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PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOETANOL A PARTIR BIOETANOL A PARTIR
DE MONDAS DE DE MONDAS DE PATATAPATATA
IES Mateo AlemaacutenIES Mateo Alemaacuten
Alcalaacute de HenaresAlcalaacute de Henares
Fondo Social Europeo
JUSTIFICACIOacuteNJUSTIFICACIOacuteN
Deacuteficit energeacutetico de EspantildeaDeacuteficit energeacutetico de Espantildea Implementacioacuten de tecnologiacuteas Implementacioacuten de tecnologiacuteas
propiaspropias Uso de BiorrefineriasUso de Biorrefinerias DIRECTIVA 200330CE DEL DIRECTIVA 200330CE DEL
PARLAMENTO EUROPEO Y DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 8 de mayo de 2003 CONSEJO de 8 de mayo de 2003 relativa al fomento del uso de relativa al fomento del uso de biocarburantes u otros combustibles biocarburantes u otros combustibles renovables en el transporterenovables en el transporte
VOCABULARIOVOCABULARIO BiocombustibleBiocombustible Combustible obtenido Combustible obtenido
mediante un proceso bioloacutegico (por mediante un proceso bioloacutegico (por oposicioacuten a los procesos geoloacutegicos) oposicioacuten a los procesos geoloacutegicos)
Biocombustibles de primera generacioacutenBiocombustibles de primera generacioacuten Biocombustibles producidos a partir de Biocombustibles producidos a partir de cereales azuacutecar y semillas oleaginosascereales azuacutecar y semillas oleaginosas
Biocombustibles de segunda Biocombustibles de segunda generacioacutengeneracioacuten Biocombustibles producidos Biocombustibles producidos a partir de materia prima vegetal que no a partir de materia prima vegetal que no tiene usos alimentarios tiene usos alimentarios
BioetanolBioetanol Biocombustible liacutequido de Biocombustible liacutequido de origen vegetal obtenido por origen vegetal obtenido por fermentacioacuten de carbohidratos fermentacioacuten de carbohidratos
EL SUSTRATOEL SUSTRATOReinoReino PlantaePlantae
DivisioacutenDivisioacuten MagnoliophytaMagnoliophyta
ClaseClase MagnoliopsidaMagnoliopsida
SubclaseSubclase AsteridaeAsteridae
OrdenOrden SolanalesSolanales
FamiliaFamilia SolanaceaeSolanaceae
GeacuteneroGeacutenero SolanumSolanum
EspecieEspecie S tuberosumS tuberosum
Nombre binomialNombre binomial Solanum tuberosumSolanum tuberosum
MONDAS DE PATATAMONDAS DE PATATA
La patata es el cuarto cultivo La patata es el cuarto cultivo mundial por detraacutes del maiacutez el mundial por detraacutes del maiacutez el trigo y el arroz trigo y el arroz
En Espantildea la produccioacuten 2007 En Espantildea la produccioacuten 2007 Aacuterea cosechada 89 000 haAacuterea cosechada 89 000 ha Cantidad 2 502 300 TCantidad 2 502 300 T
Consumos actualesConsumos actuales Procesadas industrialmenteProcesadas industrialmente Derivados de la patataDerivados de la patata Residuos industrialesResiduos industriales
PROBLEMAPROBLEMA
Composicioacuten Composicioacuten 72-75 72-75 de aguade agua 16-20 16-20 de feacutecula en forma de de feacutecula en forma de almidoacutenalmidoacuten 20-25 20-25 de substancias de substancias
nitrogenadasnitrogenadas 015 015 liacutepidosliacutepidos 10-18 10-18 de fibra dieteacutetica como de fibra dieteacutetica como
celulosacelulosa Fermentacioacuten Usan Fermentacioacuten Usan monosacaridosmonosacaridos
como sustrato como sustrato
SOLUCIOacuteNSOLUCIOacuteN
SacarificacioacutenSacarificacioacuten Desdoblamiento Desdoblamiento de un polisacaacuterido para liberar de un polisacaacuterido para liberar un monosacaacuteridoun monosacaacuterido
TiposTipos Sacarificacioacuten microbioloacutegicaSacarificacioacuten microbioloacutegica Sacarificacioacuten enzimaacuteticaSacarificacioacuten enzimaacutetica Sacarificacioacuten quiacutemicaSacarificacioacuten quiacutemica
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN MICROBIOLOacuteGICAMICROBIOLOacuteGICA
Rhyzopus oryzaeRhyzopus oryzae Se lo emplea como Se lo emplea como agente sacarificante ya que es buen agente sacarificante ya que es buen productor de amilasas Tambieacuten se lo usa productor de amilasas Tambieacuten se lo usa para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y fumaacutericofumaacuterico
Rhyzopus delemarRhyzopus delemar Es un hongo muy rico Es un hongo muy rico en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo utiliza en el proceso amilo para obtener utiliza en el proceso amilo para obtener etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten en la transformacioacuten de esteroidesen la transformacioacuten de esteroides
Rhyzopus arrhizusRhyzopus arrhizus Tambieacuten transforma Tambieacuten transforma esteroides Se lo emplea para obtener esteroides Se lo emplea para obtener amilasas y para la produccioacuten de aacutecido amilasas y para la produccioacuten de aacutecido laacutecticolaacutectico
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN ENZIMAacuteTICAENZIMAacuteTICA
Mediante amilasa tambieacuten Mediante amilasa tambieacuten denominada sacarasa o ptialinadenominada sacarasa o ptialina α-Amilasaα-Amilasa β-Amilasa β-Amilasa γ-Amilasa γ-Amilasa
Las enzimas amilasas son empleadas Las enzimas amilasas son empleadas para romper azuacutecares complejos como para romper azuacutecares complejos como el almidoacuten en azuacutecares simples el almidoacuten en azuacutecares simples
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN QUIacuteMICAQUIacuteMICA
En general se utilizan aacutecidos minerales a pH En general se utilizan aacutecidos minerales a pH 15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
JUSTIFICACIOacuteNJUSTIFICACIOacuteN
Deacuteficit energeacutetico de EspantildeaDeacuteficit energeacutetico de Espantildea Implementacioacuten de tecnologiacuteas Implementacioacuten de tecnologiacuteas
propiaspropias Uso de BiorrefineriasUso de Biorrefinerias DIRECTIVA 200330CE DEL DIRECTIVA 200330CE DEL
PARLAMENTO EUROPEO Y DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 8 de mayo de 2003 CONSEJO de 8 de mayo de 2003 relativa al fomento del uso de relativa al fomento del uso de biocarburantes u otros combustibles biocarburantes u otros combustibles renovables en el transporterenovables en el transporte
VOCABULARIOVOCABULARIO BiocombustibleBiocombustible Combustible obtenido Combustible obtenido
mediante un proceso bioloacutegico (por mediante un proceso bioloacutegico (por oposicioacuten a los procesos geoloacutegicos) oposicioacuten a los procesos geoloacutegicos)
Biocombustibles de primera generacioacutenBiocombustibles de primera generacioacuten Biocombustibles producidos a partir de Biocombustibles producidos a partir de cereales azuacutecar y semillas oleaginosascereales azuacutecar y semillas oleaginosas
Biocombustibles de segunda Biocombustibles de segunda generacioacutengeneracioacuten Biocombustibles producidos Biocombustibles producidos a partir de materia prima vegetal que no a partir de materia prima vegetal que no tiene usos alimentarios tiene usos alimentarios
BioetanolBioetanol Biocombustible liacutequido de Biocombustible liacutequido de origen vegetal obtenido por origen vegetal obtenido por fermentacioacuten de carbohidratos fermentacioacuten de carbohidratos
EL SUSTRATOEL SUSTRATOReinoReino PlantaePlantae
DivisioacutenDivisioacuten MagnoliophytaMagnoliophyta
ClaseClase MagnoliopsidaMagnoliopsida
SubclaseSubclase AsteridaeAsteridae
OrdenOrden SolanalesSolanales
FamiliaFamilia SolanaceaeSolanaceae
GeacuteneroGeacutenero SolanumSolanum
EspecieEspecie S tuberosumS tuberosum
Nombre binomialNombre binomial Solanum tuberosumSolanum tuberosum
MONDAS DE PATATAMONDAS DE PATATA
La patata es el cuarto cultivo La patata es el cuarto cultivo mundial por detraacutes del maiacutez el mundial por detraacutes del maiacutez el trigo y el arroz trigo y el arroz
En Espantildea la produccioacuten 2007 En Espantildea la produccioacuten 2007 Aacuterea cosechada 89 000 haAacuterea cosechada 89 000 ha Cantidad 2 502 300 TCantidad 2 502 300 T
Consumos actualesConsumos actuales Procesadas industrialmenteProcesadas industrialmente Derivados de la patataDerivados de la patata Residuos industrialesResiduos industriales
PROBLEMAPROBLEMA
Composicioacuten Composicioacuten 72-75 72-75 de aguade agua 16-20 16-20 de feacutecula en forma de de feacutecula en forma de almidoacutenalmidoacuten 20-25 20-25 de substancias de substancias
nitrogenadasnitrogenadas 015 015 liacutepidosliacutepidos 10-18 10-18 de fibra dieteacutetica como de fibra dieteacutetica como
celulosacelulosa Fermentacioacuten Usan Fermentacioacuten Usan monosacaridosmonosacaridos
como sustrato como sustrato
SOLUCIOacuteNSOLUCIOacuteN
SacarificacioacutenSacarificacioacuten Desdoblamiento Desdoblamiento de un polisacaacuterido para liberar de un polisacaacuterido para liberar un monosacaacuteridoun monosacaacuterido
TiposTipos Sacarificacioacuten microbioloacutegicaSacarificacioacuten microbioloacutegica Sacarificacioacuten enzimaacuteticaSacarificacioacuten enzimaacutetica Sacarificacioacuten quiacutemicaSacarificacioacuten quiacutemica
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN MICROBIOLOacuteGICAMICROBIOLOacuteGICA
Rhyzopus oryzaeRhyzopus oryzae Se lo emplea como Se lo emplea como agente sacarificante ya que es buen agente sacarificante ya que es buen productor de amilasas Tambieacuten se lo usa productor de amilasas Tambieacuten se lo usa para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y fumaacutericofumaacuterico
Rhyzopus delemarRhyzopus delemar Es un hongo muy rico Es un hongo muy rico en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo utiliza en el proceso amilo para obtener utiliza en el proceso amilo para obtener etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten en la transformacioacuten de esteroidesen la transformacioacuten de esteroides
Rhyzopus arrhizusRhyzopus arrhizus Tambieacuten transforma Tambieacuten transforma esteroides Se lo emplea para obtener esteroides Se lo emplea para obtener amilasas y para la produccioacuten de aacutecido amilasas y para la produccioacuten de aacutecido laacutecticolaacutectico
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN ENZIMAacuteTICAENZIMAacuteTICA
Mediante amilasa tambieacuten Mediante amilasa tambieacuten denominada sacarasa o ptialinadenominada sacarasa o ptialina α-Amilasaα-Amilasa β-Amilasa β-Amilasa γ-Amilasa γ-Amilasa
Las enzimas amilasas son empleadas Las enzimas amilasas son empleadas para romper azuacutecares complejos como para romper azuacutecares complejos como el almidoacuten en azuacutecares simples el almidoacuten en azuacutecares simples
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN QUIacuteMICAQUIacuteMICA
En general se utilizan aacutecidos minerales a pH En general se utilizan aacutecidos minerales a pH 15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
VOCABULARIOVOCABULARIO BiocombustibleBiocombustible Combustible obtenido Combustible obtenido
mediante un proceso bioloacutegico (por mediante un proceso bioloacutegico (por oposicioacuten a los procesos geoloacutegicos) oposicioacuten a los procesos geoloacutegicos)
Biocombustibles de primera generacioacutenBiocombustibles de primera generacioacuten Biocombustibles producidos a partir de Biocombustibles producidos a partir de cereales azuacutecar y semillas oleaginosascereales azuacutecar y semillas oleaginosas
Biocombustibles de segunda Biocombustibles de segunda generacioacutengeneracioacuten Biocombustibles producidos Biocombustibles producidos a partir de materia prima vegetal que no a partir de materia prima vegetal que no tiene usos alimentarios tiene usos alimentarios
BioetanolBioetanol Biocombustible liacutequido de Biocombustible liacutequido de origen vegetal obtenido por origen vegetal obtenido por fermentacioacuten de carbohidratos fermentacioacuten de carbohidratos
EL SUSTRATOEL SUSTRATOReinoReino PlantaePlantae
DivisioacutenDivisioacuten MagnoliophytaMagnoliophyta
ClaseClase MagnoliopsidaMagnoliopsida
SubclaseSubclase AsteridaeAsteridae
OrdenOrden SolanalesSolanales
FamiliaFamilia SolanaceaeSolanaceae
GeacuteneroGeacutenero SolanumSolanum
EspecieEspecie S tuberosumS tuberosum
Nombre binomialNombre binomial Solanum tuberosumSolanum tuberosum
MONDAS DE PATATAMONDAS DE PATATA
La patata es el cuarto cultivo La patata es el cuarto cultivo mundial por detraacutes del maiacutez el mundial por detraacutes del maiacutez el trigo y el arroz trigo y el arroz
En Espantildea la produccioacuten 2007 En Espantildea la produccioacuten 2007 Aacuterea cosechada 89 000 haAacuterea cosechada 89 000 ha Cantidad 2 502 300 TCantidad 2 502 300 T
Consumos actualesConsumos actuales Procesadas industrialmenteProcesadas industrialmente Derivados de la patataDerivados de la patata Residuos industrialesResiduos industriales
PROBLEMAPROBLEMA
Composicioacuten Composicioacuten 72-75 72-75 de aguade agua 16-20 16-20 de feacutecula en forma de de feacutecula en forma de almidoacutenalmidoacuten 20-25 20-25 de substancias de substancias
nitrogenadasnitrogenadas 015 015 liacutepidosliacutepidos 10-18 10-18 de fibra dieteacutetica como de fibra dieteacutetica como
celulosacelulosa Fermentacioacuten Usan Fermentacioacuten Usan monosacaridosmonosacaridos
como sustrato como sustrato
SOLUCIOacuteNSOLUCIOacuteN
SacarificacioacutenSacarificacioacuten Desdoblamiento Desdoblamiento de un polisacaacuterido para liberar de un polisacaacuterido para liberar un monosacaacuteridoun monosacaacuterido
TiposTipos Sacarificacioacuten microbioloacutegicaSacarificacioacuten microbioloacutegica Sacarificacioacuten enzimaacuteticaSacarificacioacuten enzimaacutetica Sacarificacioacuten quiacutemicaSacarificacioacuten quiacutemica
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN MICROBIOLOacuteGICAMICROBIOLOacuteGICA
Rhyzopus oryzaeRhyzopus oryzae Se lo emplea como Se lo emplea como agente sacarificante ya que es buen agente sacarificante ya que es buen productor de amilasas Tambieacuten se lo usa productor de amilasas Tambieacuten se lo usa para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y fumaacutericofumaacuterico
Rhyzopus delemarRhyzopus delemar Es un hongo muy rico Es un hongo muy rico en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo utiliza en el proceso amilo para obtener utiliza en el proceso amilo para obtener etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten en la transformacioacuten de esteroidesen la transformacioacuten de esteroides
Rhyzopus arrhizusRhyzopus arrhizus Tambieacuten transforma Tambieacuten transforma esteroides Se lo emplea para obtener esteroides Se lo emplea para obtener amilasas y para la produccioacuten de aacutecido amilasas y para la produccioacuten de aacutecido laacutecticolaacutectico
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN ENZIMAacuteTICAENZIMAacuteTICA
Mediante amilasa tambieacuten Mediante amilasa tambieacuten denominada sacarasa o ptialinadenominada sacarasa o ptialina α-Amilasaα-Amilasa β-Amilasa β-Amilasa γ-Amilasa γ-Amilasa
Las enzimas amilasas son empleadas Las enzimas amilasas son empleadas para romper azuacutecares complejos como para romper azuacutecares complejos como el almidoacuten en azuacutecares simples el almidoacuten en azuacutecares simples
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN QUIacuteMICAQUIacuteMICA
En general se utilizan aacutecidos minerales a pH En general se utilizan aacutecidos minerales a pH 15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
EL SUSTRATOEL SUSTRATOReinoReino PlantaePlantae
DivisioacutenDivisioacuten MagnoliophytaMagnoliophyta
ClaseClase MagnoliopsidaMagnoliopsida
SubclaseSubclase AsteridaeAsteridae
OrdenOrden SolanalesSolanales
FamiliaFamilia SolanaceaeSolanaceae
GeacuteneroGeacutenero SolanumSolanum
EspecieEspecie S tuberosumS tuberosum
Nombre binomialNombre binomial Solanum tuberosumSolanum tuberosum
MONDAS DE PATATAMONDAS DE PATATA
La patata es el cuarto cultivo La patata es el cuarto cultivo mundial por detraacutes del maiacutez el mundial por detraacutes del maiacutez el trigo y el arroz trigo y el arroz
En Espantildea la produccioacuten 2007 En Espantildea la produccioacuten 2007 Aacuterea cosechada 89 000 haAacuterea cosechada 89 000 ha Cantidad 2 502 300 TCantidad 2 502 300 T
Consumos actualesConsumos actuales Procesadas industrialmenteProcesadas industrialmente Derivados de la patataDerivados de la patata Residuos industrialesResiduos industriales
PROBLEMAPROBLEMA
Composicioacuten Composicioacuten 72-75 72-75 de aguade agua 16-20 16-20 de feacutecula en forma de de feacutecula en forma de almidoacutenalmidoacuten 20-25 20-25 de substancias de substancias
nitrogenadasnitrogenadas 015 015 liacutepidosliacutepidos 10-18 10-18 de fibra dieteacutetica como de fibra dieteacutetica como
celulosacelulosa Fermentacioacuten Usan Fermentacioacuten Usan monosacaridosmonosacaridos
como sustrato como sustrato
SOLUCIOacuteNSOLUCIOacuteN
SacarificacioacutenSacarificacioacuten Desdoblamiento Desdoblamiento de un polisacaacuterido para liberar de un polisacaacuterido para liberar un monosacaacuteridoun monosacaacuterido
TiposTipos Sacarificacioacuten microbioloacutegicaSacarificacioacuten microbioloacutegica Sacarificacioacuten enzimaacuteticaSacarificacioacuten enzimaacutetica Sacarificacioacuten quiacutemicaSacarificacioacuten quiacutemica
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN MICROBIOLOacuteGICAMICROBIOLOacuteGICA
Rhyzopus oryzaeRhyzopus oryzae Se lo emplea como Se lo emplea como agente sacarificante ya que es buen agente sacarificante ya que es buen productor de amilasas Tambieacuten se lo usa productor de amilasas Tambieacuten se lo usa para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y fumaacutericofumaacuterico
Rhyzopus delemarRhyzopus delemar Es un hongo muy rico Es un hongo muy rico en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo utiliza en el proceso amilo para obtener utiliza en el proceso amilo para obtener etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten en la transformacioacuten de esteroidesen la transformacioacuten de esteroides
Rhyzopus arrhizusRhyzopus arrhizus Tambieacuten transforma Tambieacuten transforma esteroides Se lo emplea para obtener esteroides Se lo emplea para obtener amilasas y para la produccioacuten de aacutecido amilasas y para la produccioacuten de aacutecido laacutecticolaacutectico
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN ENZIMAacuteTICAENZIMAacuteTICA
Mediante amilasa tambieacuten Mediante amilasa tambieacuten denominada sacarasa o ptialinadenominada sacarasa o ptialina α-Amilasaα-Amilasa β-Amilasa β-Amilasa γ-Amilasa γ-Amilasa
Las enzimas amilasas son empleadas Las enzimas amilasas son empleadas para romper azuacutecares complejos como para romper azuacutecares complejos como el almidoacuten en azuacutecares simples el almidoacuten en azuacutecares simples
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN QUIacuteMICAQUIacuteMICA
En general se utilizan aacutecidos minerales a pH En general se utilizan aacutecidos minerales a pH 15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
MONDAS DE PATATAMONDAS DE PATATA
La patata es el cuarto cultivo La patata es el cuarto cultivo mundial por detraacutes del maiacutez el mundial por detraacutes del maiacutez el trigo y el arroz trigo y el arroz
En Espantildea la produccioacuten 2007 En Espantildea la produccioacuten 2007 Aacuterea cosechada 89 000 haAacuterea cosechada 89 000 ha Cantidad 2 502 300 TCantidad 2 502 300 T
Consumos actualesConsumos actuales Procesadas industrialmenteProcesadas industrialmente Derivados de la patataDerivados de la patata Residuos industrialesResiduos industriales
PROBLEMAPROBLEMA
Composicioacuten Composicioacuten 72-75 72-75 de aguade agua 16-20 16-20 de feacutecula en forma de de feacutecula en forma de almidoacutenalmidoacuten 20-25 20-25 de substancias de substancias
nitrogenadasnitrogenadas 015 015 liacutepidosliacutepidos 10-18 10-18 de fibra dieteacutetica como de fibra dieteacutetica como
celulosacelulosa Fermentacioacuten Usan Fermentacioacuten Usan monosacaridosmonosacaridos
como sustrato como sustrato
SOLUCIOacuteNSOLUCIOacuteN
SacarificacioacutenSacarificacioacuten Desdoblamiento Desdoblamiento de un polisacaacuterido para liberar de un polisacaacuterido para liberar un monosacaacuteridoun monosacaacuterido
TiposTipos Sacarificacioacuten microbioloacutegicaSacarificacioacuten microbioloacutegica Sacarificacioacuten enzimaacuteticaSacarificacioacuten enzimaacutetica Sacarificacioacuten quiacutemicaSacarificacioacuten quiacutemica
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN MICROBIOLOacuteGICAMICROBIOLOacuteGICA
Rhyzopus oryzaeRhyzopus oryzae Se lo emplea como Se lo emplea como agente sacarificante ya que es buen agente sacarificante ya que es buen productor de amilasas Tambieacuten se lo usa productor de amilasas Tambieacuten se lo usa para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y fumaacutericofumaacuterico
Rhyzopus delemarRhyzopus delemar Es un hongo muy rico Es un hongo muy rico en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo utiliza en el proceso amilo para obtener utiliza en el proceso amilo para obtener etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten en la transformacioacuten de esteroidesen la transformacioacuten de esteroides
Rhyzopus arrhizusRhyzopus arrhizus Tambieacuten transforma Tambieacuten transforma esteroides Se lo emplea para obtener esteroides Se lo emplea para obtener amilasas y para la produccioacuten de aacutecido amilasas y para la produccioacuten de aacutecido laacutecticolaacutectico
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN ENZIMAacuteTICAENZIMAacuteTICA
Mediante amilasa tambieacuten Mediante amilasa tambieacuten denominada sacarasa o ptialinadenominada sacarasa o ptialina α-Amilasaα-Amilasa β-Amilasa β-Amilasa γ-Amilasa γ-Amilasa
Las enzimas amilasas son empleadas Las enzimas amilasas son empleadas para romper azuacutecares complejos como para romper azuacutecares complejos como el almidoacuten en azuacutecares simples el almidoacuten en azuacutecares simples
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN QUIacuteMICAQUIacuteMICA
En general se utilizan aacutecidos minerales a pH En general se utilizan aacutecidos minerales a pH 15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
PROBLEMAPROBLEMA
Composicioacuten Composicioacuten 72-75 72-75 de aguade agua 16-20 16-20 de feacutecula en forma de de feacutecula en forma de almidoacutenalmidoacuten 20-25 20-25 de substancias de substancias
nitrogenadasnitrogenadas 015 015 liacutepidosliacutepidos 10-18 10-18 de fibra dieteacutetica como de fibra dieteacutetica como
celulosacelulosa Fermentacioacuten Usan Fermentacioacuten Usan monosacaridosmonosacaridos
como sustrato como sustrato
SOLUCIOacuteNSOLUCIOacuteN
SacarificacioacutenSacarificacioacuten Desdoblamiento Desdoblamiento de un polisacaacuterido para liberar de un polisacaacuterido para liberar un monosacaacuteridoun monosacaacuterido
TiposTipos Sacarificacioacuten microbioloacutegicaSacarificacioacuten microbioloacutegica Sacarificacioacuten enzimaacuteticaSacarificacioacuten enzimaacutetica Sacarificacioacuten quiacutemicaSacarificacioacuten quiacutemica
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN MICROBIOLOacuteGICAMICROBIOLOacuteGICA
Rhyzopus oryzaeRhyzopus oryzae Se lo emplea como Se lo emplea como agente sacarificante ya que es buen agente sacarificante ya que es buen productor de amilasas Tambieacuten se lo usa productor de amilasas Tambieacuten se lo usa para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y fumaacutericofumaacuterico
Rhyzopus delemarRhyzopus delemar Es un hongo muy rico Es un hongo muy rico en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo utiliza en el proceso amilo para obtener utiliza en el proceso amilo para obtener etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten en la transformacioacuten de esteroidesen la transformacioacuten de esteroides
Rhyzopus arrhizusRhyzopus arrhizus Tambieacuten transforma Tambieacuten transforma esteroides Se lo emplea para obtener esteroides Se lo emplea para obtener amilasas y para la produccioacuten de aacutecido amilasas y para la produccioacuten de aacutecido laacutecticolaacutectico
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN ENZIMAacuteTICAENZIMAacuteTICA
Mediante amilasa tambieacuten Mediante amilasa tambieacuten denominada sacarasa o ptialinadenominada sacarasa o ptialina α-Amilasaα-Amilasa β-Amilasa β-Amilasa γ-Amilasa γ-Amilasa
Las enzimas amilasas son empleadas Las enzimas amilasas son empleadas para romper azuacutecares complejos como para romper azuacutecares complejos como el almidoacuten en azuacutecares simples el almidoacuten en azuacutecares simples
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN QUIacuteMICAQUIacuteMICA
En general se utilizan aacutecidos minerales a pH En general se utilizan aacutecidos minerales a pH 15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
SOLUCIOacuteNSOLUCIOacuteN
SacarificacioacutenSacarificacioacuten Desdoblamiento Desdoblamiento de un polisacaacuterido para liberar de un polisacaacuterido para liberar un monosacaacuteridoun monosacaacuterido
TiposTipos Sacarificacioacuten microbioloacutegicaSacarificacioacuten microbioloacutegica Sacarificacioacuten enzimaacuteticaSacarificacioacuten enzimaacutetica Sacarificacioacuten quiacutemicaSacarificacioacuten quiacutemica
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN MICROBIOLOacuteGICAMICROBIOLOacuteGICA
Rhyzopus oryzaeRhyzopus oryzae Se lo emplea como Se lo emplea como agente sacarificante ya que es buen agente sacarificante ya que es buen productor de amilasas Tambieacuten se lo usa productor de amilasas Tambieacuten se lo usa para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y fumaacutericofumaacuterico
Rhyzopus delemarRhyzopus delemar Es un hongo muy rico Es un hongo muy rico en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo utiliza en el proceso amilo para obtener utiliza en el proceso amilo para obtener etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten en la transformacioacuten de esteroidesen la transformacioacuten de esteroides
Rhyzopus arrhizusRhyzopus arrhizus Tambieacuten transforma Tambieacuten transforma esteroides Se lo emplea para obtener esteroides Se lo emplea para obtener amilasas y para la produccioacuten de aacutecido amilasas y para la produccioacuten de aacutecido laacutecticolaacutectico
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN ENZIMAacuteTICAENZIMAacuteTICA
Mediante amilasa tambieacuten Mediante amilasa tambieacuten denominada sacarasa o ptialinadenominada sacarasa o ptialina α-Amilasaα-Amilasa β-Amilasa β-Amilasa γ-Amilasa γ-Amilasa
Las enzimas amilasas son empleadas Las enzimas amilasas son empleadas para romper azuacutecares complejos como para romper azuacutecares complejos como el almidoacuten en azuacutecares simples el almidoacuten en azuacutecares simples
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN QUIacuteMICAQUIacuteMICA
En general se utilizan aacutecidos minerales a pH En general se utilizan aacutecidos minerales a pH 15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN MICROBIOLOacuteGICAMICROBIOLOacuteGICA
Rhyzopus oryzaeRhyzopus oryzae Se lo emplea como Se lo emplea como agente sacarificante ya que es buen agente sacarificante ya que es buen productor de amilasas Tambieacuten se lo usa productor de amilasas Tambieacuten se lo usa para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y para producir enzimas y aacutecidos laacutectico y fumaacutericofumaacuterico
Rhyzopus delemarRhyzopus delemar Es un hongo muy rico Es un hongo muy rico en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo en enzimas amiloliacuteticas por lo cual se lo utiliza en el proceso amilo para obtener utiliza en el proceso amilo para obtener etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten etanol Uacuteltimamente se le halloacute aplicacioacuten en la transformacioacuten de esteroidesen la transformacioacuten de esteroides
Rhyzopus arrhizusRhyzopus arrhizus Tambieacuten transforma Tambieacuten transforma esteroides Se lo emplea para obtener esteroides Se lo emplea para obtener amilasas y para la produccioacuten de aacutecido amilasas y para la produccioacuten de aacutecido laacutecticolaacutectico
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN ENZIMAacuteTICAENZIMAacuteTICA
Mediante amilasa tambieacuten Mediante amilasa tambieacuten denominada sacarasa o ptialinadenominada sacarasa o ptialina α-Amilasaα-Amilasa β-Amilasa β-Amilasa γ-Amilasa γ-Amilasa
Las enzimas amilasas son empleadas Las enzimas amilasas son empleadas para romper azuacutecares complejos como para romper azuacutecares complejos como el almidoacuten en azuacutecares simples el almidoacuten en azuacutecares simples
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN QUIacuteMICAQUIacuteMICA
En general se utilizan aacutecidos minerales a pH En general se utilizan aacutecidos minerales a pH 15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN ENZIMAacuteTICAENZIMAacuteTICA
Mediante amilasa tambieacuten Mediante amilasa tambieacuten denominada sacarasa o ptialinadenominada sacarasa o ptialina α-Amilasaα-Amilasa β-Amilasa β-Amilasa γ-Amilasa γ-Amilasa
Las enzimas amilasas son empleadas Las enzimas amilasas son empleadas para romper azuacutecares complejos como para romper azuacutecares complejos como el almidoacuten en azuacutecares simples el almidoacuten en azuacutecares simples
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN QUIacuteMICAQUIacuteMICA
En general se utilizan aacutecidos minerales a pH En general se utilizan aacutecidos minerales a pH 15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
SACARIFICACIOacuteN SACARIFICACIOacuteN QUIacuteMICAQUIacuteMICA
En general se utilizan aacutecidos minerales a pH En general se utilizan aacutecidos minerales a pH 15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten15 para soluciones hasta del 33 de almidoacuten
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
EL MICROORGANISMOEL MICROORGANISMO
Saccharomyces Saccharomyces cerevisiaecerevisiae es es un hongo unicelular un hongo unicelular un tipo de un tipo de levadura utilizado levadura utilizado industrialmente en industrialmente en la fabricacioacuten de la fabricacioacuten de pan cerveza y vinopan cerveza y vino
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
LA REACCIOacuteNLA REACCIOacuteN
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
TIPOS DE REACCIONESTIPOS DE REACCIONES
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CULTIVO POR LOTESCULTIVO POR LOTES En los sistemas cerrados (que En los sistemas cerrados (que
pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no pueden ser liacutequidos o soacutelidos) no existe aporte continuo de nutrientes existe aporte continuo de nutrientes ni drenaje de ceacutelulas ni de ni drenaje de ceacutelulas ni de sustancias de desechosustancias de desecho
En estos sistemas la fase En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura soacutelo balanceado no restringido dura soacutelo unas cuantas generaciones debido unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes yo a la al agotamiento de nutrientes yo a la acumulacioacuten de desechosacumulacioacuten de desechos
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
EL REACTOREL REACTOR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
ETAPASETAPAS Fermentacioacuten inicial para familiarizarse Fermentacioacuten inicial para familiarizarse
con el biorreactor con el biorreactor BatchBatch 1 1 A partir del mismo se pondraacuten a punto los A partir del mismo se pondraacuten a punto los
procedimientos de seguimiento de la procedimientos de seguimiento de la reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y reaccioacuten asiacute como de la obtencioacuten y mantenimiento del microorganismo mantenimiento del microorganismo implicado y evaluacioacuten del inoacuteculoimplicado y evaluacioacuten del inoacuteculo
Optimizacioacuten de las condiciones de Optimizacioacuten de las condiciones de produccioacuten de etanol utilizando glucosa produccioacuten de etanol utilizando glucosa como sustratocomo sustrato
Sacarificacioacuten de las mondas de patatasSacarificacioacuten de las mondas de patatas Fermentacioacuten utilizando el producto Fermentacioacuten utilizando el producto
sacarificadosacarificado
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
FERMENTACIOacuteN FERMENTACIOacuteN INICIALINICIAL
BatchBatch 1 1
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura en Se disuelven las sales y el extracto de levadura en
el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las mismas disolvente para esterilizar aparte en las mismas condiciones para evitar la reaccioacuten de Maillardcondiciones para evitar la reaccioacuten de Maillard
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
LA REACCION DE LA REACCION DE MAILLARDMAILLARD
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo una Se ha utilizado como inoacuteculo una cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir de un panadera obtenida a partir de un preparado comercial de la misma preparado comercial de la misma utilizado en panaderiacutea suspendido utilizado en panaderiacutea suspendido en el 5 del medio de cultivo en el 5 del medio de cultivo completo esteacuterilcompleto esteacuteril
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuterilesreactor y medio estaacuten esteacuteriles
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 30 ordmC30 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 300 rpm300 rpm AireacioacutenAireacioacuten 15 Lminuto15 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
SEGUIMIENTO DE LA SEGUIMIENTO DE LA REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Paraacutemetros QuiacutemicosParaacutemetros Quiacutemicos Aumento de la concentracioacuten de Aumento de la concentracioacuten de
etanoletanol Disminucioacuten de la concentracioacuten de Disminucioacuten de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Paraacutemetros MicrobioloacutegicosParaacutemetros Microbioloacutegicos
Produccioacuten de biomasaProduccioacuten de biomasa Medida de la densidad oacuteptica Medida de la densidad oacuteptica
(turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero (turbidimetriacutea proporcional al nuacutemero de microorganismos)de microorganismos)
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
MUESTREOMUESTREO
Para el seguimiento se extraen Para el seguimiento se extraen muestras con el muestreador muestras con el muestreador aseacuteptico del equipoaseacuteptico del equipo
Con un volumen de 15 mLCon un volumen de 15 mL Todos los diacuteasTodos los diacuteas
Al comenzar la jornada lectivaAl comenzar la jornada lectiva A la mitad de la jornada lectivaA la mitad de la jornada lectiva Al final de la jornada lectivaAl final de la jornada lectiva
Congeladas si no se analizan de Congeladas si no se analizan de forma inmediataforma inmediata
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE ETANOLETANOL
Mediante cromatografiacutea de gasesMediante cromatografiacutea de gases Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Tras extraer con eacuteterTras extraer con eacuteter Utilizando la teacutecnicaUtilizando la teacutecnica
SplitSplit IsotermaIsoterma Curva de calibradoCurva de calibrado
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
05 10 15 20 25
05
10
15
20
25
30
35
40
Are
a In
teg
rad
aC (gL) de etanol
C (gL) de etanol Aacuterea Integrada
0505 0655006550
11 1434014340
1515 2092020920
22 2868028680
2525 3669036690
Linear Regression Y = A + B XLinear Regression Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError----------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -0095-0095 004524004524BB 1492414924 002728002728----------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP----------------------------------------------------------------------------------------------------------------0999509995 004313004313 5 lt000015 lt00001
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONCENTRACIOacuteN DE CONCENTRACIOacuteN DE GLUCOSAGLUCOSA
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el filtrado del muestreoSobre el filtrado del muestreo Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico Utilizando el meacutetodo fenol-sulfuacuterico
para colorear las muestraspara colorear las muestras Midiendo a una longitud de onda deMidiendo a una longitud de onda de
500 nm500 nm 540 nm540 nm
Utilizando la teacutecnica de curva de Utilizando la teacutecnica de curva de calibradocalibrado
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
5 10 15 20 25
02
04
06
08
10
12
Abs
orba
ncia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa
Absorbancia
55 0236002360
1010 0457004570
1515 0684006840
2020 0920009200
2525 1150011500
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 0002100021 000511000511BB 004582004582 307896E-4307896E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099993099993 000487000487 55 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ABSORBANCIA A 500 nmABSORBANCIA A 500 nm
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
ABSORBANCIA A 540 nmABSORBANCIA A 540 nm
0 5 10 15 20 25-002
000
002
004
006
008
010
012
014
016
Ab
sorb
an
cia
C (ppm) glucosa
C (ppm) glucosa Absorbancia
0000 00000000
5050 00320032
100100 00600060
150150 00810081
200200 01210121
250250 01400140
Linear Regression for Y = A + B XParameter Value Error------------------------------------------------------------A 000176 00034B 000565 224778E-4------------------------------------------------------------R SD N P------------------------------------------------------------099684 00047 6 lt00001
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
PRODUCCIOacuteN DE PRODUCCIOacuteN DE BIOMASABIOMASA
Mediante gravimetriacutea Mediante gravimetriacutea Utilizando el incremento del peso seco del Utilizando el incremento del peso seco del
filtrofiltro Filtracioacuten a presioacuten reducidaFiltracioacuten a presioacuten reducida Filtro de nitrato de celulosa de 045 nmFiltro de nitrato de celulosa de 045 nm Secado a 105 ordmC durante 2 horasSecado a 105 ordmC durante 2 horas Enfriado en desecador a presioacuten reducida Enfriado en desecador a presioacuten reducida
y temperatura ambiente hasta peso y temperatura ambiente hasta peso constanteconstante
Utilizando el blanco adecuado como efecto Utilizando el blanco adecuado como efecto de correccioacutende correccioacuten
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
DODO600nm600nm
Mediante espectrofotometriacutea visibleMediante espectrofotometriacutea visible Sobre el muestreo directamenteSobre el muestreo directamente Utilizando blanco como efecto de correccioacutenUtilizando blanco como efecto de correccioacuten Utilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenicaUtilizando la teacutecnica monohaz y cubeta uacutenica Midiendo a una longitud de onda de 600 nmMidiendo a una longitud de onda de 600 nm Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad Midiendo entre 0050 y 0700 (de linealidad
demostrada)demostrada) Para absorbancias mayores utilizando Para absorbancias mayores utilizando
factores de dilucioacutenfactores de dilucioacuten
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
Valores Valores BatchBatch 1 1MUESTR
ADO
600nmBIOMASA
seca 2 (gL)
GLUCOSA15 (gL)
TIEMPO (h)
Etanol (gL)
M10M10 00490049 016016 15001500 000000 02480248
M13M13 00610061 030030 14801480 24002400 00000000
M15M15 04020402 048048 13601360 45254525 01440144
M18M18 13651365 110110 01480148 74507450 04540454
M19M19 22402240 180180 00960096 94009400 02600260
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
BATCH 1
-01
04
09
14
19
24
0 24 48 72 96
Tiempo (horas)
Un
ida
de
s
DO 600nm BIOM ASA seca 2 (gL) GLUCOSA5 (gL)
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
ETANOL
0
05
1
15
2
25
3
35
4
0 24 48 72 96
ETANOL
ETANOL
-0100
0000
0100
0200
0300
0400
0500
0 24 48 72 96
ETANOL
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
OBTENCIOacuteN DEL OBTENCIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
A partir de levadura comercial para A partir de levadura comercial para reposteriacutea Levitalreposteriacutea Levitalregregsin glutensin gluten
Homogeneizado Stomacher 25 g Homogeneizado Stomacher 25 g 250 mL glucosa 11 230 rpm 250 mL glucosa 11 230 rpm durante 1 minutodurante 1 minuto
Pre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horasPre-enriquecimiento 30 ordmC 24 horas Enriquecimiento 10 mL enriquecido Enriquecimiento 10 mL enriquecido
100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 100 mL de medio de cultivo a 30 ordmC 24 h 250 rpm24 h 250 rpm
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
0 20 40 60 80 100
00
05
10
15
20
25Data Data1_BModel Boltzmann Equation y = A2 + (A1-A2)(1 + exp((x-x0)dx)) Weightingy No weighting Chi^2DoF = 000057R^2 = 099974 A1 003163 plusmn001663A2 247363 plusmn005562x0 6488177 plusmn076394dx 1120418 plusmn062928
DO
600 n
m
Tiempo (horas)
CINEacuteTICA DE CINEacuteTICA DE CRECIMIENTOCRECIMIENTO
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
PARAacuteMETROS PARAacuteMETROS
Fase Fase LagLag Superior a 24 horasSuperior a 24 horas Crecimiento lento entre las 24 y 48 horasCrecimiento lento entre las 24 y 48 horas Crecimiento exponencial entre las 48 y Crecimiento exponencial entre las 48 y
80 horas80 horas Fase de crecimiento nuevamente lento Fase de crecimiento nuevamente lento
entre las 80 y 94 horasentre las 80 y 94 horas No aparece fase de decrecimiento y No aparece fase de decrecimiento y
muertemuerte La tasa de generacioacuten es de unas 24 horasLa tasa de generacioacuten es de unas 24 horas
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
GESTIOacuteN DE LA CEPAGESTIOacuteN DE LA CEPA
Identificacioacuten en Agar Saboreaud-Identificacioacuten en Agar Saboreaud-CENAMCENAM
Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Purificacioacuten agotamiento en estriacutea Agar PCAAgar PCA
ConservacioacutenConservacioacuten Periodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmCPeriodos cortos medio caldo glucosa 4 ordmC Periodos medios medio agar OGYE ndashPeriodos medios medio agar OGYE ndash
CENAM en CENAM en slantslant a 4 ordmC a 4 ordmC Periodos largos Criovial Periodos largos Criovial skim milkskim milk a ndash 20 a ndash 20
ordmCordmC
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
EVALUACIOacuteN DEL EVALUACIOacuteN DEL INOacuteCULOINOacuteCULO
Pendiente de correlaccionar DO Pendiente de correlaccionar DO 600 nm con UFC mL de 600 nm con UFC mL de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae
A partir de la medida de la DO A partir de la medida de la DO 600 nm del inoacuteculo y los valores 600 nm del inoacuteculo y los valores de McFarland aproximadamente de McFarland aproximadamente Inoacuteculo 8Inoacuteculo 8middot10middot108 8 ceacutelulas mLceacutelulas mL Concentracioacuten inicial en el reactor Concentracioacuten inicial en el reactor
44middot10middot107 7 ceacutelulas mLceacutelulas mL
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
ESCALA McFARLANDESCALA McFARLAND
Adaptada a nuestro problemaAdaptada a nuestro problema Con medida de DOCon medida de DO600 600 yy no visualno visual Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)Para el rango de linealidad de la medida (0125 y 25)
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
0 100 200 300 400 500 600 700 800
00
01
02
03
04
05
06D
O 6
00
nm
Ceacutelulas 106 mL-1 Seguacuten McFarland
Linear Regression for Y = A + B XLinear Regression for Y = A + B X
ParameterParameter ValueValue ErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA 000176000176 0003400034BB 000565000565 224778E-4224778E-4------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------099684099684 0004700047 66 lt00001lt00001------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONCLUSIONES CONCLUSIONES operativasoperativas
Mantener el medio y las Mantener el medio y las condiciones de cultivo salvo condiciones de cultivo salvo disminuir la aireacioacuten a 1 L disminuir la aireacioacuten a 1 L minuto y la agitacioacuten a 250 rpmminuto y la agitacioacuten a 250 rpm
Aumentar tanto la cantidad como Aumentar tanto la cantidad como la concentracioacuten del inoacuteculola concentracioacuten del inoacuteculo
Aumentar el tiempo hasta al Aumentar el tiempo hasta al menos 144 horas o hasta total menos 144 horas o hasta total agotamiento del sustratoagotamiento del sustrato
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONCLUSIONES CONCLUSIONES analiacuteticasanaliacuteticas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas Muestrear soacutelo una vez cada 24 horas
La muestra para determinar etanol por CG no La muestra para determinar etanol por CG no filtrarla sino centrifugarlafiltrarla sino centrifugarla
Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para Utilizar otra columna en CG maacutes especiacutefica para alcoholesalcoholes
Efectuar en las muestras para GC ensayos de Efectuar en las muestras para GC ensayos de recuperacioacutenrecuperacioacuten
No congelar las muestras solo mantener en No congelar las muestras solo mantener en refrigeracioacuten a 4 ordmCrefrigeracioacuten a 4 ordmC
Medir la DO a 600 nm y entre valores de Medir la DO a 600 nm y entre valores de absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es absorbancia 0050 y 0600 diluyendo si es necesarionecesario
Medir la concentracioacuten final de etanol por Medir la concentracioacuten final de etanol por destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea destilacioacuten y posterior areometriacutea y o picnometriacutea y calcular la productividady calcular la productividad
Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante Correlacionar la DO600nm con UFCmL mediante la Norma la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
SEGUNDA SEGUNDA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 2 2
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 110 gL 110 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCApuro de la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a del total) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten de 10 en una concentracioacuten de 10 99 momL momL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
MEDIDA DE ETANOLMEDIDA DE ETANOL
Mediante Cromatografiacutea de Mediante Cromatografiacutea de gases del extracto eteacutereo de la gases del extracto eteacutereo de la muestramuestra
Para la medida del etanol se Para la medida del etanol se utilizoacute una columna maacutes polarutilizoacute una columna maacutes polar
Se elaboroacute una nueva curva de Se elaboroacute una nueva curva de calibrado para la nueva columna calibrado para la nueva columna y las nuevas condiciones y las nuevas condiciones experimentalesexperimentales
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
05 10 15 20 2500
05
10
15
20
25
AacuteR
EA
DE
LA
INT
EG
RA
L
ETANOL (vv)
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
05 0346
1 0743
15 1059
2 1745
25 2328
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -02456-02456 013751013751BB 09932 09932 008292008292------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------098971098971 01311101311155 000125000125
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
Valores Valores BatchBatch 2 2
MUESTRA
DO 600nm
BIOMASA seca 2 (gL)
GLUCOSA3 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL (gL)
M30M30006006
88 044044 30903090 00 000000
M31M31195195
00 260260 30473047 7272 280280
M32M32290290
00 358358 02800280 9696 224224
M33M33320320
00 372372 01200120 120120 232232
M34M34330330
00 338338 00010001 144144 240240
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120 144
ETANOL (gL) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC)Grado alcohoacutelico 04 ordm (a 205 ordmC) Concentracioacuten de 0316 g100 mLConcentracioacuten de 0316 g100 mL Concentracioacuten de 32 gLConcentracioacuten de 32 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 63 Rendimiento sobre el teoacuterico 63 ProductividadProductividad 0022 gmiddot L 0022 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CORRELACIOacuteN DOCORRELACIOacuteN DO600 600 UFCmLUFCmL
Mediante la Norma Mediante la Norma ISO 7495 o ISO 6222 ISO 7495 o ISO 6222 de recuentos de mohos y levaduras en de recuentos de mohos y levaduras en alimentosalimentos
Recuento en placa de diluciones Recuento en placa de diluciones decimalesdecimales
Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE Inoculacioacuten en superficie en medio OGYE IncubacioacutenIncubacioacuten 31 ordmC31 ordmC 72 horas72 horas
Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes Resultado un factor 2 (100 veces) maacutes bajo de lo estimado seguacuten McFarlandbajo de lo estimado seguacuten McFarland
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
16 17 18 19 20 21 22
0
50
100
150
200
250
300
UF
Cm
L1
05
DO 600nm
DO600nm UFCmLmiddot105
1635 2
1745 70
1835 100
2165 300
Linear Regression for Y = A + B Linear Regression for Y = A + B X XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -9138-9138 50075007BB 55925592 26982698------------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------------099768099768 10671067 44000232000232
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Aumentar la concentracioacuten de glucosa Aumentar la concentracioacuten de glucosa
hasta un 10 maacuteximo presumible a hasta un 10 maacuteximo presumible a utilizar con mondas de patata como utilizar con mondas de patata como materia primamateria prima
Mantener la temperatura a 35 ordmCMantener la temperatura a 35 ordmC Aumentar la aireacioacuten a 2 LminutoAumentar la aireacioacuten a 2 Lminuto Mantener fija la pOMantener fija la pO22 y que regule la y que regule la
agitacioacutenagitacioacuten Aumentar la concentracioacuten del inoacuteculoAumentar la concentracioacuten del inoacuteculo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo Utilizar un tiempo de 96 horas maacuteximo
en virtud de la productividad o hasta en virtud de la productividad o hasta total agotamiento del sustratototal agotamiento del sustrato
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
TERCERA TERCERA FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
BatchBatch 3 3
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO (NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot3Hmiddot3H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot7Hmiddot7H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL Glucosa monohidratoGlucosa monohidrato 1100 gL 1100 gL HH22SOSO44 1M 1M 50 mLL50 mLLSe disuelven las sales y el extracto de levadura Se disuelven las sales y el extracto de levadura
en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido en el 95 del disolvente se le antildeade el aacutecido sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 sulfuacuterico y se ajusta el pH a 45 con NaOH 01 M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante M Se esteriliza en autoclave a 121 ordmC durante 20 minutos 20 minutos
Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del Por otro lado se disuelve la glucosa en el 5 del disolvente para esterilizar aparte en las disolvente para esterilizar aparte en las mismas condicionesmismas condiciones
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma Se ha utilizado como inoacuteculo la misma
cepa de cepa de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera obtenida a partir del cultivo puro panadera obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAde la misma aislada en PCA
Enriquecida en el mismo medio de cultivo Enriquecida en el mismo medio de cultivo completo y un volumen de 200 mL (10 completo y un volumen de 200 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una y medio estaacuten esteacuteriles y estimada en una concentracioacuten ahora realista de 4middot10 concentracioacuten ahora realista de 4middot10 77 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 2 L2 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 10 Lminuto10 Lminuto pOpO22 80 80 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Se han utilizado los mismos Se han utilizado los mismos paraacutemetros analiacuteticosparaacutemetros analiacuteticos
El aumento de concentracioacuten de la El aumento de concentracioacuten de la glucosa obliga a diluir 10 veces mas glucosa obliga a diluir 10 veces mas la muestra en el procedimiento la muestra en el procedimiento analiacuteticoanaliacutetico
El previsible aumento de la El previsible aumento de la concentracioacuten de etanol hace concentracioacuten de etanol hace necesario realizar una nueva curva necesario realizar una nueva curva de calibrado (entre 5-10 vv)de calibrado (entre 5-10 vv)
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
5 6 7 8 9 10
3
4
5
6
7
8
AR
EA
IN
TE
GR
AD
A
ETANOL VV
Etanol (vv)
Aacuterea Integral
55 30583058
66 37683768
77 44654465
88 57625762
99 63926392
1010 75367536
Linear Regression for Y = A + Linear Regression for Y = A + B XB XParameterParameter ValueValueErrorError------------------------------------------------------------------------------------------------------AA -159914-159914033964033964BB 090169 090169004415004415------------------------------------------------------------------------------------------------------RR SDSD NN PP------------------------------------------------------------------------------------------------------099524099524 01847101847166 lt00001lt00001
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
Valores Valores BatchBatch 3 3MUESTR
ADO
600nmBIOMASA seca (gL)
GLUCOSA20 (gL)
TIEMPO (h)
ETANOL middot 2 (vv)
M40M40 068068 171171 428428 00 088088
M41M41 195195 233233 30473047 2424 560560
M42M42 343343 307307 272272 4848 552552
M43M43 580580 417417 265265 7272 434434
M44M44 524524 430430 261261 9696 400400
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
0
1
2
3
4
5
6
7
0 24 48 72 96
ETANOL 2(vv) GLUCOSA3 (gL) BIOMASAseca2(gL) DO600nm
UNIDADES
HORAS
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD
Medida de la concentracioacuten final Medida de la concentracioacuten final del etanoldel etanol
Areometriacutea del destiladoAreometriacutea del destilado Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC)Grado alcohoacutelico 19 ordm (a 272 ordmC) Concentracioacuten de 1488 g100 mLConcentracioacuten de 1488 g100 mL Concentracioacuten de 148 gLConcentracioacuten de 148 gL Rendimiento sobre el teoacuterico 29 Rendimiento sobre el teoacuterico 29 ProductividadProductividad 0154 gmiddot L 0154 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Volver a utilizar el control en el pOVolver a utilizar el control en el pO22 y fijo la y fijo la
agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y agitacioacuten pues lo contrario da excesivas espumas y disminuir el volumendisminuir el volumen
No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso No se ha encontrado una explicacioacuten al descenso tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el tan elevado de etanol tras las 24 horas (baja el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el rendimiento del 44 al 29 final) ni que el consumo de glucosa no haya llegado al 50consumo de glucosa no haya llegado al 50
No obstante se ha multiplicado por 7 la No obstante se ha multiplicado por 7 la productividadproductividad
Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa Es necesario estudiar la viabilidad de la biomasa formadaformada
Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el Por cuestiones de tiempo cambiar ya el sustrato a el producto sacarificado de las mondas de patataproducto sacarificado de las mondas de patata
Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el Por cuestiones de exaacutemenes de alumnos llevar el seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida seguimiento de la reaccioacuten solo mediante la medida del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el del sustrato el producto de la fermentacioacuten y el consumo de base en el proceso que parece seguir consumo de base en el proceso que parece seguir una buena correlacioacuten con el avance de la mismauna buena correlacioacuten con el avance de la misma
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
BATCHBATCH 2 2
BATCHBATCH 3 3
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
BATCHBATCH P1 P1
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado sin sacarificado sin
suplementossuplementos
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
SUSTRATOSUSTRATO
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO Recepcioacuten de las mondasRecepcioacuten de las mondas Lavado aguaLavado agua Secado al aireSecado al aire Obtencioacuten de la pulpa Obtencioacuten de la pulpa
homogeneizador de vasohomogeneizador de vaso SacarificacioacutenSacarificacioacuten FiltradoFiltrado MedidaMedida
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
PRUEBAS DE PRUEBAS DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Para la eleccioacuten de las condiciones de Para la eleccioacuten de las condiciones de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de hidroacutelisis aacutecida del almidoacuten se partioacute de una disolucioacuten acuosa al 10 de una disolucioacuten acuosa al 10 de almidoacuten en las siguientes condicionesalmidoacuten en las siguientes condiciones SAC1 HCl 5 60 ordmC 18 hSAC1 HCl 5 60 ordmC 18 h SAC2 HCl 1M Reflujo 1 hSAC2 HCl 1M Reflujo 1 h SAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 hSAC3 HCl pH 1 60 ordmC 24 h
Se utilizoacute lugol como indicador del Se utilizoacute lugol como indicador del almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de almidoacuten y se midioacute la concentracioacuten de glucosa para el caacutelculo del rendimientoglucosa para el caacutelculo del rendimiento
Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2Se estimoacute como mejor el meacutetodo SAC2
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
MeacutetodoReaccioacuten al
lugolRendimiento
()
SAC1SAC1 -- 959959
SAC2SAC2 -- 991991
SAC3SAC3 ++ 740740
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
PRUEBA DE PRUEBA DE SACARIFICACIOacuteNSACARIFICACIOacuteN
Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de Se homogeneizoacute 1268 g de mondas de patatas limpias y secas en 200 mL de patatas limpias y secas en 200 mL de aguaagua
100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a 100 mL de la pulpa se llevaron con HCl a concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo concentracioacuten 1 M y se llevo a reflujo durante 1 horadurante 1 hora
Se filtro en calienteSe filtro en caliente Enfriado dio negativo el ensayo del lugolEnfriado dio negativo el ensayo del lugol Medida la concentracioacuten de glucosa Medida la concentracioacuten de glucosa
resulta de 58 resulta de 58 RendimientoRendimiento 99 99
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
PRUEBA DE PRUEBA DE FERMENTACIOacuteNFERMENTACIOacuteN
Al filtrado de la sacarificacioacuten se Al filtrado de la sacarificacioacuten se le ajustoacute el valor del pH a 45 con le ajustoacute el valor del pH a 45 con NaOH 1MNaOH 1M
Se ajustoacute el volumen a 135 mLSe ajustoacute el volumen a 135 mL Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten Se le antildeadioacute 15 mL de suspensioacuten
de de S cerevisiaeS cerevisiae Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm Se incuboacute a 35 ordmC y 250 rpm
durante 120 horasdurante 120 horas Se midioacute la concentracioacuten de Se midioacute la concentracioacuten de
glucosa y la cantidad de alcohol glucosa y la cantidad de alcohol
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
Ello dariacutea un rendimiento aproximado del Ello dariacutea un rendimiento aproximado del 638 638
Paraacutemetro
Concentracioacuten inicial (gL)
Concentracioacuten final
(gL)
Diferencia
GlucosaGlucosa 339339 3434 305305
EtanolEtanol 3232 142142 110110
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Se homogeneizan 1500 g de mondas Se homogeneizan 1500 g de mondas
de patatas en 2500 mL de HCl 1Mde patatas en 2500 mL de HCl 1M Se somete a reflujo en un reactor con Se somete a reflujo en un reactor con
agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de agitacioacuten vertical y calefaccioacuten de camisa durante 1 horacamisa durante 1 hora
Se filtra en un Filtro-PrensaSe filtra en un Filtro-Prensa Se ajusta el pH a 45 con NaOH 10 MSe ajusta el pH a 45 con NaOH 10 M Se lleva a un volumen de 3000 mLSe lleva a un volumen de 3000 mL
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
INOacuteCULOINOacuteCULO Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa Se ha utilizado como inoacuteculo la misma cepa
de de Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae panadera panadera obtenida a partir del cultivo puro de la obtenida a partir del cultivo puro de la misma aislada en PCAmisma aislada en PCA
Enriquecida en el medio de cultivo glucosado Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 10 similar al del 10 similar al Batch-3Batch-3 y un volumen de y un volumen de 150 mL (10 del volumen total a utilizar) 150 mL (10 del volumen total a utilizar) esteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmesteacuteril a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DOmedio estaacuten esteacuteriles con una DO600nm600nm de de 442 y estimada en una concentracioacuten de 442 y estimada en una concentracioacuten de 6610107 7 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 165 L165 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten ControladaControlada AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 60 60 pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
Valores Valores BatchBatch Patata-1 Patata-1
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M50M50 412412 00 114114
M51M51 036036 7272 441441
M52M52 008008 9494 246246
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
0
1
2
3
4
5
0 24 48 72 96
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
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0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Rendimiento de sacarificacioacuten = 83 Medida de la concentracioacuten final del Medida de la concentracioacuten final del
etanol por areometriacutea del destilado = etanol por areometriacutea del destilado = 66 gL66 gL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = Grado alcohoacutelico maacuteximo (72 horas) = 15 ordm (a 20 ordmC) 15 ordm (a 20 ordmC)
Concentracioacuten = 120 ordm = 120 gLConcentracioacuten = 120 ordm = 120 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (72 Rendimiento sobre el teoacuterico (72
horas) = 559 horas) = 559 Productividad (72 horas)Productividad (72 horas) = = 0163 gmiddot L 0163 gmiddot L--
11middot horamiddot hora-1-1
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
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0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
UTILIZACIOacuteN DEL UTILIZACIOacuteN DEL DECANTADO COMO DECANTADO COMO
INOacuteCULOINOacuteCULO Con el fin de minimizar el costo de Con el fin de minimizar el costo de
produccioacutenproduccioacuten Debido a la elevada concentracioacuten Debido a la elevada concentracioacuten
de levaduras en el decantadode levaduras en el decantado Se sembroacute en OGYE-CENAM y se Se sembroacute en OGYE-CENAM y se
incuboacute a 31 ordmC 72 horasincuboacute a 31 ordmC 72 horas Crecimiento de colonias positivoCrecimiento de colonias positivo Se sugiere la revivificacioacuten antes de Se sugiere la revivificacioacuten antes de
la inoculacioacuten a fin de minimizar la la inoculacioacuten a fin de minimizar la fase fase laglag
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
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0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONCLUSIONESCONCLUSIONES El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con El sistema inicialmente produjo un gran exceso de gas con
elevadas formacioacuten de espumas elevadas formacioacuten de espumas La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el La evacuacioacuten de las espumas con el exceso de gas en el
proceso puede ser responsable de la bajada de proceso puede ser responsable de la bajada de concentracioacuten de etanol entre las 72 h y el finalconcentracioacuten de etanol entre las 72 h y el final
A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido A partir de las 84 horas se disparoacute el consumo de aacutecido consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de consumiendo la reserva y llegando el pH a 640 sin de momento explicacioacuten algunamomento explicacioacuten alguna
A partir de las 34 horas el gasto de base se anulaA partir de las 34 horas el gasto de base se anula Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la Con el fin de aumentar tanto el rendimiento como la
productividad para el proacuteximo productividad para el proacuteximo batchbatch se propone se propone Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior Utilizar como inoacuteculo el decantado del anterior batchbatch
una vez activadouna vez activado Utilizar antiespumanteUtilizar antiespumante Minimizar la aireacioacutenMinimizar la aireacioacuten Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con Utilizar suplementos salinos y nitrogenados (con
extracto de levadura) por si se incrementa la extracto de levadura) por si se incrementa la productividadproductividad
Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 Utilizar como maacuteximo tiempo de fermentacioacuten 36-42 horashoras
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
BATCHBATCH P2 P2
Extracto de patata Extracto de patata sacarificado con sacarificado con
suplementossuplementos
EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
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EL MEDIO DE CULTIVOEL MEDIO DE CULTIVO Semejante al utilizado en Semejante al utilizado en BatchBatch P1 P1 1500 ml1500 ml Ajustado el pH a 45 Ajustado el pH a 45 Se le antildeade como suplementoSe le antildeade como suplemento
(NH(NH44))22SOSO44 20 gL20 gL KK22HPOHPO44middot 3 Hmiddot 3 H22OO 20 gL20 gL MgSOMgSO44middot 7 Hmiddot 7 H22OO 05 gL05 gL KClKCl 20 gL20 gL Extracto de levaduraExtracto de levadura 01 gL01 gL
INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
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INOacuteCULOINOacuteCULO
Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa Se ha utilizado como inoacuteculo la biomasa decantada del decantada del BatchBatch P1 P1
Enriquecida en el medio de cultivo Enriquecida en el medio de cultivo glucosado del 1 similar al glucosado del 1 similar al Batch-3Batch-3 y un y un volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y volumen de 100 mL a 35 ordmC48h y agitacioacuten a 250 rpmagitacioacuten a 250 rpm
La adicioacuten se realiza en condiciones La adicioacuten se realiza en condiciones aseacutepticas a traveacutes del septo cuando aseacutepticas a traveacutes del septo cuando reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una reactor y medio estaacuten esteacuteriles con una DODO600nm600nm de 285 y estimada en una de 285 y estimada en una concentracioacuten de 4concentracioacuten de 410108 8 UFCmLUFCmL
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
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0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
CONDICIONES DE CONDICIONES DE CULTIVOCULTIVO
VolumenVolumen 160 L160 L TemperaturaTemperatura 35 ordmC35 ordmC AgitacioacutenAgitacioacuten 250 rpm250 rpm AireacioacutenAireacioacuten 05 Lminuto05 Lminuto pOpO22 Controlado Controlado AntiespumanteAntiespumante PEG 1 mL PEG 1 mL
(1 )(1 ) pHpH Controlado a 45Controlado a 45
ConCon HH22S0S044 01 pp01 pp NaOHNaOH 1M1M
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
GRACIASGRACIAS
POR NO RONCARPOR NO RONCAR
SEGUIMIENTO DE SEGUIMIENTO DE REACCIOacuteNREACCIOacuteN
Muestreo cada 24 horasMuestreo cada 24 horas Volumen de muestra 10 mLVolumen de muestra 10 mL Medida de la concentracioacuten de Medida de la concentracioacuten de
glucosaglucosa Medida de la concentracioacuten de etanolMedida de la concentracioacuten de etanol Seguimiento de la medida de Seguimiento de la medida de
consumo de base para el consumo de base para el mantenimiento del pH constante en mantenimiento del pH constante en 4545
Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
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Valores Valores BatchBatch Patata-2 Patata-2
MUESTRAGLUCOSA10 (gL)
TIEMPO (h)ETANOL
middot 3 (vv)
M60M60 358358 0000 402402
M61M61 037037 210210 10771077
M62M62 028028 265265 822822
M63M63057057 400400 559559
0
5
10
0 6 12 18 24 30 36
GLUCOSA10 (gL) ETANOL 3(vv)
PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
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0 6 12 18 24 30 36
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PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
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PRODUCTIVIDADPRODUCTIVIDAD Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Rendimiento para la sacarificacioacuten = 75 Medida de la concentracioacuten final del etanol Medida de la concentracioacuten final del etanol
por areometriacutea del destilado = 16 por areometriacutea del destilado = 16 vvvv = 128 = 128 gLgL
Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm Grado alcohoacutelico maacuteximo (21 h) = 36 ordm vvvv Concentracioacuten Producida (21 h) = 180 gLConcentracioacuten Producida (21 h) = 180 gL Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Rendimiento sobre el teoacuterico (21 h) = 92 Productividad (21 horas)Productividad (21 horas) = = 086 gmiddot L 086 gmiddot L-1-1middot horamiddot hora-1-1
CONCLUSIONESCONCLUSIONES Seriacutea necesario optimizar las condiciones de Seriacutea necesario optimizar las condiciones de
fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
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La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
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fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten fermentacioacuten sobre todo la combinacioacuten tiempo y temperatura con el fin de tiempo y temperatura con el fin de disminuir costes tanto de produccioacuten como disminuir costes tanto de produccioacuten como medioambientalesmedioambientales
Seriacutea necesario repetir los procesos en las Seriacutea necesario repetir los procesos en las mismas condiciones para tratamiento mismas condiciones para tratamiento estadiacutesticoestadiacutestico
La utilizacioacuten de la biomasa del anterior La utilizacioacuten de la biomasa del anterior batchbatch como inoacuteculo de este ha acelerado el como inoacuteculo de este ha acelerado el proceso de produccioacuten (por su elevada proceso de produccioacuten (por su elevada concentracioacuten) concentracioacuten)
La productividad obtenida se acerca a la La productividad obtenida se acerca a la mitad de las publicadasmitad de las publicadas
CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
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CONCLUSIONES CONCLUSIONES FINALESFINALES
Seriacutea recomendable utilizar una Seriacutea recomendable utilizar una sacarificacioacuten microbioloacutegica y sacarificacioacuten microbioloacutegica y tendente a utilizar el mismo reactor tendente a utilizar el mismo reactor sin trasiego del sacarificadosin trasiego del sacarificado
Podemos afirmar que es posible Podemos afirmar que es posible repostar el depoacutesito de un repostar el depoacutesito de un automoacutevil con el bioetanol automoacutevil con el bioetanol procesado a partir de una tonelada procesado a partir de una tonelada de mondas de patatas material de mondas de patatas material actualmente tratado como RSUactualmente tratado como RSU
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