodo Bucaramanga en
especial a Gabriela Rodríguez González, quien mediante su gestión, profesionalismo, compromiso
este proyecto fue posible.
vi A mis amigos Daniela Rojas, Nathalia Hernández, Katrin Campuzano, Eduardo
Peñaranda, Karen Torres, Gaadmerary Riaño, Iván Marin y demás amigos y compañeros, quienes
siempre estuvieron presente en momentos decisivos, que mediante sus consejos y su compañía
aportaron un grano de arena para poder lograr este sueño; agradecimientos a un ser que hoy en
día no está presente, pero que en su momento significó inspiración, esfuerzo, compromiso y amor
por lo que hacía, a quien agradezco inmensamente por haber estado en mi proceso de formación;
a la señora Janeth Sierra y al señor Juan Carlos Cajias quienes me brindaron su apoyo, mediante
palabras de aliento, sabios consejos y sus experiencias de vida fueron un soporte en un momento
difícil que tuve que pasar.
Muchas Gracias a todos por hacer parte de este sueño, a ustedes les dedico y les agradezco
por servir como motivación para lograr este sueño, gracias por cada una de las cosas que me
brindaron en su momento, Dios y la Virgen los bendiga; este título también es de ustedes.
vii Tabla de Contenido
Capítulo 1
1. Introducción………………………………………………………………….......16
2. Planteamiento del problema……………………………………………………...19
3. Justificación……………………………………………………………………...22
4. Marco teórico…………………………………………………………………….23
5. Marco legal…………………………………………………………………….....32
6. Marco Referencial………………………………………………………………..33
7. Objetivos…………………………………………………………………………36
Capítulo 2
8. Metodología…………………………………………………………………...…37
Capítulo 3
9. Resultados y discusión…………………………………………………………...44
10. Conclusiones……………………………………………………………………..68
11. Recomendaciones………………………………………………………………..69
12. Bibliografía………………………………………………………………………70
13. Anexos…………………………………………………………………………...76
viii Lista de tablas
Tabla 1. Nomenclatura utilizada para el nombramiento de aislados de RCD...............................39
Tabla 2. Condiciones generales para la obtención de biomasa………………………….………40
Tabla 3. Condiciones generales para la síntesis de NPs según el microorganismo……….………43
Tabla 4. Parámetros operacionales del ZETASIZER-Nano Series ZS90/Malvern para determinar
tamaño y carga de NPs……………………………………………………………………………43
Tabla 5. Nomenclatura para la identificación de los aislados obtenidos a partir de
RCD…………………………………………………………………………………………...…46
Tabla 6. Biomasa obtenida de cada uno de los aislados (Bacterias, Hongos filamentosos y hongos
levaduriformes), esto se determinó mediante la aplicación de la fórmula de peso
húmedo………………………………………………………………………………………..….47
Tabla 7. Microrganismos sintetizadores de NPs reportado por Xiaolei Zhang, Song Yan y Tyagi
Surampalli………………………………………………………………………..………………53
Tabla 8. Medición de Potencial Z………………………………………………………………..67
ix Lista de figuras
Figura 1. Área y puntos de muestro para conformar una muestra aleatorizada…………………..37
Figura 2. Procedimiento para el aislamiento de microorganismos provenientes de RCD………..38
Figura 3. Microorganismos aislados a partir de residuos de construcciones……………………..46
Figura 4. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5 y Absorbancia de la cepa CRCDB2
en 3 diferentes tiempos…………………………………………………………………………...52
Figura 5. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5 y Absorbancia de la cepa CRCDB5
en 3 diferentes tiempos…………………………………………………………………………...52
Figura 6. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5 y Absorbancia de la cepa CRCDB7
en 3 diferentes tiempos…………………………………………………………………………...52
Figura 7. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5 y Absorbancia del control
negativo………………………………………………………...………………………………...52
Figura 8. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa
CRCDB2 en 6 diferentes tiempos en medio Neutro………………………………………………59
Figura 9. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa
CRCDB2 en 6 diferentes tiempos en medio ácido………………………………………………59
Figura 10. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa
CRCDB5 en 6 diferentes tiempos en medio Neutro………………………………………………59
Figura 11. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa
CRCDB5 en 6 diferentes tiempos en medio ácido………………………………………………59
Figura 12. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa
CRCDB7 en 6 diferentes tiempos en medio Neutro………………………………………………60
x
Figura 13. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa
CRCDB7 en 6 diferentes tiempos en medio ácido………………………………….………….…60
Figura 14. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH del control
negativo en 6 diferentes tiempos en medio Neutro………………………………………………60
Figura 15. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH del control
negativo en 6 diferentes tiempos en medio ácido…………………………………..……………60
Figura 16. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB2 (T6) evaluando
pH=6.5…………………………………………………………………………………………...62
Figura 17. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB2 (T6) evaluando
pH=7.5…………………………………………………………………………………………...62
Figura 18. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB5 (T6) evaluando
pH=6.5…………………………………………………………………………………………...63
Figura 19. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB5 (T6) evaluando
pH=7.5…………………………………………………………………………………………...64
Figura 20. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB7 (T6) evaluando
pH=6.5…………………………………………………………………………………………...65
Figura 21. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB7 (T6) evaluando
pH=7.5…………………………………………………………………………………………...66
11
Lista de imágenes
Imagen 1. Escala nanométrica…………………………………………………………..24
Imagen 2. Métodos físicos y químicos para la obtención de NPs………………………..29
Imagen 3. Muestras después de la medida de la distribución del tamaño de partícula…....41
Imagen 4. Celda usada para medir la carga de las NPs (Z-siZer)………………………...42
Imagen 5. Área de maestro, puntos de recolección de muestra……………………..……44
Imagen 6. Pretratamiento de la arenilla para el aislamiento de microorganismos………..45
Imagen 7. Agua estéril suplementado con 4% de arenilla…………………………..……48
Imagen 8. Kit para determinar sílice soluble modelo Si-5 marca HACH…………...……50
Imagen 9. Sputtering utilizado para realizar el recubrimiento con oro de las muestras…..54
Imagen 10. Microscopia electrónica de barrido SEM de la cepa CRCDB2………...……55
Imagen 11. Microscopia electrónica de barrido SEM de la cepa CRCDB5…………..….56
Imagen 12. Microscopia electrónica de barrido SEM de la cepa CRCDB7……..……….56
12
Resumen
Título: Producción biológica de nanopartículas de óxido de silicio utilizando escombros
procedentes de construcciones del área metropolitana de Bucaramanga
Autor: Vargas Domínguez, Jahir Oswaldo
Palabras Clave: Nanopartículas de silicio, Síntesis Biológica, Escombros, Biotecnología,
Microorganismos
Descripción:
Las nanoparticulas (NPs) son partículas compuestas por átomos y moléculas de
dimensiones inferiores a 100 nm. En los últimos años los microorganismos tales como
levaduras, hongos filamentosos y en especial, las bacterias han sido utilizados como una
alternativa amigable con el medio ambiente para la síntesis de estos nanocompuestos.
En este trabajo se aislaron 15 microorganismos a partir de residuos de construcciones y
demoliciones (RCD), depositados en la escombrera el Parqué S.A. Posteriormente, se
determinó la capacidad biosintetizadora de nano partículas de óxido de silicio de estos
microorganismo por medio de ensayos; para losgrarlo inicialmente se obtuvo una biomasa
de cada uno de los microorganismos aislados, y se ´puso en contacto con el residuo
pulverizado en agua destila para identificar por medio de óxido de silicio soluble, pH cada
72 horas y verificación de formación de estas nan partículas por medio se SEM para con
el fin de observar el comportamiento del microorganismo expuesto al material inoculado.
De esta manera se seleccionaron las cepas CRCDB2, CRCDB5 y CRCDB7, las cuales
presentaron variaciones en el sílice soluble, el pH, lo cual permitió inferir que estas cepas
poseían la capacidad de sintetizar NPs; para comprobar dicha actividad se realizó un diseño
13
de experimentos, en el que se evaluó el silicio disuelto y pH cada 24 horas durante 6 días;
los para establecer la eficiencia de este proceso de cada bioensayo se las nanopartículas
formadas mediante técnicas como DLS para determinar el tamaño de las NPs y potencial
Z para establecer la carga de las NPs sintetizadas; es así como se concluye que estas cepas
poseen dicha capacidad sintetizando NPs de Oxido de Silicio tanto de primera como de
segunda generación.
14
Abstract
Title: Biological production of silicon oxide nanoparticles using debris from buildings in
the metropolitan area of Bucaramanga
Author: Vargas Domínguez, Jahir Oswaldo
Key words: Silicon nanoparticles, Biological synthesis, Debris, Biotechnology,
Microorganisms
Description:
Nanoparticles (NPs) are particles composed of atoms and molecules of dimensions less
than 100 nm. In recent years, microorganisms such as yeasts, filamentous fungi and in
particular, bacteria have been used as a friendly alternative to the environment for the
synthesis of these nanocomposites.
In this work, 15 microorganisms were isolated from construction and demolition waste
(RCD), deposited in the El Parqué S.A. Subsequently, the biosynthetic capacity of nano
particles of silicon oxide of these microorganism was determined by means of tests; to
obtain it initially a biomass of each of the isolated microorganisms was obtained, and it
was put in contact with the residue sprayed in distilled water to identify by means of soluble
silicon oxide, pH every 72 hours and verification of the formation of these nan particles.
by means of SEM for the purpose of observing the behavior of the microorganism exposed
to the inoculated material.
In this way, strains CRCDB2, CRCDB5 and CRCDB7 were selected, which showed
variations in soluble silica, pH, which allowed us to infer that these strains had the ability
to synthesize NPs; To verify this activity, an experimental design was carried out, in which
the dissolved silicon and pH were evaluated every 24 hours for 6 days; the ones to establish
the efficiency of this process of each bioassay were the nanoparticles formed by techniques
such as DLS to determine the size of the NPs and Z potential to establish the load of the
15
NPs synthesized; This is how it is concluded that these strains have this capacity by
synthesizing NPs of Silicon Oxide both first and second generation.
16
Capítulo I
1. Introducción
La nanotecnología es una disciplina de la ciencia que se encarga del estudio,
producción, manipulación y desarrollo de materiales en un rango dimensional de 1 a 100
nm (Nanómetros) llamados nanopartículas (NPs) (Santos, Troncoso, & Lamilla, 2017), la
materia, al ser manipulada a una escala manométrica le permite ser de carácter transversal
y tener aplicaciones en diversos sectores, dentro de un contexto multidisciplinario. Uno de
los objetivos principales de la nanotecnología es promover el desarrollo humano y mejorar
la calidad de vida (Tahrioui & Ouahid Hessissen, 2016). La nanotecnología demuestra
mediante sus aportes científicos las diversas aplicaciones que poseen las nanopartículas,
los cuales incluyen ingeniería, electrónica, medicina, industria farmacéutica, microbiología
y medio ambiente, entre otras. Esta nueva disciplina científica proporciona un crecimiento
inteligente, sostenible e inclusive para el desarrollo de nuevas soluciones en el diagnóstico
y prevención del crecimiento de microorganismos patógenos, el tratamiento de
enfermedades y sustitución de elementos para la elaboración de equipos electrónicos.
Es por ello, que la nanotecnología es uno de los campos que estimula mayor interés
científico en el siglo XXI. Gracias a sus aportes investigativos, se han generado productos
a partir de nanomateriales (nanopartículas, nanocompuestos, nanotubos, etc), cuya
finalidad es la sustitución de materiales y reactivos químicos que puedan resultar costosos
o perjudiciales para el medio ambiente a tal punto, que ya existe un consenso en la
17
comunidad científica en que la nanotecnología dará origen a la revolución industrial del
siglo XXI, tal como lo dijo Charles M. Vest’s Ex-Presidente del MIT (Massachusetts
Institute of Technology) en un discurso del año 2001 (Alas Orozco, 2018).
Las nanoparticulas (NPs) son partículas compuestas por átomos y moléculas de
dimensiones inferiores a 100 nm, las propiedades de estos materiales y su posterior uso
depende del tamaño, estabilidad y estructura (amorfas, cristalina, esférica o triangulares)
(Salunke, Sawant, Lee, & Kim, 2016). Al ser de tamaños tan pequeños varían las
propiedades físicas, químicas y biológicas de las partículas, ocasionando que tengan
propiedades ópticas, eléctricas y magnéticas que difieren sustancialmente de otras
partículas más grandes de un mismo elemento. Por lo general, las nanopartículas son
estructuras elaboradas artificialmente a base de carbono y metales como oro, plata, silicio,
cadmio y Zinc, entre otros (O., Pethica, Pidgeon, Porritt, & Ryan, 2004).
El estudio de estos nanocompuestos se ha centrado en la síntesis de NPs mediante
la implementación de diversos métodos tales como los Bottom-Up (Métodos químicos, de
abajo hacia arriba), Top-dowm (Métodos físicos, de arriba hacia abajo) y Métodos
biológicos usando microorganismos y plantas; lo cual ha permitido la síntesis y producción
de diversos tipos de NPs con el fin de controlar características esenciales como:
composición química, estructura y tamaño. La necesidad de buscar tecnologías más
económicas y amigables con el medio ambiente, contribuyó en la implementación y
desarrollo biotecnológico en la obtención de NPs, siendo esta una nueva herramienta
18
innovadora para estudiar, sintetizar e investigar la aplicabilidad y flexibilidad de estos
nanocompuestos, manteniendo las características principales de las mismas y su función
de acuerdo al área de aplicación.
Hoy en día existen diversos estudios en donde se han reportado microorganismos
tales como bacterias, levaduras y hongos, juegan un papel importante en la remediación de
metales tóxicos a través de la reducción de iones metálicos (Botello, Garza, & Gomes de
la Fuente, 2007). Uno de los estudios más recientes en donde más se reportan este tipo de
actividades por parte de microorganismos fue realizado en 2017 por Andrés Santos,
Claudia Troncoso y sus colaboradores en donde describen diversos microorganismos como
biosintetizadores de NPs y su posible ruta metabólica para llevar a cabo este proceso. Es
por ello, que este proyecto se sintetizó NPs de silicio empleando microorganismos aislados
de residuos utilizando como sustrato escombros de construcciones depositados en la
escombrera el Parqué en Bucaramanga Santander.
19
2. Planteamiento del problema
Una de las acciones por la cual Bucaramanga se considera una ciudad en pro del
desarrollo, es por el gran aumento de habitantes en los últimos 5 años (Financial Times,
2015), es por esto que la demanda de viviendas se ha incrementado y por consecuencia de
esto la producción de desechos de construcciones ha venido dándose en grandes
proporciones sin que las autoridades ambientales tengan control sobre la disposición final
de los mismos. Bucaramanga y su área metropolitana actualmente solo cuenta con un sitio
autorizado para la disposición de los Residuos de Construcción y Demolición-RCD en el
municipio de Bucaramanga, según el PGRIS 2016-2027 la cantidad anual de residuos de
construcción y demolición generados en el área metropolitana de Bucaramanga es de
aproximadamente 4.642,32 toneladas por año, en algunas ocasiones son depositados en la
escombrera “ EL PARQUE S.A.” entidad privada destinada para la disposición final con
un área de recepción de 3.200.000 m3, en donde no se dispone de infraestructura, ni
tampoco de estudios de mercado que permitan evidenciar diferentes alternativas para
aprovecharlos ( SALUD PUBLICA Y SANEAMIENTO AMBIENTAL, 2015).
El botadero “EL PARQUE S.A” fue sellado el viernes 20 de marzo de 2015 por
las autoridades ambientales competentes ya que presentaba problemas como,
contaminación, quemas de los residuos inservibles que van acompañados de escombros y
la no delimitación del predio por parte de los responsables, además de esto no contaban
con el permiso ambiental para la recepción y disposición de este material (Rendon Jaimes,
2015), la autoridad ambiental que ejerce jurisdicción sobre el lugar donde está ubicado el
20
botadero de Tierra El Parque S.A. es el Área Metropolitana de Bucaramanga; de acuerdo
al Decreto 2041 del 2014 y el Decreto 1076 del 2015, este tipo de actividades no requieren
licencia ambiental pero si un permiso (MINAMBIENTE, 2017). Sin embargo, el área
metropolitana de Bucaramanga mediante la subdirección ambiental expidieron el oficio
número 2427 el 7de mayo del 2015 el cual le permite el manejo y recepción de los RCD y
mediante este la reapertura de este botadero, a pesar de ello, en este periodo el sellamiento
de esta escombrera provoco que diferentes empresas tuvieran que depositar estos desechos
en el relleno sanitario el carrasco, lo cual ocasiona una diminución en la vida útil del sitio
de disposición final y un problema ambiental por la mezcla de residuos orgánicos con RCD
( Salud Publica Y Saneamiento Ambiental, 2015).
Los residuos generados se están disponiendo en diferentes lugares como parques,
orillas de ríos o lotes baldíos, sin que las autoridades competentes o gubernamentales
tengan control sobre los mismos y de esta manera generando problemas como la
contaminación de quebradas o ríos, proliferación de roedores y la creación de botaderos
clandestinos de residuos orgánicos ocasionando malos olores y poniendo en riesgo la salud
publica en diferentes puntos del área metropolitana de Bucaramanga, la Emab (Empresa
de aseo de Bucaramanga) para el 2017 emitió una alerta a las entidades ambientales
gubernamentales en donde informo sobre la grave contaminación que se venía presentado
por la disposición de residuos sobre la cuenca en la quebrada La Ronda en Floridablanca
Santander, además de esto para 2016 informo el riesgo que amenaza la escarpa occidental
en los barrios Santander, Pío XII, 12 de octubre en donde se evidencia un deterioro en
21
algunos de los taludes y se teme que ocurra deslizamientos masivos de tierra debido a la
erosión del suelo a causa de estos residuos, otro de los barrios que presenta esta
problemática es la calle 34 con carrera décima y once de La Cumbre en donde se encuentra
un lote baldío que es utilizado como botadero ilegal de escombros, desechos y tierra
(Gomez Buitrago, 2017).
22
3. Justificación
A través de esta investigación se quiere dar un valor agregado a estos desechos de
construcciones los cuales poseen materiales que contienen alta presencia de óxido de silicio
los cuales no tiene ninguna utilidad en el botadero El parque S.A. mediante el
aprovechamiento de la actividad biológica de microorganismos autóctonos para la
biosíntesis de NPs de silicio, las cuales pueden ser comercializadas a diversas industrias
dependiendo las características que tomen de estas NPs al final del proceso de
biotransformación del RCD, y de forma paralela se convierte en una estrategia para mitigar
el impacto ambiental causado por la disposición de estos residuos.
23
4. Marco Teórico
4.1 Nanotecnología
La nanotecnología es una disciplina de la ciencia que se encarga del estudio, diseño,
síntesis, función y aplicación de estos nanomateriales en diferentes sectores; a través de la
manipulación de la materia a escala nanométrica, esto permite la que la distribución de sus
átomos y moléculas les confieran propiedades totalmente nuevas e innovadoras. Por lo
tanto, científicos utilizan la nanotecnología para crear materiales, aparatos y sistemas
novedosos y poco costosos con propiedades únicas (Alas Orozco, 2018).
4.1.1 Inicios de la nanotecnología.
Uno de los pioneros en el campo de la Nanotecnología es el Físico estadounidense
Richard Feynman, que en el año 1959 en un congreso de la sociedad americana de Física
en Calltech, pronunció el discurso “There’s Plenty of Room at the Bottom” (Hay mucho
espacio ahí abajo) en el que describe un proceso que permitiría manipular átomos y
moléculas en forma individual, a través de instrumentos de gran precisión, de esta forma
se podrían diseñar y construir sistemas en la nanoescala átomo por átomo, en este discurso
Feynman también advierte que las propiedades de estos sistemas nanométricos, serían
distintas a las presentes en la macroescala (González, 2016).
En 1981 el Ingeniero estadounidense Eric Drexler, inspirado en el discurso de
Feynman, publica en la revista Proceedings of the National Academy of Sciences, el
artículo “Molecular engineering: An approach to the development of general capabilities
24
for molecular manipulation” en donde describe en detalle lo descrito años anteriores por
Feynman. Además de Drexler, el científico Japonés Norio Taniguchi, utilizó por primera
vez el término nano-tecnología en el año 1974, en la que define a la nanotecnología como
el procesamiento, separación y manipulación de materiales átomo por átomo (La
nanotecnología; 2018, Agosto 20; http://www.nanotecnologia.cl/que-es-nanotecnologia).
4.2 Nanopartículas
Las nanoparticulas (NPs) son partícula nanoscópica compuestas por átomos y
moléculas cuyas dimensiones se encuentran en una escala escala mesoscópica,
generalmente citado con una variación entre 1 a 100 nm las cuales pueden tener diferentes
tamaños y su morfología puede variar según su estructura, estas pueden ser amorfas,
cristalina, esférica o triangulares variando su función de acuerdo a su estructura (Beltrán
Flores, 2015); estas pueden estar constituidas por de diferentes elementos como oro, Zinc,
plata, cobre, titanio, silicio, entre otros y también se pueden dividir en NPs de primera
generación (entre100 y 10 nm) y las de segunda generación (entre 10 y 1 nm) ver imagen
1 (Pedroso & Guillen, 2006).
Imagen 1. Escala nanométrica. Recuperado de http://www.solucaoaulas.com/publicacoes/nanotecnologia-e-
saude-do-trabalhador-uma-relacao-potencialmente-perigosa/
25
4.2.1 Propiedades
4.2.1.1 Propiedades Físicas
Las propiedades físicas de las NPs dependen de su forma, tamaño, estructura
interna y las características de superficie que pueden alcanzar una gran complejidad debido
a la composición de cada una de ellas, lo cual determina la distribución en el medio donde
se encuentren dando lugar a la agrupación o dispersión, en función de las fuerzas de
atracción o repulsión que medien entre ellas (Llamosa Pérez, 2014).
Las nanopartículas poseen dos propiedades que caracterizan la interacción materia-
radiación: esparcimiento y absorción, en donde el esparcimiento en un proceso elástico en
el que la materia re-emite la onda de luz incidente, mientras que la adsorción convierte la
energía incidente en otro tipo de energía lo que les confiere (Castillo Rivera & Pérez López,
2016).
Súper paramagnetismo (Fe, Co, Ni).
Conversión de algunos metales en semiconductores (ZnO, Si); algunos
semiconductores se convierten en aislantes.
Fluidos con propiedades magnéticas.
Fotoluminiscencia efecto cuántico.
Incremento de la absorción de la radiación solar con la disminución del tamaño de
la nanopartículas.
Elevada conductividad eléctrica y térmica, como la plata; baja conductividad
eléctrica y térmica de otras nanopartículas como el oro.
26
Modificación de las propiedades electrónicas.
4.2.1.3 Propiedades químicas
Las nanopartículas presentan propiedades químicas importantes, una de ellas es el
auto ensamblado y la capacidad de actuar como catalizadores. Su alta reactividad química
es originada a partir de su superficie específica y del número de átomos en la superficie, lo
que les proporciona una alta producción de energía (Cornejo, 2015).
4.2.1.4 Propiedades mecánicas
Las propiedades mecánicas de las nanopartículas varían según el tamaño, a escala
nanométrica su estructura atómica le proporciona una mayor resistencia y a su vez les
confiere propiedades mecánicas superiores a las de los macromateriales, haciéndolas más
funcionales y eficientes incrementando su dureza y resistencia (Cornejo, 2015).
4.2.3 Aplicaciones
Diversas investigaciones han logrado el desarrollo e implementación de NPs en
diferentes campos, debido a sus propiedades físicas, químicas, mecánicas y ópticas, lo que
les permite estar inmersas en áreas como:
4.2.3.1 El medio ambiente
Involucra el impulso de materiales y procesos no contaminantes para el tratamiento
de aguas residuales, desanilización de agua, descontaminación de suelos, procesamiento
27
de residuos, reciclaje de sustancias, nanosensores para la detección de sustancias químicas
o gases tóxicos presentes en un ecosistema (Romero, 2015).
4.2.3.2 La industria energética
Mejoramiento de los sistemas de producción y almacenamiento de energía limpias
y renovables como la energía solar, aumentando la eficiencia de las celdas solares mediante
biopeliculas compuestas por nanopartículas de Silicio, además la innovación de
tecnologías que ayuden a disminuir el consumo energético a través de la creación de nuevos
materiales más eficientes y menos costosos que ayuden a la creación de nuevos métodos
para la obtención de energías limpias (Gómez Villarraga, 2014).
4.2.3.3 Medicina
Desarrollo de nanotransportadores de fármacos a sitios específicos del cuerpo, que
pueden llegar a ser útiles para tratamiento del Cáncer u otras enfermedades que hoy son
difíciles de tratar, para ello se desarrollan y estudian nanobots programados para identificar
y destruir <células tumorales, también, existe el desarrollo de biosensores moleculares con
capacidad de detectar sustancias de interés que sirvan para el diagnóstico de una patología
(Moghaddam, Md Tahir, & Azizi, 2015).
4.2.3.4 Agroindustria
Aplicación de nanosensores útiles en el aseguramiento de la calidad, dispositivos
que funcionen para la detección de frescura y vida útil de un alimento, detección de
28
microorganismos patógenos, aditivos, fármacos, metales pesados, toxinas y otros
contaminantes, desarrollo de plaguicidas, herbicidas, fertilizantes, mejoramiento de suelos,
nanosensores en la detección de niveles de agua, Nitrógeno , agroquímicos, etc (V Duncan,
2011).
4.2.3.5 Industria textil
Desarrollo de tejidos que repelen las manchas y sean autolimpiables, antiolores, así
mismo la incorporación de nanochips que den la posibilidad de cambio de color a las telas,
o bien el control de la temperatura conocidos como “tejidos inteligentes” (Romero, 2015).
4.2.3.6 Electrónica
Comprenden el desarrollo de unidades electrónicas para la sustitución de
componentes convencionales en equipos como los procesadores, chips, tarjetas inteligente,
elaboración de elementos semiconductores, nanocables entre otros, que han logrado
mejorar la funcionalidad de estos elementos (G. Corral, 2013)
4.3 Métodos de síntesis
4.3.1 Métodos Bottom-up
Estos métodos se basan en la construcción de estructuras complejas a partir de otras
más simples mediante, técnicas de autoensamblado, también son conocidos como métodos
químicos, (Ver Imagen 2) los cuales se basan en la reducción de un metal, síntesis
electroquímica en solución coloidal y micro emulsiones; estos métodos son los más usados
por su rapidez, simpleza y por la calidad de las nanoestructuras obtenidas, ya que las NPs
29
sintetizadas por estos métodos poseen una excelente uniformidad (estructura) y tamaños
estrechos (Tahrioui & Ouahid Hessissen, 2016).
4.3.2 Métodos top-down
Estos métodos también conocidos como métodos físicos, se basan en la reducción
del tamaño de agregación del material hasta llegar a un tamaño nanométrico con un
consumo considerable de energía (Ver Imagen 2), los cuales pueden ser: la condensación
con un gas inerte, corte por láser y pirolisis; la aplicación de estos métodos posee una gran
ventaja sobre los métodos químicos ya que pueden producir grandes cantidades de NPs,
pero a su vez, presenta un gran problema, ya que no pueden ejercer un control sobre el
tamaño, produciendo NPs con un amplio rango de tamaño que pueden originar un efecto
poco controlable y predecible (Gómez, 2013).
Imagen 2. Métodos físicos y químicos para la obtención de NPs. Recuperado de
https://www.fucsalud.edu.co/sites/default/files/2018-08/Art-1.pdf
30
4.3.3 Métodos biológicos
Para la obtención de nanocompuestos se han implementado diversas tecnologías
que reduzcan los costos, aumente la productividad y funcionalización, es por ello que la
biosíntesis se desarrolla como una alternativa para la producción de nanomateriales como
una herramienta verde para la síntesis, en donde se implementan sistemas biológicos y/o
organismos vivos para el desarrollo, modificación o producción de productos que puedan
generar un bien o un servicio (Botello, Garza, & Gomes de la Fuente, 2007); estos métodos
se centran en el estudio y uso de la actividad metabólica de algunas microorganismos tales
como bacterias, levaduras y hongos, los cuales pueden producir diferentes tipos de NPs,
estos microorganismos mediante su actividad metabólica generan una amplia variedad de
metabolitos que favorecen la reducción de iones del medio; este proceso se lleva a cabo en
condiciones de temperatura y presión ambiental (Yañez Cruz, Villanueva Ibáñez, Nayeli,
& colaboradores, 2016).
Además diversos estudios han posibilitado el desarrollo de herramientas para llevar
acabo la biosíntesis de NPs reduciendo los costos de producción e impacto ambiental, esto
hace de los métodos biológicos sea un método eficiente, económico y amigable con el
medio ambiente (Santos, Troncoso, & Lamilla, 2017).
31
4.3.3.1. Síntesis de NPs por bacterias
Las bacterias son los microorganismos más estudiados para la síntesis de diversos
nanocompuestos, siendo estos microrganismos considerados como potenciales productores
de NPs de diferentes tipos como : Oro, Zinc, Plata, Cobre, Silicio, Entre otros (Correa
Llantén, Muñoz Ibacache, Castro, Muñoz, & Blamey, 2016), debido a su capacidad de
reducir iones de metales, además de esto, son procesos amigables con el medio ambiente
ya que no requieren de químicos altamente tóxicos y peligros, son procesos de bajo costos
escalables y el producto es de igual o mayor estabilidad que las NPs sintetizadas mediante
métodos químicos y físicos (Iravani, Korbekandi, S.V., & and Zolfaghari, 2014).
4.3.3.2 Síntesis de NPs por Hongos Filamentosos y levaduriformes
Los hongos filamentosos y levaduriformes son microorganismos altamente
eficientes en le secreción de enzimas, ayudando al proceso de bioacumulación de iones
metálicos, la unión de estas enzimas a los iones generan una reducción de estas enzimas
generando la formación de NPs o nanoestructuras (Boroumand Moghaddam A. , Namvar,
Moniri, & Colaboradores, 2015).
32
5. Marco Legal
Actualmente en la legislación colombiana no se encuentran registros en la que se
consideren los riesgos y peligros para la manipulación de Nanopartículas, tampoco las
condiciones físicas de un laboratorio para llevar a cabo este tipo de investigaciones;
actualmente se reportan diversas investigaciones en la que se estudian los riesgos para la
salud humana al desarrollar este tipo de nanoestructuras.
33
6. Marco Referencial
El término nanaopartículas fue escuchado desde el siglo IX en Mesopotoamia, la
cerámica solía tener un brillo metálico el cual era un producto de la oxidación atmosférica,
este brillo fue creado por los artesanos mezclando sales de cobre y plata con óxidos y
vinagre, ocre y arcilla en la superficie de la cerámica, esto se situaba en un horno y
posteriormente calentado a 600 °C en una atmósfera reductora (Vega Baudrit & León Ruiz,
2009).
En 1875 Michael Faraday físico y químico británico dio la primera descripción, en
términos científicos, donde se con conocieron las principales propiedades ópticas de
metales en escala nanométrica, lo cual dio paso a la nanociencia y al desarrollo de diversos
estudios sobre la síntesis de NPs (Villarraga, 2012).
Aproximadamente 10 años atrás se han venido registrando diversos estudios los
cuales han descrito nanopartículas sintetizadas de plata, oro, silicio y zinc empleando
microorganismos, teniendo un aplicabilidad en diversos sectores como energético, medico,
farmacéutico, entre otros; en 2007 se lograron producir nanopartículas de Zinc Empleando
microorganismos a partir de sulfuro de Zinc (ZnS), estas NPs se caracterizaron mediante
Espectrometría de fluorescencia y Microscopia de fuerza Atómica; en 2008 se sintetizaron
nanopartículas de Zinc, Plata, Oro, Sílice y Cadmio a partir de residuos de minas en
Veracruz, México y Oaxaca, México, empleando bacterias y hongos aislados de estas
34
minas, en este estudio Zanella describe que la capacidad sintetizadora depende del tipo de
microorganismo, fisiología y características genotípicas.
En 2011 en la Universidad de la Rioja produjeron nanopartículas de plata, estas
fueron recubiertas con sílice mediante un método organometálico que consta en hacer
reaccionar diferentes compuestos como polímeros, ligando alquílicos de cadena larga o
sustratos inorgánicos para la síntesis de NPs; posteriormente en 2012 Rodolfo Zanella
describió algunas de las metodologías utilizadas para la obtenciones de NPs controlando la
forma y el tamaño, en 2013 en la Universitat ramon llull se sintetizaron nanopartículas de
óxido de sílice, las cuales fueron empleadas en aparatos biomédicos como un agente
bactericida, fungicida, antiviral o cicatrizante.
La síntesis de nanopartículas metálicas se puede generar ya sean por métodos
químicos o métodos físicos, la síntesis química de NPs es el método más utilizado, ya que
aparte de tratarse de un procedimiento sencillo, permite la obtención de nanopartículas en
gran cantidad y en corto periodo de tiempo, mientras que los métodos físicos se necesita
grandes cantidades de energía y equipos de alta tecnología; dado a lo anterior, la síntesis
biológica surge como una alternativa para la síntesis de NPs, Xiaolei Zhang, Song Yan y
R.Y. Surampalli describen en su artículo publicado en 2011 algunos microorganismos que
poseen dicha actividad.
35
Debido a que estos procesos biológicos para la obtención NPs ha tomado gran
importancia en la comunidad científica, muchos investigaciones han elucidado las posibles
rutas metabólicas o mecanismos que llevan a cabo los microorganismos para sintetizar
estas NPs; tal cual como los describe Andrés Santos, Claudia Troncoso, Claudio Lamilla y
sus colaboradores en su artículo publicado 2017 titulado Nanoparticles Synthesized by
Antarctic Bacteria and their Possible Mechanisms of Synthesis, en donde describen que
aún no se tiene conocimiento sobre las enzimas y las rutas metabólicas que desarrollan los
microorganismos.
36
7. Objetivos
7.1. Objetivo General
7.1.1 Sintetizar NPs de óxido de silicio por vía biológica utilizando como sustrato
escombros de construcciones depositados en la escombrera el Parqué en
Bucaramanga, Santander.
7.2. Objetivos Específicos
7.2.1 Seleccionar los microrganismos con la capacidad biosintetizadora mediante la
caracterización de las NPs de silicio.
7.2.2 Caracterizar las nanopartículas biosintétizadas a partir de los residuos de
construcciones mediante técnicas tales como microscopia SEM, DLS y Z-Sizer.
7.2.3 Establecer la actividad biosintética que poseen los microorganismos aislados de
RCD mediante un diseño de experimentos.
37
Capítulo II
8. Metodología
8.1 Selección de puntos de muestreo y recolección de escombros
Se recolectaron aproximadamente 2 Kg de RCD en un área de 2m2 compuesta de
arena, cemento y guijarros en el botadero de tierra El Parque S.A; la muestra se recolectó
en bolsas con cierre hermético de 27*28 cm de 6 puntos diferentes para obtener una
muestra compuesta (Figura 1).
8.2 Aislamiento de microorganismos autóctonos a partir de RDC
Se realizó una suspensión de 1gr de RCD en 99 mL de agua destilada estéril,
partiendo de allí, se realizaron diluciones seriadas (1:10) hasta obtener una dilución 10-5,
sembrando (0.1 mL) de las diluciones en agar nutritivo para el aislamiento de bacterias y
Figura 1. Área y puntos de muestro para conformar una muestra aleatorizada.
2 m
2 m
38
en agar PDA para el aislamiento de hongos filamentosos y hongos levaduriformes (Figura
2), cada siembra se hizo por duplicado.
,
Hechas las siembras de las diluciones, el agar nutritivo se íncubo a 37 °C durante 26 horas,
mientras agar PDA se incubó a temperatura ambiente durante 9 días, realizando controles
de crecimiento a cada una de las cajas cada 24 horas con el fin de controlar el crecimiento
fúngico e impedir que el desarrollo micelial de algunas especies hongos filamentosos
solapara el crecimiento de otras especies de crecimiento lento.
La obtención de aislados puros se realizó mediante la aplicación de técnicas básicas
microbiológicas como el repique por punción en caso de hongos filamentosos y siembra
por agotamiento en caso de bacterias y hongos levaduriformes.
99 mL 9 mL 9 mL 9 mL
10-2 10-3 10-4 10-5
RCD
1 gr 1 mL
1 mL 1 mL
A. Nutritivo 2 2 3
3 3 3
0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL
A. PDA
Figura 2. Procedimiento para el aislamiento de microorganismos provenientes de RCD
39
8.3 Nomenclatura de aislados
A medida que se fueron realizando las purificaciones de los microorganismos y
obteniendo las cepas puras, se asignó un código para determinar la identificación y
procedencia del aislado (Tabla 1).
8.4 Ensayos de producción de NPs
Para el montaje de los ensayos se estableció la siguiente metodología:
8.4.1 Obtención de biomasa
Se aumentó la biomasa de los aislados suspendiéndolos en un medio liquido
enriquecido tal y como se observa en la tabla 2, esto se incubaron en un Shaker a 150 rpm
hasta obtener un crecimiento (Tabla 2); para controlar la pureza de cada aislado se realizó
revisiones cada 24 horas realizando una tinción (Gram) a cada aislado.
Nomenclatura Definición
C Cepa aislada
RCD Residuo de Construcción y
Demolición
B – HF– HL
Tipo de aislado obtenido:
B: Bacteria
HF: Hongo
HL: Levadura
# Numero de cepa aislada
Tabla 1. Nomenclatura utilizada para el nombramiento de aislados de RCD
40
Tipo de microorganismos Medio de cultivo Tiempo
(Horas)
pH Temperatura
(°C)
Bacterias Caldo nutritivo 72 7 37
Hongos filamentosos Caldo Extracto de malta
suplementado con glucosa
168 6 27
Hongos levaduriformes 72 7 27
Cumplido el tiempo de crecimiento de cada uno de los microorganismos, se
procedió a extraer la biomasa, para ello, se distribuyó el caldo en 5 tubos Falcon estériles
de 50 ml y estos se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 minutos, posteriormente se
descartó el sobrenadante y se determinó el peso húmedo de cada uno de los
microorganismos mediante la siguiente formula.
Peso Humedo =(𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑡𝑢𝑏𝑜 biomasa) − (𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑢𝑏𝑜)
Volumen de la muestra (45mL)
8.4.2 Síntesis de nanopartículas
En un Erlenmeyer se añadió 200 mL de agua destilada suplementado con 4% de
arenilla y se ajustó el pH según los requerimientos fisiológicos del tipo de microorganismo
(Bacterias pH: 7, hongos filamentosos pH: 6 y hongos levaduriformes pH: 7); cada
Erlenmeyer se esterilizo 2 veces con el fin de garantizar la inocuidad de cada uno de los
bioensayos, seguido a esto, se procedió a inocular en una cabina de flujo laminar cada uno
de los Erlenmeyer con la biomasa obtenida anteriormente. El proceso de síntesis se llevó a
cabo en un Shaker a 180 rmp siguiendo las condiciones de síntesis de NPs para cada uno
de los microorganismos (Tabla 3).
Tabla 2. Condiciones generales para la obtención de biomasa
Recuperado de https://es.slideshare.net/yuricomartinez/labo2-peso-hmedo-peso-seco-turbidimetra?from_action=save
Tabla 2. Condiciones generales para la obtención de biomasa
41
Tipo de microorganismos Tiempo
(Horas)
pH Temperatura
(°C)
Bacterias 120 7 37
Hongos filamentosos 120 6 30
Hongos levaduriformes 120 7 30
Cada 24 horas se tomó una alícuota de 10 mL, iniciando desde el tiempo 0 (T0)
hasta cumplir las 120 horas (T6), cada una de estas alícuotas se filtró utilizando una
membrana con un poro de 0.45µm y posterior a esto se determinó el sílice soluble mediante
un Kit comercial (Si-5-1455400) de los tiempo T0 y T6 de cada uno de los bioensayos,
este kit no permitió tener una lectura cualitativa mediante el inserto del Kit y una lectura
cuantitativa mediante la Absorbancia, la cual se realizó a una longitud de onda de 450 nm.
8.4.3 Extracción de biomasa y visualización de NPs
Para poder visualizar las nanopartículas se filtró cada una de las muestras
haciéndolas pasar por un filtro de membrana con un poro de 0.45µm, recuperando el
sobrenadante en un tubo Falcón estéril y descartando el filtro; para impedir que alguna de
las muestras se contaminaran se realizó un lavado (300 mL Agua estéril) y una desinfección
(200 mL Hipoclorito 30% y 300 de Alcohol 95%) del equipo cada vez que finalizaba los
tiempos de filtración de cada uno de los microorganismo.
Para la visualización de las NPs las muestras sometieron a un baño con ultrasonido
durante 20 minutos a 30°C, posterior a esto, se tomó 100µL de las alícuotas
Tabla 3. Condiciones generales para la síntesis de NPs según el microorganismo.
42
correspondientes a los tiempos T0 y T6 de cada uno de los microorganismos y se dejó caer
una pequeña gota sobre una lámina portaobjetos previamente desinfectada, adicionalmente
se agregó 150µL de etanol sobre la muestra; las láminas se dejaron en un desecador de
sílice durante 1 hora, trascurrido este tiempo, se retiraron las láminas y se realizó un
recubrimiento con oro en un Cressington SPUTTER COATER por 2 ciclos cada uno de 30
segundos para ser visualizadas en el SEM.
8.5 Diseño de experimento para la selección del mejor aislado
Se seleccionaron 3 cepas microbianas con mayor actividad biosintética para
establecer el efecto del pH sobre la síntesis de NPs. Para ello, se realizó el mismo montaje
expuesto en el ítem 6.2.2 siguiendo las mismas condiciones de incubación variando el pH
(pH optimo 7,5 y pH acido 6.5).
8.5.1 Determinación de tamaño de NPs
Para determinar el tamaño de las nanoparticulas se utilizó el equipo ZETASIZER-Nano
Series ZS90/Malvern el cual posee las siguientes especificaciones (Ver tabla 4).
Rango de Adquisición para tamaño de partícula 2nm -3μm
Rango de trabajo para potencial Z ±500mV
Volumen de muestra 1 mL
Técnica de medición Dispersión dinámica de luz (90 grados)
Laser He-Ne
Potencia 4.0mW
Longitud de onda 633nm
Temperatura (°C) 30
Tabla 4. Parámetros operacionales del ZETASIZER-Nano Series ZS90/Malvern para determinar tamaño y carga de Nps.
43
Las muestras se colocaron en baño con ultrasonido por 30 minutos a una temperatura de
30°C. Posteriormente, se sacó una alícuota de 1mL de cada muestra y se depositó en la
celda para DLS (Imagen 1).
8.5.2 Determinación de carga de NPs
Para establecer el potencial Z de las NPs se usó el mismo procedimiento anterior, es decir, la
muestra se sometió por 30 minutos a ultrasonido en un baño a temperatura de 30°C y se sacó una
alícuota de 1mL para su medida. La Imagen 4, ilustra la celda de potencial Z y la celda con la
muestra lista para su lectura.
Imagen 3. Muestras después de la medida de la distribución del tamaño de partícula
Imagen 4. Celda usada para medir la carga de las NPs (Z-siZer)
44
Capítulo III
9. Resultados y discusión.
La selección del área y la toma de muestras se realizaron en el predio El Parque
S.A. específicamente en el sector 2 cuadrante 4, en donde se encuentran todos los residuos
de construcciones provenientes del área metropolitana de Bucaramanga, estos residuos
están compuestos por arenilla, cemento, piedras, entre otros, los cuales poseen una alta
concentración de silicio en forma de cuarzo entre otros componentes (Sosa Henríquez,
Escandell Bermúdez, & Batista Hernández, 2006); el muestreo se realizó en un área de 2
m2 seleccionando 6 puntos diferentes para obtener una muestra compuesta, removiendo
aproximadamente 2cm de la superficie con el fin de remover impurezas, posterior a esto
se tomaron varias porciones de residuos tamizándolos hasta obtener 2 Kg de arenilla (Ver
Imagen 5).
Los residuos de construcciones son un gran reservorio de microorganismos
ambientales ya que este tipo de suelo está constituido por sustancias sólidas, líquidas y
gaseosas, en las que se encuentran diversos minerales, restos de plantas y animales, agua
Imagen 5. Área de maestro, puntos de recolección de muestra.
45
(sales inorgánicas y ciertos compuestos orgánicos) y gases, dado a lo anterior, el suelo es
un medio de cultivo ideal ya que dichas sustancias y materiales existentes en el suelo
proporcionan nutrientes orgánicos e inorgánicos propiciando el crecimiento microbiano
(Nogales, 2005); dado a lo anterior mediante técnicas básicas microbiológicas se lograron
aislar un total de 15 cepas (Ver figura 3).
Para la selección cepas microbiológicas se tuvo en cuenta las colonia que
evidenciaran similitud en cuanto a su crecimiento macroscópico (Ver Imagen 6B y 6C), a
estas cepas se le realizó siembras por agotamiento en agar nutritivo para bacterias y en agar
malta para hongos levaduriformes con la finalidad de obtener cultivos axénicos (Ver anexo
1 y 2); para los hongos filamentosos, se realizaron siembras por punción en medio PDA de
cada uno de los morfotipos, esta técnica se realizó hasta lograr obtener un cultivo axénico
de cada cepa fúngica (Ver anexo 3).
Imagen 6. A) Pretratamiento de la arenilla para el aislamiento de microorganismos; B) Crecimiento de
bacterias y C) Crecimiento de Hongos filamentosos y levaduriformes.
A
B
¿
A
C
46
A medida que se obtenía los microorganismos en cultivos axénicos se les asignaba
una nomenclatura la cual consta en el tipo de microorganismo (Bacterias, Hongo
filamentoso o hongo levaduriforme), el origen de la cepa aislada y el número de aislado
obtenido con el fin de identificar cada una de estas cepas microbiológicas (Ver Tabla 5).
Cepas Bacterianas Hongos Filamentosos Hongos Levaduriformes
CRCDB1 CRCDHF1 CRCDHL1
CRCDB2 CRCDHF2 CRCDHL2
CRCDB3 CRCDHF3
CRCDB4 CRCDHF4
CRCDB5 CRCDHF5
CRCDB6 CRCDHF6
CRCDB7
Para evaluar si cada uno de los aislados obtenidos poseía la capacidad de sintetizar
NPs, inicialmente se obtuvo una biomasa de cada uno de las cepas microbiológicas, la cual
se determinó mediante peso húmedo (Ver tabla 6 y Anexo 4); para asegurar la inocuidad
Hongos40%
Bacteria 47%
Levaduras13%
AISLAMIENTOS DE CEPAS MICROBIOLOGÍCAS
Tabla 5. Nomenclatura para la identificación de los aislados obtenidos a partir de RCD
Figura 3. Microorganismos aislados a partir de residuos de construcciones entre las que se encuentran: 7 cepas
bacterianas, 6 hongos filamentosos y 2 hongos levaduriformes.
47
de cada aislado se tomaron muestras de 1 mL cada 24 horas de los erlenmeyer con la
biomasa en agitación y mediante tinciones de Gram se aseguró que el morfotipo inicial se
conservara y no presentara contaminaciones con otro tipo de microorganismo.
Cepa
aislada
Peso del Tubo
(13,3 g)
Biomasa
obtenida
Total de
Biomasa
# Tubo g/mL g
CRCDB1
1 0,2
1 2 0,2
3 0,3
4 0,3
CRCDB2
1 0,2
1 2 0,3
3 0,2
4 0,3
CRCDB3
1 0,4
1,9 2 0,6
3 0,4
4 0,5
CRCDB4
1 0,5
1,7 2 0,4
3 0,5
4 0,3
CRCDB5
1 0,3
1,1 2 0,3
3 0,2
4 0,3
CRCDB6
1 0,3
1,1 2 0,2
3 0,3
4 0,3
CRCDB7
1 0,3
1,3 2 0,3
3 0,3
4 0,4
Al haber obtenido una concentración considerable de biomasa de cada uno de los
morfotipos aislados, se realizó el montaje de los bioensayos para determinar que cepas
poseían la capacidad de sintetizar NPs de óxido de silicio; esto consistió en la inoculación
de cada uno de los morfotipos en un erlenmeyer, el cual contenía 200 mL de agua destilada
suplementado con 4% de arenilla estéril (Ver Imagen 7B) a un pH de 7.5; el agua se utilizó
Cepa
aislada
Peso del Tubo
(6,81g)
Biomasa
obtenida
Total de
Biomasa
# Tubo g/mL g
CRCDHF1
1 7,07
22,47 2 8,1
3 7,3
CRCDHF2
1 7,04
21,15 2 7,08
3 7,03
CRCDHF3
1 7,03
22,16 2 7,09
3 8,04
CRCDHF4
1 6,12
21,45 2 8,03
3 7,3
CRCDHF5
1 7,76
20,12 2 7,9
3 4,46
CRCDHF6
1 7,76
20,12 2 7,9
3 4,46
Cepa
aislada
Peso del Tubo
(6,81g)
Biomasa
obtenida
Total de
Biomasa
# Tubo g/mL g
CRCDHL1 1 1,64
3,01 2 1,37
CRCDHL2 1 0,8
1,5 2 0,7
Tabla 6. Biomasa obtenida de cada uno de los aislados (Bacterias, Hongos filamentosos y hongos levaduriformes), esto se
determinó mediante la aplicación de la fórmula de peso húmedo.
48
con el fin de garantizar que el microorganismos empleara el cuarzo (Silicio cristalino)
como fuente de alimento, ya que el agua al no poseer nutrientes obliga al microorganismos
de alguna manera a utilizar el silicio disuelto como una fuente para su supervivencia , dando
que el silicio es el principal componente de la arena, encontrándose en una concentración
igual o superior del 89% en forma cristalina (Erazo Rosales & Flores Claros, 2005); además
de esto, se utilizó como control negativo agua estéril suplementado con 4% de arenilla
para garantizar la inocuidad de la arena y el agua que se utilizaron (Ver Imagen 7A).
Para poder determinar que microrganismos poseían dicha actividad, se tomaron
alícuotas de 15 mL cada 72 horas; las muestras se filtraron utilizando una membrana con
un poro 0.45µm con el fin de separar la arena y los microorganismos de las NPs
sintetizadas, ya que la arena posee un diámetro promedio de 0,0625-2 mm (Velasco
Velasquez & Guallichico Loya, 2014), mientras que las bacterias, poseen un diámetro
promedio entre 0.5 y 5 µm (Molina López & Uribarren Berrueta, 2017) quedando
atrapados junto con los granos de arena en la membrana.
Imagen 7. A) Agua estéril suplementado con 4% de arenilla (cada Erlenmeyer se esterilizó 2 veces para asegurar la
inocuidad del medio), B) Agua estéril suplementado con 4% de arenilla e inoculado con la biomasa obtenida previamente.
A B
49
A cada uno de los bioensayos se les determinó el sílice soluble en 3 diferentes
tiempos y el pH a cada uno de los erlenmeyer, esto con el fin de establecer que
microorganismos utilizaban el silicio para su actividad metabólica y de esta manera
originar NPs de Oxido de Silicio (SiO2); el silicio se puede encontrar de forma soluble, es
decir, que este elemento que se encuentra disuelto en un solvente (agua), lo que le permite
al microorganismos utilizarlo como fuente de alimento mediante la incorporación o la
biomcumulacion de este elemento en sus estructuras celulares (Boroumand Moghaddam
A. , Namvar, Moniri, & Colaboradores, 2015).
El silicio al ser uno de los elementos más abundantes del planeta, es el principal
constituyente de las rocas ígneas, el cuarzo y la arena, encontrándose en 3 diferentes
estados; insoluble (cuarzo, cistobalita, tridimita y arena), soluble (partículas disueltas) o
coloidal (procedentes de procesos industriales como fundición y fabricación de ladrillos,
cerámicas, porcelanas y cristales) (S.a., 2014); para la determinación del silicio soluble se
empleó un kit (Ver Imagen 8A y Anexo 5) el cual se basa en la adición del molibdato de
amonio, el cual reacciona formado ácidos heteropolares, los cuales se descomponen al
adicionar ácido molibdofosfórico sin afectar el ácido molibdosílisico, este acido se forma
cuando la muestra contiene fosfatos dando una coloración amarilla (Ver Imagen 8B); para
aumentar la sensibilidad y lograr determinar el sílice soluble en la muestra se le adiciona
ácido cítrico para eliminar las interferencias de fosfatos, es allí donde esta coloración
amarilla desaparece y se le adiciona polvo de silicio, este ácido forma de nuevo los
50
compuestos heteropolares con el sílice soluble de la muestra permitiendo una coloración
azul (Ver Imagen 8C ), esta coloración es proporcional a la concentración del silicio
presente en la muestra.
La determinación del silicio soluble mediante el kit (prueba colorimétrica) se
realizó a cada uno de los tiempos de cada aislado estudiado, mientras que la ABS de cada
uno de los bioensayos se realizó por triplicado reportando el promedio (Ver anexo 6).
Según lo experimentado y lo reportado en el anexo 6, se puede evidenciar que de
los 15 microorganismos aislados y evaluados, solo 3 bacterias presentaron actividad, la
cuales fueron: CRCDB2 (Ver Figura 4), CRCDB5 (Ver Figura 5) y CRCDB7 (Ver Figura
6), estas cepas presentaron una alteración en la reducción del silicio soluble, lo cual está
directamente relacionado con la acidificación de la suspensión en la que estaban y a su vez
comparada con el control negativo que no presentó ninguna alteración (Ver Figura 7), en
un estudio realizo por Ouahid Hessissen, Amin y Tahrioui, Ali en 2016, mencionan que las
Imagen 8. A) Kit para determinar silicio soluble modelo Si-5 marca HACH, Imagen recuperada de https://es.hach.com; B)
Muestra de con presencia de fosfato (tuvo izquierdo); C) Muestra con presencia de sílice (tuvo derecho).
A B C
51
bacterias llevan a cabo el proceso de síntesis de nanopartículas en medios básicos o ácidos,
esta síntesis, como también ocurre en otras NPs, es dependiente de cofactores, en este caso,
NADH y la enzima nitrato reductasa.
La reducción del sílice soluble y la acidificación del medio permite inferir que los
estas 3 cepas bacterianas que presentaron actividad posiblemente sintetizan NPs, sin
embargo, diversos estudios reportan que las bacterias son los microorganismos más
empleados para sintetizar NPs por su rápido crecimiento y adaptabilidad a condiciones
extremas sin detener su metabolismo, es decir que mediante el estrés celular pueden
modificar su actividad metabólica secretando enzimas con el fin de llevar a cabo un proceso
metabólico(Zhang, Yan, & Surampalli, 2011).
Actualmente la síntesis biológica de NPs ha demostrado que son herramientas
rentables y amigables con el medio ambiente; existe una gran variedad de microorganismos
que son sintetizadores de NPs en los que diversos estudios relacionan dichos
microorganismos, Xiaolei Zhang, Song Yan y Tyagi Surampalli en su artículo Synthesis
of nanoparticles by microorganisms and their application in enhancing microbiological
reaction rates, reportan un gran número de microorganismos sintetizadores de NPs, el
material del que está conformada y el tamaño en nanómetros (nm) (Ver Tabla 7).
52
T0 T3 T6
Kit Silice Si-5 4 8 2
Abs Kit Silice Si-5 0,133 0,243 0,099
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0123456789
Ab
sorb
anci
a K
it S
ilici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Sili
cio
So
lub
le S
i-5
Tiempos Analizados
CRCDB2
T0 T3 T6
Kit Silice Si-5 4 6 2
Abs Kit Silice Si-5 0,132 0,186 0,102
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0
1
2
3
4
5
6
7
Ab
sorb
anci
a K
it S
ilici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Sili
cio
So
lub
le S
i-5
Tiempos Analizados
CRCDB5
T0 T3 T6
Kit Silice Si-5 4 6 4
Abs Kit Silice Si-5 0,137 0,197 0,112
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0
1
2
3
4
5
6
7
Ab
sorb
anci
a K
it S
ilici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Sili
cio
So
lub
le S
i-5
Tiempos Analizados
CRCDB7
T0 T3 T6
Kit Silice Si-5 4 4 4
Abs Kit Silice Si-5 0,137 0,135 0,134
0,1322
0,133
0,1338
0,1346
0,1354
0,1362
0,137
00,5
11,5
22,5
33,5
44,5
Ab
sso
rban
cia
Kit
Sili
cio
Si-
5 a
65
0 n
m
Kit
Sili
cio
So
lub
le S
i-5
Tiempos Analizados
Control Negativo
Figura 4. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5 y Absorbancia de la cepa
CRCDB2 en 3 diferentes tiempos.
Figura 6. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5 y Absorbancia de la cepa
CRCDB7 en 3 diferentes tiempos.
Figura 5. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5 y Absorbancia de la cepa
CRCDB5 en 3 diferentes tiempos.
Figura 7. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5 y Absorbancia del control
negativo.
53
Para verificar que estos 3 microorganismos sintetizaran NPs, las muestras se
analizaron en un Microscopio Electrónico de Barrido (SEM) (Ver Anexo 7), para lograr
visualizar las NPs, se tomaron muestras a partir de los tubos Falcón que contenían el
sobrenadantes previamente filtrado se sometieron a un baño con ultrasonido ya que las NPs
por su naturaleza tienden a aglomerarse, las ondas impactan las NPs generando una
disgregación de estas en el medio líquido como partículas individuales, creando una
muestra homogénea y mediante esto alcanzar potencialmente una distribución dimensional
adecuada de las NPs en el medio en donde se encuentren suspendidas (Kaur, Ellis, &
Romer, 2017); al haber sometido las muestras a ultrasonido, se preparó cada una de las
muestras tomando 100 µm de los tiempos T0 y T6, además se le adiciono etanol para
agilizar la evaporación del agua y ayudar a la disgregación de las NPs.
Tabla 7. Microrganismos sintetizadores de NPs reportado por Xiaolei Zhang, Song Yan y Tyagi Surampalli; Recuperado de
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21055786
54
El montaje para la visualización de las NPs se realizó en un soporte circular donde
se agregó los volúmenes correspondientes de las muestras, estas deben estar adheridas a
dicho soporte, para ello se usó una cinta de carbono, lo cual permite un adecuado flujo de
los electrones; las muestras conductoras de electricidad son fáciles de analizar, ya que la
circulación de los electrones permite minimizar los problemas asociados con la generación
de carga. Además, las muestras que son buenas conductoras de la electricidad son también
buenas conductoras del calor, lo que reduce la probabilidad de su degradación térmica
(S.A, 2012); dado a lo anterior, debido a que las NPs de silicio no son conductoras, se les
realizó un recubrimiento en un Sputtering (Ver Imagen 9A) con oro (Ver Imagen 9B) y de
esta manera mejorar su conductividad eléctrica y térmica y así evitar la destrucción de las
NPs para ser visualizadas.
Las muestras fueron analizadas de acuerdo a los tiempos T0 (Ver imagen 10A,11A
y 12A) y T6 (Ver Imágenes 10B,11B y 12B) de cada uno de los microorganismos después
Imagen 9. A) Sputtering utilizado para realizar el recubrimiento con oro de las muestras, B) Muestra recubiertas con oro.
A B
55
de haber realizado el recubrimiento; CRCDB2 (Ver Imagen 10), CRCDB5 (Ver Imagen
11) y CRCDB7 (Ver Imagen 12), en donde se puede evidenciar la presencia de partículas
luminiscentes; la visualización de estas estructuras se logra, gracias a que la generación de
unos electrones en un cañón el cual contiene un filamento de tungsteno, que tiene
normalmente un diámetro de 0.1 mm y está doblado en forma de horquilla. Con un SEM
el barrido se lleva a cabo mediante dos pares de bobinas localizadas entre las lentes del
objetivo; uno de los pares desvía el haz en la dirección X hacia la muestra y el otro lo desvía
en la dirección Y. El barrido se controla mediante aplicación de una señal eléctrica a uno
de los pares de las bobinas de barrido, de manera que el haz de electrones alcanza la muestra
al lado del eje central del sistema de lentes permitiendo la detección de estas señales y la
visualization de las NPs (S.A, 2012).
Imagen 10. Microscopia electrónica de barrido SEM de la cepa CRCDB2 A) Muestra Tiempo 0 B) Muestra tiempo 6
A A
A B
56
A
A
A
B
B
B
Imagen 11. Microscopia electrónica de barrido SEM de la cepa CRCDB5 A) Muestra Tiempo 0 B) Muestra tiempo 6
Imagen 12. Microscopia electrónica de barrido SEM de la cepa CRCDB7 A) Muestra Tiempo 0 B) Muestra tiempo 6
A
A B
57
Mediante el análisis microscopio de la muestra se puedo inferir que estas 3 bacterias
poseían la capacidad de sintetizar NPs, por lo que estos aislado se mandaron a secuenciar,
sin embargo, no fue posible lograr su identificación molecular ya que los
electroferogramas no fueron muy claros y presentaron bastante anomalías (Ver Anexo 8),
estas inconsistencias posiblemente fueron causadas debido a que el cebador y/o la
concentración del DNA fueron inferiores a la necesaria para llevar acabo la secuencia,
también la concentración del DNA no fue suficiente, el proceso de extracción y
purificación no fueron los adecuados o que las muestras posiblemente contenían dos tipos
de DNA, es decir que presentaron contaminaciones, entre otras diversas causas (Rodríguez
Martínez, 2004).
Para corroborar si estos microrganismos poseían la capacidad de sintetizar NPs se
realizó de nuevo el proceso de síntesis anteriormente descrito evaluando un pH ácido y un
pH neutro, para determinar si el pH influye en la síntesis como lo menciona Ouahid
Hessissen, Amin y Tahrioui, Alien en su estudio en 2016, donde menciona que las
bacterias llevan a cabo el proceso de síntesis de nanopartículas en medios básicos o ácidos,
se procedió a evaluar la síntesis de NPs a un pH acido (6,5) y un pH neutro (7,5); en estos
bioensayos se evaluaron los mismo parámetros, como lo fue el silicio soluble mediante el
Kit Si-5, absorbancia y pH cada 24 horas (Ver anexo 9); las cepas CRCDB2 (Ver figura 8
y 9), CRCDB5 (Ver figura 10 y 11) y CRCDB7 (Ver figura 12 y 13) presentaron actividad
y una relación en cuanto a la reducción del silicio soluble medido con el Kit Si-5 y la
absorbancia en un medio básico; la actividad metabólica de estos microorganismos
58
aumentaron el silicio soluble con respecto al tiempo, más exactamente durante las primeras
72 horas presentando variaciones significativas en el pH, lo que nos permite inferir que las
cepas llevan a cabo un proceso metabólico generando algún tipo de compuesto o sustancia
lo que acidifica el medio donde se encuentra, sin embargo, a un pH ácido el sílice soluble
disminuyó considerablemente durante el tiempo de ensayo y las variación del pH no fueron
tan significativas como lo ocurrido a un pH neutro (Funke, Case, & Tortora, 2016).
Dado a lo anterior, este aumento y reducción del silicio soluble se puede relacionar
con la actividad metabólica, puesto que los microorganismos poseen la capacidad de
acumular y detoxificar diversas sustancias o químicos dado a la segregación de enzimas como
las reductasas, enzimas especializadas que son capaces de reducir las sales de metal a NPs
metálicas con una aceptable distribución de tamaño (Singh et al., 2016). El componente que
subyace a esta síntesis biológica de NPs aún no está totalmente descrito y se conoce poco sobre
estos procesos, pero muchos estudios describen esta actividad y la relacionan con la
segregación de enzimas, los genes de resistencia a sustancias químicas, proteínas, péptidos,
cofactores reductores y moléculas orgánicas que tienen papeles significativos al actuar como
agentes reductores (Ouahid Hessissen & Tahrioui, 2016), también algunas bacterias poseen
una serie de estructuras de resistencia como bombas trans-membranales, sistemas de
expulsión o extrusión, impermeabilidad a metales, alteración en la solubilidad y toxicidad
mediante cambios en el estado redox, precipitación extracelular de metales, entre otros, lo
cual le permite a estas bacterias desarrollar mecanismos enzimáticos y no enzimáticos que
conducen a la síntesis de nanopartículas (Santos, Troncoso, & Lamilla, 2017).
59
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6
Kit Sílice Si-5 4 6 8 6 6 4 4
pH Básico 7,57 7,54 7,37 7,11 6,87 6,84 6,67
Abs Kit Sílice Si-5 0,127 0,143 0,231 0,192 0,172 0,117 0,109
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0123456789
Ab
sorb
anci
a K
it S
ílici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Síli
cio
so
lub
le S
i-5
Tiempos analizados
CRCDB2
Kit Sílice Si-5 pH Básico Abs Kit Sílice Si-5
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6
Kit Sílice Si-5 4 6 6 8 6 6 4
pH Básico 7,53 7,51 7,34 7,04 6,74 6,71 6,58
Abs Kit Si-5 0,134 0,142 0,168 0,228 0,187 0,176 0,131
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0
2
4
6
8
10
Ab
sorb
anci
a K
it S
ílici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Síli
cio
so
lub
le S
i-5
Tiempos analizados
CRCDB5
Kit Sílice Si-5 pH Básico Abs Kit Si-5
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6
Kit Sílice Si-5 8 6 6 4 4 4 4
pH ácido 6,57 6,52 6,51 6,51 6,47 6,45 6,42
Abs Kit Sílice Si-5 0,221 0,182 0,174 0,161 0,147 0,128 0,107
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0
2
4
6
8
10
Ab
sorb
anci
a K
it S
ílici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Síli
cio
so
lub
le S
i-5
Tiempos analizados
CRCDB2
Kit Sílice Si-5 pH ácido Abs Kit Sílice Si-5
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6
Kit Sílice Si-5 8 6 6 6 4 4 4
pH ácido 6,56 6,53 6,53 6,51 6,47 6,45 6,39
Abs Kit Sílice Si-5 0,237 0,194 0,175 0,154 0,133 0,121 0,113
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0
2
4
6
8
10
Ab
sorb
anci
a K
it S
ílici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Síli
cio
so
lub
le S
i-5
Tiempos analizados
CRCDB5
Kit Sílice Si-5 pH ácido Abs Kit Sílice Si-5
Figura 8. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa CRCDB2 en
6 diferentes tiempos en medio Neutro pH 7.5
Figura 9. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa CRCDB2 en
6 diferentes tiempos en medio Ácido pH 6.5
Figura 10. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa CRCDB5 en
6 diferentes tiempos en medio Neutro pH 7.5
Figura 11. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa CRCDB5 en
6 diferentes tiempos en medio Ácido pH 6.5
60
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6
Kit Sílice Si-5 4 4 4 6 8 6 6
pH Básico 7,54 7,51 7,37 7,14 6,89 6,84 6,78
Abs Kit Sílice Si-5 0,124 0,138 0,144 0,187 0,204 0,197 0,183
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0
2
4
6
8
10
Ab
sorb
anci
a K
it S
ílici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Síli
cio
so
lub
le S
i-5
Tiempos analizados
CRCDB7
Kit Sílice Si-5 pH Básico Abs Kit Sílice Si-5
T0 T2 T4 T6
Kit Sílice Si-5 4 4 4 4
pH Básico 7,54 7,53 7,53 7,49
Abs Kit Sílice Si-5 0,128 0,130 0,132 0,129
0,1260,1270,1280,1290,130,1310,1320,133
012345678
Ab
sorb
anci
a K
it S
ílici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Síli
cio
so
lub
le S
i-5
Tiempos analizados
Control Negativo
Kit Sílice Si-5 pH Básico Abs Kit Sílice Si-5
T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6
Kit Sílice Si-5 8 6 6 6 6 4 4
pH ácido 6,57 6,54 6,52 6,5 6,46 6,42 6,4
Abs Kit Sílice Si-5 0,231 0,196 0,182 0,164 0,157 0,124 0,118
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0
2
4
6
8
10
Ab
sorb
anci
a K
it S
ílici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Síli
cio
so
lub
le S
i-5
Tiempos analizados
CRCDB7
Kit Sílice Si-5 pH ácido Abs Kit Sílice Si-5
T0 T2 T4 T6
Kit Sílice Si-5 6 6 6 6
pH ácido 6,51 6,49 6,47 6,47
Abs Kit Sílice Si-5 0,182 0,187 0,196 0,194
0,175
0,18
0,185
0,19
0,195
0,2
5,6
5,8
6
6,2
6,4
6,6
Ab
sorb
anci
a K
it S
ílici
o S
i-5
a 6
50
nm
Kit
Síli
cio
so
lub
le S
i-5
Tiempos analizados
Control Negativo
Kit Sílice Si-5 pH ácido Abs Kit Sílice Si-5
Figura 13. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa CRCDB7 en 6 diferentes tiempos en medio Ácido pH 6.5
Figura 12. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH de la cepa CRCDB7 en
6 diferentes tiempos en medio Neutro pH 7.5
Figura 14. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH del control negativo en
6 diferentes tiempos en medio Neutro pH 7.5
Figura 15. Determinación de sílice soluble mediante el Kit Si-5, Absorbancia y pH del control negativo en 6 diferentes tiempos en medio Ácido pH 6.5
61
Para poder ratificar dicha actividad llevada a cabo por las 3 cepas estudiadas y la
presencia de NPs, se filtraron las muestras de los ensayos (pH ácido y neutro) de los
tiempos T6 de cada una de las cepas, estas muestras se analizaron mediante Dispersión
Dinámica de Luz (DLS) para determinar el tamaño y Potencial Z (Z-sizer) para conocer
la carga y la conductividad de las NPs sintetizadas. Al realizar el análisis se pudo confirmar
que las cepas estudiadas inicialmente si poseen la capacidad de sintetizar NPs ya que las
mediciones obtenidas mediante DLS presentaron estructuras a un escala nanométrica
consideradas nanoparticulas (1-100 nm) tal cual como lo describe Eduardo Beltran Flores
en su artículo Materiales porosos cristalinos soportados por nanopartículas magnéticas:
Estructuras core-shell.
El tamaño de las NPs puede deberse a varias razones como el crecimiento celular,
las condiciones de incubación y disponibilidad del sustrato y agitación, estos factores
determinan el tamaño de la NPs (Santos, Troncoso, & Lamilla, 2017); la cepa CRCDB2 a
un pH ácido (Ver figura 16) presentó medidas por encima del rango descrita por Beltrán
Flores, las cuales se encuentran entre 122 nm a 220 nm fuera del rango ya antes descrito;
mientras que esta misma cepa a un pH neutro (Ver figura 17) presentó mediciones entre
68,06 nm a 105,7 nm obteniendo NPs de primera (100 a 10 nm) y segunda generación (10
a 1 nm) descritas por Pedroso Sanmiguel y Guillen, Alejandro en su artículo Microarray
and nanotechnology applications of functional nanoparticles publicado en 2006; dado a lo
anterior, se puede afirmar que el pH influye directamente sobre el tamaño de las NPs
sintetizadas por esta cepa variando el tamaño de estas.
62
Size d.nm Mean Number
Percent
122,4 6,9
141,8 29,8
164,2 41,8
190,1 20,2
220,2 2,0
Size d.nm Mean Number
Percent
68,06 12,3
78,82 37,3
91,28 37,7
105,7 12,7
Figura 16. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB2 (T6) evaluando pH=6.5
Figura 17. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB2 (T6) evaluando pH=7.5
63
La cepa CRCDB5 fue la cepa que presentó mejor calidad de NPs en cuanto al tamaño de estas nanoestructuras, a un pH
ácido (Ver figura 18) esta cepa sintetizó NPs entre 32 a 58nm, sin embargo, a un pH neutro (Ver figura 19) esta cepa logró
sintetizar NPs mucho más pequeñas las cuales están entre los 10 a 18 nm.
Size d.nm Mean Number
Percent
32,67 12,4
37,84 34,8
43,82 35,0
50,75 15,1
58,77 2,6
Figura 18. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB5 (T6) evaluando pH=6.5
64
La cepa CRCDB7 fue la única cepa de las 3 analizadas que no presentó NPs en el rango manométrico tanto a pH ácido
(Ver figura 20) como a pH neutro (Ver figura 21), las NPs sintetizadas por esta cepa están entre los 105 y 342nm, sin embargo a
pH ácido, el equipo reportó una medida en 90nm la cual corresponde al 1% de las lecturas reportadas.
Size d.nm Mean Number
Percent
10,10 15,5
11,70 39,1
13,54 33,1
15,69 10,9
18,17 1,4
Figura 19. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB5 (T6) evaluando pH=7.5
65
Size d.nm Mean Number Percent
91,28 1,0
105,7 6,4
122,4 15,3
141,8 20,0
164,2 18,2
190,1 13,7
220,2 9,4
255,0 6,3
295,3 4,3
342,0 2,8
Figura 20. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB7 (T6) evaluando pH=6.5
66
Size d.nm Mean Number
Percent
105,7 5,2
122,4 17,3
141,8 24,6
164,2 21,7
190,1 14,8
220,2 8,7
255,0 4,6
295,3 2,1
342,0 0,8
Figura 21. Determinación del tamaño de NPs mediante DLS de la cepa CRCDB7 (T6) evaluando pH=7.5
67
Al haber caracterizado y confirmado la presencia de NPs y con el fin de conocer la
carga que poseía estas NPs (Ver Tabla 8); se realizó la medición del potencial Z, lo cual
aportó información detallada como la dispersión, agregación, conductividad y movilidad
de las NPs en el medio en el que se encontraban, conociendo estas cargas, se puede aplicar
para mejorar la formulación de dispersiones, emulsiones y suspensiones (S.a., Potencial
Zeta, 2017);las NPs sintetizadas poseen carga negativa lo que les confiere la capacidad de
ser conductores, dado a que estas cargas de superficie alteran la distribución de los iones
que se encuentran dispersos en el medio, dando como resultado la formación de una capa
alrededor de la partícula generando un movimiento browniano lo cual le confiere la
capacidad de ser conductora al ser sometida a una fuente de energía (Moulden & Hartman,
2006).
Cepa pH
evaluado
Calidad del
resultado
Potencial
Zeta (mV)
Movilidad
(µmcm / Vs)
Voltaje
efectivo (V)
Conductividad
(mS / cm)
CRCDB2 pH Ácido Buena -28,1 -2,205 147 0,00913
pH Neutro Buena -26,9 -2,11 147 0,0217
CRCDB5 pH Ácido Buena -7,49 -0,5868 147 0,011
pH Neutro Buena -31,6 -2,477 147 0,0119
CRCDB7 pH Ácido Buena -20 -1,57 147 0,00596
pH Neutro Buena -12,3 -0,9651 147 0,00766
Tabla 8. Medición de Potencial Z
68
10. Conclusiones
Los RCD son una buena fuente de materia prima para la síntesis biológica de las
nanopartículas, mediante los ensayos realizados se pudo obtener NPs tanto de primera
generación como de segunda generación
La síntesis biológica es una alternativa que día a día toma más auge en el ámbito
científico, mediante sustratos ricos en minerales se puede generar NPs empleando los
microorganismos como maquinarias para llevar a cabo la formación de NPs, las cuales
pueden tener diversas aplicación en el ámbito industrial, medicinal, farmacéutico, textil y
energético.
Se pudo establecer que el pH interfiere en cuanto al tamaño de NPs dependiendo
del microorganismo, ya que a pH ácido la cepa CRCDB2 no presentó NPs de primera
generación (10-100) mientras que a pH neutro presentó NPs entre los 68 y 105 nm.
Se determinó que la cepa CRCDB5 es el aislado que presentó más eficiencia en
cuanto a la síntesis de NPs, a pH neutro esta cepa sintetizó NPs más pequeñas que las
demás presentando NPs entre 10 y 18 nm, mientras que a pH ácido sintetizó NPs un poco
más grande, las cuales están entre 32 y 58 nm; es decir que el pH interfiere en la síntesis
de NPs.
69
11. Recomendaciones
Se sugiere realizar espectro de masa a los RCD para conocer la composición y la
concentración de cada uno de los compuestos presentes.
Para posteriores estudió se recomienda la identificación molecular de las 3 cepas
sintetizadoras de NPs.
Realizar estudios de polidispersión de las NPs en diferentes fluidos para impedir
que las medidas por DLS sean erróneas ya que el agua no es un buen diluyente para impedir
la agregación de las NPs.
Se recomienda realizar un diseño de experimentos más riguroso para optimizar el
proceso según la industria pueda hacer uso de estos materiales.
70
12. Bibliografía
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76
ANEXOS
77
Anexo 1. Cultivos axénicos de bacterias
Anexo 2. Cultivos axénicos de hongos levaduriformes.
78
Anexo 3. Cultivos axénicos de hongos filamentosos
Anexo 4. Laboratorio para determinar Biomasa mediante peso húmedo (Sánchez Gonzales
& Martínez Saldaña, 2018) modificado por Jahir Vargas Dominguez.
DETERMINACIÓN DE BIOMASA
“PESO HÚMEDO, PESO SECO, TURBIDIMETRÍA”
I. FUNDAMENTO TEÓRICO
Biomasa es un término general que se refiere a los microorganismos presentes en un
sistema. A la vez también se puede referir como la cantidad de células, de personas o masa
de seres vivos. El objetivo de la biomasa es la reproducción de células.
La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes de un bioproceso
ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de
una variable clave para establecer las tasas de producción, de consumo de nutrientes y el
79
cálculo de los balances de masa de cualquier proceso biológico. Los métodos clásicos de
determinación de biomasa son métodos directos que se basan en el número de células o en
el peso celular. Para determinar la biomasa es necesario calcular el número de células en
una determinada muestra. Esto es importante en ciertas circunstancias; por ejemplo, para
determinar la inocuidad de muchos alimentos o drogas se requiere cuantificar los
microorganismos en esos productos. Los métodos para estimar el número de
microorganismos pueden medir la cantidad de células, la masa celular o la actividad
celular. Los métodos que cuantifican la cantidad de células son útiles principalmente para
enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o
actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos
filamentosos, en los que es difícil cuantificar las células individuales.
A. Medida de biomasa
La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es utilizada
frecuentemente como base para la medida de una actividad metabólica, o de un
constituyente metabólico o químico. Algunos de los métodos para cuantificar la biomas
son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca exactitud.
Peso húmedo
Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación
de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes
volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en
el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido
retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy
80
empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del
peso, de acuerdo a la forma y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se
determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de
una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el
Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las
paredes bacterianas.
Las ecuaciones que se determinarán son:
Figura 4. Metodología de Peso Húmedo y Peso Seco
81
Anexo 5. Determinación de sílice soluble, Inserto Kit Si-5 (1455400)
82
83
Anexo 6. Determinación de silicio soluble mediante un kit comercial, Absorbancia y
medición del pH de cada uno de las cepas aisladas en 3 diferentes tiempos (T0, T3 y T6)
Cepa Tiempo Kit Silicio Soluble pH inicial pH final
mg/L ABS
CRCDB1
T0 4 0,135
7,53 7,41 T3 4 0,149
T6 4 0,125
CRCDB2
T0 4 0,132
7,52 6,65 T3 6 0,186
T6 2 0,102
CRCDB3
T0 4 0,141
7,56 7,62 T3 4 0,133
T6 4 0,123
CRCDB4
T0 4 0,124
7,51 7,49 T3 4 0,148
T6 4 0,139
CRCDB5
T0 4 0,133
7,49 6,21 T3 8 0,243
T6 2 0,099
CRCDB6
T0 4 0,143
7,49 7,34 T3 6 0,187
T6 2 0,105
CRCDB7
T0 4 0,137
7,42 6,98 T3 6 0,197
T6 4 0,112
CONTROL
T0 4 0,102
7,51 7,42 T3 4 0,108
T6 4 0,107
Cepa Tiempo Kit Silicio Soluble pH inicial pH final
mg/L ABS
CRCDHF1
T0 4 0,133
5,4 5,5 T3 4 0,128
T6 4 0,130
CRCDHF2
T0 4 0,132
5,6 5,5 T3 4 0,137
T6 4 0,135
CRCDHF3
T0 4 0,137
5,5 5,4 T3 4 0,131
T6 4 0,134
CRCDHF4
T0 4 0,134
5,4 5,5 T3 4 0,136
T6 4 0,131
CRCDHF5
T0 4 0,131
5,6 5,5 T3 4 0,135
T6 4 0,340
CRCDHF6
T0 4 0,138
5,6 5,5 T3 4 0,134
T6 4 0,136
CONTROL
T0 4 0,137
5,4 5,3 T3 4 0,135
T6 4 0,134
Cepa Tiempo Kit Silicio Soluble pH inicial pH final
mg/L ABS
CRCDHL1
T0 4 0,137
5,4 5,5 T3 4 0,132
T6 4 0,135
CRCDHL2
T0 4 0,141
5,6 5,5 T3 4 0,133
T6 4 0,123
CONTROL
T0 4 0,137
7,6 7,5 T3 4 0,135
T6 4 0,134
84
Anexo 7. Microscopio Electrónico de Barrido (SEM) utilizado para visualizar las NPs
sintetizadas por los microorganismos, microscópico perteneciente a Tecnoparque Nodo
Bucaramanga (SENA).
85
Anexo 8. Secuenciación de las cepas capaces de sintetizar NPs CRCDB2, CRCDB5 Y
CRCDB7 respectivamente
86
87
88
Anexo 9. Determinación de silicio soluble mediante un kit comercial, Absorbancia y
medición del pH de cada uno de las 3 cepas variando el pH (Ácido - Neutro), los análisis
se realizaron cada 24 horas.
Cepa Tiempo Kit Silicio Soluble pH Neutro
mg/L Abs
CRCDB2
T0 4 0,127 7,57
T1 6 0,143 7,54
T2 8 0,231 7,37
T3 6 0,192 7,11
T4 6 0,172 6,87
T5 4 0,117 6,84
T6 4 0,109 6,67
CRCDB5
T0 4 0,134 7,53
T1 6 0,142 7,51
T2 6 0,168 7,34
T3 8 0,228 7,04
T4 6 0,187 6,74
T5 6 0,176 6,71
T6 4 0,131 6,58
CRCDB7
T0 4 0,124 7,54
T1 4 0,138 7,51
T2 4 0,144 7,37
T3 6 0,187 7,14
T4 8 0,204 6,89
T5 6 0,197 6,84
T6 6 0,183 6,78
CONTROL
T0 4 0,128 7,54
T2 4 0,130 7,53
T4 4 0,132 7,53
T6 4 0,129 7,49
Cepa Tiempo Kit Silicio Soluble pH ácido
mg/L Abs
CRCDB2
T0 8 0,221 6,57
T1 6 0,182 6,52
T2 6 0,174 6,51
T3 4 0,161 6,51
T4 4 0,147 6,47
T5 4 0,128 6,45
T6 4 0,107 6,42
CRCDB5
T0 8 0,237 6,56
T1 6 0,194 6,53
T2 6 0,175 6,53
T3 6 0,154 6,51
T4 4 0,133 6,47
T5 4 0,121 6,45
T6 4 0,113 6,39
CRCDB7
T0 8 0,231 6,57
T1 6 0,196 6,54
T2 6 0,182 6,52
T3 6 0,164 6,5
T4 6 0,157 6,46
T5 4 0,124 6,42
T6 4 0,118 6,4
CONTROL
T0 6 0,182 6,51
T2 6 0,187 6,49
T4 6 0,196 6,47
T6 6 0,194 6,47
