PRODUCCIÓN DE SANGRE ARTIFICIAL A PARTIR DE HEMERITRINA OBTENIDA

DEL GUSANO MARINO Sipunculus nudus

Resumen

El propósito de esta investigación fue encontrar otro medio para la producción de

sangre por medio de la proteína hemeritrina encontrada en la especie de gusanos

marinos Sipunculus nudus, este proyecto va desde la obtención de la proteína hasta la

producción de la sangre, debe recalcarse que esta mezcla es artificial y es universal.

1

Introducción.

Una de las necesidades en las que se enfrenta el sistema de salud a nivel mundial es la

demanda de las transfusiones de sangre que existe. Las transfusiones de sangre

permiten salvar vidas y mejorar la salud. Se puede decir, que nueve de cada diez

personas necesitarán una transfusión de sangre en algún momento de su vida; debido

a alguna cirugía o por motivo de algún accidente pero muchos de estos cuando

requieren de una transfusión no pueden acceder por las limitaciones que el sistema

presenta, esto debido a que no se cuenta con la cantidad suficiente o no se cuenta con

el tipo de sangre requerida.

Actualmente se cuenta con numerosas campañas de concientización y aun así las

tasas de donación son inferiores al uno por ciento de la población

Una transfusión de sangre es un procedimiento médico relativamente sencillo durante el

cual un paciente recibe sangre o algún componente de la sangre a través de una vía

intravenosa. Ésta puede utilizarse para reponer una pérdida de sangre o de una parte

de ésta.

Es raro el caso en donde se lleve a cabo una transfusión de sangre completa. En vez

de eso, se hacen transfusiones de los componentes de la sangre que se necesitan. Los

glóbulos rojos, la parte que se transfunde más a menudo, se utilizan para incrementar la

capacidad de la sangre de transportar oxígeno y para evitar el agotamiento y otras

complicaciones

Teniendo en cuenta que en el mundo millones de pacientes no tienen acceso a este

recurso cuando lo necesitan (generalmente cuando sufren enfermedades crónicas,

complicaciones en el parto, cirugías o accidentes de tránsito) diversos científicos han

dedicado años de trabajo al desarrollo de sangre artificial.

En la actualidad, la sangre artificial se trabaja mediante perfluorocarbonos (PFC), un

líquido claro e inerte de consistencia similar al aceite, o soluciones de hemoglobina, que

utilizan elementos vivos como placenta humana, sangre vacuna o bacterias. Entre los

avances más recientes, científicos del Centro Escocés de Medicina Regenerativa

2

obtuvieron a mediados de este año el permiso para desarrollar sangre a partir de

células madre adulta. Esto permitiría transportar de manera efectiva oxígeno y dióxido

de carbono por todo el cuerpo.

La manera alternativa en que se busca producir sangre por medio de gusanos marinos

(proteína), sal y agua; se conoce de un estudio que se llevado a cabo por el doctor

Silaghi-Dumitrescu, sus investigaciones están enfocadas a lograr un fluido estéril, que

no conlleve riesgos de infección durante la transfusión, ni requiera tanta refrigeración, a

fin de que pueda ser aplicada en humanos de manera instantánea, en situaciones de

emergencia.

La sangre se compone principalmente de un tipo de proteína que se encuentra en

gusanos marinos llamados Anélidos poliquetos (Polychaete annelid), llamada

hemeritrina. Se encontró que la proteína de los gusanos resiste más tipos de estrés que

la hemoglobina que es la proteína principal de la sangre humana.

Estas investigaciones tienen el fin de aportar alternativas seguras y que puedan

almacenarse de una forma eficiente y sin cuidados especiales para cualquier tipo de

emergencia.

Cabe señalar que la sangre artificial no es un sustituto de sangre, sino que es un medio

de protección que ayuda al organismo a regenerar su sangre en tan solo 24 horas sin la

necesidad de exponerse a riegos mortales.

Nuestra investigación está dirigida a sostener todas las cuestiones planteadas

anteriormente con el desarrollo teórico de proponer otra especie marina para la

ampliación de materia prima en la obtención de hemeritrina.

El Sipunculus nudus es también una especie marina, que porta la proteína estudiada

para la producción de sangre artificial, pretendemos que sea una opción para la

extensión de nuestro panorama en la búsqueda de otra especie que nos ayude en la

elaboración de esta nueva fuente de sangre.

3

Antecedentes.

Transfusiones de sangre.

El almacenamiento y transfusión de sangre estéril compatible o de componentes de la

sangre es un procedimiento de rutina que salva vidas. Su desarrollo tiene una larga

historia y ha dependido de los experimentos con animales realizados por varios

médicos y científicos. Actualmente se hacen alrededor de 88 millones de donaciones de

sangre cada año, suficientes para llenar 32 piscinas olímpicas, a pesar de que todavía

no son suficientes para cubrir la demanda. La investigación sigue encontrando formas

alternativas de abastecerse de sangre e incluso alternativas a la sangre. (George Crile,

2011)

Donación de sangre a nivel mundial.

El 65% de las donaciones de sangre se hacen en los países desarrollados, que solo

representan un 25% de la población mundial. Las tasas de donación siguen siendo

inferiores al 1% de la población (el mínimo necesario para atender las necesidades

básicas de un país) en 73 países, 71 de los cuales son países en desarrollo o en

transición. En 42 países los donantes voluntarios no remunerados, que son la fuente

más segura, aportaron menos del 25% de las donaciones. En 2007, 31 países seguían

obteniendo donaciones remuneradas, que totalizaron más de un millón de donaciones.

En 41 países no se realizaron en toda la sangre donada pruebas de detección de una o

más de las siguientes infecciones transmisibles por transfusión: VIH, hepatitis B y C, y

sífilis. (Bagozzi, 2009)

De los 85,4 millones de donaciones hechas en 2007, aproximadamente el 65%

correspondieron a los países desarrollados, que solo representan aproximadamente un

25% de la población representada. (Bagozzi, 2009)

Las donaciones por 1000 habitantes, que también reflejan la disponibilidad general de

sangre en un país, son muy variables, y la menor disponibilidad corresponde a los

países en transición y en desarrollo. La tasa media de donaciones fue de 38,1/1000

habitantes (entre 4,92 y 68,01) en los países desarrollados, de 7,5 (entre 1,07 y 35,18)

4

en los países en transición, y de 2,3 (entre 0,40 y 7,46) en los países en desarrollo. Se

registraron menos de 10 donaciones por 1000 habitantes en 73 países, 71 de los cuales

son países en desarrollo o en transición. (Jose, 1997)

Según las estadísticas, cada año en el todo el mundo se donan cerca de 80 millones de

litros de sangre, que es el equivalente a 40 piscinas olímpicas. Estos datos también nos

arrojan unas cifras en las que se indica que el 54% de los donantes de sangre son

hombres, correspondiendo el  46% a las mujeres. Si diferenciamos por edades, el  41%

de los donantes tienen entre 31 y 45 años, el 35% corresponde a los que abarcan la

franja de 18 a 30 años y 24% restante a los de 46 a 65 años. Una reciente encuesta

entre personas que habían donado sangre en alguna ocasión mostró que un 45,4% de

los preguntados dado sangre por solidaridad y altruismo y un 19,8% porque lo había

necesitado un familiar y/o conocido. (20 minutos, 2014)

Donación de sangre en México.

En México la recuperación de sangre es de menos del 65% del 100% necesario (en

Latinoamérica es de apenas 37%). Del total de la sangre donada, sólo el 2% es

voluntario. 90% de 6 mil 500 donadores (cifra anual de 2011) acude porque tiene a un

ser querido hospitalizado. De los 80 países del mundo con un bajo índice de

donaciones de sangre (menos de 10 donaciones por cada mil personas), 79 son

naciones en desarrollo (es el caso de México). (Mexicana, 2012)

Investigaciones y avance en las transfusiones sanguíneas.

Richard Lower fue el primero en realizar una transfusión sanguínea de animal a animal

y de animal a humano, ambos en 1665. La primera transfusión sanguínea

documentada, de humano a humano y con resultado exitoso no se produjo hasta 1830,

cuando James Blundell transfirió sangre de su asistente a una mujer que sufría

hemorragia posparto. (Dr. Decaro Jorge, 2010).En esos tiempos la transfusión

sanguínea era un procedimiento técnicamente difícil: los únicos aparatos disponibles

eran plumas de animales o tubos de plata, y no había forma de prevenir la formación de

coágulos de sangre. A pesar de esto, su práctica continuó como un procedimiento

5

extremo y pronto se usaron nuevas soluciones intravenosas como una solución salina,

leche y albúmina extraída de huevo. (Dimitrescu, 2013)

Los experimentos con animales, que se desarrollaron entre los años 1900 y 1916,

permitieron que las transfusiones se convirtieran gradualmente en el tratamiento

rutinario que conocemos en la actualidad. En 1907, George Crile perfeccionó la técnica

de la transfusión de arteria a vena, usando perros, tal como describió en su aplicación a

32 pacientes. El protagonista del siguiente mayor logro fue Adolph Hustin, quién en

1914 halló que añadir citrato de sodio a la sangre impedía que ésta se coagulara y

podía entonces transferirse a perros con seguridad. En 1915, Richard Lewinsohn

fomentó este descubrimiento al establecer la máxima cantidad de citrato que podría

transferirse a perros sin que provocara toxicidad. Esto reveló la concentración máxima

de citrato de sodio que podía añadirse a la sangre para conseguir un efecto

anticoagulante óptimo. (Crile, 2011)

El siguiente avance se produjo en 1915 cuando Richard Weil mostró que esta sangre a

la que se había añadido citrato, podía almacenarse durante dos días y mantener su

efectividad al ser transferida a cobayas y perros que habían perdido sangre. A estos

experimentos le siguieron el trabajo de Peyton Rous y Joseph Turner en conejos en

1916, que demostró que con determinados aditivos y el tratamiento adecuado, la

sangre podía almacenarse durante 14 días y posteriormente administrarse con éxito

mediante transfusión. (George Crile, 2011)

Sangre artificial.

En 2011, un sustitutivo de la sangre derivado del plasma de vaca se usó para salvar la

vida de una mujer a la que sólo le quedaba un litro de sangre en el cuerpo pero que su

religión impedía una transfusión sanguínea convencional. En este caso se usó un

transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (Hemopure) que no requiere la

compatibilidad de tipos sanguíneos y puede durar hasta tres años sin refrigeración.

(Jonathan, 2012)

6

Esta es una de las llamadas sangres artificiales, diseñadas para aumentar el transporte

de oxígeno en el cuerpo después de una fuerte pérdida de sangre. Sin embargo, éstas

han tenido una historia controvertida. (Jonathan, 2012)

Un metaanálisis de estudios sugirió que el uso de sangre artificial ha aumentado en un

30% el riesgo de muerte. La FDA atrajo las críticas de las fuerzas navales de los EEUU,

quién habían financiado la mayor parte de las investigaciones. Las críticas se

fundamentaban en que la FDA había interrumpido los ensayos clínicos, y el autor del

metaanálisis fue denunciado por una de las empresas que desarrolló el tratamiento.

(Saulo, 2012)

En la actualidad, la sangre artificial se trabaja mediante perfluorocarbonos (PFC), un

líquido claro e inerte de consistencia similar al aceite, o soluciones de hemoglobina, que

utilizan elementos vivos como placenta humana, sangre vacuna o bacterias.

(dimitrescu, 2014)

Cultivo de glóbulos rojos.

Los investigadores también han estado trabajando en la creación de una reserva

continua de glóbulos rojos provenientes de células madre embrionarias. Después de un

primer desarrollo de esta técnica en ratones, investigadores japoneses desarrollaron

una línea de células madre embrionarias humanas inmortalizadas que podían usarse

indefinidamente para producir glóbulos rojos. El trabajo en este campo se ha retrasado

indefinidamente debido a inquietudes éticas y problemas para obtener licencias para el

uso de células derivadas de embriones humanos. (Diego, 2014) A pesar de estas

precauciones se espera que los ensayos clínicos empiecen pronto.

En el año 2011 se cultivaron glóbulos rojos de células madre hematopoyéticas

extraídas de médula ósea. Estos cultivos produjeron 10 billones de células (el

equivalente a 2 mililitros de sangre) y, después de pruebas iniciales en ratones, estas

células se inyectaron de nuevo a la médula ósea del donante. Se observó que se

comportaban igual que glóbulos rojos normales, de modo que esta técnica parece

7

prometedora, a pesar de que el reto se mantiene en magnificar el proceso para obtener

grandes cantidades. (Emma, 2014)

Sangre artificial obtenida a través de la hemeritrina de gusanos marinos Anélidos

poliquetos.

Científicos de la Universidad Babeş-Bolyai, en Rumania, desarrollaron un compuesto

muy similar a la sangre. El doctor Radu Silaghi-Dumitrescu, líder de esta investigación,

menciona que está fabricado a partir de albúmina (principal proteína de la sangre, que

se sintetiza en el hígado), agua, sal y una proteína obtenida de gusanos marinos. Hasta

el momento, han sido muchos los intentos por crear sangre artificial; sin embargo, no se

había logrado que las sustancias obtenidas resistieran el estrés mecánico y químico. La

sangre está compuesta por hemoglobina, que se encarga de transportar oxígeno

obtenido de los órganos respiratorios a los tejidos, en este caso, el fluido artificial

creado por el equipo rumano, contiene hemeritrina, una proteína que ha mostrado ser

sumamente resistente a varios tipos de estrés. En su laboratorio, el doctor Silaghi-

Dumitrescu transfirió la sangre desarrollada a ratones sin que éstos presentaran alguna

enfermedad o efecto adverso; el siguiente paso es que dicho compuesto trabaje por

horas en el cuerpo de los roedores. El doctor Silaghi-Dumitrescu sigue trabajando para

lograr un fluido estéril, que no conlleve riesgos de infección durante la transfusión, ni

requiera tanta refrigeración, a fin de que pueda ser aplicada en humanos de manera

instantánea, en situaciones de emergencia. (Martínez, 2013)

Hemeritrina.

Es una proteína que se encuentra en los glóbulos sanguíneos de algunos anélidos y de

unos pocos braquiópodos. La proteína hemeritrina es responsable del enlace y

transporte de O2 en algunos invertebrados. A pesar de su nombre, no contienen grupos

hemos. (J.C., 2014)

El trabajo hecho por los investigadores rusos se hizo con anélidos poliquetos, los

poliquetos constituyen el grupo más numeroso de anélidos, estos son de vida marina,

habitando en las zonas litorales y neríticas, estos gusanos son difíciles de hallar y no en

toda región abundan, nosotros usaremos el gusano marino llamado Sipuncúlido nudus,

8

el cual contiene igual la proteína hemeritrina. (Dimitrescu, Ferric carboxymaltose

improves exercise capacity and quality of life in patients with pulmonary arterial

hypertension and iron deficiency: A pilot study., 2014)

Anélidos Poliquetos.

Son los gusanos anillados, pues su cuerpo está formado por una serie de anillos o metá

meros de anatomía muy  parecida. (Tirsoferrol)

Podemos definir a los anélidos como mazoos triblásticos con simetría bilateral, 

esquizocelomados y protóstomos.  

El mayor avance del filo esta representado por la metamería.La cavidad celómica alcan

za un alto grado de desarrollo. 

La región cefálica se especializa con órganos diferenciados, tales como tentáculos,

palpos y ojos rudimentarios de los poliquetos.

El sistema nervioso está formado por ganglios cerebroideos, dos cordones que no

recorren el cuerpo y ganglios con sus ramas laterales.

Las tres grandes clases del filo de los Anélidos son:

Clase Poliquetos (unas 5.300 especies), Son gusanos con cerdas, sobre todo

marinos y a menudo luminiscentes

Clase Oligoquetos (unas 3.100 especies), que son, sobre todo, terrestres o viven

en el suelo, como la lombriz de tierra;

Clase Hirudíneos (unas 300 especies), Son las sanguijuelas, en su mayoría, de

agua dulce pero también pueden ser marinas o terrestres. (Tirsoferrol)

9

Poliquetos.

El cuerpo es alargado y sección redondeada, con la boca en un extremo y el ano

en el otro, presenta simetría bilateral. Está compuesto por varias unidades

similares, o segmentos, separados externamente por surcos y en su interior por

tabiques.

Los segmentos suelen tener unos lóbulos (parápodos) con cerdas que

pertenecen al sistema de locomoción. (Garza, 2013)

El sistema digestivo está formado por un tubo recto y el sistema nervioso tiene

órganos sensoriales poco desarrollados.

Los  poliquetos  crecen  por adición de segmentos al  cuerpo en el extremo

posterior, algunos son depredadores activos. Tienen un modo de vida sedentario

y extraen partículas de agua o depósitos en el fondo.

Aparato circulatorio debido a que no hay continuidad entre las cavidades

celómicas el sistema no puede ser abierto, sino que ha de ser cerrado.

Está constituido por dos grandes vasos: ventral y dorsal. La hemolinfa circula de

la parte posterior hacia delante en el vaso dorsal, y al contrario en el vaso ventral

En la superficie de las branquias se realiza el intercambio de gases, ya que

estas están muy irrigadas. En ocasiones también se puede realizar a través del

cuerpo.

La fecundación es externa presenta una larva trocófora similar a la de los

moluscos

(Garza, 2013)

Sipuncúlidos

Los Sipunculus o sipuncúlido son un filo de animales protóstomos celomados, marinos

y con el cuerpo no segmentado. Se conocen entre 144 y 320 especies. Se les

denomina gusanos cacahuate.

Normalmente no sobrepasan los 10 cm de largo. Su característica más destacable es

su boca, rodeada por un anillo de tentáculos retráctiles. El tracto digestivo, en forma de

U helicoidal, pasa de la cavidad oral a la parte posterior del cuerpo para luego remontar

10

y acabar en un ano en el costado del animal; algunos grupos poseen una estructura

calcificada anal (y una porción calcificada posterior. (Adina, 2013)

Presentan celoma, pero no aparato circulatorio, aprovechan los fluidos intersticiales

para el transporte de oxígeno y nutrientes. El celoma está separado en dos porciones

por un saco de compensación; se distingue un celoma del introverto y otro del cuerpo.

El exterior del cuerpo está muy muscularizado y les permite encogerse hasta parecer

un cacahuate. (Dumitrescu, 2013)

11

Objetivos generales:

Purificación de la proteína hemeritrina a partir del gusano marino de la especie

Sipunculus nudus para su uso en la preparación de sangre artificial.

Objetivos particulares:

Búsqueda de secuencias homologas de la proteína hemeritrina.

Secuenciar la proteína.

Obtener la secuencia nucleotidica y el marco de lectura completo.

Expresión de la proteína con plásmidos de expresión

Producción de la proteína.

Preparación de la sangre artificial.

12

Metodología

Nos daremos a la tarea de buscar en bases de datos secuencias tanto del genoma

completo como del mRNA, esto nos ayudará a conocer la secuencia de nucleótidos del

cual está compuesta la proteína y poder obtener el marco de lectura completo.

Reiteramos la utilización de base de datos para encontrar el marco de lectura en la

secuencia de ADN, este nos da la traducción de la proteína correspondiente y a la vez

nos dará instrucciones para hacer una proteína completa.

(NCBI National Center for Biotechnology Information)

Ya teniendo la secuencia de nucleótidos ésta será insertada en un vector o vehículo de

clonación, el cual consiste en una molécula de ADN capaz de replicarse de forma

autónoma. Entre los vectores más utilizados se encuentran los plásmidos ya que estos

pueden replicarse independientemente del cromosoma principal. Los más comunes son

E.Colli y Saccharomyces Cerevisiae.

(LA GUÍA)

Queremos mencionar que para nuestro sistema se utilizará Saccharomyces Cerevisiae,

dado que es una levadura eucarionte y nuestra proteína proviene de un organismo

eucarionte.

Dependiendo de su origen, las levaduras son ricas en proteína y vitaminas (Martínez et

al., 2001), además poseen la propiedad de no ser tóxicas, presentan alta digestibilidad,

elevado contenido en proteínas, grasas, carbohidratos.

Las células de la levadura se multiplican rápidamente por gemación, una forma

asimétrica de reproducción asexual: a partir de una célula se origina una protuberancia

que va creciendo y acaba dando lugar a otra célula, más pequeña (al principio) que la

célula inicial y diferenciada genéticamente de la célula original. En condiciones óptimas,

este tipo de reproducción dura unas dos horas y permite la colonización total de los

13

mostos en cuestión de horas o días. El rápido crecimiento ha sido clave a la hora de

elegir esta levadura como herramienta para la investigación y las aplicaciones

biotecnológicas.

(Consejo Superior de Investigaciones Cientifícas (CSIC))

Una vez que obtengamos la secuencia nucleotídica de la hemeritrina, procederemos a

aislar el ARNm (ARN mensajero) el cual codifica a la proteína de interés, esto lo

haremos con el propósito de obtener una copia del ADN de la proteína mediante la

transcriptasa reversa, ésta copia llamada ADNc (ADN complementario), no presentará

intrones, lo cual permitirá que la proteína se exprese correctamente dentro de un

huésped que será nuestro vector de expresión el ADNc en la célula de levadura para su

replicación, éste huésped eucariótico no distinguirá entre el ADN extraño y el propio, y

la maquinaria celular continuará el programa genético de replicación, transcripción y

traducción de los genes que se han introducido.

(LA GUÍA)

(Manipulación de la expresión)

Separación o recuperación de las proteínas

El siguiente paso se llevara a cabo por medio de la purificación de las proteínas, el cual

depende de la localización de la Proteína, la cual también proporciona ciertas ventajas

según cada caso.

Si la proteína se acumula en el citoplasma, el primer paso es la ruptura celular, por

medios mecánicos o químicos.

La acumulación en el citoplasma lleva a la acumulación de cuerpos de inclusión, lo que

depende de factores como la secuencia de la proteína, la fuerza del promotor, la

temperatura, velocidad de crecimiento, etc. Los cuerpos de inclusión pueden tener

agregadas grandes cantidades de contaminantes como ADN, ARN y chaperonas, por

mencionar haciendo que la proporción de proteínas en el cuerpo de inclusión llegue a

14

ser baja .Si las proteínas son acumuladas en el espacio periplásmico, la aplicación de

un choque osmótico permite la extracción de la proteína a la vez que causa muy poco

daño a las células.

La recuperación de la proteína puede llevarse a cabo empleando filtros de diversos

tamaños y con superficie cargada. Los ácidos nucleicos pueden ser removidos

mediante extracciones o bien agregando agentes policatiónicos como la polietinilamina.

La proteína puede ser capturada o precipitada selectivamente empleando una variedad

de materiales que han sido desarrollados para este propósito, como algunas resinas de

interacción hidrofóbica (Kato y col, 2004).

(Lara, 2011)

Cuando ya se tenga la proteína purificada, se dispone a preparar la sangre artificial,

esta mezcla estará compuesta por agua, sales, la proteína hemeritrina y albúmina

como agente contra los factores de estrés. (Tu discovery)

15

Bibliografía

20 minutos. (17 de Enero de 2014). Recuperado el Abril de 2014, de 20 minutos: http://blogs.20minutos.es/yaestaellistoquetodolosabe/tag/donante-de-sangre/

Adina, M. (2013). Mitochondrial genome sequence and gene order of Sipunculus nudus give additional support for an inclusion of Sipuncula into Annelida. Organic Chemistry.

Bagozzi, D. (Noviembre de 2009). who int. Recuperado el Abril de 2014, de who int: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs279/es/

Consejo Superior de Investigaciones Cientifícas (CSIC). (s.f.). Recuperado el 03 de JUNIO de 2014, de Consejo Superior de Investigaciones Cientifícas (CSIC): http://seresmodelicos.csic.es/llevat.html

Crile, G. (2011). Animal Research. Recuperado el Abril de 2014, de Animal Research: http://www.animalresearch.info/es/avances-medicos/148/transfusi-n-de-sangre/

Diego, D. R. (2014). ocw. Recuperado el abril de 2014, de ocw: http://ocw.um.es/cc.-de-la-salud/metodos-alternativos-a-la-experimentacion-animal/ejercicios-proyectos-y-casos-1/tpd-s3.pdf

Dimitrescu. (2013). sangre artificial en Rumania. SCI-TECH, 35.

Dimitrescu. (2014). Ferric carboxymaltose improves exercise capacity and quality of life in patients with pulmonary arterial hypertension and iron deficiency: A pilot study. Nature.

dimitrescu. (enero de 2014). Noticias tu discovery. Recuperado el abril de 2014, de Notcias tu discovery: https://noticias.tudiscovery.com/gusanos-marinos-nuevos-donadores-de-sangre-para-el-hombre/

Dr. Decaro Jorge, D. F. (2010). clausen. Recuperado el abril de 2014, de clausen: http://www.clausen.com.uy/trabajos/HISTORIA%20DE%20LA%20MEDICINA.pdf

Dumitrescu. (2013). Proatherogenic adipocytokines levels in metabolic syndrome. Nature.

Emma, M. L. (2014). OCW. Recuperado el abril de 2014, de http://ocw.um.es/cc.-de-la-salud/metodos-alternativos-a-la-experimentacion-animal/ejercicios-proyectos-y-casos-1/tpd-s3.pdf

Garza, M. G. (2013). A new species of Amphictene (Annelida, Pectinariidae) from the Gulf of Mexico, with a redescription of Amphictene guatemalensis. Nature.

George Crile, A. H. (2011). Animal Research. Recuperado el Abril de 2014, de Animal Research: http://www.animalresearch.info/es/avances-medicos/148/transfusi-n-de-sangre/

J.C., R. (2014). F-box and leucine-rich repeat protein 5 (FBXL5): sensing intracellular iron and oxygen. Inorganic Biochem, 26.

16

Jonathan, B. L. (2012). Experience with the use of Hemopure in the care of a massively burned adult. Nature.

Jose, A. G. (1997). Tu y la química. México, DF: Pearson.

LA GUÍA. (s.f.). Recuperado el MAYO de 2014, de LA GUÍA: http://biologia.laguia2000.com/biotecnologia/clonacion-del-adn

Lara, Á. R. (agosto de 2011). Revista Mexicana de Ingenieria Quimica SCielo. Recuperado el junio de 2014, de Revista Mexicana de Ingenieria Quimica SCielo: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?pid=S1665-27382011000200006&script=sci_arttext

Manipulación de la expresión. (s.f.). Recuperado el mayo de 2014, de Manipulación de la expresión: http://www.ugr.es/~eianez/Biotecnologia/expresion.htm#_Toc30852825

Martínez, P. (Noviembre de 2013). cyd conacyt. Recuperado el Mayo de 2014, de cyd conacyt: http://www.cyd.conacyt.gob.mx/268/articulos/ciencia-en-el-mundo.html

Mexicana, C. R. (14 de Junio de 2012). Vida y estilo. Recuperado el Abril de 2014, de Vida y estilo: http://vidayestilo.terra.com.mx/mujer/dia-mundial-del-donante-de-sangre-datos-cifras-requisitos,00bd05bdf2be7310VgnVCM20000099cceb0aRCRD.html

NCBI National Center for Biotechnology Information. (s.f.). Recuperado el mayo de 2014, de NCBI National Centerfor Biotechnology Infoermation: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

Saulo, C. M. (febrero de 2012). slideshare. Recuperado el abril de 2014, de http://www.slideshare.net/dianaehv7/documente-sangre-artificial

Tirsoferrol. (s.f.). Recuperado el mayo de 2014, de Tirsoferrol: http://www.tirsoferrol.org/ciencias/x_anelidos.html

Tirsoferrol. (s.f.). Recuperado el 2014, de Tirsoferrol: http://www.tirsoferrol.org/ciencias/pdf/A103.pdf

Tu discovery. (s.f.). Recuperado el febrero de 2014, de Tu discovery.

17