Production et extraction de quelques principes actifs ... · UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département des Sciences Biologiques

UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Sciences Biologiques

Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de

MASTER ACADEMIQUE

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie

Filière : Biologie

Spécialité : Microbiologie appliquée

Présenté par : MELOUAH Ratiba Oum Hani

Thème

Soutenu publiquement

Le : 10/06/2015

Devant le jury :

UKM Ouargla Président M.C.B BOUAL Zakaria

UKM Ouargla Encadreur M.A. A BOUAZIZ Sabrina

UKM Ouargla Examinateur M.A. A BOUDERHAM Amel

Année universitaire : 2014/2015

Production et extraction de quelques

principes actifs isolés à partir des

actinomycètes

I

Avant tous je remercie ALLAH le tout puissant de m'avoir aidé à

surmonter toute les difficultés lors de mon études et ce ne sont pas

ces quelques mots qui exprime mes sentiments les plus sincères.

Je tiens en premier lieu à exprimer mes sincères remerciements à

mon encadreur Mme BOUAZIZ Sabrina maitre assistante à

l’Université Kasdi Merbah pour avoir dirigé ce travail, pour son

aide, ses précieux conseils, sa compréhension et son soutien moral

lors de la rédaction de ce manuscrit; et mon examinateur Melle

BOUDERHAM Amel maitre assistante à l’Université Kasdi

Merbah pour son aide, ses orientations et ses corrections sérieuses

pour ce travail.

J’exprime à monsieur le Docteur BOUAL Zakaria, maitre de

conférence Les toutes mes reconnaissances, d’avoir accepté

précédé ce jury. Je le remercie infiniment et sincèrement.

Ainsi j'adresse mes sincères remerciements aux touts les

enseignants du département des Sciences Biologique; les chefs et

les techniciennes de laboratoire Microbiologique de l'Université

Kasdi Merbah.

Enfin je remercie ma famille : mes parents pour leurs soutiens

sans faille, parfois inquiets mais toujours compréhensifs, tout au

long de ces années, ainsi que mes frères, sœurs, oncles, et tantes

pour leurs soutien affectif et moral.

Pour tous ceux qui ont contribué à la réalisation de ce mémoire,

d’une manière directe ou indirecte.

Ratiba Oum Hani

II

Je dédie ce modeste travail à:

Les deux personnes, les plus chers au monde que

je ne remercierais jamais assez : leur aides, l'encouragement,

Soutiens, sacrifices et leur patience pendant toute ma vie:

mes chères parents : Lakhdar et Latifa

A mon grande père : Mohammed Lakhdar

A mes grandes mères : Djemaa et Mamazerga

Mes chères sœurs : Aldjia, Ftima zohra

Mes chères frères : Abbas, Hamza, Abou Elkacem,

Abd Elheï, Abd Eddaïm et Tarek

Mes tantes : Aicha, Salima, Ghania, Mouna, Hadjira, Hanina

Khadjija, et OumElkhir

Mes oncles : Abd Elkarim, Belkhir, Ibrahim, M.Taher, Fouzi, Fadel,

Touhami, Youcef

Tous mes chères amis :

Aicha, Mebaraka, Manel, Amina, Naima, Dalal, Maimouna, Ouafa,

Maria, Khaouther, Houda, Asma, Zaineb, Haciba, et Hala, A

Touts les étudiants, enseignants et personnels du

département des Sciences Biologique.

Ratiba Oum Hani

III

Ae : extrait de l'acétate d'éthyle

B.subtilis : Bacillus subtilis

But : extrait de n-butanol

CCM : chromatographique sur couche mince

D.O : Densité optique

Di : extrait de dichlorométhane

h : heurs

Hex : extrait de n-hexane

j : jour

P.S : pois sec

Sys.E : système d'éluant

trs/min : Tours/min

Z.D.I : zone d'inhibition

Liste des abréviations

IV

Figure

Titre Page

01 Cycle de développement des actinomycètes (Streptomyces spp.) (ZOUAGHI,

2007).

11

02 Mode d’action des antibiotiques (TORTORA, 2012). 18

03 Protocole d’extraction des antibiotiques à partir de mycélium et de filtrat de

culture. 25

04 Mise en évidence de l’activité antibiotique des extraits des isolat

d’actinomycète sur milieu Muller-Hinton par la méthode des puits.

26

05 Cinétiques de croissance de la souche ITA1X dans le milieu Bennett. 29

06 Cinétiques de pH de la souche ITA1X dans le milieu Bennett. 30

07 Cinétiques de production d’antibiotique de la souche ITA1X vis-à-vis

Bacillus subtilis.

30

08 Diamètres des zones d'inhibition des extraits organiques et de mycélium de

la souche ITA1X vis-à-vis Bacillus subtilis.

31

09 Chromatographie des extraits organiques sur couche mince et révélation

chimiques avec cinqs systèmes de solvants.

32

10 Chromatographie sur couche mince de l'extrait hexanoique et révélation

chimique par la ninydrine.

33

11 Activité antibactérienne des extraits organiques vis-à-vis Bacillus subtilis par

la méthode des puits.

41

12 Activité antibactérienne de l'extrait de mycélium vis-à-vis Bacillus subtilis

par la méthode des puits.

41

13 Extraction des antibiotiques par des solvants organiques (utilisation

d’ampoule à Décanter).

41

Liste des figures

V

Tableau

Titre Page

I La classification hiérarchique de la classe Actinobacteria basée

sur l'analyse phylogénétique de l'ADNr / ARNr 16S

(GARRITY et al., 2004).

06

II Répartition de quelques genres d’actinomycètes par type

d’habitat (GOODFOLLOW et WILLIAMS, 1983)

10

III Cinétiques de pH de la souche ITA1X dans le milieu Bennett 42

IV Cinétiques de croissance de la souche ITA1X dans le milieu

Bennett. 42

V Cinétiques de production d’antibiotique de la souche ITA1X vis-

à-vis Bacillus subtilis.

42

VI Rf de chromatographe de l'extrait organique de hexane. 42

VII Diamètres des zones d'inhibition des extraits organiques et de

mycélium de la souche ITA1X vis-à-vis Bacillus subtilis. 33

Liste des tableaux

Table de matière

Remerciements I

Dédicace II

Liste des abréviations III

Liste des figures IV

Liste des tableaux V

Introduction …………………………………………………………………………………01

Chapitre I.- Actinomycètes

I.1.- Historique……………………………………………………………………………….03

I.2.- Définition des actinomycètes…………………………………………………………...03

I.3.- Caractères généraux…………………………………………………………………….04

I.4.- Classification des actinomycètes……………………………………………………….04

I.4.1.- Genres et espèces de l’ordre Actinomycetales……………………………………….07

I.4.1.1.- Caractères morphologiques………………………………………………………...07

I.4.1.2.- Caractères chimiotaxonomiques……………………………………………………07

I.4.1.2.1.- Acides aminés de la paroi…………………………………………………...........07

I.4.1.2.2.- Glucides……………………………………………………………......................07

I.4.1.2.3.- Acides gras……………………………………………………………………….07

I.4.1.2.4.- Acides nucléiques…………………………………………………………...........08

I.5.- Ecologie et distribution dans la nature…………………………………………………08

I.6.- Importance des actinomycètes…………………………………………………………09

I.7.- Cycle de développement des actinomycètes (exemple type : Streptomyces spp)……...10

Partie I.- Bibliographie

Chapitre II.- Principaux actifs des actinomycètes et méthode d'extraction

II.11.- Substances bioactives produites par les actinomycètes…………………………....12

II.1.1.- Antibiotiques…………………………………………………………………….12

II.1.1.1.- Historique………………………………………………………………………12

II.1.1.2.- Définition des antibiotiques…………………………………………………...12

II.1.1.3.- Classification des antibiotiques……………………………………………….13

II.1.1.3.1.- Familles des β-lactamines…………………………………………………...13

II.1.1.3.2- Les pénicillines………………………………………………………………..13

II.1.1.3.3.- Les céphalosporines………………………………………………………….14

II.1.1.3.4.- Les aminosides………………………………………………………………14

II.1.1.3.5.- Les phénicols………………………………………………………………..14

II.1.1.3.6.- Les tétracyclines……………………………………………………………..15

II.1.1.3.7.- Les macrolides………………………………………………………………..15

II.1.1.3.8.- Les quinolones…………………………………………………………………15

II. 1.1.3.9.- Les polypeptides…………………………………………………….................15

II.1.1.4.- Mode d’action des antibiotiques………………………………………………16

II.1.1.4.1.- Action sur la paroi bactérienne……………………………………………...16

II.1.1.4.2.- Action sur la membrane cellulaire…..……………………………………….16

II.1.1.4.3.- Action sur des ribosomes………………………………………………….......17

II.1.1.4.4.- Action sur la biosynthèse des acides nucléiques…..………………………...17

II.1.1.5.- Production des antibiotiques…………………………..……………………….18

II.1.1.5.-Extraction des antibiotiques……………………………………………………19

II.1.1.6.- Extraction aux solvants organiques…………………………………………...19

II .1.1.7.- Résistance aux antibiotiques………………………………………………….19

II.1.2.- Enzymes……………………………………………………………………………20

Chapitre III.- Matériels et méthodes

III.1.- Objectif de travail…………..………………………………………………….......21

III.2.-Matériels biologiques………………………………………………………………..21

III.3.- Cinétique de croissance et de production des antibiotiques……………………..21

III.3.1.- Pré-culture et culture …………………………………………………………….21

III.3.2.- Cinétique de croissance…………………………………………………………21

III.3.3.- Estimation de variation de pH …………………………………………………22

III.3.4.- Cinétique de production des antibiotiques…………………………………….22

III.4.- Extraction et purification des antibiotiques……………………………………...22

III.4.1.- Extraction par des solvants……………………………………………………..23

III.4.1.1.- Extraction à partir du mycélium……………………………………………..23

III.4.1.2.- Extraction à partir du filtrat de culture……………………………………...23

III.4.2.- Antibiographie et choix de solvant d’extraction………………………………23

III.4.2.1.- Méthode des puits…………………………………………………………….23

III.4.3.- Séparation et semi-purification des principaux actifs…………………………25

III.4.3.1.- Séparation par chromatographies analytiques sur couches minces…………25

III.4.3.1.1.- Préparation des plaques de gel de silice……………………………………25

III.4.3.1.2.- Développement des plaques et sélection du système d’élution…………..25

Partie II.- Etude expérimentale

III.4.3.1.3.- Révélation chimique des plaques…………………………………………...26

III.4.3.1.3.- Révélation microbiologique des chromatogrammes (bioautographie)……….26

Chapitre IV.- Résultats et discussions

IV.1.- Résultats…………………………………………………………………………..28

IV.1.1.- Cinétique de croissance et de production des antibiotiques……………………28

IV.1.1.1.- Cinétique de croissance……………………………………………………….28

IV.1.1.2.- Estimation de variation de pH …… …………………………………………28

IV.1.1.3.- Cinétique de production des antibiotiques…………………………………...29

IV.1.2.- Extraction des antibiotiques……………………………………………………29

IV.1.2.1.- Extraction à partir du mycélium……………………………………………..30

IV.1.2.2.- Extraction à partir des filtrats de culture…………………………………….30

IV.1.3.- Séparation et semi-purification des principaux actifs………………………...30

IV.1.3.1.- Chromatographie analytique sur couche mince……………………………..30

IV.1.3.2.- Révélations chimiques des plaques………………………………………….32

IV.1.3.3.- Bioautographie ………………………………………………………………32

IV.2.- Discussions……………………………………………………………………….33

IV.2.1.- Cinétiques de croissance et de production des antibiotiques…………………33

IV.2.1.1.- Cinétiques de croissance et de variation du pH des antibiotiques………….33

IV.2.1.2.- Cinétiques de production des antibiotiques…………………………………34

IV.2.2.- Extraction des antibiotiques……………………………………………………34

IV.2.2.1.- Extraction à partir du mycélium……………………………………………..34

IV.2.2.2.- Extraction à partir des filtrats de culture…………………………………….34

IV.2.3.- Séparation et semi-purification des principaux actifs…………………………34

IV.2.3.1.- Chromatographie analytique sur couche mince……………………………..34

IV.2.3.2.- Révélations chimiques ………………………………………………………34

IV.2.3.3.- Bioautographie ……………………………………………………………….34

Conclusion………………………………………………………………………………..35

Références bibliographique……………………………………………………………...36

Annexes…………………………………………………………………………………..41

Introduction

Introduction

1

La découverte de la pénicilline stimula la recherche d'autres antibiotiques.

Selman Waksman, travaillant à l'époque à la Rutgers university annonça en 1944

qu'avec ses associés il avait trouvé un nouvel antibiotique, la streptomycine, produit

par l'actinomycète Streptomyces griseus. On ne peut pas minimiser l'importance de la

streptomycine, car c'était le premier antibiotique capable de traiter la tuberculose avec

succés (PRESCOTT et al., 2013).

Aujourd'hui on recherche de nouveaux composés antimicrobiens d'origine

biologique à partir d'une grande variété d'organismes et de nombreux habitats naturels

(VALAN et al., 2008).

Les actinomycètes c'est un groupe de bactéries filamenteuses, septées et

ramifiées en mycélium de structure analogue à celle des champignons auxquels elles

étaient autre fois assimilées. Mais malgré leur aspect morphologique de type

fongique, leur physiologie et leur organisation cellulaire sont de type procaryote et

confirment leur classification parmi les bactéries (BOUSSEBOUATT., 2002). Les

actinomycètes ont une distribution très large dans la nature : air, aliment, sol. Ils

jouent un rôle important dans les cycles biologiques et ont la particularité, pour un

grand nombre d'entre eux, de produire des antibiotiques et des enzymes protéolytiques

utiles de nombreux domaines (LECTERCH et al., 1983).

Les métabolites secondaires microbiens représentent une source importante

de composés dotés d'ingénieuses structures et d'activités biologiques puissantes. Les

bactéries du sol et les champignons ont joué un rôle significatif dans la découverte

d'antibiotiques. Les chiffres et les espèces de microbes dans le sol varient directement

avec les conditions environnementales comme la disponibilité des nutriments, la

texture du sol, et le type de couverture végétale (ATLAS et al., 1998 cité par VALAN

et al., 2008). La capacité de produire un grand nombre de métabolites secondaires

chimiquement différents est associée surtout avec les actinomycètes. Ils acquièrent

une importance particulière, car ils sont la source la plus puissante pour la production

d'antibiotiques et d'autres métabolites secondaires bioactifs (VALAN et al., 2008). Ils

sont surtout réputés pour la production d’antibiotiques antibactériens et

antifongiques avec près de 70 % des molécules actives commercialisées à leur

Introduction

2

actif (SOLANKI et KAHANNA., 2008). Le genre Streptomyces est connu comme

étant le producteur du plus grand nombre d’antibiotiques, soit 80 % des

antibiotiques sécrétés par les actinomycètes (DEMAIN , 2006 cité par AOUICHE.,

2011).

En Algérie, les sols de palmeraies, qui constituent un écosystème particulier,

renferment un potentiel assez riche en actinomycètes particulièrement les

actinomycètes rarement isolés de part le monde tels que les genres Planomonospora,

Planobispora, Nocardiopsis, Actinomadura, Saccharothrix….etc, (SABAOU et al.,

1998) qui se sont révélés être de grands producteurs de nouvelles molécules

antimicrobiennes (ZITOUNI et al., 2005 et BOUDJELLA et al., 2006).

Dans le présent travail, nous nous sommes fixés comme objectifs essentiels :

l’étude cinétique de la croissance et de la production d’antibactériens, l’extraction des

molécules bioactives, la séparation et la classification, par la technique

chromatographique de Betina, des molécules antibactériennes produites.

La première partie de ce manuscrit est consacrée à une synthèse

bibliographique détaillée sur les actinomycètes en général ainsi que sur leurs

principaux actifs et méthode d'extraction.

La seconde partie du document traite les principes généraux des matériels et

méthodes utilisés à savoir :

Production des antibiotiques en milieu liquide;

Extraction et purification des antibiotiques;

Antibiographie et choix de solvant d’extraction.

Enfin la troisième partie présente les résultats obtenus ainsi que leurs

discussions.

Partie I.-

Bibliographie

Chapitre I.-

Actinomycètes


3

I.1.- Historique

D’après Waksman (1961), Ferdinand Cohn fut le premier à décrire unactinomycète en 1875 et en 1878, Harz, nomma Actinomyces bovis, un organismeparasite rencontré dans une infection de la mâchoire d’un bovin. Depuis, lesactinomycètes ont été isolés des sols, des matières organiques en décomposition, deseaux, de presque tous les habitats où la vie est possible (THEILLEUX, 1993 etbergey’s maniual, 2007 cité par DJINNI, 2009).

Waksman divise en quatre grandes catégories l’histoire des actinomycètes.La première, est celle de la découverte de leur rôle dans la pathologie et va de 1874aux années 1990. La seconde période (1900-1919) se rapporte à la mise enévidence et à l’étude des actinomycètes du sol, avec les travaux de Kraisky, deCohn, de Waksman et de Curtis. C’est ensuite la période (1919-1940) au coursde laquelle une meilleure connaissance des germes a été acquise grâce auxrecherches de Waksman, de Lieske, de Krassilnikov entre autre. La dernière époquehistorique, enfin, est celle des antibiotiques produits par les Actinomycètes. Ellecommence en 1940 et le nom de Selman Waksman lui est indissolublement lié(LE MINOR, 1989).

Les actinomycètes ont été isolés pour la première fois par Cohn en 1875 àpartir de sources humaines (WILLIAMS et al., 1984). Et c’est en 1943 que S.Waksman a pu isoler un genre Actinomycète à partir du sol.

I.2.- Définition des actinomycètes

Etymologiquement, le mot actinomycète a été dérivé des mots grecs « Aktis »qui veut dire rayon et « mykes » qui veut dire champignon. Les Actinomycètes ontété considérés comme un groupe intermédiaire entre bactérie et champignons.Maintenant, ils sont reconnus comme des organismes procaryotes(ANDRIAMBOLOLONA, 2010).

Les actinomycètes constituent l’ordre des Actinomycétales (MARIAT etSEBALD, 1990) regroupe les genres Streptomyces, Frankia, Actinomyces et Nocardiaqui comprennent des bactéries filamenteuses dont la morphologie ressemble àpremière vue à celle des mycètes filamenteux: c'est pourquoi on les appelle demanière informelle actinomycètes. Cependant les filament des actinomycète sont enréalité constitués de cellules procaryotes dont le diamètre est beaucoup plus petit quecelui des cellules eucaryotes des moisissures (TORTORA et al., 2012).

Les véritables Actinobacteria, également connus sous le nom d'actinomycètes,sont des microorganismes à coloration de Gram positive. Ils ont un type de croissance


4

mycélien (les cellules produisent des filaments et des ramifications) rappelant celuides champignons filamenteux. Un des premiers organismes étudiés dans ce groupe estle genre Actinomyces qui a donné son nom au groupe (PERRY et al., 2004).

I.3.- Caractères généraux

Les actinomycètes constituent un groupe tout à fait unique demicroorganismes procaryotes (ANDRIAMBOLOLONA, 2010). Ce sont des bactériesfilamenteuses, septées, ramifiées, prenant généralement le Gram positive ; possédantun coefficient de chargaff (GC%) compris entre 60-70% (LARPENT, 1989)

La majorité des actinomycètes cultivés sur milieu solide forment unmycélium de substrat et un mycélium aérien. Néanmoins, il existe desgroupes qui ne forment qu’un mycélium de substrat poussant à la surface etdans le milieu de culture ou un mycélium aérien dont les hyphes sont attachésau milieu par des crampons (AOUAR, 2006).

Leurs propriétés chimiques, physiologiques, et immunologiques les rangentparmi les procaryotes. Leur paroi cellulaire ne renferme ni chitine ni cellulose maisune glycoprotéine contenant de la lysine (formes fermentatives) ou de l’acidediaminopimélique (formes oxydatives), et leur cytologie est celle des bactéries(MARIAT et SEBALD, 1990).

La plupart des actinomycètes sont immobiles. Toutefois certains typesproduisent des spores flagellées permettant leur dispersion dans les habitatsaquatiques (DJABALLAH, 2010).

Ils sont hétérotrophes, leur croissance est plus lente (7 à 28 jours) que celle desautres bactéries (24 heures) (ANDRIAMBOLOLONA, 2010), saprophytes, largementdistribuées dans le sol, l'eau et les plantes montrant une diversité chimique etmorphologique marquée, mais forment une ligne distincte de l'évolution desorganismes (GOODFELLOW et O'DONNELL, 1989)

Les actinomycètes sont répandus dans l'environnement et la plupart desespèces sont chimio-organotrophes, aérobies, mésophiles et croissent de façonoptimale dans la gamme de pH 5,0 à 9,0 avec une proximité optimale à la neutralité(WILLIAMS et WELLINGTON, 198 ; GOODFELLOW et WILLIAMS, 1983).

I.4.- Classification des actinomycètes

Les actinomycètes appartiennent au règne des Procaryotes, à la divisiondes Firmicutes et à la classe des Thalobacteria, contenant l’ordre des Actinomycetales(LARPENT, 2000). La classe des Actinobacteria se présente comme suit :


5

Classe Actinobacteria

Sous-classe Ordre Famille

Acidimicrobidae Acidimicrobiales Acidimicrobiaceae

Rubrobacteridae Rubrobactérales Rubrobacteraceae

Coriobacteridae Coriobactérales Coriobacteriaceae

Sphaerobacteridae Sphaerobactérales Sphaerobacteraceae

Actinobacteridae Actinomycétales

La classe des Actinobacteria est divisée en cinq sous-classes (TableauI) : Acidimicrobidae, Rubrobacteridae, Coriobacteridae, Sphaerobacteridae etActinobacteridae. Chacune de ces sous classes est constituée d'un ou de plusieursordres eux-mêmes constitués d'une ou de plusieurs familles. Dans la sous-classedes Actinobacteridae, l'ordre des Actinomycetales est subdivisé en 10 sous-ordres : Actinomycineae, Micrococcineae, Corynebacterineae,Micromonosporineae, Propionibacterineae, Psuedonocardineae, Streptomycineae,Streptosporangineae, Frankinea et Glycomycineae (STACKEBRANDT et al.,1997; LABEDA et KROPPENSTEDT, 2000 ; STACKEBRANDT et SCHUMANN,2000).


6

Tableau I.- La classification hiérarchique de la classe Actinobacteria basée surl'analyse phylogénétique de l'ADNr / ARNr 16S (GARRITY et al., 2004 cité parAOUAR, 2006).

Classe Actinobacteria

S/Cl Acidimicrobidae Rubrobacteridae Coriobacteridae Sphaerobacteridae Actinobacteridae

S/Cl Actinobacteridae

Ordres Bifidobacteriales Actinomycetales

Ordre Actinomycetales

S/O

Actinomycineae

S/O

Micrococcineae

S/O

Corynebacterineae

S/O

Micromonosporineae

S/O

Propionibacterineae

Famille

Actinomycetaceae

Familles

Micrococcaceae

Bogoriellaceae

Rarobacteraceae

Sanguibacteraceae

Brevibacteriaceae

Cellulomonadaceae

Dermabacteraceae

Dermatophilaceae

Dermacoccaceae

Intrasporangiaceae

Jonesiaceae

Microbacteriaceae

Beutenbergiaceae

Promicromonosporceae

Familles

Corynebacteriaceae

Dietziaceae

Gordoniaceae

Mycobacteriaceae

Nocardiaceae

Tsukamurellaceae

Williamsiaceae

Famille

Micromonosporiaceae

Familles

Propionibacteriaceae

Nocardioidaceae

S/O

Psuedonocardineae

S/O

Streptomycineae

S/O

Streptosporangineae

S/O

Frankinea

S/O

Glycomycineae

Familles

Pseudonocardiaceae

Actinozynnemataceae

Famille

Streptomycetaceae

Familles

Streptosporangiaceae

Nocardiopsaceae

Thermomonosporaceae

Familles

Frankiaceae

Geodermatophilaceae

Microsphaeraceae

Sporichthyaceae

Acidothermaceae

Kineosporiaceae

Familles

Glycomycetaceae

S/Cl: sous classe, S/O: sous ordre


7

I.4.1.- Genres et espèces de l’ordre Actinomycetales

La définition des genres et des espèces se fonde sur un ensemble decaractères morphologiques et chimio-taxonomiques.

I.4.1.1.- Caractères morphologiques

Les principaux critères morphologiques correspondent à la présence,l'abondance et la disposition des hyphes du mycélium du substrat ou du mycéliumaérien. Ainsi que la présence des spores, leur nombre, leur mobilité, leur forme, leurposition sur les hyphes, la présence de sclérotes, de sporanges ou de synnémata(AOUAR, 2006).

I.4.1.2.- Caractères chimiotaxonomiques

La composition de la paroi cellulaire en acides aminés, glucides et lipidesconstituent le principal caractère utilisé en chimiotaxonomie (AOUAR, 2006).

I.4.1.2.1.- Acides aminés de la paroi

Les Streptomyces et genre apparentés contiennent la forme LL-DAP(acide 2,6-diaminopimélique) contrairement à l'ensemble des autres Actinomycétales(AOUAR, 2006).

I.4.1.2.2.- Glucides

Les glucides de la paroi cellulaire permettent une séparation en quatregroupes majeurs. Le spectre de sucres A (arabinose + galactose) estcaractéristique des genres Nocardia et Saccharopolyspora. Le spectre glucidiqueB (madurose) est présent chez les genres Actinomadura et Streptosporangium.Les Streptomyces et genres apparentés ne synthétisent aucun glucide en quantitécaractéristique (spectre C). Il en est de même pour les genres Thermomonospora etles Thermoactinomyces. La présence de xylose et d'arabinose (spectre D) estcaractéristique des Actinoplanes et du genre Micromonospora (AOUAR, 2006).

I.4.1.2.3.- Acides gras

Ce sont des chaînes qui peuvent être droites ou ramifiées, saturées ouinsaturées. Le nombre d’atomes de carbone est caractéristique du genre. Les acidesgras rencontrés chez les actinomycètes sont, soit des molécules de 12 à 20 atomes decarbone, soit un groupe d’acides mycoliques de 20 à 90 atomes de carbone,caractéristique des genres tels que Mycobacterium, Nocardia et Rhodococcus(COLLIN et al., 1977 cité par KITOUNI, 2007).


8

I.4.1.2.4.- Acides nucléiques

Les déterminations portent sur le pourcentage de guanine et cytosine, surle spectre obtenu par électrophorèse des fragments de l'ADN (obtenus par ladigestion par les enzymes de restriction), sur le taux d'hybridation ADN - ADN ouADN - ARN et sur la séquence de l'ARNr 16S. Une différence de plus de 10 %indique que deux souches sont sans relation. Au-delà de 70 % de similitude(l'hybridation ADN-ADN), deux souches sont considérées comme appartenant àla même espèce. Le séquençage de l’ARNr 16S, constitue un outil précieux pourdéterminer le degré de relation entre souches, espèces et genres (LARPENT etLARPENT et GOURGAUD, 1985).

I.5.- Ecologie et distribution dans la nature

Les actinomycètes sont très largement distribués dans la nature etprincipalement dans les sols de différentes natures (Tableau II). Il ont été trouvésdans les eaux douces ou salées, dans les compostes, dans l’atmosphère et dans lessubstrats les plus divers. Dans le sol, ils sont présents depuis la surface jusqu’àplus de 2 mètres de profondeur. Le nombre de ces microorganismes atteintd’après (GOODFELLOW et WILLIAMS, 1983) généralement les 106 germespar gramme de sol séché. D’après (WAKSMAN, 1967), le rapportMicroorganisme totaux / Actinomycètes, diminue au fur et à mesure que laprofondeur augmente. Selon ce même auteur, alors que la couche superficiellecontient au moins 80 % de bactéries actinomycétales, par rapport au nombretotal de microorganismes, la couche située à une profondeur de 80 centimètre necontient que (40%) ou beaucoup moins jusqu’à seulement 16 %.

Les actinomycètes sont généralement plus nombreux que les champignons,mais moins abondants que les autres bactéries. Les actinomycètes préfèrent un pHneutre ou peu alcalin, ils sont généralement mésophiles, d'autres sontthermophiles tolérants des températures avoisinant 50°C et peuvent aller jusqu’à60°C (GOODFELLOW et WILLIAMS., 1983). La majorité des actinomycètescroient dans des conditions humides mais aérobies et peuvent se développer dans desendroits où l’activité de l’eau (aw) est très basse (DAVIES et WILLIAMS, 1970 ;GOODFELLO et WILLIAMS, 1983).

Les sols sahariens sont caractérisés par une teneur minime en eau avecun degré de pluviométrie souvent inférieur à 100 mm par an, des températuresextrêmement élevées et de faibles quantités d’humus. Des travaux anciens ontprouvé définitivement que les sols désertiques ne sont pas stériles, ils sont peuplésd’une flore microbienne très variée (KILLIAN et FEHER, 1939). Parmi les bactéries


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isolées, les actinomycètes font partie essentielle de cette microflore, leurs présence estconsidérable dans ce type d’écosystème extrême (KILLIAN et FEHER, 1939).

Leur rôle dans le sol est important en raison de leur aptitude à dégrader lessubstances organiques non biodégradables par les champignons et les bactéries(CRAWFORD., 1993), et à produire des substances probiotiques et antibiotiques(KIESER et al., 2000). Les premiers stades de la dégradation de la matière organiquesont le fait de bactéries et de champignons. Les actinomycètes ne se développent pasdurant ces premiers stades en raison de leur inaptitude à la compétition, par contre, ilsse développent relativement bien sur une matière organique partiellement dégradée etinapte à porter une microflore fongique et bactérienne (CRAWFORD, 1993). Lesactinomycètes sont fréquemment bactériolytiques grâce à des enzymeshydrolytiques capables de fragmenter les peptides de la paroi, leurs propriétésanti microbienne sont aussi bien connues et un bon nombre d’antibiotique sontproduits lors de leur croissance. L’équipement enzymatique des actinomycètesest très diversifiés, il est à l’origine du rôle écologique majeur de cesorganismes (BOUDEMAGH, 2007).

I.6.- Importance des actinomycètes

Les Actinomycètes sont les plus prolifiques de tous les micro-organismes entant que producteurs d'antibiotiques. On estime que les deux tiers des quelque sixmille antibiotiques isolés jusqu'ici sont produits par les actinomycètes, et c'est SelmanA. Waksman qui, le premier, a démontré la richesse des actinomycètes dans cedomaine. Ce fut dans ses laboratoires que furent isolés quatre des premiersantibiotiques utiles: l'actinomycine (1940), antitumorale; la streptomycine (1944),antibactérienne, y compris antituberculeuse; la néomycine (1949), antibactérienne; etla candicidine (1953), antifongique, ayant aussi des propriétés pharmacologiquesintéressantes en tant que ligand des stérols.

Les enzymes sont, après les antibiotiques, les plus importants produits desactinomycètes. Certaines sont utilisées à cet effet dans l'industrie alimentaire(isomérase du glucose) et dans celle des détergents (protéases).

Les glycosidases des actinomycètes jouent un rôle important dans ladégradation des biomasses végétales (amylases, xylanases) et animales (chitinases)(LECHEVALIER, 1981).


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Tableau II.- Répartition de quelques genres d’actinomycètes par type d’habitat(GOODFOLLOW et WILLIAMS, 1983).

Genre Habitat

Actinomadura

Actinoplane

Frankia

Microbiospora

Micromonospora

Rhodococcus

Saccharomonospora

Streptomyces

Steptosporangium

Sol

Sol, Eau, Litière

Nodules des racines

Sol

Sol, Eau

Sol, Eau, Fumier, Litière, Matière en décomposition

Sol, Eau, Litière

Sol et Eau

Matière en décomposition et en fermentation

I.7.- Cycle de développement des actinomycètes (exemple type : Streptomyces spp)

Sur milieu solide (Figure 01), la cellule bactérienne initiale, appelée « sporelibre » croît à la surface du milieu de support non seulement en s'allongeant, commetoute bactérie, mais aussi en se ramifiant et, même, en pénétrant en profondeur dans lemilieu, sans se diviser, sans qu'aucune septation n'apparaisse (= mycélium). Aprèsquelques jours, le mycélium produit des structures aériennes qui s'étendent en hauteur(= hyphes aériens). Ces structures vont développer des torsades, tel un tire-bouchon.Leur partie terminale, après une série de réplications et de migrations du chromosomebactérien, montre l'apparition d'un nombre important d'événements de septation, quisont à la base de la formation d'autant de jeunes cellules bactériennes qui vont, aprèsmaturation et libération, donner naissance à de nouvelles formes libres, pour que lecycle vital recommence (ZOUAGHI ,2007).

En milieu liquide, les cellules se développent uniquement sous forme demycélium primaire, même si de très rares Streptomyces peuvent sporuler dans cetenvironnement. En milieu solide, une différentiation morphologique est doncobservée (formation du mycélium aérien) tandis qu’en milieu liquide, ladifférentiation est généralement physiologique (SMAOUI, 2010).


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Figure 01.- Cycle de développement des actinomycètes (Streptomyces spp.)(ZOUAGHI, 2007)

Chapitre II.-

Principaux actifs

des actinomycètes

et méthode

d'extraction

Chapitre II.- Principes actifs des actinomycètes et méthode d'extraction

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II.1.- Substances bioactives produites par les actinomycètes

Les actinomycètes représentent une grande proportion de la biomassemicrobienne du sol. Ils ont la capacité de produire une large variété de moléculesbioactives entre autres des antibiotiques et d’enzymes extracellulaires (LOUCIF,2011).

II.1.1.- Antibiotiques

II.1.1.1.- Historique

En 1928, Alexander Fleming observa que la croissance de Staphylococcusaureus était inhibée autour d'une colonie de moisissure ayant contaminé la boite dePetri où se trouvaient les bactéries. La moisissure était Penicillium notatum, et l'agentactif, isolé peu de temps après, fut nommé pénicilline. En microbiologie, lorsqu'onensemence un milieu solide avec un échantillon prélevé dans l'environnement, enparticulier dans le sol, on observe couramment entre les diverses colonies desréactions d'inhibition similaires à celles de Fleming. Ce mécanisme d'inhibitions'appelle antibiose. De ce mot dérive le terme « antibiotique », soit une substanceproduite par un microorganisme – habituellement une bactérie ou un mycète – et qui,en petites quantités, inhibe la croissance d'un autre microorganisme (TORTORA,2012).

II.1.1.2.- Définition des antibiotiques

Le mot antibiotique fut employé pour la première fois, en 1942 par Waksmanqui en a donné la définition suivante :

Un antibiotique est une substance chimiquement définie, produite par desmicroorganismes et qui a la propriété d'inhiber la croissance ou même de détruire desbactéries ou d'autre microorganismes en solution dilué in vitro ou in vivo (SIMON etMEUNIER, 1970)

A l’origine, le mot antibiotique désigne tout produit microbien qui, même detrès faibles concentrations, inhibe ou tue certains microorganismes. On l’emploiemaintenant dans un sens plus large pour inclure en outre toute substance synthétiqueou semi-synthétique dotée de ces propriétés (SINGLETON, 1994).

Les antibiotiques sont produits par un large éventail de microorganismesfongiques et bactériens, et inhibent ou tuent à faibles concentrations spécifiquementd’autres microorganismes (MARINELLI, 2009). Un grand nombre d’antibiotiques aété identifié en milieu naturel, mais moins de 1% sont médicalement utiles. Beaucoupd’antibiotiques naturels ont été structuralement modifiés en laboratoire pour


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augmenter leur efficacité formant la classe des antibiotiques semi-synthétiques(MADIGAN et MARTINKO, 2007).

II.1.1.3.- Classification des antibiotiques

Les antibiotiques peuvent être classés selon plusieurs critères : la naturechimique, le mécanisme d’action et le spectre d’action. La classification desantibiotiques en tenant compte du spectre antimicrobien ne parait pas être la meilleureen raison de l’évolution de la résistance bactérienne. La classification chimiquepermet de classer les antibiotiques en groupes assez homogènes mais éloignés desobjectifs cliniques. Enfin, celle basée sur le mécanisme d’action rend compte despropriétés particulières de chaque groupe d’antibiotiques (WALSH, 2000).

La diversité et la complexité des molécules antibactériennes rendentnécessaire leur classification. Les antibiotiques peuvent être classés selon leurs modesd'action sur les agents infectieux, en fonction des microorganismes qu’ils inhibent oubien selon leurs structures chimiques. En utilisant ce dernier moyen de classement,nous pouvons distinguer plusieurs familles, elles mêmes divisées en plusieurs classesà savoir, les aminoglycosides, les β-lactamines, les céphalosporines, leschloramphénicols, les glycopeptides, les lincomycines, les macrolides, les quinolones,les sulfamides, les tétracyclines, les antibiotiques peptidiques, les dérivés dedicétopipérazines, les peptides cycliques, ….etc (SMAOUI, 2010).

II.1.1.3.1.- Familles des β-lactamines

La famille des β -lactamines comprend un grand nombre de molécules, toutescaractérisées par la présence d’un cycle β-lactame indispensable à l’activitéantibiotique (CAVALLO et al., 2004). Les β -lactamines sont des moléculescycliques qui interfèrent avec les étapes finales de la synthèse du peptidoglycane(CAVALLO et al., 2004). Ils exercent une action bactéricide sur de nombreusesespèces bactériennes. La thienamycine connu sous le nom de imipenème, l’un desderniers antibiotiques découvert possédant un cycle lactame et doté d’un large spectred’action, est produit par l’espèce actinomycetale, Streptomyces cattleya (DEMAIN etLANCINI, 2006).

II.1.1.3.1.1.- Les pénicillines

Le terme pénicilline regroupe plus de 50 antibiotiques chimiquementapparentés. Toutes les pénicillines ont une structure commune dans laquelle la chaînecyclique β –lactame tient lieu de noyau. De ce fait, on les appelle aussi β –lactamines.Elles se distinguent par les chaines latérales chimiques qui sont rattachés au noyau. les


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pénicillines sont produites par voie naturel ou par voie sous-mis synthétique(TORTORA, 2012).

Elles agissent en fusant obstacle a l'assemblage du réseau macromoléculairedu peptidoglycane ; se qui bloque les dernières étapes de la formation de la paroicellulaire ; en particulier celle des bactéries a Gram positif. Du même coup, ellesinhibent la croissance du microbe. Dépourvu de protection, celui-ci meurt rapidement(TORTORA, 2012).

II.1.1.3.2.- Les céphalosporines

Les céphalosporines appartiennent à la classe des céphèmes. Elles ont étéclassées en quatre générations selon leur spectre d'activité (Jacques, 2004). Lacéphalosporine C est un antibiotique naturel extrait du cephalosporidium, unchampignon. Elle fut le premier membre de cette famille. Celle-ci s’étoffa peu à peusous l’impulsion des chercheurs, qui ont synthétisé des molécules de plus en plusefficaces et de moins en moins sensibles aux défenses des bactéries. On parle decéphalosporines de 1ére, 2ème, 3ème et 4ème génération. Ces dernières ont laparticularité d’être efficaces sur des zones de l’organisme qui ne pouvaient êtretraitées jusque-là, comme le liquide céphalo-rachidien. On peut citer les plus avancées: céfépime et cefpirome (NATHAN ET ÉBERLIN, 1994).

II.1.1.3.3.- Les aminosides

Les aminoglycosides, ou aminosides, forment une famille d'antibiotiques dontles molécules sont reliées par des liaisons glycosidiques. Ils comprennent lastreptomycine et la gentamicine, qui perturbent les premières étapes de la synthèsedes protéines en modifiant la conformation de la sous-unité 30S du ribosomeprocaryote. Il en résulte des erreurs de lecture du code génétique des ARNm

(TORTORA, 2012). L’antibiotique le plus connu est la streptomycine produite parStreptomyces griseus et la gentamycine produite par Micromonospora purpurea(DEMAIN et LANCINI, 2006).

II.1.1.3.4.- Les phénicols

On retrouve dans ce groupe le chloramphénicol, facile à synthétiser. Ce sontdes antibiotiques à large spectre, capables de traiter de nombreuses zones del’organisme, dont le système nerveux central, mais à toxicité élevée. On les utilise parexemple dans le traitement des méningites (NATHAN et ÉBERLIN, 1994). Lechloramphénicol est un antibiotique bactériostatique à large spectre qui perturbe lasynthèse des protéines. En se liant à la sous unité 50S du ribosome, il inhibe laformation des liaisons peptidiques dans les polypeptides en croissance. Du fait de sa


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structure chimique relativement simple, il est moins dispendieux à synthétiserchimiquement qu'à isoler à partir de culture de Streptomyces. Sa faible taillemoléculaire facilite sa diffusion dans des régions du corps habituellementinaccessibles à beaucoup d'autres agents (TORTORA, 2012)

II.1.1.3.5.- Les tétracyclines

Les tétracyclines possèdent une structure particulière, elles sont formées de 4cycles accolés sur lesquels sont fixées diverses chaines latérales. Ces antibiotiquesinhibent la synthèse protéique en empêchant la liaison de l’aminoacyl-ARNt à la sousunité 30S du ribosome bactérien (PRESCOTT et al., 2007). Elles s'interposent entreles ARN t porteurs des acides aminés et la sous-unité 30S du ribosome, ce quiempêche l'ajoute de nouveaux acides aminés au polypeptide en formation(TORTORA, 2012).

II.1.1.3.6.-Les macrolides

Les macrolides font partie d'une famille d'antibiotiques qui tire son nom dumacrocycle lactone que ces agents renferment (TORTORA, 2012). Les macrolidescomportent un grand cycle de 14, 15 ou 16 carbones. Ils ont un spectre étroit. Cesantibiotiques traversent les membranes bactériennes pour parvenir dans le cytoplasmede la bactérie où ils vont se fixer sur leur cible : l'unité 50S du ribosome. Cettefixation perturbe la synthèse des protéines (JACQUES, 2004). Ce groupe agit parblocage de la synthèse protéique des germes résistant aux β-lactamine et auxtétracyclines (en particulier les staphylocoques). Il se caractérise par une forteélimination biliaire pour la spiramycine et, à moindres degrés, l’érythromycine(RUCKEBUSCH et TOUTAIN, 1982).

II.1.1.3.7.- Les quinolones

Les quinolones sont des composés cycliques et l'ajoute de fluor sur la structurede base a permis d'obtenir les fluoroquinolones. Toutes les molécules de cette familleinhibent la réplication de l'ADN bactérienne. Pour ce faire, elles se fixent sur uneenzyme indispensable à la réplication : la gyrase ou ADN gyrase, cette enzyme étaitintra-cytoplasmique. La quinolone doit traverse les différentes membranesbactériennes (JACQUES, 2004).

II.1.1.3.8.- Les polypeptides

Ce sont des antibiotiques bactéricides à spectre étroit, on les utilise dans lesinfections sévères à bacilles gram négatif. Ce sont les antibiotiques de références pourle traitement des endocardites. La famille de polypeptide, qui comprend la colistine, la


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polymyxine B, la bacitracine et la tyrothricine, présente les caractéristiquescommunes suivantes :

- structure polypeptidique

- activité contre les bacilles gram positifs sauf la bacitracine

- faible absorption; d’où leur usage en antibiothérapie digestive.

La colistine entre dans la composition de nombreuses spécialités où elle est associéeaux sulfamides, aux ß- lactamines et aux macrolides (RUCKEBUSCH et TOUTAIN,1982).

II.1.1.4.- Mode d’action des antibiotiques

Les antibiotiques doivent tuer ou inhiber les micro-organismes sans détruireles cellules. En effet, pour pouvoir être utilisable en pratique clinique, un antibiotiquedoit se caractériser par une action spécifique sur les germes visés sans perturber lefonctionnement des cellules de l’hôte. Comme le montre la figure 03, le mode d'actiondes antibiotiques varie d'une classe à une autre (SMAOUI, 2010) :

II.1.1.4.1.- Action sur la paroi bactérienne

De nombreux antibiotiques inhibent la synthèse du peptidoglycane, composantessentiel de la paroi des bactéries à Gram+ et à Gram-. La synthèse de la paroibactérienne comporte trois étapes successives : la première qui se passe à l'intérieurde la bactérie, consiste en la formation des unités de base, l'UDP-N-acéthyl-glucosamine et l'UDP-N-acéthylmuramyl-pentapeptide. La deuxième étape permet lepassage par un système de transporteurs lipidiques à travers la membranecytoplasmique de ces deux précurseurs et leur addition pour former une molécule dedisaccharide-pentapeptide. Au cours de la troisième étape, cette molécule s'intègre aupeptidoglycane préexistant et, à ce stade, deux enzymes essentielles interviennent :une transglyscosylase qui permet l'attachement des disaccharides-pentapeptides entreelles aboutissant à la formation des chaînes polysaccharidiques, et une transpeptidasequi réticule les chaînes entre elles par formation d'une liaison peptidique entrel'alanine-4 d'un disaccharide –pentapeptide et le peptide d'une chaîne voisine.Chacune de ces trois étapes peut être perturbée par l'action des antibiotiques. Parexemple, les β-lactames inhibent la dernière étape de la synthèse du peptidoglycane(SMAOUI, 2010).


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II.1.1.4.2.- Action sur la membrane cellulaire

La membrane plasmique des microbes, située juste après la paroi cellulaire, estla cible de nombreux agents antimicrobiens. Essentielle à la cellule, cette membranejoue un rôle actif dans la régulation de l'entrée des nutriments et de l'élimination desdéchets. Certains antibiotiques, en particulier les antibiotiques polypeptidiques,influent sur la perméabilité de la membrane plasmique des bactéries. Ces modificationengendrent la rupture de la membrane et, par conséquent, la perte d'importantmétabolites cellulaires (TORTORA, 2012).

II.1.1.4.3.- Action sur des ribosomes

D'autres, comme les aminoglycosides, les tétracyclines, les phénicoles, lesmacrolides, les lincosamides et les streptogramines, qui se fixent sur le ribosomebactérien inhibant différentes étapes de la synthèse protéique (BENZEGGOUTA,2005)

II.1.1.4.4.- Action sur la biosynthèse des acides nucléiques

La synthèse des acides nucléiques (ADN et ARN) peut aussi être perturbée parles antibiotiques: cas des sulfamides, du triméthoprime, des quinolones, desrifamycines et des nitro-imidazoles (BENZEGGOUTA, 2005)

La structure des acides nucléiques bactériens ou fongiques (ADN ou ARN) neprésente aucune particularité. Par conséquent, les antibiotiques qui agissent à ceniveau sont toxiques pour toutes les cellules. On utilise d’ailleurs cette propriété pourune action antimitotiques (dans les antitumoraux). Les antibiotiques de Streptomycesemployés en tant que cytostatiques sont de différentes natures : la mitomycine etl’adriamycine (anthracyclines), l’actinomycine (peptide), la bléomycine(glycopeptide), la puromucine (nucléoside). D’autres molécules sont utilisées en tantqu’antibactériens comme la novobiocine (glycoside) qui inhibe la réplication del’ADN et la rifamycine (ansamycine) qui ploque la synthèse de l’ARNm parinhibition de l’ARN polymérase bactérienne (KIESER et al., 2000 ; TORTORA et al.,2003).

Dans cette classe, on trouve deux groupes d'antibiotiques. Un premier agitdirectement sur la synthèse des acides nucléiques, et un deuxième groupe intervientau niveau de leurs précurseurs de synthèse. Dans le premier groupe on peutdistinguer :


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Les quinolones qui agissent sur les enzymes réglant la conformation de l'ADN telque les topo-isomérases (essentiellement l'ADN gyrase). L'arrêt de l'activité de cesenzymes bloque tout changement de conformation et toute synthèse d'ADN.

Le deuxième groupe d'antibiotiques agit sur les précurseurs de synthèse des acidesnucléiques qui sont les folates. Ces derniers et en particulier l'acide tétrahydrofoliquejoue un rôle essentiel dans la synthèse des bases puriques et pyrimidiques. Pour cedeuxième groupe, on peut citer les sulfamides et les 2-4-diaminopyrimidines(SMAOUI, 2010).

Figure 02.- Mode d’action des antibiotiques (TORTORA, 2012).

II.1.1.5.- Production des antibiotiques

Les actinomycètes sont les plus prolifiques de tous les microorganismes entant que producteurs d’antibiotiques (BERDY, 2005). On estime que les deux tiers desquelque six mille antibiotiques isolés jusqu'ici sont produits par les actinomycètes.Historiquement A. Waksman fut le premier à démontrer la richesse des actinomycètesdans ce domaine, il isola quatre des premiers antibiotiques utiles : l'actinomycine(1940)- antitumorale ; la streptomycine (1944)- antibactérienne et antituberculeuse ;la néomycine (1949)- antibactérienne ; et la candicidine (1953)- antifongique ayantaussi des propriétés pharmacologiques intéressantes en tant que ligand des stérols.Parmi les espèces actinomycètales, les Streptomyces sont les plus importants


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producteurs d'antibiotiques et autres métabolites secondaires, 75% des antibiotiquessont produits par les espèces de streptomycètes (REVEL et al., 2000).

Les antibiotiques des actinomycètes sont utilisés aussi dans le traitement decertaines maladies des plantes. La blasticidine, par exemple, est active sur Piriculariaoryzae, un pathogène du riz (TOMITA et al., 1990).

La synthèse des antibiotiques est largement répandue chez les actinomycètes,50 à 75% des souches isolées en sont productrices et sont à l'origine de 70% desantibiotiques naturels connus dans le monde (OKAMI, 1988).

II.1.1.5.-Extraction des antibiotiques

La conduite d'un procédé d'extraction et de purification des molécules activesest ramenée à trois opérations de base :

1. Séparation des particules insolubles, telles que les composantes du milieu deculture, les cellules et le mycélium. Ceci se fait par filtration ou parcentrifugation.

2. L'extraction du produit se fait par fractionnement avec les solvants organiquesou précipitation par la phase de partition.

3. La purification partielle des molécules est réalisée de façon très sélective grâceà l'application de la technique chromatographique (ZOUAGHI, 2007).

II.1.1.6.- Extraction aux solvants organiques

Le but de l'extraction à l'aide des solvants organiques est de faire passerl'antibiotique de la phase aqueuse à la phase organique .Cette opération permet déjàde purifier partiellement les molécules présentes dans le surnageant. Le choix dusolvant dépend de la stabilité des substances antimicrobiennes dans le solvant lors del'extraction (ZOUAGHI, 2007).

II.1.1.7.- Résistance aux antibiotiques

En revanche, les bactéries avaient trouvé les moyens pour résister et parconséquent, éviter l'action des antibiotiques, et se développer en présence d'uneconcentration en antibiotique significativement plus élevée que celle habituellementactive sur les souches de cette espèce. Il faut distinguer la résistance innée ounaturelle, de la résistance acquise apparaissant chez des bactéries sensibles auxantibiotiques. Celle-ci, correspond à une adaptation des bactéries aux antibiotiques,qui est due soit à des mutations, soit à la présence de nouveaux gènes portés par desplasmides ou des transposons. La résistance par mutation chromosomique neconcerne qu'un faible pourcentage des souches isolées en clinique; par contre la


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résistance d'origine plasmidique est beaucoup plus fréquente, découverte à la fin desannées 50, au Japon à la suite d'une épidémie de dysenterie bacillaire(BENZEGGOUTA, 2005)

II.1.2.- Enzymes

Après les antibiotiques, les enzymes sont les produits industriels les plusimportants des actinomycètes (THEILLEUX, 1993). En effet, ce sont d’excellentsproducteurs d’enzymes à utilisation industrielle telles que des protéases, deschitinases (TANAKA et OMURA, 1990 ; VONOTHINI et al., 2008), des amylases,des cellulases, des xylanases et des lipases (PARK et al., 2002). A titre d’exemple : laD-xylose isomérase, plus connue sous le nom de glucose isomérase, produite parl’espèce Actinoplanes missouriensis et plusieurs espèces de Streptomyces, est utiliséepour obtenir des sirops riches en D-fructose. Un complexe amylasique issu deStreptomyces hydroscopicus et S. praecox a été exploité pour préparer des siropsriches en maltose. Les protéases d’actinomycètes sous forme libre ou immobiliséessont employées dans les industries alimentaires, pharmaceutiques, en tannerie etcomme additifs dans les détergents (ex : pronase de S. griseus) (THEILLEUX, 1993).Par ailleurs, les actinomycètes produisent de fortes quantités de chitinases et de β-1-3-glucancase et causent des plasmolyses et des lyses des parois cellulaires despathogènes (CONN, 2005). D’après PARK et al., 2002, les chitinases produites etsécrétées par les actinomycètes agissent sur les cuticules des nématodes adultes etprovoquent ainsi leur mort. Notamment l’espèce Streptomyces coelicolor qui sécrètede nombreuses hydrolases incluant : 60 protéases/peptidases, 13chitinases/chitosanases, 8 cellulases/endoglucanases, 3 amylases et 2 pectates lyases(BENTLEY et al., 2002).

Partie II.- Etude

expérimentale

Chapitre III.-

Matériels et

méthodes


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III.1.- Objectif de travail

L’objectif principal de la présent étude, consiste à la production etl’extraction des principes actifs à partir des actinomycètes en culture liquide etd’examiner les activités de ces molécules en travail expérimental permet demettre en évidence :

Le choix de meilleur solvant d’extraction ;

Caractérisation chimique des extraits bruts actifs et;

D’étudier de pouvoir antagoniste des extraits actifs vis-à-vis des souchescibles.

III.2.- Matériels biologiques

La souche testée est une bactérie d'actinomycète isolée à partir de la région deOuargla, identifiée et classée parmi le genre Streptomyces codée ''ITA1x''.

Le choix des bactéries cibles a été effectué après une étude de l'activitéantimicrobienne de ITA1x vis-à-vis de profils des souches pathogènes (bactérie etchampignons) en utilisant la méthode de cylindre d'Agar et les résultats sont montréesque la souche la plus sensible est la bactérie Bacillus subtilis.

III.3.- Cinétique de croissance et de production des antibiotiques

III.3.1.- Pré-culture et culture

Le milieu utilisé est celui de Williams (1965). Des pré-cultures de 3 jours sontd’abord préparées sur tubes à partir de fragments mycéliens raclés d’une boites dePétri incubées de 7 à 10 jour. A partir de ces cultures en pente des souchessélectionnées, on ajoute 2 ml d’eau distillé stérile et on racle la surface du milieu(celui de Williams modifier «1965») avec une pipette stérile. 1 ml de la suspensionsert à ensemencer un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu liquide.L’incubation est effectuée dans un bain Marie avec agitation permanente à 28 °Cpendant 12 jours à 240 tour/min (HACENE, 1992).

III.3.2.- Cinétique de croissance

La concentration cellulaire a été exprimée en poids cellulaire sec à l'étuveaprès séchage à 105˚C. Le volume de culture prélevé est transvasé dans un tube flaconde 50 ml puis centrifugé à 5500 g pendant 15 min. Le filtrat de culture est récupérédans un tube flacon stérile et servira au test d'activité sur les microorganismes cibles.le culot est ré-suspendu dans un volume égal d'eau distillé stérile (lavage), puis


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recentrifugé à 5500 g pendant 15 min. L'opération de lavage est répétée trois fois. Lesurnageant est éliminé et le culot est transvaser dans une boite de Pétri en verrepréalablement pesé (m0). La boite de Pétri est ensuite mise au four à 105˚C pourséchage, puis pesée jusqu'au poids constant (m).

Le poids sec est calculé selon l'équation suivante :

PS = (m - m0)1000/V (g/l)

M = poids de la boite de Pétri après séchage en g.

M0 = poids de la boite de Pétri vide en g.

V = volume du liquide en ml. (MORAKCHI, 2011)

III.3.3.- Estimation de variation de pH

Des prélèvements quotidiens à intervalle de 24 h ont été effectués pourl'évolution du pH pendant 12 jours, sur le milieu Bennett (pH initial à 7,2) dans desconditions aseptiques à partir des erlenmeyer en agitation. Le volume prélevé dépenddu type d'analyses à effectuer, il est généralement de 5 à 10 ml.

III.3.4.- Cinétique de production des antibiotiques

La cinétique de production des antibiotiques a été suivie pendant 12 jours, àpartir des prélèvements ponctuels effectués en cours de fermentation, toutes les 24 h.L’activité antibiotique est déterminée par la méthode des puits contre Bacillus subtilis.Dans cette méthode, du milieu Muller Hinton est ensemencé avec une suspension duB.subtilis en boîtes de Pétri. Des puits sont conçus à l’aide d’un emporte-pièce de 6mm de diamètre. Une quantité de 150 μl de culture à analyser est prélevée stérilementpuis introduite dans le puits. Les boîtes sont mises 2 h à 4°C pour laisser diffuser lessubstances actives tout en arrêtant momentanément la croissance des germes, puisincubées à 37 °C. La lecture des résultats se fait en mesurant le diamètre d’inhibitionautour du puits après 24 h (TOUMATIA, 2015).

III.4.- Extraction et purification des antibiotiques

Après les cultures, les milieux sont centrifugés à 8000 tr/mn, pendant 20 mn etce ci pour analyser séparément le filtrat des cellules (HACENE, 1992).

III.4.1.- Extraction par des solvants : (AUGUSTINE et al., 2005 ; BADJI et al.,2006 ; ZITOUNI et al., 2005)


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Après avoir réalisé des cultures liquides sur Erlenmeyers et obtenu le filtrat deculture. Une extraction par des solvants organiques de différentes polarités esteffectuée. Il est à signaler que les antibiotiques produits peuvent être extraits à partirdu mycélium et/ou du filtrat de culture.

III.4.1.1.- Extraction à partir du mycélium

Le mycélium est récupéré après filtration ou centrifugation et lavé 3 fois àl’eau distillé par centrifugation à 3000 g pendant 10 min pour se débarrasser desimpuretés et autres résidus du milieu. Le culot mycélien est égoutté, récupéré dansune fiole et immergé dans du méthanol. Le tout est mis sous agitation magnétiquependant 2 h de manière à assurer une homogénéisation convenable (à T°C ambiante).L’extrait méthanolique est ensuite récupéré par filtration sous vide puis concentré àsec à 40°C à l’aide d’un évaporateur rotatif, le résidu est repris dans 5 ml de méthanolet ce afin de tester son activité par antibiographie (DJINNI, 2009).

III.4.1.2.- Extraction à partir du filtrat de culture

L’extraction des antibiotiques à partir du filtrat de culture nécessite le choixd’un solvant non miscible à l’eau, cinq solvants de polarité croissante sont utilisés : len- hexane, le benzène, le dichlorométhane, l’acétate d’éthyle et le n- butanol. Afin dedéterminer le meilleur solvant d’extraction (VALAN ARASU, 2009), le filtrat estmélangé dans une ampoule à décanter avec un volume égal de solvant, les deuxphases organique et aqueuse sont récupérées séparément concentrées à sec puisreprise dans un minimum de méthanol ou d’eau. L’activité antibactérienne estrecherchée dans les deux phases organique et aqueuse (DJINNI, 2009).

III.4.2.- Antibiographie et choix de solvant d’extraction

L’activité inhibitrice des différentes phases organiques obtenues est testée parantibiographie (méthode des puits).

III.4.2.1.- Méthode des puits

L’activité antimicrobienne de la phase organique et aqueuse est testée parantibiogaphie (méthode des puits) on utilisant le milieu Muller Hinton qui, une foiscoulé dans des boites de Pétri, est ensemencé avec les germes cibles. Des puits de 6mm de diamètre sont réalisés à l’aide d’un emporte pièce.

Un aliquote de 50 ul de surnagent de culture est prélevé stérilement puisintroduit dans les puits préalablement tapissés par une goutte de gélose blanche, lesboites sont mises à 4°C pendant 2 h afin de permettre une diffusion des substancesactives tout en arrêtant la croissance des germes, puis incubées à 37°C pour les


24

bactéries et à 28°C pour les moisissures. La lecture des résultats s’effectue enmesurant le diamètre des zones d’inhibitions autour des puits après 24 h pour lesbactéries (DJINNI, 2009).

Figure 03.- Protocole d’extraction des antibiotiques à partir de mycélium et de filtratde culture.

Culture d'actinomycète sousagitation permanente (240

trs/ min) 12j/28°CCentrifugationation

Filtrat de cultureMycélium

Ampouleà décanter

Extraction par des solvantsorganiques :

surnageant/solvant (v/v)

Lavage à l'eau parcentrifugation3000 g/10min

n-hexane

Benzène

Dichlorométhane

Acétate d'éthyle

n-butanol

La phaseorganiquerécupérée

Filtration sous vide

Concentrer àsec à 40˚C

Récupérationdans 5ml du

méthanol

Récupération dans5ml du méthanol

Concentration à sec à40 C

Testantibiographie


25

Figure 04.- Mise en évidence de l’activité antibiotique des extraits de l'isolatd’actinomycète sur milieu Muller-Hinton par la méthode des puits.

III.4.3.- Séparation et semi-purification des principes actifs

III.4.3.1.- Séparation par chromatographie analytique sur couche mince

Une fois le meilleur solvant d’extraction pour la souche étudiée est choisi, ilest nécessaire de déterminer le meilleur système de séparation par migration enréalisant une chromatographie sur plaques de gel de silice, prêtes à l’emploi et aussides plaque préparer par nous même et même dans certains cas on utilise de papierWatman n°1 (DJINNI, 2009).

III.4.3.1.1.- Préparation des plaques de gel de silice

Les plaques de gel de silice sont préparées, en mélangeant 40 g de silice avecle gypse ou un autre liant et 100 ml d’eau distillée dans un Erlenmeyer de 250 ml.Après agitation manuel vigoureuse, le gel obtenu est étalé de manière régulière etuniforme sur des plaques en verre à l’aide d’un étaloir sous forme de fine couche(0,25 mm), les plaques sont, par la suite, séchées durant une nuit à 37°C et régénéréesà 105°C pendant 30 min à 1 h avant utilisation (DJINNI, 2009).

III.4.3.1.2.- Développement des plaques et sélection du système d’élution

Des dépôts de petit volume (30 ul) d’extrait actif sont déposés sous forme despots, à 3 cm du bord inférieur de la plaque et à 2 cm des bords latéraux, les spots sont


26

séchés sous courant d’air froid, entre chaque application. Les cuves rectangulairesutilisées, contiennent 100 ml d’éluant. L’atmosphère des cuves est saturée pendant 2h, avec les vapeurs du système de solvant choisi, avant d’y introduire les plaques.

Les différents systèmes de solvant habituellement utilisés sont :

N-Butanol-Acide acétique-Eau (60 : 20 : 20 et 6 :1.5 :2, v/v/v), Acétate d’éthyle-Méthanol (100:15, v/v), Ethanol-Ammoniaque-Eau (40:30:30, v/v/v), et Acétonitrile-Eau (50:50, v/v).

La chromatographie est arrêtée lorsque le front du solvant a parcouru unedistance d’environ 15 cm à partir du dépôt. Le solvant est éliminé de la plaque parsimple évaporation à température ambiante. Le chromatogramme est observé à l’œilnu et sous lumière ultra-violet ( 245 et 356 nm) et les spots (absorption et

fluorescence) qui apparaissent sont notés.

III.4.3.1.3.- Révélation chimique des plaques

Parallèlement aux bioautographie, il est effectuer des révélations chimiquessur les plaques ayant migrées dans les même conditions, afin d’établir éventuellementdes corrélations, au même front, entre activité biologique et révélation chimiquespécifique.

Les principaux révélateurs utilisés sont les suivants (MERCK, 1980 cité parHACENE, 1992) :

Révélateur des amines : Ninhydrine

Révélateur des glucides : Diphénylamine-aniline

Révélateur des phénols : Fer (III) chlorure

Révélateur des alcools supérieurs, des stéroïdes et des huiles éthérées : la vanilline-H2SO4

Révélateur des aromatiques polycycliques : le formaldéhyde-H2SO4

III.4.3.1.3.- Révélation microbiologique des chromatogrammes (bioautographie)

Cette méthode consiste d’une part, à détecter les taches actives présentes dansles extraits en déterminant leur nombre et leur rapports frontaux (Rf) respectifs etd’autre part, à choisir le meilleur système de solvant de migration permettant de


27

séparer le mieux les antibiotiques entre eux ou des autres composés non actifs. Lesplaques sont placées sur un support en verre dans une boite en polyéthylène (22 x 24cm). A la base de la boite, une feuille de papier filtre imbibées d’environ 30ml d’eaustérile afin de maintenir une atmosphère humide et de retarder ainsi la dessiccation dela gélose au cours de l’incubation. Le dispositif est stérilisé durant 1 h sous UV à 254nm. Un volume de 50 ml de gélose molle (semi solide) Muller Hinton en surfusion estinoculé avec 1ml de la suspension de germe cible contenant 107 UFC/ml (DO= 0,5).

Ce milieu est réparti de façon homogène et uniforme avec une pipette stérilesur les plaques. Après solidification, la boite est mise à 4°C pendant 2 h afin depermettre la diffusion de substance antibiotique dans le milieu puis incubée à 28°C.Les zones d’inhibition sont notées après 24 à 48 h et les Rf calculés selon la formule :(BETINA, 1973 cité par DJINNI, 2009).

Distance parcouru par le spot

Rf =

Distance parcouru par la phase mobile

Chapitre IV.-

Résultats et

Discussions


28

IV.1.- Résultats

IV.1.1.- Cinétiques de croissance et de production des antibiotiques

Les cinétiques de croissance et de production des métabolites antimicrobiens ont été

suivies en culture liquide de la souche ITA1X sur milieu Bennett pendant 12 jours. Des

prélèvements quotidiens à intervalle de 24 h ont été effectués pour l’évolution du pH et du

poids sec d'une part, et d'autre part à mesurer les diamètres des zones d'inhibitions vis-à-vis

Bacillus subtillus.

IV.1.1.1.- Cinétique de croissance

Les résultats obtenus sont représentées dans la Figure 05. Après une incubation de

24h, la cinétique de croissance de la souche ITA1X révèle une croissance rapide arrivant à

6g/l. Durant les trois premiers jours la biomasse reste stable, mais au quatrième jour apparait

une baisse du poids sec à 2g/l pour devenir 4g/l. Le cinquième jour, elle remonte à 10g/l puis

elle démunie à 4g/l au septième jour et reste stable jusqu'à le 12ème

jour.

Figure 05.- Cinétiques de croissance de la souche ITA1X dans le milieu Bennett.

IV.1.1.2.- Estimation de variation de pH

Les valeurs enregistrées du pH démontrent que, durant les premiers 24 heurs de

croissance, on observe une acidification rapide du milieu (de pH =7.2 à pH=4.7). Le pH

remonte ensuite progressivement pour atteindre un maximum de 8.6 au huitième jour, puis il

démunie entre les 216 et 240 heurs et atteint en fin de fermentation la valeur de 8.4 (Figure

06).


29

Figure 06.- Cinétiques de pH de la souche ITA1X dans le milieu Bennett.

IV.1.1.3.- Cinétique de production des antibiotiques

L'activité antibactérienne de la souche ITA1X vis-à-vis Bacillus subtillus est détectée

par la méthode des puits. La production des métabolites antimicrobiens apparait dès le

premier jour d’incubation. Elle est maximale de premier au troisième jour et neuvième au

onzième jour d'incubation (Figure 07).

Figure 07.- Cinétiques de production d’antibiotique de la souche ITA1X vis-à-vis Bacillus

subtilis.

IV.1.2.- Extraction des antibiotiques

Les résultats de l’extraction permettent de montrer que les cinq extraits de filtrats du

culture par des solvants organiques ainsi que le mycélium sont actifs contre la bactérie

Bacillus subtilis.


30

IV.1.2.1.- Extraction à partir du mycélium

L’extraction des antibiotiques à partir de 30 g de mycélium séché a été réalisée par 5

ml de méthanol. L’extrait du mycélium a une couleur marron foncée et présente une activité

contre Bacillus subtilis avec un diamètre d’inhibition de l’ordre 12 mm.

IV.1.2.2.- Extraction à partir des filtrats de culture

Pour l’extraction des antibiotiques à partir du filtrat de culture de la souche ITA1X,

cinq solvants organiques de polarités différentes ont été testés : n-hexane, benzène,

dichlorométhane, acétate d’éthyle et n-butanol. Les résultats des antibiographies des extraits,

illustrés dans la Figure 08, montrent que la n-hexane est le meilleur du point de vue

extrabilité avec une zone d’inhibition de l’ordre de16 mm de diamètre.

Figure 08.- Diamètres des zones d'inhibition des extraits organiques et de mycélium de la

souche ITA1X vis-à-vis Bacillus subtilis.

IV.1.3.- Séparation et semi-purification des principaux actifs

IV.1.3.1.- Chromatographie analytique sur couche mince

La chromatographie analytique sur couche mince a été effectuée pour séparer les

substances actifs et détecter le meilleur système de séparation. Cinqs systèmes de solvants de

migration ont été testés, il s’agit de : B.A.E (n-Butanol-Acide acétique-Eau, 60 : 20 : 20 et

6:1.5:2, v/v/v), A.M (Acétate d’éthyle-Méthanol, 100:15, v/v), E.A.E (Ethanol-Amoniaque-

Eau, 40:30:30, v/v/v), et A.N.E (Acétonitrile-Eau, 50:50, v/v) et cela pour l’élution de

l’extrait par n-hexane, benzène, dichlorométhane, acétate d’éthyle et n-butanol. Le système

B.A.E (6:1.5:2, v/v/v) a été retenu pour les bioautographies, les révélations chimiques et les


31

Figure 09.- Chromatographie des extraits organiques sur couche mince et révélation

chimiques avec cinqs systèmes de solvants (a, b, c, d et e).

c

Hex Ae Di But

Sys.E : A.N.E

a

Hex Ae Di But

Sys.E : E.A.E

b

Hex Ae Di But

Sys.E : A.M

e

Hex Ae Di But

Sys.E : B.A.E

(6:1.5:2)

d

Hex Ae Di But

Sys.E : B.A.E

(60:20:20)


32

purifications car il permet une meilleure séparation des taches qui sont localisées à l’œil nu

après révélation, comparativement au système A.M, E.A.E et A.N.E (Figure 09).

IV.1.3.2.- Révélations chimiques des plaques

Des révélations chimiques des plaques ont été réalisées pour classer et détecter la

nature des extraits obtenus. Suite à la sélection du meilleur système de migration, d’autres

plaques de gel de silice sont développées dans les mêmes conditions dans le but d’avoir un

aperçu sur la nature chimique des antibiotiques produits. Cinqs révélateurs chimiques utilisées

montrent que les extraits sont révélés positifs à la ninhydrine et négatif au autres révélateurs

chimiques utilisés, a savoir, le chlorure de fer ferrique (révélateur des phénols et des acides

hydroxamiques), le formaldéhyde-H2SO4 (révélateur des aromatiques polycycliques), la

vanilline-H2SO4 (révélateur des alcools supérieurs, des stéroïdes et des huiles éthérées) et au

nigrame (révélateur des glucides).

IV.1.3.3.- Bioautographie

La bioautographie consiste à faire migrer les fractions par chromatographique sur

couche mince et détecter les taches actives contre la souche cible et ce la par révélation

microbiologique.

Après migration sur le système de l’extrait hexanoique, les plaques de CCM ont fait

l’objet d’une bioautographie en utilisant Bacillus subtilis. La Figure 10 illustre les résultats de

CCM de l'extrait hexanoique et révélation chimique par la ninhydrine.

La bioautographie de la phase hexanoique a montré la présence d'une tache active n° 3

a couleur jaune-oronge de Rf = 0.34 (Tableau VII).

Les

spots

Rf Couleur des

taches

1 0.27 Orange clair

2 0.29 Jaune

3 0.34 Jaune-oronge

4 0.46 Oronge

5 0.50 Oronge

6 0.56 Rose-violet

7 0.63 Rose-violet

8 0.72 Rose-violet Figure 10.- Chromatographie de l'extrait hexanoique

sur couche mince et révélation chimique par la

ninhydrine

Tableau VII.- Rf de chromatographe

de l'extrait hexanoique.


33

IV.2.- Discussions

IV.2.1.- Cinétiques de croissance et de production des antibiotiques

IV.2.1.1.- Cinétiques de croissance et de variation du pH des antibiotiques

Les cinétiques de croissance et de production des antibiotiques de la souche ITA1X ont

été menées en conditions liquides, en agitation, sur milieu Bennett, qui a déjà été utilisé pour

ce genre d'étude dans notre laboratoire.

Le pH évolue, de la même manière et avec une vitesse constante, pour atteindre des

valeurs légèrement basiques. Cette évolution serait due à la dégradation des sources azotées

organiques tels que les acides aminés présents dans l'extrait de levure, qui sont désaminés

pour libérer de l'ammonium. L'accumulation de ce dernier induit la basification du milieu. De

telles constatations ont été énoncées par Strub (2008)

La courbe de croissance de la souche ITA1X est caractérisée par une absence de la

phase de latence : elle peut être obtenue en adaptant l'inoculum sur le même milieu

(préculture) et en augmentant sa taille (GUIRAUD., 2007).

La phase stationnaire commence juste après un jour de fermentation. Elle est

caractérisée par une période courte et stable de croissance accompagnée d’une augmentation

du pH qui est probablement due à la dégradation des sources azotées. Cette phase est suivie

par un abaissement de croissance peut être expliquée par la précision des conditions

favorables du culture (température, agitation).

Durant la phase de croissance on observe deux phases exponentielles (le phénomène

de diauxie) : la première après un jour d'incubation est marquée par une acidification du

milieu de culture qui peut être expliquée par une libération d’acides organiques, la deuxième

entre le 4ème

et le 6ème

jour est marqué par un pH alcalin. Il se pourrait que le phénomène de

diauxie observé pour la souche ITA1X soit dû aussi à la consommation précoce des acides

aminés de l'extrait de levure ajouté au milieu et que le glucose ne soit consommé en tant que

source de carbone qu’au cours de la seconde phase exponentielle (TOUMATIA., 2015).

Après la phase de déclin (du 7ème

au 8ème

jour), une croissance additive (assez faible),

appelée communément croissance cryptique, laquelle a été déjà signalée chez plusieurs

microorganismes, notamment les entérobactéries (PRESCOTT et al., 2002 ) a été observée.

Cette croissance s’explique par le fait que les cellules encore vivantes utilisent comme

substrat les débris des cellules mortes qui se sont lysées durant la phase de déclin

(TOUMATIA., 2015).


34

IV.2.1.2.- Cinétiques de production des antibiotiques

Les activités antimicrobiennes débutent à la fin de la phase exponentielle et le début de

la phase stationnaire. Les activités deviennent maximales dès le 9ème

ou 10ème

jour, c’est-à-

dire, à la fin de la phase de déclin. Cela indique que ces activités sont dues à des

métabolites secondaires. Les productions maximales d’antibiotiques par la souche ITA1X ont

lieu durant les phases de ralentissement et stationnaire, comme dans le cas de la majorité des

microorganismes. Une autre production d’antibiotiques pour la souche ITA1X a lieu en fin de

phase de déclin pour atteindre un maximum durant la croissance cryptique.

IV.2.2.- Extraction des antibiotiques

Le principe de l'extraction par les solvants organiques se résume en une séparation du

surnageant en deux phases ; une phase organique et une phase aqueuse et de faire passer les

molécules bioactives dans la phase organique.

IV.2.2.1.- Extraction à partir du mycélium

L'activité antibactérienne est retrouvée dans le mycélium de la souche ITA1X c'est-à-

dire probablement il y a des substances intracellulaires solubles dans le solvant méthanolique.

IV.2.2.2.- Extraction à partir des filtrats de culture

Les produits actifs antibactériens des filtrats de culture de la souche ITA1X sont en fait

partiellement extractibles par les solvants que nous avons utilisés et le meilleur apparait avec

l'extrait de n-hexane, cela explique la solubilité des substances bioactifs de la souche ITA1X

dans les solvants qui ont la propriété physico-chimique apolaire.

IV.2.3.- Séparation et semi-purification des principaux actifs

IV.2.3.1.- Chromatographie analytique sur couche mince

L'analyse chromatographique sur couche mince a montré que le système d'élution

B.A.E (6:1.5:2, v/v/v) permet une meilleure séparation des taches. Ce système éluant est

compatible pour la séparation des molécules que nous avons trouvées apolaires.

IV.2.3.2.- Révélations chimiques

Des révélations positives ont été obtenues avec la ninhydrine dont huit tâches de

couleurs et de Rf différents. Ces résultats suggèrent que les extraits organiques ont une nature

protéique et contiennent un ou plusieurs acides aminés.

IV.2.3.3.- Bioautographie

La bioautographie de la phase hexanoique a montré la présence d'une tache active.

Conclusion

Conclusion

35

Le présent travail est une étude de la production, extraction et purification dequelques composés actifs extraits à partir des souches d'actinomycètes isolée de larégion de Ouargla.

L'étude consiste à suivre la cinétique de croissance et de production, et celapour permettre de connaitre le meilleur jour de croissance et de production desantibiotiques; ainsi de faire l'extraction des composées actifs à partir de mycélium etde filtrat de culture et cela on utilisant différentes solvant organiques de différentpolarité; ce qui nous donne une idée sur la nature des composés extraits; l'étude estensuite suivi d'un essai de semi-purification des ces fractions organiques, et cela parl'analyse chromatographique sur couche mince, pour obtenir la meilleur phase ousystème d'élution. On se basant sur le ces résultats, on peut obtenir des informationssur la nature du principe actif par l'utilisation de différentes révélateurs chimique etmicrobiologique.

Les résultats d'étude montrent que la cinétique de croissance et de productiond’antibiotiques est maximale au cinquième et dixième jour d'incubationrespectivement. D'après l'extraction des antibiotiques et la recherche d'activitéantagoniste vis-à-vis Bacillus subtilis ; on résulte que les molécules antimicrobiennessont secrétées dans le milieu de culture et associées au mycélium. L'extraction par lessolvants a révélé que l'hexane semble être le solvant le plus approprié pour extraire lesmolécules bioactives des filtrats de la culture. La chromatographie à montré que lemeilleur système de séparation est le n-butanol-acide acétique-eau (6-1,5-2). Larévélation chimique et microbiologique (bioautographie) à permet de détecter la tacheactive ; et elle est de nature protéique.

En perspectives, il serait nécessaire de continuer l’étude, par la purificationcomplète des molécules produites (en utilisant d’autres techniqueschromatographiques comme l’HPLC) et de déterminer leurs structures par l’utilisationde plusieurs techniques spécifiques comme la spectroscopie d’absorption en lumièreUV-VIS, la spectroscopie d’absorption en lumière IR, la spectroscopie de masse et larésonance magnétique nucléaire.

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bibliographiques

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Annexes

Annexes

41

Annexes I

Figure 11.- Activité antibactériennedes extraits organiques vis-à-visBacillus subtilis par la méthode despuits.

Figure 12.- Activité antibactériennede l'extrait de mycélium vis-à-visBacillus subtilis par la méthode despuits.

Figure 13.- Extraction desantibiotiques par des solvantsorganiques (utilisation d’ampoule à

Décanter).

Annexes

41

Annexes I




Décanter).

Annexes

41

Annexes I




Décanter).

Annexes

42

Annexes II

Tableau III.- Cinétiques de pH de la souche ITA1X dans le milieu Bennett

Tableau IV.- Cinétiques de croissance de la souche ITA1X dans le milieu Bennett

Jours 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12P.S (g/l) / 6 6 6 4 10 6 4 4 4 4 4 4

Tableau V.- Cinétiques de production d’antibiotique de la souche ITA1X vis-à-visBacillus subtilis.

Jours 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Z.D.I(mm) 0 8 9 7 7 7 7 10 12

Tableau VI.- Diamètres des zones d'inhibition des extraits organiques et de mycéliumde la souche ITA1X vis-à-vis Bacillus subtilis.

Extraits organiques et demycélium

Diamètres des Zone d'inhibitionen (mm)

n-Hexane 16

Benzène 12

Dichlorométhane 14

Acétate d'éthyle 15

n-Butanol 13

Mycélium 12

Jours 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

pH 7.2 4.7 7.4 7.5 8.0 8.1 8.2 8.2 8.6 8.05 7.9 8.3 8.4

6 6 66

Annexes

43

Annexe III

1- Diphénylamine-aniline : révélateur des glucides

* Solution à vaporiser : dissoudre 4 g de diphénylamine, 4 ml d’aniline et 20 mld’acide phosphorique dans 200 ml d’acétone

* Traitement complémentaire : chauffer pendant 5 min à 100°C. Les tachesapparaissent roses, violettes ou bleues.

2-Chlorure de fer ferrique (FeCl3) : révélateur des phénols et des acideshydroxamiques.

*Solution de vaporisation : solution de FeCl3 de 1 à 5% dans HCl 0,5 N.

Les taches correspondant aux phénols sont colorées au bleu vert et celles des acides

hydroxamiques, en rouge.

3- Ninhydrine : révélateur des amines, des acides aminés et des oses amines.

* Solution de vaporisation : dissoudre 0,2 g de ninhydrine dans 100 ml d’acétone.

* Traitement complémentaire:chauffer à 105 °C jusqu’au développement optimal destaches(couleur violette, rose).

4- Vanilline-acide sulfurique : révélateur des alcools supérieurs, des stéroïdes et deshuiles éthérées.

* Solution de vaporisation : dissoudre 1 g de vanilline dans 1000 ml de H2SO4concentré.

* Traitement complémentaire : chauffer à 120°C pendant 5 à 10 (couleurs violette,rose ou grise).

5- Formaldéhyde-acide sulfurique : révélateur des aromatiques polycycliques.

*Solution de vaporisation : dissoudre 0,2 ml d’une solution de formaldéhyde (37%)dans 10 ml deH2SO4 concentré. Les taches apparaissent de divers couleurs (brunes,blanches…)

Résumé

Ce travail porte sur l'étude de production, extraction et semi-purification de quelques molécules

bioactifs isolée d'une souche d’actinomycètes « ITA1X ».

L’étude consiste d’une part à l’estimation de la cinétiques de croissance et de production de

métabolites actifs de la souche ITA1X et l'extraction aux différentes solvants organiques, de différentes

polarités de ces métabolites, et d’autre par de mettre en évidence l'activité antimicrobienne des extraits et

un essai de semi-purification des principes actifs.

Les résultats ont montrés que la cinétique de croissance et de production d’antibiotiques est

maximale au cinquième et dixième jour d'incubation respectivement. Le meilleur solvant d'extraction est

le hexane avec une zone d'inhibition de 16 mm de diamètre. La chromatographie sur couche mince, des

extraits d'isolat ITA1X, selon la technique de Betina révèle la présence d'un composé bioactifs

antibactérien de nature protéique.

Mots clés: actinomycète, cinétique de croissance, cinétique de production, extraction, purification.

ملخص

اإلسحخالص و انحقة اندزئة نبعض اندزئبت حىة انشبط يعزونة ي انسالنة انشعبعة ,هزا انعم حطشق إن دساسة اإلحبج

« ITA1X » .

واسحخالصهب بحبنم « ITA1X »جحثم انذساسة ف جقذش حشكة انى واإلحبج نهشكببت األضة انفعبنة نهسالنة انشعبعة

و جقة خزئة نألسس , وي خهة أخشي يعبندة واضحة نهشبط انضبد نألحبء انذققة نهسحخهصبت, ي خهة, عضىة يخحهفة انقطبة

. انفعبنة

أفضم يحهىل .أوضحث انحبئح أ حشكة انى و اإلحبج انقصىي نهضبدات انحىة ف انىو انخبيس و انعبشش عه انحىان

عه وخىد يشكب Betinaكشفث انكشويبجىغشافك عه طبقة دققة حسب جقة . يى16نإلسحخالص هى انهكسب بسبفة جثبظ قطشهب

. حى انشبط ضذ انبكحش رو طبعة بشوجة

. جقة, إسحخالص, حشكة اإلحبج, حشكة انى, بكحشب شعبعة:كلمات دالة

Abstract

This work focuses on the study production, extraction and purification of some semi-bioactive

molecules isolated from a strain of actinomycetes "ITA1X".

The study consists of a part in the estimation of the growth kinetics and production of active

metabolites of ITA1X strain and extraction with different organic solvents of different polarity of these

metabolites, and secondly by putting demonstrated the antimicrobial activity of extracts and semi-

purification of the active ingredients test.

The results showed that the kinetics of growth and antibiotic production is maximum at the fifth

and tenth day of incubation respectively. The best extraction solvent is hexane with a zone of inhibition of

16 mm diameter. The thin layer chromatography, the isolate ITA1X extracts, according to the technique of

Betina reveals the presence of an antibacterial compound of bioactive proteinaceous.

Key words : actinomycetes, growth kinetics, kinetics of production, extraction, purification.

Documents

Production et extraction de quelques principes actifs ... · UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département des Sciences Biologiques